Lectures 2-4 Pharm Biotech 2016users.auth.gr/pchristo/teaching/Lectures 2-4_Pharm... ·...

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΧρήστοςΠαναγιωτίδης,Ph.D.ΚαθηγητήςΚυτταρικής/ΜοριακήςΒιολογίαςΕργαστήριοΦαρμακολογίας,ΤομέαςΦαρμακογνωσίας/ΦαρμακολογίαςΤμήμαΦαρμακευτικής, ΣχολήΕπιστημώνΥγείας,ΑριστοτέλειοΠανεπιστήμιοΘεσσαλονίκης54124Θεσσαλονίκη

ΦαρμακευτικήBιοτεχνολογίαΔIAΛEΞΕΙΣ2-4

EIΣAΓΩΓHΣΤΗΝΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΤΟΥΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥDNAΚΑΙΣΤΙΣ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣΤΗΣ


ΣύγχρονηΒιοτεχνολογίακαιΓενετικήΜηχανική

α)ΗσύγχρονηΒιοτεχνολογίαξεκίνησεσχεδόνπαράλληλαμετηνανάπτυξητωντεχνολογιώνγενετικήςμηχανικήςπουεπέτρεψαντηναπομόνωση,τροποποίηση,εισαγωγήκαιέκφρασητμημάτωνγενετικούυλικού.β)Τα«εργαλεία»πουέχειαναπτύξειηγενετικήμηχανικήμαςεπιτρέπουν:•Ναταυτοποιούμε τογονίδιοπουκωδικοποιείτηνπρωτεΐνητουενδιαφέροντος•ΝακόβουμετηναλληλουχίατουDNAπουπεριέχειαυτήντηναλληλουχίατουγονιδίου•Νακλωνοποιούμε τογονίδιααυτόσεένανκατάλληλοφορέα,π.χ.πλασμίδιο ήβακτηριοφάγο•Ναπροσδιορίζουμετηναλληλουχίατουγενετικούυλικού•Ναχρησιμοποιούμετουςφορείςαυτούςγιαναμεταφέρουμετογονίδιοτουενδιαφέροντοςσεάλλουςοργανισμούς,όπωςτοβακτήριοEscherichiacoliήκαισεκύτταραθηλαστικώνπουαναπτύσσονταισεκυτταροκαλλιέργειες κλπ.•Ναεπάγουμε(διεγείρουμε)τακύτταρααυτάγιαναενεργοποιήσουμετηνέκφρασητουγονιδίουκαιτηνπαραγωγήτηςτηςπρωτεΐνητουενδιαφέροντος.•Ναεκχυλίσουμεκαινακαθαρίσουμετηνπρωτεΐνηγιαθεραπευτικήχρήση.


Παραγωγήμεγάλωνποσοτήτωνπρωτεϊνώνμεκλωνοποίησηγονιδίωνσεφορείςέκφρασης

Ιδιότητεςτωνφορέων pGEX1. Ισχυρόςκαιρυθμιζόμενις

υποκινητής(Tac promoter)2. Παρουσίαγονιδίουlac Iq3. Ετικέτα(tag)GST

(θειοτρανσφεράση τηςγλουταθειόνης)

Παράδειγμα:Οιβακτηριακοί φορείςέκφρασηςpGEX("Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase” (1988) Smith,D.B.andJohnson,K.S.,Gene 67,31-40)


DNAμπορείνααπομονωθείείτεαπόκύτταραήαπόιστούςπροκειμένουναμελετηθεί• ΠΡΟΣΟΧΗ:

ΤοDNA είναιέναΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο(ακόμηκαιτο DNAτωνσχετικάμικρώνβακτηριακώνγονιδιωμάτωνείναιαρκετάμεγάλο) πουείναιεξαιρετικάευαίσθητοστημηχανικήκαταπόνηση,δηλαδήμπορείπολύεύκολανα«σπάσει»σεμικρότεραθραύσματακατάτηδιάρκειατωνεργαστηριακώνχειρισμών.

ΕΠΟΜΕΝΩΣ

üΤο«κόψιμο»τουDNA σεμικρότεραθεραύσματαμπορείναβελτιώσειτημηχανικήτουσταθερότητα καινααπλοποιήσειτοχειρισμότου


Πωςμπορούμενα«κόψουμε»τοDNAσεμικρότεραθραύσματα;

METHXPHΣHEIΔIKΩNENZYMΩN

✍YΠAPXOYNΠPOΫΠOΘEΣEIΣ;

✔NAI,TAENZYMAAYTAΘAΠPEΠEINAΔIAΣΠOYNTODNAΠANTAΣTIΣIΔIEΣAΛΛHΛOYXIEΣOIOΠOIEΣEINAIEKTΩN

ΠPOTEPΩNΓNΩΣTEΣ


ΕργαλείαστηνΦαρμακευτικηΒιοτεχνολογία– ΓενετικήΜηχανική

Ενδονουκλεάσες περιορισμού:•Αυτάταένζυμαπροέρχονταιαπόβακτήριαόπουχρησιμοποιούνταιωςμηχανισμόςάμυναςενάντιαστουςιούς(βακτηριοφάγους)πουταπροσβάλλουν,αποικοδομώντας τοDNAτωνεισβολέων.Υπάρχουνεκατοντάδεςτέτοιεςενδονουκλεάσες περιορισμούπουτιςχρησιμοποιούμεσανμοριακάψαλίδιαγιανακόψουμετοDNAσεσυγκεκριμένεςθέσειςκαινααπομονώσουμεταγονίδιαDNAλιγάση:•Τοένζυμοαυτόχρησιμοποιείταιφυσιολογικάστηναντιγραφήαλλάκαιστηνεπιδιόρθωση«σπασμένου»DNA.ΜπορείναχρησιμοποιηθείκαιγιατηνενσωμάτωσηνέωνγονιδίωνστοDNA.Πλασμίδια:•ΕίναικυκλικάDNA.Μπορούνναδιαμορφωθούνγιαναμεταφέρουνταγονίδιατουενδιαφέροντοςήανασυνδυασμένο DNA.Βακτηριοφάγοι(ήφάγοι):•Είναιιοίπουμολύνουνταβακτήρια.Οιβακτηριοφάγοιμπορούνναδιαμορφωθούνγιαναμεταφέρουνταγονίδιατουενδιαφέροντοςήανασυνδυασμένο DNA.


Τιείναιοιενδονουκλεάσες περιορισμού;

Οιενδονουκλεάσεςπεριορισμούείναιενδονουκλεάσεςοιοποίεςαναγνωρίζουνσυγκεκριμένεςπαλινδρομικές

αλληλουχίεςστοDNA,τοοποίοδιασπούνπάνταστιςίδιεςπροκαθορισμένεςθεσεις.

Θαδείξουμεμερικάπαραδείγματαστιςεπόμενεςδύοδιαφάνειες


Τέσσερις“δημοφιλείς” ενδονουκλεάσεςπεριορισμού


Περισσότερεςενδονουκλεάσες περιορισμού

EcoRI

HaeIII

AluI

NotI

HindIII

θέσηδιάσπασης Σακχαροφωσφορικός σκελετός


Απόπουπροέρχονταιοιενδονουκλεάσες περιορισμού;

✔Οιενδονουκλεάσεςπεριορισμούαπομονώθηκαναρχικάαπόβακτήρια.Είναισυστατικάενός

μηχανισμούάμυναςτωνβακτηρίωνενάντιασεεισβολήξένουγενετικούυλικού,π.χ.απόμόλυνση

μεκάποιονβακτηριοφάγο.

✄ΓιατίοιενδονουκλεάσεςπεριορισμούδενδιασπούνκαιτοDNAτουβακτηρίουπουτιςπαράγει;


ΧημικέςτροποποιήσειςτουDNA τωνβακτηρίωνπουπαράγουνενδονουκλεάσες

περιορισμούτοπροστατεύουναπόενδονουκλεολυτική πέψηαπόαυτές

ΜεθυλιωμένοDNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

Η EcoRIδεμπορείναδιασπάσειτομεθυλιωμένο DNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

ΔιάσπασητουDNA

«κολλώδη»άκρα

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI

EcoRIμεθυλάση

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI


ΚΑΙΜΕΤΑΤΗΝΚΟΠΗΤΙ;

ΠωςαναλύεταικαιπωςχρησιμοποιείταιτοDNAμετάτηνπέψητουμεενδονουκλεάσες

περιορισμού;


Hλεκτροφορητική ανάλυσητουDNA

κοντόθραύσμα

μεσαίου-μεγέθουςθραύσμα

κοπήμεενδονουκλεάσηπεριορισμού



DNA

Μεγαλύτερομέγεθος

μικρότερομέγεθος

ΔίκλωνοπλασμιδιακόDNA

ΠέψημεEcoRI ΠέψημεHindIII

Αρχή

Τέλος

Εμφάνισηφιλμ

εμφανισμένοαυτοραδιογράφημαφύλλοφωτογραφικού

χαρτιού

πηκτήαγαρόζηςζεύγηνουκλεοτιδίων(Χ10

00)

201086

2

+

-


ΗσημασίατουμάρτυραμεγέθουςθραύσματοςDNAστηνηλεκτροφόρηση


Ταστάδιατηςηλεκτροφορητικής ανάλυσηςσεπηκτέςαγαρόζης

μικροπιπέτακαλώδια

τροφοδοτικό

Α)καλούπισχηματισμούτηςπηκτής Β)Ηαγαρόζη «χύνεται»στοκαλούπισχηματισμούπηκτής Γ)τοποθέτησηπλαστικής

«χτένας»γιατονσχηματισμόοπών(πηγαδάκια)στηνεπιφάνειατηςπηκτής

πηγαδάκια

ταινία

διάλυμααγαρόζης

καλούπι

Γυάλινηεπιφάνεια

βάσηστήριξης


Προετοιμασίακαιενυδάτωσητηςπηκτήςαγαρόζης


Ταστάδιατηςπροετοιμασίαςγιαηλεκτροφόρηση σεπηκτέςαγαρόζης

α)Ηαγαρόζη «χύνεται»στοκαλούπισχηματισμούπηκτήςστοοποίοέχειήδητοποθετηθείκαιηχτένασχηματισμούπηγαδιών

α)Μετάτηστερεοποίησητηςαγαρόζης καιτηναπομάκρυνσητηςχτέναςσχηματισμούπηγαδιών,τοκάθεδείγμαDNAτοποθετείται(«φορτώνεται»)σεξεχωριστόπηγαδάκι

γ)Μετάτηντοποθέτησητωνδειγμάτωνησυσκευήενώνεται,μεχρήσηκαλωδίων,μετοτροφοδοτικόκαιξεκινάηηλεκτροφόρηση μεπαροχήρεύματοςσυγκεκριμένηςτάσης.


Χειρισμόςτουδείγματοςπουπρόκειταινααναλυθείμεηλεκτροφόρηση


Χειρισμόςτηςπηκτήςαγαρόζης μετάτοτέλοςτηςηλεκτροφόρησης


Ηλεκτροφορητικές μέθοδοιχρησιμοποιούνταικαιστονπροσδιορισμότωνDNA αλληλουχιών


ΔιαδικασίααλληλούχισηςDNAμετημέθοδοτουSangerπουβασίζεταιστηχρήση

διδεοξυνουκλεοτιδίων

Διδεοξυαδενοσίνη (ddATP)


Aλληλούχιση DNAμετημέθοδοτουSanger


ΑυτοματοποιημένοςπροσδιορισμόςτηςαλληλουχίαςτουDNA


Ηπρώτηαλληλούχιση πλήρουςγονιδιώματοςεπιτεύχθηκετο1995γιατοDNAτουβακτηρίουHaemophilus influenza

Σταθμοίστηναλληλούχιση γονιδιωμάτων

1996: Πρώτηαλληλούχιση τουευκαρυωτικού γονιδιώματος (ζυμομύκητας–Saccharomycescerevisiae)

1998: Πρώτηαλληλούχιση γονιδιώματος πολυκύτταρουευκαρυώτη (Caenorhabditiselegans)2000: Aλληλούχιση γονιδιωμάτων Drosophilamelanogaster &Arabidopsisthaliana2004: Πλήρηςαλληλούχιση τουανθρώπινουγονιδιώματος


ΗγνώσητηςαλληλουχίαςτωνβάσεωντουDNAεπιτρέπειτονπροσδιορισμότωνπεριοχώνπουκωδικοποιούνπρωτεΐνες

πλαίσιαανάγνωσης




DNA

DNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςπάνωαλυσίδαςτουDNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςπάνωαλυσίδαςτουDNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςκάτωαλυσίδαςτουDNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςκάτωαλυσίδαςτουDNA


KΛΩNOΠOIHΣHH«αρχειοθέτηση»τουDNAστο

εργαστήριο


Πλασμίδια:Οιπιοκοινοίφορείςκλωνοποίησης


Χωρητικότητακοινώνφορέωνκλωνοποίησης


Hδιαδικασίατηςκλωνοποίησης

ΚΟΠΗΜΕΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

θραύσμαDNA πουθακλωνοποιηθεί

ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗΣΥΝΔΕΣΗΜΕΤΗΝDNAΛΙΓΑΣΗ

δίκλωνοκυκλικόπλασμιδιακό DNA

ανασυνδυασμένο DNA


Πολλαπλασιασμόςτωναντιγράφωνενόςγονιδίουμεκλωνοποίηση

βακτηριακόκύτταρο καλλιέργειαγιατον

πολλαπλασιασμότωνβακτηριακών κυττάρων

Μετάαπόλύσητωνβακτηριακών κυττάρωναπομονώνονταιμεγάλεςποσότητεςDNA

Τοανασυνδυασμένοπλασμιδιακό DNAεισάγεταιστοβακτηριακό κύτταρο


Aπαραίτητες ιδιότητεςενόςπλασμιδιακούφορέακλωνοποίησης

1. Aλληλουχίες έναρξηςαντιγραφής(ORI)2. Γονίδιοπουεπιτρέπειεύκοληεπιλογή(π.χ.

αντίστασησεαντιβιοτικό)3. Aλληλουχίες πουεπιτρέπουνκοπήαπόαρκετές

ενδονουκλεάσες περιορισμού(polylinker)4. (Υποκινητής πουεπιτρέπειρυθμιζόμενη

έκφραση)


Γενωμικές &cDNA Bιβλιοθήκεςχρωμοσωμικό DNA

γονίδιοΑ γονίδιοΒγονίδιοΒ γονίδιοΑ

εξόνιο ιντρόνιο μη-μεταγραφόμενοDNA

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ

ΠΕΨΗΜΕΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΤΟΥ DNA

ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΜΕΤΑΓΡΑΦΗ&ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗDNA

ΣΥΡΡΑΦΗ(ΜΑΤΙΣΜΑ)ΤΟΥ RNA

mRNAs

RNAμετάγραφα

θραύσματαDNA

γενωμικοί κλώνοιDNAσεγενωμική βιβλιοθήκη cDNA κλώνοισεβιβλιοθήκη cDNA


Ταβήματατηςκλωνοποίησης σεπλασμίδιο


Κατασκευήγενωμικών βιβλιοθηκών

DNA ανθρώπουΠΕΨΗΜΕ

ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΤΑΘΡΑΥΣΜΑΤΑΤΟΥDNAΕΝΣΩΜΑΤΩΝΟΝΤΑΙΣΕ

ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ

εκατομύρια θραύσματαγενωμικού DNA

ΕΙΣΑΓΩΓΗΤΩΝΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΣΕΒΑΚΤΗΡΙΑ

ανασυνδυασμένα μόριαDNA

γενωμική βιβλιοθήκη


ΔιαδικασίαπαρασκευήςcDNA

ιστός,π.χ.εγκέφαλος

λύσητωνκυττάρωνκαι απομόνωση

mRNA

mRNA

υβριδισμόςμεεκκινητή polydT

mRNAκατασκευήαντιγράφουDNAμε

χρήσηαντίστροφηςμεταγραφάσης

κατεργασίαμεάλκαλι γιανααποικοδομηθεί τοRNA

Το3’άκροτουcDNAσχηματίζει

θηλειά

σύνθεσησυμπληρωματικήςαλυσίδαςDNA μεDNA-πολυμεράση,ηθηλειάτου

3’άκρουδραωςεκκινητής

δίκλωνοcDNA αντίγραφοτουαρχικούmRNA

κατεργασίαμενουκλεάση πουαποικοδομεί μονόκλωνοDNA γιανα

αποικοδομηθεί ηθηλειά


ΠροσανατολισμένηκλωνοποίησητουδίκλωνουcDNAσεπλασμιδιακόφορέα


Bιβλιοθήκες DNAμπορούννακατασκευασθούνκαισεβακτηριοφάγους

λυτική οδόςλυτική οδόςσχηματισμόςπροφάγου (λυσιγονία)

βακτηριακό κύτταρο

βακτηριακό χρωμόσωμα

βακτηριφάγοςλάμδα

τοDNAτουφάγουκυκλοποιείται

πρόσδεσητουφάγου στονξενιστήκαι«ένεση»τουιικού DNA

σύνθεσητωνιικώνπρωτεϊνώνπου

χρειάζονταιγιατοσχηματισμόνέωνιών

ΤαχείααντιγραφήτουDNA τουλφάγου και

πακετάρισμασεπλήρειςιούς

λύσητουκυττάρουκαιαπελευθέρωση

μεγάλωνποσοτήτωννέωνιών

βήμαενεργοποίησης

ΕνσωμάτωσητουDNAτουλφάγου στοχρωμόσωματου

ξενιστή

κυτταρικήδιαίρεση

τοενσωματωμένοDNA τουλφάγουαντιγράφεταιμαζίμετοχρωμόσωματουξενιστή


Τακοσμίδιαείναιπλασμιδιακοίφορείςκλωνοποίησηςπουπεριέχουνμίαήδύοθέσεις“cos”. (Ηθέση cos είναιμίααλληλουχίαπερίπου200bp πουπροέρχεταιαπότονφάγολκαιηοποίαείναιαπαραίτητηγιατο«πακετάρισμα»τουDNA σεσωματίδιαφάγου).

Πωςκλωνοποιούμετο DNAσεένακοσμίδιο;1.Χρησιμοποιούμετηθέσηπολλαπλήςκλωνοποίησης(polylinker)γιαναενθέσουμε

θραύσματαDNA πουέχουνδημιουργηθείμεπέψημεενδονουκλεάσεςπεριορισμού.

2.ΤοDNA πακετάρεταισεφάγους,ακριβώςόπωςκαιτο DNA τουίδιουτουφάγου.3.Τακοσμίδιαπολλαπλασιάζονταιμέσασταβακτηριακάκύτταραόπωςκαιτα

πλασμίδια(δηλ.φέρουνγονίδιαπουπροσδίδουνστακύτταρααντίστασησεαντιβιοτικό).

4.Τακοσμίδιααπομονώνονταιακριβώςόπωςκαιταπλασμίδια.

Τοπλεονέκτηματουςείναιότιμπορούννα«πακετάρουν»μέσαστην«κεφαλή»τουφάγουμεγαλύτερασεμέγεθοςθραύσματαDNA (40-55kbofDNA,δηλ.σεκοσμίδιαμεγέθους~5kb μπορούμεναεισάγουμεενθέματα33-50kb).

Kοσμίδια


• Τοκοσμίδιο«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηBglII σεθέσηκοντάστηθέσηcos.• Το γενωμικόDNA«κόβεται»μετηνενδονουκλεάση Sau3A(μερικήυδρόλυση),που

δημιουργείσυμβατά«κολλώδη»άκραμετηνBglII. Ταθραύσματατακατεργαζόμαστεμεαλκαλικήφωσφατάση(ΓΙΑΤΙ;)

• ΤοDNA δότηςσυνδέεταιμετοDNAδέκτη(κοσμίδιο)μετηνDNAλιγάσηδημιουργώνταςενσειράσυνδέσεις.ΤοDNAκαθαρίζεταιμεβάσητομέγεθος.

• ΤοDNA «πακετάρεται»σεφάγους.

Kλωνοποίησησεκοσμίδια- Παράδειγμα


ΤοDNAτωνκοσμιδίων«πακετάρεται»σεγραμμικήμορφή

Θραύσμαπροςκλωνοποίηση(35-55bp,κομμένομεBamHI)

Προσθήκηλιγάσης καιATP


Κοσμίδια- ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ


Πολύπλοκεςγενετικέςκατασκευέςμπορούνναγίνουνμεδιαδοχικέςκλωνοποιήσεις

θραυσμάτωνDNAπλασμιδιακός φορέας

πρώτοένθεμα

δεύτεροένθεμα

τρίτοένθεμα


ΠΩΣMΠOPOYMENATAYTOΠOIHΣOYMEAΠOIKIEΣΠOYΠEPIEXOYNANAΣYNΔYAΣMENOYΣΦOPEIΣKΛΩNOΠOIHΣHΣAΠO

AYTEΣΠOYΠEPIEXOYN«AΔEIOYΣ»ΦOPEIΣ;


Διάκρισημπλε-λευκώναποικιώνγιατονεντοπισμόανασυνδυασμένωνφορέων


Eντοπισμός ανασυνδυασμένων φορέωνμεβάσητηνέκφρασηενόςγονιδίουθανάτου

Nsi I*

Hind

III

Asp7

18 I

Kpn

IEcl1

36 II

Sac I

Bam

H I

Spe

IEcoR

IPst I

EcoR

VNo

t IXho

INsi I*

Xba

IDra

IIApa

IBstB

I

pZErO™-2.13.3 kb

Stu IPlaclacZα ccdB

f1 ori

Apo I†

BspH I

SnaB I

Comments for pZErO™-2.1 3297 nucleotides

Lac Promoter/Operator Region: bases 95-216M13 Reverse Priming Site: bases 205-221LacZα ORF: bases 217-558Sp6 Priming Site: bases 239-256Multiple Cloning Site: bases 269-381M13 (-20) Forward Priming Site: bases 415-430M13 (-40) Forward Priming Site: bases 434-450Fusion Joint: bases 559-567ccdB Lethal Gene ORF: bases 568-870f1 origin: bases 895-1307Kanamycin Resistance ORF: bases 2116-1322ColE1 origin: bases 2502-3175

ColE1Kanamycin

Afl III

* The two Nsi I sites in theMCS are the only sites inthe vector.

† There are two tandemApo I sites at thislocation. Apo I alsorecognizes the EcoR Isite.

Sp6

A-160319

The sequence of pZErO™-2.1 has been compiled from information in sequence databases, publishedsequences, and other sources. This vector has not been completely sequenced. If you suspect an error in thesequence, please contact Invitrogen's Technical Services Department.


Yβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων

μίγμαμονόκλωνωνμορίωνDNA

υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιοστους42˚C

υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιο στους35˚C

ουβριδισμόςδενείναιακριβής

υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιο στους35˚C

μονόκλωνοιDNAανιχνευτέςγιατογονίδιοΑ

μόνοτοΑσχηματίζεισταθερήδιπλήέλικα

ταΑ,CκαιEσχηματίζουνσταθερέςδιπλέςέλικες


TαυτοποίησηAποικιώνπουΠεριέχουνΘετικούςKλώνουςμεYβριδισμό


ΠΩΣMΠOPOYMENAEΠITYXOYMETHN

ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣHΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN

DNA(πριντην κλωνοποίησηήκαιμετά);


ΣτύπωμακατάSouthern μετάαπόανάλυσηDNAμεηλεκτροφόρησησεπήκτωμα


Aνίχνευση τηςμετάλλαξηςπουπροκαλείδρεπανοκυτταρικήαναιμίαμευβριδισμό

νουκλεϊνικών οξέων

πρωτεΐνη

φυσιολογικήβ-σφαιρίνη

φυσιολογικήπρωτεΐνη

μεταλλαγμένηπρωτεΐνη

παθολογικήβ-σφαιρίνημετάλλαξη

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

ανιχνευτήςφυσιολογικούγονιδίου

ανιχνευτήςμεταλλαγμένουγονιδίου

άτομα άτομα• Τοάτομο1έχειδύο

φυσιολογικάγονίδιαβ-σφαιρίνης

• Τοάτομο2έχειδύομεταλλαγμέναγονίδιαβ-σφαιρίνης

• Τοάτομο3έχειέναφυσιολογικόκαιέναμεταλλαγμένογονίδιοβ-σφαιρίνης


Χρήσηυβριδισμούνουκλεϊνικών οξέωνγιατονπροσδιορισμότηςτοπολογίαςτων

γονιδίωνσταχρωμοσώματα


TIKANOYMEOTANTOΔIAΘEΣIMOΓENETIKOYΛIKOΔENEINAIΔIAΘEΣIMOΣEΠOΣOTHTEΣIKANEΣΠPOΣ

ANAΛYΣH;

ΦTIAXNOYMEΠEPIΣΣOTEPOΜΕΤΗΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ

ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ(PCR)


PCR– Η ενίσχυσητουDNAinvitro


ΗσημασίατηςθερμικήςσταθερότηταςτηςDNAπολυμεράσης στηδιαδικασίατηςPCR

Πολυμεράση 3’->5’εξωνουκλεάση

Πηγήκαιιδιότητες

Taq όχι ΠροέρχεταιαπότοThermus aquaticus.Οχρόνοςημιζωής τηςστους95˚Cείναι1,6ώρες

Pfu ναι ΠροέρχεταιαπότοPyrococcus furiosus.Κάνει τα λιγότερα λάθη σε σχέση µε τις υπόλοιπες θερµοσταθερές DNAπολυµεράσες

Vent ναι ΠροέρχεταιαπότοThermococcus litoralis (είναι γνωστή και ως Tliπολυµεράση). Ο χρόνοςημιζωής τηςστους95˚Cείναιπερίπου7ώρες


ΟκύκλοςτηςτεχνικήςPCR


ΠολλαπλασιασμόςτουDNAμεPCR


ΕκθετικήαύξησητουDNAκατάτηνPCR


ΜοριακήδιαγνωστικήμεPCR


ΜοριακήδιαγνωστικήμεPCRστηνιατροδικαστική

ηλεκτροφορητική ανάλυσηεκκινητέςPCR

ομόλογαχρωμοσώματα

πατρικό

μητρικό

ΕπαναλλαμβανόμενεςαλληλουχίεςσεθέσηVNTR

άτομο A άτομο B άτομο C άτομο F

αριθμό

ςεπα

ναλήψεω

ν

Ηλεκτροφ

όρησ

η

3ζεύγηομ

όλογωνχρωμο

σωμά

των

Ηλεκτροφ

όρησ

η

VNTR:VariableNumberTandemRepeat(Μεταβλητόςαριθμόςιαδοχικώνεπαναλήψεων)


AνίχνευσηHIVμεRT-PCR

δείγμααίματοςαπόμολυσμένο

άτομο

ελάχισταιοσωμάτια HIVστονορότουμολυσμένουατόμου

Απομάκρυνσητωνκυττάρωνμεφυγοκέντρηση

Εκχύλισητουιικού RNA

γονιδιώματος

Αντίστροφημεταγραφή/ενίσχυσημε

PCR

Ηλεκτροφόρηση σεπηκτή

αίμαμημολυσμένουατόμου

χρησιμοποιείταιωςαρνητικόςμάρτυρας


XρήσηRT-PCRμεπολλαπλούςεκκινητέςστημοριακήδιαγνωστικήμιάςιογενούςνόσου


HPCRστηνκλωνοποιησηDNAκαιRNAκύτταρα

απομόνωσηRNAαπομόνωσηDNA

DNAπουθακλωνοποιηθεί

mRNAπουθακλωνοποιηθεί

Αποδιάταξη DNA/ προσθήκηεκκινητών

ΕνίσχυσημεPCRΕνίσχυσημεPCR ΕνίσχυσημεPCR

Αποδιάταξη αλυσίδων&προσθήκη2ου εκκινητή

Προσθήκη1ου εκκινητή,αντίστροφηςμεταγραφάσης

καινουκλεοτιδίων

ΕνίσχυσημεPCR

γενωμικοίκλώνοι

cDNAκλώνοι


ΧρήσητηςPCRπραγματικούχρόνουγιαποσοτικέςμετρήσειςγενετικούυλικού


ΜοριακοίφάροιστηνPCRπραγματικούχρόνου


Kατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεσηπλασμιδιακός φορέας

συνθετικόολιγονουκλεοτίδιο/εκκινητής πουφέρειτηνεπιθυμητήμετάλλαξη

αποδιάταξηαλυσίδωνDNA

κλωνοποιημένο φυσιολογικόγονίδιο

ΟλοκλήρωσητηςσύνθεσηςμεχρήσηDNAπολυμεράσης και

DNAλιγάσης

ΕισαγωγήσεκύτταραΑντιγραφήκαιαπομόνωσηστα

θυγατρικάκύτταρα

μεταγραφή μεταγραφή

μετάφραση μετάφραση

ταμισάκύτταραπαράγουνφυσιολογικήπρωτεΐνη

ταμισάκύτταραπαράγουνμεταλλαγμένηπρωτεΐνηπουφέρει

αλλαγήσεένααμινοξύ


Eισαγωγή κατευθυνόμενωντροποποιήσεωνστογενετικόυλικό

ΦυσιολογικόγονίδιοΧ

Μόνοτομεταλλαγμένογονίδιοεκφράζεται

Προσθήκηγονιδίου

Απαλειφήγονιδίου

Αντικατάστασηγονιδίου

Δενυπάρχεικανέναενεργόγονίδιο

Εκφράζεταικαιτοφυσιολογικόκαιτομεταλλαγμένογονίδιο


Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικώνθηλυκόποντίκι

τροποποιημένογονίδιομεμεθόδουςγενετικήςμηχανικής

ES κύτταρασταοποίαένααπόταδύοαντίγραφατουγονιδίουέχειαντικατασταθείμετην

μεταλλαγμένημορφή

εισαγωγήτροποποιημένουγονιδίουστακύτταρα

τακύτταρασχηματίζουναποικίες

Απομονωμένοπρώιμοέμβρυο

ζευγάρωμακαιαναμονήγια3μέρες

ΈνεσηκυττάρωνESστο πρώιμοέμβρυο

πρώιμοέμβρυοπουσχηματίσθηκεμερικώςκαιαπό

κύτταραES

εισαγωγήεμβρύουσεψευδο-εγκύους

ποντικούς

αναζήτησησπάνιωναποικιώνπουπεριέχουντο

τροποποιημένογονίδιο

Διαγονιδιακός ποντικόςμεγαμετικάκύτταραταοποίαπεριέχουνκαιτροποιημένααντίγραφατουγονιδίου-στόχου

ελέγχεταιηπαρουσίατουτροποποιημένουγονιδίουσεσωματικάκύτταρααπογόνωνκαιοιθετικοίαπόγονοιδιασταυρώνονται

Γέννηση


Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας

Lectures 2-4 Pharm Biotech 2016users.auth.gr/pchristo/teaching/Lectures 2-4_Pharm... ·...

Documents

Transcript of Lectures 2-4 Pharm Biotech 2016users.auth.gr/pchristo/teaching/Lectures 2-4_Pharm... ·...