ÉLECTROPHORÈSE

A. Théorie

- l’électrophorèse, la migration d’un ion dans un champ électrique, est utilisée dans les séparations analytiques des molécules biologiques

-

selon les lois de l’électrostatique, la force électrique, Félectrique

, sur un ion avec une charge q dans un champ électrique d’intensité, E, est:

Félectrique

= qE

-

la migration électrophorétique

de l’ion à

travers la solution est opposée par une force de friction: Ffriction

= vf

où

v représente la vitesse de migration et f son coefficient de friction

-

le coefficient de friction donne une mesure de la résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration

-

ceci dépend de la taille, la forme, et l’état de solvatation de l’ion ainsi que de la viscosité

de la solution

-

dans un champ électrique constant, les forces sur l’ion vont s’égaliser et :

qE

= v f

---

-

donc, chaque ion se déplace avec une vitesse caractérisée par une mobilitéélectrophorétique, µ, définie par : µ

= v / E = q / f

-

cette équation indique que les protéines à

leur point isoélectrique (où

q=0)possèdent une mobilité

électrophorétique

nulle

-

-

la méthode d’électrophorèse la plus couramment utilisée est celle de l’électrophorèse en zones

•

technique dans laquelle l’échantillon est contraint à

se déplacer dans une phase solide, comme le papier filtre, la cellulose, ou d’un gel

-

par cette technique

1) on élimine largement l’agitation provoquée par la convection, un facteur limitant du point de vue résolution.

2) en plus, cette technique requiert une quantité

faible de matériel

permettant ainsi la migration des composantes en bandes discrètes.

B. Électrophorèse sur gel

-

constitue la technique parmi les plus puissantes et les plus faciles à

utiliser dans laséparation des macromolécules

-

les gels d’usage commun, l’agarose

et le polyacrylamide, possèdent des pores dela taille des protéines à

séparer

-

-

la séparation moléculaire est basée non seulement sur la mobilitéélectrophorètique

des molécules, mais aussi sur le principe de filtration sur gel

-

les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille plus grande, ce qui est l’inverse de la filtration par gel.

-

ceci est dû

au fait que dans la filtration par gel, il y a des espaces pour

le solvant entre les billes de gel, ce qui n’existe pas dans l’électrophorèse sur gel

-

ce qui fait que la migration des molécules larges est donc retardée par rapport aux molécules plus petites

B.1

Électrophorèse en gel de polyacrylamide

-

aussi appelé

PAGE

(pour PolyAcrylamide

Gel Electrophoresis),

-

les gels sont fabriqués à

partir d’une polymérisation radicalaire d’acrylamideet N,N’-méthylènebisacrylamide dans un tampon

-

avant que le mélange réactionnel n’ait durci, il est coulé

dans un récipient formépar deux plaques de verres et polymérisera en une couche mince de gel de quelquesmillimètres

Figure 1

- Les échantillons sont déposés dans des puits préformés au sommet du gel

- le tampon est le même dans les réservoirsdu haut et du bas (pH ~9 pour que toutesles protéines aient une charge négative)

-

un courant continu de 100 à

200 volts parcourt le gel pendant la durée demigration

-

les protéines migreront versl’anode (+) selon leur ratiocharge/masse

-

après migration, le gel est retiré

et lesbandes de protéine sont visualisées (voir pages suivantes)

•

dans ce type de gel, plus le gel est long,meilleure est la finesse des bandes et larésolution

Gel de polyacrylamide

Figure 2

-

afin d’augmenter la résolution et donc restreindre les protéines dans des bandes plus minces, le gel peut être modifié

en utilisant deux gels dans des tampons différents:

-

un gel de séparation (running gel),

préparé

comme le gel précédent -

un gel de concentration (stacking

gel),

qui surmonte le gel de séparation et qui est de plus haute porosité

-

le tampon dans le réservoir du bas etcelui du gel de séparation sontidentiques

-

le tampon du gel de concentrationpossède un pH ~ 2 unités de moins.

-

le pH du tampon dans le réservoirsupérieur doit contenir un acidefaible (typiquement de la glycine,pKa

= 9.78) et son pH est ajusté

prèsde celui du réservoir inférieur

B.2 Électrophorèse en pH discontinu

Figure 3

-

quand le courant est branché, les ions du tampon du réservoir supérieur migrent dansle gel de concentration

- les ions du réservoir supérieur rencontrent un pH inférieur à

leur

pKa

(pH< 9.8) -

par conséquent l’acide faible (glycine) devient neutre et électrophorétiquementimmobile

- ceci produit une déficience en transporteurs de charges

et la production d’une haute résistance électrique, R, qui à

cause un courant constant imposé, I, résulte selon la loi d’Ohms (E=IR) en un champ électrique (E) très élevé.

-

ce champ électrique plus fort fait en sorte que les protéines migrent plus rapidement dans le gel de concentration

-

quand les anions atteignent le gel de séparation (où

le pH est supérieur au pKa

dela glycine), les ions du tampon retrouvent leur charge

-

les protéines ralentissent vu qu’il n’y a plus de déficience en ions à

cet endroit.

-

cet effet a comme résultat de comprimer les protéines en bandes très

minces(~ 0.01mm) et ordonnées selon leur mobilité

lorsqu’elles entrent dans le gel de séparation

-

ce qui minimise la diffusion dispersive des protéines

-

-

quand les protéines entrent dans le gel de séparation, elles sont retardées selonleurs tailles par l’effet de filtration du gel:

-

petites protéines migrent plus rapidement-

grosses protéines migrent plus lentement

-

puisque le pH du tampon de séparation est plus élevé, les ions du tampon du reprennent leur propre charge quand ils pénètrent le gel de séparation

-

la déficience en transporteurs de charges a donc disparu et à

partir de ce point la séparation électrophorètique

procède de façon normale

-

l’important est que la réduction dans les bandes macromoléculaires en rentrant dans le gel de séparation augmente de façon très significative la résolution

du point de vue de la séparation des macromolécules

C. Gels SDS-PAGE

-

la méthode la plus répandue parmi les techniques biochimiques afin de déterminer la pureté

d’une protéine

-

cette technique dépend du fait que certains savons ou détergents, par le biais de leurs interactions hydrophobes, sont capables de dénaturer la structure d’une protéine

-

le sodium dodecyl

sulfate

(SDS) représente un des détergents les plus puissants àcet égard (formule chimique du SDS: [CH3

- (CH2

)10

– CH2

– O – SO3-]Na+

)

-

le SDS se lie de façon importante aux protéines; une concentration de 0.1% dodecyl

sulfate est suffisante pour saturer par sa liaison avec une chaîne polypeptide à

un taux de 1 molécule de détergent par 2 résidus d’acides aminés

-

en présence de SDS, les protéines contenant des sous-unités sont désunies et lachaîne polypeptide de chaque sous-unité

adopte une conformation étendue

Figure 4

-

la forte charge négative globale apportée par le SDS masque la charge intrinsèque des protéines

-

par conséquence le rapport charge/masse sera le même pour toutes les protéines de même masse

et la séparation électrophorétique

du gel avec du SDS dépendra uniquement du phénomène de gel-filtration par les pores du gel

-

cette méthode donne la meilleure

résolution et les bandes sont les plus résolues de toutes les méthodes d’analyse

-

en utilisant des marqueurs de poids moléculaires connus, il est possible de calibrer la migration sur gel par rapport aux poids moléculaires

-

il a été

démontré

qu’on peut obtenir une relation linéaire entre la mobilitéélectrophorétique

et le logarithme du poids moléculaire

(Figure 5)

-

cette méthode possède deux grands avantages par rapport à

l’électrophorèse ordinaire :

-

1) l’utilisation de SDS dissous les agrégats

et les particules insolubles qui peuvent -

causer des problèmes en bloquant les pores du gel

2) la mobilité

électrophorétique

possède une relation directe avec le poids moléculaire

Figure 5

Relation entre les masses moléculaires desprotéines et leur mobilité

électrophorétique

Résumé

de l’électrophorèse avec un gel contenant du SDS

Figure 6

Visualisation des protéines dans les gels

-

une fois que la migration des protéines dans le gel est terminée, il faut visualiserles bandes obtenues par les protéines

- les différentes approches sont:

-

la coloration avec le bleu de Coomassie

brillant

(Figure 7A)

-

la coloration au nitrate d’argent

(Figure 7B)

-

autoradiographie

(si les protéines sont marquées avec un isotoperadioactif comme le S35

ou le C14)

- ces approches vont cependant détecter toutes les protéines sur le gel.

-

une approche plus spécifique consiste à

détecter la protéine d’intérêt avec unanticorps qui reconnaît cette protéine -> par

immunobuvardage

ou "Western blot"

Figure 7

Coloration au Bleu de Coomassie

brillant Coloration au nitrate d’argent

Coloration de gels de protéines

A B