Le rôle du système mélanocortine dans le contrôle de l'activité thermogène du tissu adipeux...

I

Le rôle du système mélanocortine dans le contrôle de l’activité thermogène du tissu adipeux brun.

Thèse

Boris Monge Roffarello

Doctorat en neurobiologie Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

© Boris Monge Roffarello, 2015

III

Résumé

L’obésité se caractérise par un excès de masse adipeuse corporelle. Elle est due à un

déséquilibre de la balance énergétique qui dépend de l’apport énergétique et les dépenses

énergétiques, notamment via la thermogenèse du tissu adipeux brun (brown adipose tissue —

BAT). Le BAT est sous l’influence de différents systèmes de neurotransmetteurs au sein du

système nerveux central et en particulier au niveau de l’hypothalamus par le système

mélanocortines (SM). Cependant, le rôle du SM dans l’hypothalamus sur le contrôle du BAT

reste à éclaircir. Les travaux présentés dans cette thèse visaient à i) montrer que le noyau

paraventriculaire de l’hypothalamus (PVH) est au centre de la modulation des effets du SM sur la

thermogenèse du BAT par le système endocannabinoïde (SE) et ii) mettre en évidence que le

noyau préoptique médial (MPO) est un site d’activation de la thermogenèse par les

mélanocortines dépendant d’un relais dans le noyau dorsomédian de l’hypothalamus (DMH).

Nous avons observé que l’injection intra-cérébro-ventriculaire de MTII, un agoniste des

récepteurs aux mélanocortines, augmente la dépense énergétique via la thermogenèse du BAT.

D’autre part, les effets du MTII sur le BAT sont inhibés ou partiellement potentialisés par

l’injection respective d’un agoniste (Δ9-THC) ou d’un antagoniste (AM251) du SE. Par la suite,

nous avons mis en évidence que ces observations font intervenir spécifiquement le récepteur aux

mélanocortines 4 et le récepteur aux cannabinoïdes de type 1. Enfin, notre étude a montré que des

neurones du PVH co-expriment ces deux récepteurs et que les effets sur la thermogenèse de

l’injection de MTII dans le PVH, sont totalement inhibés par l’administration de Δ9-THC dans le

4éme ventricule, suggérant donc, que la modulation du SM par le SE a lieu au sein de neurones du

PVH projetant vers la moëlle épinière. D’autre part, l’injection de MTII dans le MPO stimule la

thermogenèse du BAT. Toutefois, des lésions du DMH causées par l’acide kaïnique inhibent les

effets du MTII. De plus, l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme du tissu adipeux

blanc inguinal est stimulée par le MTII, mais seulement chez les rats lésés. Ces résultats

permettent donc d’établir que le duo MPO-DMH est une cible importante dans la modulation de

l’homéostasie énergétique par les mélanocortines. L’ensemble de ces résultats montre le rôle

majeur du SM au sein de l’hypothalamus dans le contrôle de l’activité thermogène du BAT.

Cependant, la compréhension des réseaux neuronaux impliquant le SM et ses co-régulateurs reste

à éclaircir avant d’envisager un traitement thérapeutique de l’obésité via le SM.

V

Abstract

Obesity is characterized by an adiposity excess. It is due to an imbalance between energy

intake and energy expenditure, which includes a few components including brown adipose tissue

(BAT) thermogenesis. BAT is controlled by different neuronal systems of the central nervous

system, including the melanocortin system (MS). However, the role of the hypothalamic

melanocortin system in the control of BAT thermogeneis remains unclear. The studies presented

in this thesis were designed to study i) that the paraventricular nucleus of the hypothalamus

(PVH) is central for modulating the effects of MS on BAT thermogenesis by the

endocannabinoid system (ES) and ii) to highlight the influence of the medial preoptic nucleus

(MPO) as a site of the thermogenic action of MS and exploring the role played by the

dorsomedial nucleus of the hypothalamus (DMH) in this action.

We observed that intracerebroventricular (i.c.v) injection of melanocotin II (MTII), a

melanocortin receptor agonist, increased energy expenditure through BAT thermogenesis. The

MTII effects on BAT were inhibited or partially potentiated by an injection of ES agonist (Δ9-

THC) or antagonist (AM251) respectively. Subsequently, we demonstrated that the melanocortin

4 receptor and the cannabinoid receptor type 1 were specifically involved in these observations.

Finally, our study showed that PVH neurons co-expressed both these receptors and the effects on

thermogenesis of the MTII injection into the PVH were completely inhibited by the

administration of Δ9-THC in the 4th ventricle, suggesting that the modulation of MS by the ES

occurred through PVH neurons projecting to the spinal cord. On the other hand, the injection of

MTII in MPO stimulated BAT thermogenesis. Nonetheless, DMH lesions caused by kainic acid

inhibited the effects of MTII. Furthermore, the gene expression involved in inguinal white

adipose tissue metabolism were stimulated by MTII, but only in lesioned rats. These results

indicate that the MPO-DMH duet is an important target in the modulation of energy homeostasis

by the melanocortins. All of these results show the major role of MS within the hypothalamus in

the control of BAT thermogenic activity. However, understanding of neural networks involving

the MS and its co-regulators remains to be clarified before considering therapeutic treatment of

obesity through the activation of MS.

VII

Tables des matières

RESUME ....................................................................................................................................................... III

ABSTRACT .................................................................................................................................................... V

TABLES DES MATIERES ........................................................................................................................ VII

LISTE DES TABLEAUX .............................................................................................................................. XI

LISTE DES FIGURES ............................................................................................................................... XIII

LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................................... XV

REMERCIEMENTS ................................................................................................................................... XXI

AVANT-‐PROPOS .................................................................................................................................. XXIII

INTRODUCTION .......................................................................................................................................... 1 1 LA REGULATION DE L’HOMEOSTASIE ENERGETIQUE. ...................................................................................... 5

1.1 Les signaux périphériques régulant l’homéostasie énergétique. ............................................. 6 1.1.1 Les signaux sensoriels et la phase céphalique. ......................................................................................................... 8 1.1.2 L’effet des signaux digestifs et des métabolites sur la prise alimentaire. ..................................................... 8

1.1.2.1 Les signaux gastro-‐intestinaux. ............................................................................................................................. 9 1.1.2.2 L’effet des métabolites. .......................................................................................................................................... 11

1.1.3 Les signaux postprandiaux. ............................................................................................................................................ 13 1.1.3.1 L’insuline. ..................................................................................................................................................................... 13 1.1.3.2 La leptine. .................................................................................................................................................................... 14

1.2 La régulation centrale de l’homéostasie énergétique. ............................................................... 15 1.2.1 Le rôle de l’hypothalamus dans l’homéostasie énergétique. ........................................................................... 15

1.2.1.1 Les neurones de premier ordre du noyau arqué. ....................................................................................... 17 1.2.1.2 Les neurones de second ordre. ........................................................................................................................... 21

1.2.2 Le rôle du NTS dans la régulation de l’homéostasie. .......................................................................................... 23 1.2.2.1 Le NTS est le centre de l’activité du SNA. ....................................................................................................... 24 1.2.2.2 Les interactions du NTS et de l’hypothalamus dans la régulation de l’homéostasie. ................. 24

2 LA THERMOGENESE DU TISSU ADIPEUX BRUN. .............................................................................................. 27 2.1 Le tissu adipeux brun. ............................................................................................................................... 28

2.1.1 Les caractéristiques du tissu adipeux brun. ........................................................................................................... 28 2.1.1.1 Origine et développement du tissu adipeux brun. ..................................................................................... 28 2.1.1.2 Localisation du tissu adipeux brun chez le rat et l’homme. ................................................................... 31 2.1.1.3 Le secrétome du tissu adipeux brun. ............................................................................................................... 31 2.1.1.4 Les adipocytes beiges. ............................................................................................................................................ 33 2.1.1.5 La lipogenèse et la lipolyse une compétence commune à tous les adipocytes. ............................. 33

VIII

2.1.2 Les mécanismes cellulaires permettant la production de chaleur. .............................................................. 35 2.1.2.1 L’activation de l’adipocyte brun : la cascade adrénergique. .................................................................. 35 2.1.2.2 Les mécanismes de l’activité thermogène. .................................................................................................... 38 2.1.2.3 Les mécanismes de la capacité thermogène. ................................................................................................ 39 2.1.2.4 Les facteurs endocriniens périphériques influençant l’adipocyte brun. .......................................... 40

2.2 Le contrôle central de l’activité thermogène du tissu adipeux brun. .................................. 42 2.2.1 Le contrôle central du tissu adipeux brun lors de la thermorégulation. .................................................... 42

2.2.1.1 Les afférences de la perception thermique cutanée et centrale. ......................................................... 43 2.2.1.2 Les mécanismes hypothalamiques impliqués dans le contrôle du BAT. .......................................... 45 2.2.1.3 Le système nerveux sympathique. .................................................................................................................... 48

2.2.2 Les autres mécanismes impliqués dans le contrôle central de l’activité du iBAT. ................................. 50 2.2.2.1 Rythme ultradien et stress : rôle de l’orexine. ............................................................................................. 50 2.2.2.2 La fièvre. ....................................................................................................................................................................... 51 2.2.2.3 L’hypoglycémie ......................................................................................................................................................... 52 2.2.2.4 L’hypoxie. ..................................................................................................................................................................... 52

3 IMPLICATION DU SYSTEME MELANOCORTINE DANS LA REGULATION DE L’HOMEOSTASIE

ENERGETIQUE : SON ROLE DANS LA THERMOGENESE. ...................................................................................................... 55 3.1 Le système mélanocortine. ..................................................................................................................... 55

3.1.1 Ses principaux acteurs. .................................................................................................................................................... 55 3.1.1.1 Localisation et synthèse des ligands endogènes. ....................................................................................... 55 3.1.1.2 Localisation et fonction des récepteurs. ......................................................................................................... 56

3.1.2 Ses partenaires dans le contrôle de la prise alimentaire. ................................................................................. 58 3.1.2.1 L’effet de la leptine et de l’insuline sur l’expression de la POMC. ....................................................... 58 3.1.2.2 Les endocannabïnoides. ........................................................................................................................................ 59

3.2 La thermogenèse induite par l’alimentation ................................................................................. 60 3.3 La mise en évidence de l’implication du système mélanocortine dans le contrôle de la

thermogenèse. ...................................................................................................................................................................... 61 3.3.1 Les évidences génétiques ................................................................................................................................................ 62 3.3.2 Les évidences pharmacologiques. ............................................................................................................................... 62 3.3.3 Les évidences anatomo-‐fonctionnelles. .................................................................................................................... 63

PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS GENERAUX DES TRAVAUX. ................................................... 67 Problématique. ........................................................................................................................................................................ 69 Objectifs généraux des travaux. ....................................................................................................................................... 71 Objectifs spécifiques. ............................................................................................................................................................ 71

CHAPITRE 1 ............................................................................................................................................... 73

THE CANNABINOID RECEPTOR 1 IS INVOLVED IN THERMOGENESIS INDUCED BY THE

BRAIN STIMULATION OF THE MELANOCORTIN-‐4 RECEPTOR IN MALE RATS. .............................. 75

IX

Résumé ....................................................................................................................................................................................... 77 Abstract ...................................................................................................................................................................................... 79 Introduction ............................................................................................................................................................................. 81 Research Design and Methods ......................................................................................................................................... 83 Results ......................................................................................................................................................................................... 91 Discussion ................................................................................................................................................................................. 93 Acknowledgements ............................................................................................................................................................... 95 References ................................................................................................................................................................................. 97 Tables ........................................................................................................................................................................................ 103 Figure Legends ...................................................................................................................................................................... 105 Figures ...................................................................................................................................................................................... 109

CHAPITRE 2 ............................................................................................................................................ 117

THE MEDIAL PREOPTIC NUCLEUS AS A SITE OF THE THERMOGENIC AND METABOLIC

ACTIONS OF MELANOTAN II IN MALE RATS. ........................................................................................... 119 Résumé ..................................................................................................................................................................................... 121 Abstract .................................................................................................................................................................................... 123 Introduction ........................................................................................................................................................................... 125 Research Design and Methods ....................................................................................................................................... 127 Results ....................................................................................................................................................................................... 131 Discussion ............................................................................................................................................................................... 133 Acknowledgements ............................................................................................................................................................. 137 References ............................................................................................................................................................................... 139 Tables ........................................................................................................................................................................................ 143 Figure Legends ...................................................................................................................................................................... 145 Figures ...................................................................................................................................................................................... 147

DISCUSSION GENERALE, PERSPECTIVES DE RECHERCHE ET CONCLUSION. ..................... 151 Chapitre 1 ................................................................................................................................................................................ 153 Chapitre 2 ................................................................................................................................................................................ 157 Perceptives de recherche et conclusion ..................................................................................................................... 161

REFERENCES. .......................................................................................................................................... 165

XI

Liste des tableaux

Introduction.

Tableau 1: Principaux facteurs hypothalamiques impliqués dans la régulation de l’homéostasie

énergétique. ............................................................................................................................ 18

Tableau 2: Résumé des principales fonctions, sites d’expression et de l’affinité des ligands pour

les récepteurs aux mélanocortines. ......................................................................................... 57

Chapitre 1.

Table 1: qPCR gene information. ................................................................................................. 103

Table 2: probes characterizations. ................................................................................................ 103

Chapitre 2.

Table 1: qPCR gene information. ................................................................................................. 143

Table 2: Effects of MTII infusion in MPO on blood variation of insulin, NEFA and triglycerides

in DMH-lesioned rats. .......................................................................................................... 144

XIII

Liste des Figures

Introduction.

Figure 1: Régulation de l’homéostasie énergétique. ........................................................................ 6

Figure 2: Représentation spatiotemporelle des différentes phases d’un cycle de prise alimentaire.6

Figure 3: Modèle d’intégration des signaux d'adiposité et de satiété. .............................................. 7

Figure 4: Section sagittale du cerveau de rat montrant l'emplacement de l'hypothalamus. ........... 16

Figure 5: Représentation tridimensionnelle de l'hémisphère droit de l'hypothalamus du rat. ....... 16

Figure 6: La régulation centrale de la balance énergétique. ........................................................... 26

Figure 7: Representation schématique de la différenciation des adipocytes. ................................. 30

Figure 8: Localisation du tissu adipeux brun chez le rat et l’homme. ........................................... 33

Figure 9: L’activation de l’adipocyte brun. .................................................................................... 36

Figure 10: Représentation de la circuiterie neuronale contrôlant l’activité du iBAT. ................... 42

Chapitre 1.

Figure 1: Experimental protocol. ................................................................................................. 109

Figure 2: Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on whole body thermogenesis. . 110

Figure 3: Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT thermogenesis, whole

body thermogenesis and metabolic activity. ........................................................................ 111

Figure 4: Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT gene expression. ........ 112

Figure 5: Effect of HS024 or Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT thermogenesis,

whole body thermogenesis and metabolic activity. ............................................................. 113

XIV

Figure 6: Colocalization of MC4R with CB1 and VGLUT2 mRNA in the PVH. ...................... 114

Figure 7: Effect of Δ9-THC on the PVH MTII infusion effect on iBAT thermogenic activity and

capacity. ................................................................................................................................ 115

Chapitre 2.

Figure 1: Histological verification. .............................................................................................. 147

Figure 2: Effects of the MPO infusion of MTII in Sham- and DMH-lesioned rats on iBAT and

whole body thermogenesis. .................................................................................................. 148

Figure 3: Effects of the MPO infusion of MTII on iBAT, iWAT, liver and heart metabolic

activity in Sham- and DMH-lesioned rats. ........................................................................... 149

Figure 4: Effects of the MPO infusion of MTII on iBAT and iWAT gene expression in Sham-

and DMH-lesioned rats. ....................................................................................................... 150

XV

Liste des abréviations

Abréviation Définition

2-AG 2-Arachidonylglycerol

α-MSH Alpha-melanocyte-stimulating hormone

β-MSH Beta-melanocyte-stimulating hormone

γ-MSH Gamma-melanocyte-stimulating hormone

Δ9-THC Delta-9-tetrahydrocannabinol

ACC Acétyl-coenzyme A carboxylase

aCSF Artificial cerebrospinal fluid

ACTH Adrénocorticotrophine

ADRB3 Récepteur β-3 adrénergique

ADP Adénosine diphosphate

AEA Anandamide

AGL Acides gras libres

AGLC- AGL à longue chaine chargée négativement

AGPAT Acylglycérol-phosphate acyltransférase

AgRP Agouti-releated peptide

ALP Acide lysophosphatidique

AMPc Adénosine monophosphate cyclique

ANP Atrial natriuretic peptide

AP Area postrema

APp Acide phosphatidique

ARC Noyau arqué de l’hypothalamus

ARN Acide ribonucléique

XVI

ARNm ARN messager

ATF2 Activating-transcription factor-2

ATGL Lipase des TG du tissu adipeux

ATP Adénosine triphosphate

BAT Tissu adipeux brun

BDNF Brain-derived neurotrophic factor

BMP-7 Bone morphogenetic protein-7

BMP-8b Bone morphogenetic protein-8b

BNP Brain-derived natriuretic peptide

C/EBPβ CCAAT/enhancer-binding protein-β

CART Cocaine- and amphetamine- regulated transcript

CB1 Récepteur aux cannabinoïdes de type 1

CCK Cholécystokinine

CNP C-type natriuretic peptide

CPT1β Carnitine palmitoyl transférase 1β

CRE cAMP response element

CRH Corticotropin-releasing hormone

DG Diglycéride

DGAT Diacylglycérol acyltransférase

DIO2 Deiodinase iodothyronine 2

DMH Noyau dorsomédian de l’hypothalamus

DPP-4 Dipeptidyl-peptidase 4

En1 Engrailed-1

EP3-R Récepteur 3 aux prostaglandines E

XVII

FADH2 Flavine adénine dinucléotide H2

FAS Acides gras synthetase

FATP1 Protéine transporteuse d’acide gras 1

FDG Fluoro-deoxyglucose

FGF-2 Fibroblast growth factor-2

FGF-21 Fibroblast growth factor-21

FOXC2 Forkhead box C2

FOXO1 Forkhead box containing protein 1

G3P Glycerol-3-phosphate

GHS-R Récepteur de la ghréline

GLP-1 Glucagon-like peptide 1

GLUT4 Transporteur au glucose de type 4

GPAT Glycérol-phosphate acyltransférase

H+ Protons

HSL Lipase sensible aux hormones

iBAT BAT interscapulaire

i.c.v. Intra-cérébro-ventriculaire

IGF-1 Insulin-like growth factor-1

IL-6 Interleukine-6

IML Colonne intermediolatérale de la moelle épinière

INS-R Récepteur de l’insuline

Jak2 Janus kinase 2

L-PGDS Lipocalin prostaglandin D synthase

LCR Liquide céphalorachidien

XVIII

LHA Aire latérale de l’hypothalamus

LPS Lipopolysaccharide

MAG Monoacylglycérol

MC3/4R Récepteurs aux mélanocortines 3 et 4

MCH Melanin-concentrating hormone

MCR Récepteurs aux mélanocortines

MGL Lipase du monoacylglycérol

MnPO Noyau préoptique médian

MPO Noyau préoptique médial

MTII Melanotan-II

MVL Médulla ventrolatérale

MVMR Médulla ventromédiale rostrale

Myf5 Facteur myogénique 5

NA Noradrénaline

NADH, H+ Nicotinamide adénine dinucléotide H, H+

NMDA Acide N-méthyl-D-aspartique

NPY Neuropeptide Y

NRF1 Nuclear respiratory factor 1

NRF2 Nuclear respiratory factor 2

NTS Noyau du tractus solitaire

OXM Oxyntomoduline

PAG Substance grise périaqueducale

PBL Noyau parabrachial latéral

PBLd PBL dorsal

XIX

PBLle PBL latéral externe

PC Pro-hormones convertases

PGC1α PPAR-γ co-activator 1α

PGE2 Prostaglandine

PKA Protéine kinase A

PLA2 Phospholipase A2

PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase

PNs Peptides natriurétiques

POMC Pro-opiomélanocortine

PP Polypeptide pancréatique

PPAR-γ Peroxisome-proliferator-activated receptor-γ

PPRE PPAR response element

pRB Retinoblastoma protein

PRDM16 PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain-containing-16

pSTAT-3 Phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3

PVH Noyau paraventriculaire de l’hypothalamus

PYY Peptide YY

PYY (1-36) Peptide YY (1-36)

PYY (3-36) Peptide YY (3-36)

RARE Retinoic acid response elements

RBP-4 Retinol-binding protein-4

RIP40 Receptor-interacting protein 140

RPa Noyau du raphé pallidus

RPar RPa rostral

XX

SNA Système nerveux autonome

SNC Système nerveux central

SNS Système nerveux sympathique

T3 Triiodothyronine

T4 Thyroxine

TEP Tomographie par émission de positrons

TG Triglycéride

TIA Thermogenèse induite par l’alimentation

TRE Thyroid response element

TRH Thyrotropin-releasing hormone

TRP Transient receptor potential family of cation channels

UCP-1 Uncoupling protein 1

VEGF-A Vascular endothelial growth factor-A

VMH Noyau ventromédian de l’hypothalamus

Y1 Récepteurs du NPY de types 1



XXI

Remerciements

Je tiens tous d’abord à remercier mon directeur de recherche, le professeur Denis Richard

pour m’avoir accueilli au sein de son équipe de recherche et soutenu lors de mes années d’études

doctorales. J’ai beaucoup apprécié son encadrement bienveillant ainsi que la confiance qu’il m’a

accordée lors de la réalisation de mes travaux. Enfin je le remercie pour ces paroles stimulantes

qui surent m’amener au bout de mon aventure doctorale ; il restera un modèle d’engagement et

d’éthique scientifique.

Je remercie sincèrement le Dr Elena Timofeeva, le Dr David Saint-Pierre et le Dr Yves

Deshaies d’avoir accepté d’examiner cette thèse et de siéger parmi les membres du jury.

J’aimerais remercier particulièrement le Dr Elena Timofeeva pour son soutien et ses conseils lors

de mes travaux et le Dr Yves Deshaies pour ces conseils et son soutien dans mes choix d’avenir

mais aussi pour nos quelques discussions fortement inspirantes sur la place et le rôle d’un

scientifique dans notre société.

Je tiens aussi à remercier chaleureusement et amicalement tous les membres des équipes du

Dr Yves Deshaies, Dr Mathieu Laplante, Dr Fréderic Picard, Dr Elena Timofeeva et Dr Denis

Richard avec qui j’ai eu le grand plaisir de travailler. J’aimerais remercier Julie Plamondon,

Marie Claude Roy, Pierre Samson et Yves Gélinas pour leur soutien et leurs conseils dans mon

travail au laboratoire, pour leur générosité, pour leur accueil et de m’avoir offert leur amitié. Je

remercie aussi Cynthia Bouchard et Audrey Chalifoux pour leur aide à l’animalerie et leurs

sourires. Un grand merci à Annie Moreau pour sa disponibilité et son assistance. J’aimerais par la

suite remercier mes collègues et amis étudiants, à commencer par Alexandre Caron, le Dr

Sébastien Labbé, le Dr Pierre-Gilles Blanchard pour leur aide et leurs précieux conseils. Enfin

pour finir la section collègues de travail, je souhaite remercier plus qu’un collègue, un ami, le Dr

Damien Lanfray, qui m’a apporté son aide et son soutien dans la rédaction de ce manuscrit et

avec qui j’ai partagé en compagnie d’Émilie sa conjointe de nombreux bons moments et bons

repas qui vont me manquer. Merci à vous deux.

Je tiens à remercier mes amis dont certains sont mentionnés ci-dessus et ma famille.

J’exprime toute ma gratitude à mes parents, ma mère et Yann qui m’ont encouragé tout au long

de mes études et de cette aventure. Merci à Estelle et Nicolas qui nous ont permis ces moments

XXII

de détente nécessaire à l’accomplissement d’un doctorat. Enfin, je remercie Agathe ma conjointe,

le mot est faible et je n’aurais pas assez de mots pour lui témoigner toute ma reconnaissance et

mon amour pour être présente à mes cotés. Sans elle rien n’aurait été possible.

Je dédie cette thèse à mon grand-père et ma grand-mère disparus pendant la réalisation de

celle-ci.

XXIII

Avant-propos

Le dépôt de cette thèse à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université

Laval signifie l’évaluation finale en vue de l’obtention du grade de Philosophae doctor ès

Sciences (Ph.D.). Ce manuscrit vise à montrer l’implication du système mélanocortine dans le

contrôle central de l’activité thermogène du tissu adipeux brun. La première section de cet

ouvrage est constituée d’une introduction générale rédigée en français abordant les

caractéristiques du système mélanocortine et des ses partenaires neuronaux impliqués dans la

régulation de la balance énergétique, ainsi que l’innervation sympathique et les caractéristiques

du tissu adipeux brun. Les chapitres 1 et 2 constituent la seconde section, celle-ci s’intéresse aux

travaux dans le domaine sus-cité que j’ai réalisés au cours de ces dernières années dans le

laboratoire de Dr Denis Richard. Étant déjà soumis dans des journaux scientifiques spécialisés

dans le domaine des neurosciences et de la physiologie, ces chapitres prennent la forme d’articles

scientifiques rédigés en langue anglaise, conformément aux exigences éditoriales. La dernière

section de cette thèse discute des résultats, dans le but de démontrer leur nouveauté, leur

pertinence et de proposer de nouvelles orientations de recherche susceptibles de contribuer à

l’avancement des connaissances dans le domaine de la neurobiologie de l’obésité.

Articles présentés

Lors de mon séjour dans le laboratoire du Dr Denis Richard, j’ai eu la chance et le plaisir

d’être sollicité pour contribuer aux travaux de quelques étudiants-chercheurs de talent. Ces

collaborations avec mes collègues ont abouti à la parution de nombreux articles dans des

journaux à fort impact, en plus de diversifier les champs de compétences de chacun d’entre nous.

Cependant, les articles formant le cœur de cette thèse et présentés ici sont l’expression des projets

de recherche pour lesquels j’ai oeuvré à la direction des travaux, de la planification initiale des

hypothèses de travail et des expérimentations à la rédaction, en passant par la mise au point des

protocoles.

La liste des articles qui suit retranscrit mes activités de recherche lors de mes études

doctorales. Les études précédées d'un astérisque et en caractère gras sont celles qui ont été

insérées dans cet ouvrage, elles sont accompagnées d’un avant-propos spécifique aux travaux

qu’elles détaillent.

XXIV

Lanfray, D., Arthaud, S., Ouellet, J., Compère, V., Do Rego, J.-L., Leprince, J.,

Lefranc, B., Castel, H., Bouchard, C., Monge-Roffarello, B., Richard, D., pelletier, G.,

Vaudry, H., Tonon, M-C., Morin, F. (2013). Gliotransmission and Brain Glucose-Sensing:

Critical Role of Endozepines. Diabetes. 62(3):801-10

Lopez, C.A., Guesdon, B., Baraboi, E.-D., Roffarello, B.M., Hétu, M., and Richard,

D. (2011). Involvement of the opioid system in the orexigenic and hedonic effects of

melanin-concentrating hormone. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301, R1105–

11.

Richard, D., Monge-Roffarello, B., Chechi, K., Labbé, S.M., and Turcotte, E.E.

(2012). Control and physiological determinants of sympathetically mediated brown adipose

tissue thermogenesis. Front Endocrinol (Lausanne) 3, 36.

* Monge-Roffarello, B.*, Labbe, S.M.*, Roy, M-C., Lemay, M-L., Coneggo, E., Sanson,

P., Lanfray, D., Richard D. (2014). The cannabinoid receptor 1 is involved in thermogenesis

induced by the brain stimulation of the melanocortin-4 receptor in male rats.

Endocrinology. 155(9): 3448-58.

Les travaux présentés dans ce premier chapitre sont le fruit d’une collaboration de

nombreux membres de l’équipe du Dr Richard : Dr Sébastien M. Labbé (stagiaire postdoctoral),

Marie-Claude Roy (M. Sc., Assistante de recherche), Marie-Laurence Lemay (stagiaire d’été,

étudiante en pharmacologie à l’université Laval), Estelle Coneggo (Stage de fin d’étude,

Étudiante à l’école d’ingénieur polytech de l’université de Nice Sophia Antipolis) et le Dr

Damien Lanfray (Stagiaire postdoctoral). Estelle Coneggo a participé aux expériences

d’injections chroniques, ainsi qu’au soin des animaux de laboratoire nécessaires à ces

expériences. Marie-Laurence Lemay a assuré la préparation logistique et le soin des animaux de

laboratoire nécessaires aux expériences de mesure de température du iBAT et injection de traceur

radioactif. Marie-Claude Roy a apporté sa précieuse aide lors du sacrifice des animaux de

XXV

laboratoire et à la lyse des tissus dans le cadre des mesures de captage de C14-bromopalmitate et

de H3-deoxyglucose. Le Dr Damien Lanfray a participé à la lyse des tissus dans le cadre des

mesures de captage de C14-bromopalmitate et de H3-deoxyglucose, mais a surtout partagé son

savoir-faire dans la quantification d’ARNm. Enfin, le Dr Sébastien M. Labbé c’est très

activement impliqué dans les expériences de mesure de température du iBAT ; il a aussi apporté

son expertise lors des injections de traceurs radioactifs et m’a conseillé tout au long des travaux.

Personnellement, ma participation s’est échelonnée tout au long du projet. J’ai participé à

sa conceptualisation avec le Dr Richard, réalisé les chirurgies stéréotaxiques et les injections

centrales. J’ai aussi eu à développer et mettre au point une méthode fiable afin de mesurer la

température du iBAT, ainsi que des procédures d’hybridation in situ couplées à une

immunohistochimie. Enfin, j’ai participé à l’ensemble des mesures effectuées, à la compilation, à

l’analyse des résultats, et finalement à la rédaction du manuscrit. Les Drs Richard et Labbé m’ont

ensuite fait part de leurs corrections qui ont grandement amélioré le manuscrit, qui a été soumis

en décembre 2013 à la revue Endocrinology. La révision de l’article qui a surtout consisté à

retirer les éléments portant sur la colocalisation de MC4R et de CB1 dans le PVH.

* Monge-Roffarello, B., Labbe, S.M., Lenglos, C., Caron, A., Lanfray, D., Samson, P.,

Richard D. (2014). The medial preoptic nucleus as a site of the thermogenic and metabolic

actions of Melanotan II in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 307(2):

R158-66.

Les travaux présentés dans ce second chapitre sont le fruit d’une collaboration de nombreux

membres de l’équipe du Dr Richard : le Dr Sébastien M. Labbé (stagiaire postdoctoral), Mr

Alexandre Caron (étudiant au doctorat), le Dr Damien Lanfray (Stagiaire postdoctoral) et Mr

Pierre Samson (professionnel de recherche). Mr Pierre Samson a participé à l’étalonnage et à

l’entretien du système permettant d’évaluer la quantité de CO2 exhalée par les animaux lors des

expériences de mesure de température du iBAT et d’injection de traceur radioactif. Le Dr Damien

Lanfray a apporté sa précieuse aide lors de la lyse des tissus dans le cadre des mesures de captage

de 14C-bromopalmitate et de 3H-deoxyglucose, mais a surtout partagé son savoir faire dans la

quantification des ARNm.

XXVI

Personnellement, ma participation s’est échelonnée toute au long du projet. J’ai participé à

sa conceptualisation avec le Dr Richard, réalisé les chirurgies stéréotaxiques et les injections

centrales. J’ai utilisé mes connaissances acquises lors des études réalisées dans le chapitre 1 pour

réaliser l’ensemble des procédures expérimentales chez l’animal de manière autonome. Enfin, j’ai

participé à l’ensemble des mesures effectuées, à la compilation et à l’analyse des résultats, et

finalement à la rédaction du manuscrit dont Mr Alexandre Caron a effectué des relectures qui ont

amélioré la qualité de l’anglais. Par la suite, les Dr Richard et Labbé m’ont fait part de leurs

corrections qui ont grandement amélioré le manuscrit, qui a été soumis en février dernier à la

revue American Journal of Physiology⎯Regulatory, Integrative and Comparative Physiology.

La révision de l’article a consisté à améliorer la figure 1 en ajoutant un gradient de couleur

permettant d’évaluer l’effet de chacun des sites d’injections de Mélanotane II sur l’élévation de la

température du tissu adipeux brun.

1

Introduction

3

L’obésité est définie par un excès de tissu adipeux blanc. Elle a pour origine une

dérégulation à long terme du bilan d’énergie et a des conséquences majeures sur la santé des

sujets atteints. L’obésité a pris une dimension pandémique au cours des 40 dernières années. En

effet, dans les années 70 la prévalence de l’obésité était de 10% au Canada pour atteindre 26% en

2010, une augmentation qui a des conséquences importantes sur la mortalité précoce (environ

20% des cas sont imputables à l’obésité des sujets) et les hospitalisations. Effectivement,

certaines pathologies sont reconnues comme étant une conséquence directe de l’obésité. Parmi

celles-ci, on compte environ 70 % des cas de diabète de type 2, 25 % des cas d’ostéoarthrite, 18

% des cancers colorectaux et 12 % des cas de dépression (Janssen, 2013).

L’augmentation de la prévalence de l’obésité a des conséquences économiques direct et

indirect important. En effet, les patients obèses sont souvent atteints de complications générées

par les facteurs de comorbidités associés aux pathologies citées précédemment, avec pour

conséquence 3,9 milliards de dollars de dépense dans les soins de santé directs en 2006 pour les

hospitalisations, les médicaments, les visites chez le médecin et les services d’urgences. De plus,

Il faut ajouter 3,2 milliards de dollars de coûts indirects reliés à l’incapacité et à la perte de

productivité en raison de la maladie ou de décès prématurés.

Dans ce contexte, l’amélioration du niveau de compréhension des mécanismes qui

aboutissent à la dérégulation du bilan d’énergie apparaît primordiale. La question des

mécanismes contrôlant la prise alimentaire a été largement discutée. Or, celle ayant attrait à la

dépense énergétique fut peu étudiée jusqu'à la mise en évidence de la présence du tissu adipeux

brun (Brown Adipose Tissue — BAT) fonctionnel chez l’adulte, celui-ci participant la

thermogenèse et donc la dépense d’énergie. Il apparaît donc qu’une meilleure compréhension des

mécanismes centraux contrôlant le BAT représente une nouvelle voie de recherche majeure dans

la lutte contre l’obésité.

L’introduction générale de cette thèse se propose donc de s’intéresser à la régulation du bilan

d’énergie, et plus particulièrement au contrôle des deux principaux acteurs qui y participent, la

prise alimentaire et la thermogenèse. Dans les lignes qui vont suivre, nous allons aborder la

régulation du bilan d’énergie, puis nous mettrons l’emphase sur le BAT principal effecteur de la

thermogenèse et son contrôle central lui permettant d’assurer cette fonction. Enfin, nous

détaillerons l’importance du système mélanocortine dans le contrôle de la thermogenèse.

5

1 La régulation de l’homéostasie énergétique.

L’homéostasie énergétique de l’organisme est finement régulée par le contrôle des apports

et de la dépense énergétique. La prise alimentaire constitue l’unique composante de l’apport

exogène tandis que la dépense énergétique correspond à la somme des dépenses liées aux

métabolisme basal, à l’activité physique volontaire et à la thermogenèse (Richard, 2007). Le bilan

énergétique de l’organisme correspond à la différence entre l’apport et la dépense d’énergie.

Ainsi, dans des conditions d’homéostasie énergétique, cette valeur est égale à zéro, on parle alors

de bilan d’énergie nul. Lorsque le bilan d’énergie est positif, c’est-à-dire que l’apport est

supérieur à la dépense énergétique, l’excès calorique est alors stocké sous forme de graisse. Afin

d’éviter l’accumulation excessive de tissu adipeux, des signaux provenant de la périphérie vont

informer le système nerveux central (SNC) du bilan d’énergie et de l’état des réserves de

l’organisme. Par la suite, le SNC et plus particulièrement l’hypothalamus via des neuropeptides

anaboliques et cataboliques ajuste l’apport en énergie. Parallèlement, le système de récompense

réduit la satiété, alors que le système nerveux sympathique (SNS) stimule la thermogenèse, Ainsi,

la complémentarité de ces systèmes permet une régulation fine du poids corporel (Figure 1.).

(tractus((gastro+intes/nal)(Ghréline,(GLP+1(

(pancréas,((Tissu(adipeux)((Insuline,(lep/ne((

Réserves d’énergie (graisse)

Prise alimentaire

Anabolique catabolique NPY(AgRP(MCH(

Endocannabïnoides(

α+MSH(CART(

CRH,(TRH(Sérotonine((

Cerveau Hypothalamus

Système de la récompense Complexe dorso-vagal

(

Environnement

Production de chaleur

gas (Gh ( (Gh ( (

R

chaleg (g (

reg (g (

Prode de

SNS(

Thermogénèse(((BAT,(UCP+1)(

6

Figure 1: Régulation de l’homéostasie énergétique.

Abréviations : α-MSH, Alpha-Melanocyte-Stimulating Hormone; AgRP, Agouti-Releated Peptide;

BAT, tissu adipeux brun; CART, Cocaine- and Amphetamine-Regulated Transcript; CRH, Corticotropin-

Releasing Hormone; GLP-1, Glucagon-Like Peptide 1; MCH, Melanin-Concentrating Hormone; NPY,

Neuropeptide Y; SNS, Système Nerveux Sympathique; TRH, Thyrotropin-Releasing Hormone; UCP-1,

Uncoupling Protein 1. Traduit et adapté de Richard and Boisvert., The neurobiology of obesity, Obesity

supp vol. 14, 2006.

1.1 Les signaux périphériques régulant l’homéostasie énergétique.

Les signaux périphériques régulant l’homéostasie énergétique sont libérés de manière

séquentielle par différents organes durant ou consécutivement à l’ingestion de nourriture. Aussi,

selon le moment où ils sont mis en action, on distingue les stimuli de la phase céphalique

(sensoriels), de la phase gastrique (mécaniques, chimiques et hormonaux) et de la phase

postprandiale (nutriments et hormones) (Berthoud, 2002). (Figures 2 et 3.).

Figure 2: Représentation spatiotemporelle des différentes phases d’un cycle de prise

alimentaire.

Le dégradé de noir et blanc représente l’intensité de la sensation de satiété et de faim.

Abréviation : DR, début du repas; FR, fin du repas; PRC, Phase de réponses céphaliques; PSC,

poursuite de stimulation céphalique. Traduit de (Smeets et al., 2010).

PRC$ PSC$Phase$céphalique$

Phase$gastrique$Inges6on$$$$$$Diges6on$$$$$$$$Absorp6on$Sa6a6on$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$Sa6été$

Faim$

DR$ FR$ DR$FR$ DR$DR$intervalle$entre$les$repas$$

$ striq $

distension$de$l’estomac,$détec6on$des$nutriments$$et$libéra6on$d’hormones$

PRC$ PSC$

La$pensée,$l’an6cipa6on,$la$vision,$l’odorat,$le$gout$et$les$sensa6ons$oropharyngées$$$

7

Figure 3: Modèle d’intégration des signaux d'adiposité et de satiété.

Abréviation : AP, l’area postrema; CCK, la cholécystokinine; GLP-1, Glucagon-Like Peptide 1; NTS, le

noyau du tractus solitaire; OXM, l’oxyntomoduline; PP, le polypeptide pancréatique; PYY (3-36), le

peptide yy (3-36). Traduit de (Wren and Bloom, 2007).

Afférences vagales

Intestin

Pancréas

Tissu adipeux

estomac

étirement

nutriments

Ghréline

insuline

leptine

Adiponectine

Visfatine Resistine

8

1.1.1 Les signaux sensoriels et la phase céphalique.

Avant la phase d’ingestion, les signaux sensoriels visuels, olfactifs, tactiles et gustatifs vont

guider nos choix alimentaires. En effet, au cours de l’apprentissage, ces différents sens font appel

à la partie hédonique du SNC, dans le but d’attribuer une valeur palatable aux aliments. Il a été

montré chez l’humain et d’autres primates que l’information visuelle est intégrée avec les

informations provenant de l’olfaction et du goût pour former des associations polymodales au

niveau du cortex (Berthoud, 2002). De plus, l’activation de ces sens influe sur la physiologie

digestive en permettant d’initier la digestion céphalique, qui prépare le tractus gastro-intestinal,

afin d’optimiser notamment la digestion et l’absorption des nutriments. Enfin, la phase

céphalique permet à l’organisme d’anticiper l’élévation de la glycémie (Smeets et al., 2010), et

intervient également dans l’activation de la thermogenèse (LeBlanc, 2000).

1.1.2 L’effet des signaux digestifs et des métabolites sur la prise alimentaire.

Les signaux digestifs sont secrétés en fonction de la nature physico-chimique du bol

alimentaire. En effet, les caractéristiques physiques du bol alimentaire sont détectées par les

mécanorécepteurs du tube digestif, qui remplissent une fonction très importante dans le contrôle

de la prise alimentaire (Powley and Phillips, 2004). Lors de la distension gastrique, consécutive

au passage du bol alimentaire dans l’estomac, les mécanorécepteurs de la paroi gastrique

stimulent le nerf vague qui communique avec le SNC pour mettre en place une réponse

anorexigène chez le rat (Phillips and Powley, 1996; Berthoud et al., 2001). Ainsi, il a été montré

que l’ingestion d’un bol alimentaire volumineux mais à faible valeur calorique chez l’humain a

un court effet inhibiteur sur la réalimentation (Kral and Rolls, 2004).

Parallèlement, l’intestin est également capable d’intégrer les caractéristiques chimiques du

bol alimentaires. En effet, dans l’intestin les aliments sont dégradés en macro- et

micronutriments, facilement transportables et assimilables par l’organisme. La nature de ces

nutriments peut être détectée grâce à des chémorécepteurs spécifiques présents sur les différents

types de cellules de l’épithélium intestinal (Powley and Phillips, 2004).

L’activation de ces cellules par leur nutriment respectif entraîne une sécrétion d’hormones

anorexigènes (Badman and Flier, 2005) (Figure 3.). D’autre part, les nutriments que sont les

9

métabolites, c’est à dire le glucose, les acides aminés et les acides gras, peuvent agir directement

sur le SNC (Blouet and Schwartz, 2010). De ce fait, l’augmentation de leurs concentrations

plasmatiques, s’accompagne d’une inhibition proportionnelle de la prise alimentaire.

1.1.2.1 Les signaux gastro-intestinaux.

Le tractus gastro-intestinal est l’organe endocrinien le plus volumineux de l’organisme.

Celui-ci synthétise de nombreuses hormones d’environ 10 à 50 acides aminés qui participent au

contrôle de la prise alimentaire et de la dépense énergétique (Lancha et al., 2012). Parmi celles-ci,

la ghréline qui est synthétisée par l’estomac est la seule hormone orexigène circulante connue à

ce jour (Wren et al., 2001). De plus, les signaux anorexigènes comme la cholécystokinine (CCK),

le glucagon-like peptide 1 (GLP-1) et le peptide YY (PYY) sont secrétés par l’intestin (Troke et

al., 2014).

L’estomac.

La ghréline constitue la principale hormone libérée dans la circulation sanguine par

l’estomac. Celle-ci est sécrétée par les cellules X/A du fundus de l’estomac. Son taux

plasmatique augmente consécutivement au jeûne et diminue dès l’absorption de nutriments. Des

études réalisées chez l’Homme et le rongeur indiquent qu’une injection chronique de ghréline par

voie sanguine s’accompagne d’une augmentation de la masse adipeuse (Tschöp et al., 2000;

Wren et al., 2001; Rodríguez et al., 2009) et dont l’augmentation dans le sang chez l’Homme est

corrélé avec une diminution de la dépense énergétique (St-Pierre et al., 2004), indiquant que cette

hormone exerce des effets pro-anaboliques. De plus, des études réalisées chez le rongeur

montrent que les effets de cette hormone sont également observés suite à une injection centrale,

suggérant que les effets de la ghréline sont relayés en partie par le SNC (Tschöp et al., 2000;

Asakawa et al., 2001). Par ailleurs des études réalisées par Chen et ses collaborateurs indiquent

que la ghréline constitue à ce jour l’une des rares hormones orexigènes identifiées, capable de

stimuler l’activité des neurones à neuropeptide Y (NPY) et/ou à agouti-related peptide (AgRP)

situés dans le noyau arqué de l’hypothalamus (ARC) (Chen et al., 2004a), suggérant que les

effets pro-anaboliques sont relayés en partie par l’activation de cette population de neurones.

Enfin, il a été montré chez la souris que l’effet négatif de la ghréline sur la dépense énergétique

est relayé par l’activation du récepteur de la ghréline (GHS-R) présent au niveau du BAT (Lin

10

and Sun, 2012), suggérant que la ghréline exerce ces effets via l’activation simultanée de cibles

centrales et périphérique via le BAT.

L’intestin.

L’intestin est subdivisé en plusieurs parties, incluant le duodénum, situé juste après le

pylore gastrique, puis le jéjunum, l’iléon et le colon qui est relié au rectum.

Au niveau du duodénum et du jéjunum, les cellules de type I libèrent de la CCK en réponse

aux lipides et aux protéines contenus dans le bol alimentaire. La CCK fut la première hormone

gastro-intestinale anorexigène à être identifiée chez le rat (Gibbs et al., 1973). Ainsi, des travaux

réalisé chez l’homme montrent que l’injection périphérique de CCK induit une diminution dose

dépendante de la prise de nourriture (Lieverse et al., 1995). Des études réalisées chez le rongeur

suggèrent de plus que ces effets anorexigènes passent par l’activation des récepteurs CCK 1 et 2

situés sur le nerf vague et dans de nombreuses régions cérébrales (Moran et al., 1997).

Cependant, à long terme les animaux vont compenser l’effet anorexigène aigu observé. Par

ailleurs, des études réalisées par Smith et ses collaborateurs chez le rat, montrent que la CCK ne

modifie pas le comportement alimentaire chez des animaux ayant préalablement subi une

vagotomie, indiquant que les effets anorexigènes de la CCK sont relayés par le nerf vague (Smith

et al., 1981). Enfin, des travaux plus récents indiquent que l’injection périphérique/centrale de la

CCK pourrait également stimuler la dépense énergétique (Lo et al., 2010), toutefois la nature des

voies impliquées dans cette réponse pro-anabolique est actuellement indéterminée.

Plus en aval dans l’intestin, les cellules L de l’iléon secrètent du GLP-1 consécutivement au

passage du bol alimentaire. Celui-ci, en plus d’activer les voies anorexigènes centrales, participe

également à la régulation (i) de la sécrétion d’insuline par les cellules β pancréatiques, (ii) de la

motilité gastrique et (iii) de la concentration plasmatique de glucagon (Drucker, 2005). Le GLP-1

est une hormone essentielle dans la régulation de l’homéostasie énergétique, car en agissant

positivement et rapidement sur la satiété, elle permet de limiter la quantité d’aliments ingérés et

d’augmenter le délai entre les repas (Williams et al., 2009). Enfin, des études réalisées chez le rat

montrent que l’injection intraveineuse de GLP-1 s’accompagne d’une augmentation de la

consommation d’oxygène (Osaka et al., 2005). Toutefois, des études réalisées par la suite chez la

souris montrent que l’invalidation du gène codant pour le récepteur de GLP-1 (GLP-1R) ou bien

11

l’administration périphérique d’un antagoniste de ce récepteur s’accompagnent d’une

augmentation de la dépense énergétique (Hansotia et al., 2007; Knauf et al., 2008), indiquant que

les mécanismes de régulation de ce récepteur nécessite d’être mieux appréhendé.

Enfin, suite au passage du bol alimentaire dans la partie distale de l’intestin, les cellules de

type L localisées au niveau du colon secrètent du PYY dans la circulation sanguine. Le PYY est

une hormone présente chez tous les vertébrés et codée par un gène paralogue au NPY (Tatemoto

and Mutt, 1980). Le PYY est secrété sous deux formes aux caractéristiques pharmacologiques

distinctes, le PYY (1-36) et le PYY (3-36) qui constitue la forme majoritaire (Grandt et al., 1994;

Kirchner et al., 2010). Ainsi, des travaux réalisés chez le rongeur indiquent que le PYY1-36 exerce

des effets orexigènes en se liant spécifiquement aux récepteurs du NPY de types 1 (Y1) et 5 (Y5)

(Kanatani et al., 2000). Toutefois, des études réalisées chez le rongeur et l’homme indiquent que

le PYY (3-36) exerce quant à lui des effets anorexigènes et pro-anaboliques via l’activation du

récepteur du NPY de type 2 (Y2), (Dumont et al., 1995; Batterham et al., 2002; Sloth et al., 2007;

De Silva et al., 2011) dans l’ARC (Teubner and Bartness, 2013). Enfin, la sécrétion de la forme

clivée de PYY est sous le contrôle de la dipeptidyl-peptidase 4 (DPP-4), suggérant que synthèse

de DPP-4 est essentiels dans la régulation de la balance énergétique (Troke et al., 2014).

1.1.2.2 L’effet des métabolites.

Les métabolites, tel que le glucose, les acides aminés et les acides gras, sont issus de la

dégradation des aliments par les processus de digestion et peuvent être stockés puis libérés par le

tissu adipeux et le foie lors d’un jeûne prolongé et même le muscle squelettique dans des cas

extrêmes. Les variations de taux circulants des différents métabolites sont détectées au niveau de

l’hypothalamus afin de déterminer le statut énergétique de l’organisme.

Le glucose.

Les premières études visant à évaluer la capacité du SNC à intégrer les variations de la

glycémie, ont montré qu’une altération centrale de la glycémie s’accompagne d’une diminution

de la dépense énergétique et d’une augmentation de la consommation de nourriture chez le

rongeur (Müller et al., 1973). Des expériences réalisées par la suite chez les rongeurs montrent

que la prise de nourriture consécutive à une période d’hypoglycémie est inhibée par l’injection

12

périphérique de glucose (Campfield et al., 1985), suggérant que le glucose constitue à lui seul un

signal anorexigène. Par ailleurs, une étude réalisée chez le rongeur indique que la prise

alimentaire peut être stimulée par l’injection centrale de 2-deoxyglucose, un analogue non

métabolisable du glucose, chez des animaux nourris ad libitum (Berthoud and Mogenson, 1977).

Enfin, des travaux réalisés en collaboration avec notre laboratoire montrent que l’intégration par

le SNC des variations de la glycémie impliquent la libération d’endozépines par les cellules

astrogliales hypothalamiques (Lanfray et al., 2012).

Les acides aminés.

Au milieu du siècle dernier, Mellinkoff suggéra l’existence d’une relation directe entre les

taux circulants d’acides aminés et le sentiment de satiété (Mellinkoff et al., 1956). Plus tard, des

études ont mis en évidence qu’un régime alimentaire riche en protéines est suivi, dès le premier

jour, par une diminution de la prise alimentaire et une augmentation de la concentration en acides

aminés dans le sang et dans le liquide céphalorachidien (Peters and Harper, 1987; Harper and

Peters, 1989). Par la suite, il a été montré par microdialyse, que les concentrations en acides

aminés essentiels, telles que la leucine, sont augmentées dans certains noyaux hypothalamiques

consécutivement à la prise d’un repas hyper-protéiné (Currie et al., 1995), suggérant que les

variations de leurs concentrations plasmatiques peuvent être intégrées par certaines structures du

SNC. Ainsi, des travaux réalisés par Cota et ses collaborateurs ont montré que l’injection centrale

de leucine induit une diminution de la prise alimentaire chez des rats à jeun (Cota et al., 2006).

Enfin, les travaux de Schwartz et ses collaborateurs ont montré que les effets satiétogènes d’une

injection centrale de leucine sont relayés par l’activation des neurones à pro-opiomélanocortine

(POMC)/ cocaine- and amphetamine- regulated transcript (CART) du ARC et s’accompagnent

d’une stimulation des neurones à ocytocine, du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVH)

et des fibres sympathiques du noyau du tractus solitaire (NTS) (Blouet et al., 2009).

Les acides gras.

À la même époque que Mellinkoff, Kennedy suggéra que les acides gras circulants sont

impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire (Kennedy, 1953). De nos jours, il est bien établi

que l’intégration centrale des variations de la lipidémie plasmatique participe à la régulation (i)

du comportement alimentaire, (ii) de la sécrétion d’insuline ainsi que (iii) de la production

13

hépatique de glucose. Ainsi, des travaux réalisés chez le rat par Obici et Schwinkendorf ont

montré que l’injection centrale d’acide oléique induit une diminution de la prise alimentaire et de

la production hépatique de glucose (Obici et al., 2002). Ces effets pro-cataboliques

s’accompagnent d’une stimulation des neurones à POMC/CART et d’une inhibition de l’activité

des neurones à NPY/AgRP (Obici et al., 2002; Schwinkendorf et al., 2011), suggérant que ces

populations neuronales participent à l’intégration centrale des variations de la lipidémie.

1.1.3 Les signaux postprandiaux.

Les signaux postprandiaux participant à la régulation de l’homéostasie énergétique sont

libérés par différents tissus en réponse aux variations des taux circulant de métabolites. Les deux

signaux post-prandiaux les mieux caractérisés sont l’insuline et la leptine, qui sont

respectivement produits par le pancréas et le tissu adipeux blanc.

1.1.3.1 L’insuline.

L’insuline est secrétée par les cellules β du pancréas lors de l’augmentation de la glycémie

en condition postprandiale (Granger and Kushner, 2009). L’insuline est une hormone

hypoglycémiante dont les effets sont opposés à ceux du glucagon produit par les cellules α

pancréatiques, et qui permet de maintenir la glycémie proche d’une valeur moyenne de 5 mM

chez le rongeur et l’homme (Jiang and Zhang, 2003). Des études de liaison radioactive, réalisées

au début des années 70, ont permis d’identifier le récepteur de l’insuline (INS-R), un récepteur

ubiquitaire présent chez tous les vertébrés (Freychet et al., 1971). Par la suite, des résultats ont

montré que l’injection centrale d’insuline induit une diminution de la prise alimentaire ainsi

qu’une augmentation de la dépense énergétique chez le singe (Woods et al., 1979), suggérant que

l’insuline est capable d’activer certaines voies neuronales pro-cataboliques. Par ailleurs, des

expériences réalisées chez le rongeur indiquent que l’injection intrapéritonéale d’insuline stimule

l’expression de la POMC dans le ARC, suggérant que cette hormone est capable de traverser la

barrière hémato-encéphalique et exerce ses effets anorexigènes via l’activation de la voie du

système mélanocortine (Kim et al., 1999). Enfin, une étude réalisée chez le rat montre que l’effet

anorexigène d’une injection centrale d’insuline est bloqué par un antagoniste des récepteurs aux

mélanocortines 3 et 4 (MC3/4R) (Benoit et al., 2002), confirmant ainsi que l’effet satiétogène de

l’insuline est relayé par l’activation du système mélanocortinique.

14

1.1.3.2 La leptine.

La leptine est une adipokine de 16 kDa codée par le gène ob (Zhang et al., 1994),

principalement produite par les adipocytes blancs (Ahima and Osei, 2004). Les taux circulants de

cette adipokine sont proportionnels à la quantité de tissu adipeux et reflètent de ce fait le statut

énergétique de l’organisme. Les obeses présentent par conséquent des taux sanguins de leptine

supérieur à la normale, qui a pour conséquence la mise en place à long terme d’une résistance à la

leptine (Carter et al., 2013). Les modèles transgéniques murins déficients pour le gène de la

leptine (souris ob/ob) ou pour le gène du récepteur de la leptine (souris db/db) présentent un

phénotype obèse caractérisé par une augmentation de la prise alimentaire et une diminution de la

dépense énergétique (Friedman and Halaas, 1998). L’administration chronique de leptine à des

souris ob/ob entraîne une réduction de la prise alimentaire, une augmentation de la dépense

énergétique et une réduction rapide de la masse corporelle (Weigle et al., 1995). Le gène db qui

code pour le récepteur de la leptine permet, par des mécanismes d’épissage alternatif, la synthèse

de plusieurs isoformes (courtes, longues et secrétées) (Moran and Phillip, 2003). Au niveau du

SNC, la leptine se lie à la forme longue Ob-Rb dont l’expression est très élevée dans

l’hypothalamus ventromédian (Funahashi et al., 2003). L’invalidation du gène db, spécifiquement

dans le SNC, induit un phénotype obèse, hyperphage et hypométabolique (Seeley et al., 1996).

Enfin, l’administration de leptine diminue l’expression des acides ribonucléiques messagers

(ARNm) codant pour les gènes NPY et AgRP, tout en augmentant ceux codant pour le gène de la

POMC (Cowley et al., 2001), suggérant que les effets de la leptine sont relayés par la stimulation

et l’inhibition des voies neuronales hypothalamiques respectivement anorexigènes et orexigènes.

Par ailleurs, de nombreuses adipokines tels que l’adiponectine, la resistine et l’acylation

stimulating protein issues elles aussi du tissu adipeux blanc semblent également impliquées dans

la régulation de l’homéostasie énergétique (Lancha et al., 2012), toutefois l’importance de ces

adipokines in vivo reste à être déterminée sachant que leurs secrétions n’est pas synchrone avec la

phase postprandiale.

15

1.2 La régulation centrale de l’homéostasie énergétique.

Le système nerveux central (SNC) est le siège de l’intégration des différents signaux

périphériques relatifs au statut énergétique de l’organisme. Chacun des signaux périphériques

mobilise une ou plusieurs voies neuronales spécifiques afin de générer une multitude de réponses

contrôlant les deux leviers de la régulation de l’homéostasie énergétique. Parmi les différentes

structures du SNC impliquées dans ces réponses, l’hypothalamus est considéré comme le

principal centre intégrateur régulant l’homéostasie énergétique. Néanmoins, d’autres structures,

tels que le noyau du tractus solitaire (NTS), une structure de la région pontique contrôlant

l’activité du système nerveux autonome (SNA) et le métabolisme périphérique (Schwartz et al.,

2000; Myers and Olson, 2012), agissent en synergie avec l’hypothalamus afin de réguler la

balance énergétique.

1.2.1 Le rôle de l’hypothalamus dans l’homéostasie énergétique.

L’hypothalamus est la partie antéro-inférieure du diencéphale. Il est délimité dans sa partie

rostrale par le chiasma optique, la lamina terminalis et la commissure antérieure, alors que dans

sa partie caudale il est circonscrit par un plan vertical postérieur aux corps mamillaires. Au

niveau dorsal, il est bordé par le thalamus, alors que du côté ventral le plancher hypothalamique

est en contacte direct avec le liquide céphalorachidien (LCR) (figure 3).

Le rôle essentiel de l’hypothalamus dans le contrôle de l’homéostasie énergétique fut

suggéré dès les années 40, par des travaux montrant que la lésion du noyau ventromédian

entrainait une hyperphagie et une obésité alors qu’une lésion de l’hypothalamus latéral conduisait

à une réduction de la prise alimentaire et à la perte de poids chez le rat (Hetherington and Ranson,

1940; Anand and Brobeck, 1951). Par la suite, de nombreuses études ont montré l’implication de

l’ARC dans la régulation de l’homéostasie énergétique.

16

Figure 4: Section sagittale du cerveau de rat montrant l'emplacement de l'hypothalamus.

Figure 5: Représentation tridimensionnelle de l'hémisphère droit de l'hypothalamus du rat.

Abréviations : AHA, aire hypothalamique antérieure; ARC, noyau arqué; AV3V, aire

antéroventrale du 3éme ventricule; CI, capsule interne; DP, sous noyau parvocellulaire dorsal du noyau

paraventriculaire (PVH); DMH, noyau dorsomédian; F, fornix; LHA, aire latérale; LM, sous noyau

magnocellulaire latéral du PVH; LPOA, l’aire préoptique latérale; ME, éminence médiane; MP, sous

noyau parvocellulaire médial du PVH; MPO, noyau préoptique médial; OT, tractus optique; SCh, noyau

suprachiasmatique; SON, noyau supraoptique; SI, substantia inomminata; ST, noyau sous-thalamique;

VMH, noyau ventromédian; VP, sous noyau parvocellulaire ventral du PVH. Tirée de (Berthoud, 2002).

17

L’ARC est situé immédiatement au-dessus de l’éminence médiane, un organe circum-

ventriculaire permettant le passage des hormones et des nutriments du sang vers le LCR, et est en

mesure de percevoir les modifications du statut énergétique de l’organisme (Schwartz et al.,

2000; Dhillo, 2007). L’ARC est un noyau composé notamment de deux populations de neurones

distinctes dites de premier ordre, agissant de façon opposée sur la prise alimentaire. L’une

exprime la POMC, le précurseur de l’alpha melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) (Poggioli

et al., 1986) et le cocaine and amphetamine-regulated transcript (CART) (Kristensen et al.,

1998; Elias et al., 1998b) qui sont des neuropeptides anorexigènes, tandis que l’autre produit le

NPY (Stanley et al., 1986; Hahn et al., 1998) et l’agouti-related protein (AgRP) (Hahn et al.,

1998; Broberger et al., 1998a), deux neuropeptides orexigènes. Ces deux populations neuronales

projettent vers différents neurones dits de second ordre, situés dans l’ensemble de l’hypothalamus

et notamment dans le noyau paraventriculaire (PVH), l’aire latérale (LHA), le noyau

ventromédian (VMH) et le noyau dorsomédian (DMH) de l’hypothalamus. Ces derniers sont

largement impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire et/ou dans la régulation de

l’homéostasie énergétique (DeFalco et al., 2001; Berthoud, 2002; Myers and Olson, 2012; Parker

and Bloom, 2012). Les principaux peptides identifiés comme impliqués dans le contrôle de la

prise alimentaire sont recensés dans le tableau 1.

1.2.1.1 Les neurones de premier ordre du noyau arqué.

Les neurones POMC/CART.

Bien que l’α-MSH ai été découverte à la fin des années 50 (Harris, 1959), son précurseur, la

POMC, ainsi que son principal lieu de synthèse, l’ARC, ne furent identifiés qu’à la fin des années

70 (Mains et al., 1977; Jacobowitz and O'Donohue, 1978). Durant la première moitié des années

90, 5 récepteurs aux mélanocortines (MCR) furent caractérisés (Mountjoy et al., 1992; Chhajlani

et al., 1993; Gantz et al., 1993a; 1993b; Labbé et al., 1994), dont notamment les MCR de types 3

et 4, deux récepteurs présents exclusivement au niveau du SNC (Mountjoy, 2010) (Cf. 3.1.1.2).

Des expériences, réalisées à l’aide de la technique d’hybridation in situ chez le rongeur, indiquent

que le jeûne aigu ou chronique s’accompagne d’une diminution des taux d’ARNm codant la

POMC au niveau de l’ARC, et que ces effets sont renversés suite à la réalimentation des

18

Tableau 1: Principaux facteurs hypothalamiques impliqués dans la régulation de

l’homéostasie énergétique.

peptides Récepteur(s) impliqué(s)

Site(s) d’expression dans l’hypothalamus

références

Facteu

rs orexigène

s

AgRP MC3-‐R, MC4-‐R ARC (Fong et al., 1997) Beacon N.D. ARC, LHA, PVH (Collier et al., 2000)

Dynorphine Kappa PVH (Lambert et al., 1993) GABA GABAa, GABAb ARC, VMH (Patel and Ebenezer, 2004)

Galanine Gal-‐R1, -‐R2, -‐R3 ARC, DMH, LHA (Branchek et al., 2000) Galanin-‐like peptide Gal-‐R2 ARC, PVH (Seth et al., 2004)

Ghréline GHS-‐R ARC (Wren et al., 2001) MCH MCH1-‐R, MCH2-‐R LHA (Qu et al., 1996)

Neuropeptide Y Y1-‐R, Y2-‐R, Y5-‐R ARC, DMH, VMH (Erickson et al., 1996) Nociceptine ORL-‐1 ARC (Polidori et al., 2000) Orexine A Ox1-‐R, Ox2-‐R LHA (Haynes et al., 1999; Shiraishi et al., 2000)

VGF N.D. ARC (Hahm et al., 2002) amandamine CB1R ARC, LHA, VMH, DMH, PVH (Ameri, 1999) 26RFa/43RFa GPR103 LHA (do Rego et al., 2006)

Facteu

rs ano

rexigène

s

α-‐MSH MC3-‐R, MC4-‐R ARC (Fan et al., 1997; Yaswen et al., 1999) Apéline APJ ARC, PVH (Reaux et al., 2002) BDNF TrkB VMH (Xu et al., 2003)

Bombésine/GRP GRP-‐R PVH (Wada et al., 1998) CART N.D. ARC, DMH, LHA (Bannon et al., 2000) CGRP CGRP-‐R ARC, LHA (Dhillo et al., 2003) CRH CRH1-‐R, CRH2-‐R PVH (Richard et al., 2000) ODN RCPG de l’ODN ARC (do Rego et al., 2007)

Dopamine D1, D2 ARC, DMH (Ladurelle et al., 1991)

GLP-‐1 GLP1-‐R ARC, DMH, LHA, PVH, VMH (Tang-‐Christensen et al., 1996; Peters et al., 2001)

GLP-‐2 GLP2-‐R DMH (Tang-‐Christensen et al., 2000) Nesfatine-‐1 N.D. ARC, PVH (Kohno et al., 2008)

Neuromédine S NMU2R PVH (Ida et al., 2005) Neuromédine U NMU2R VMH (Kowalski et al., 2005)

Neuropeptide B et W GPR7 PVH (Ishii et al., 2003) Neurotensine NTR-‐1 ARC, DMH, PVH, VMH (Remaury et al., 2002)

NPFF NPFF-‐1, NPFF-‐2 VMH, DMH (Sunter et al., 2001) Ocytocine OXT-‐R PVH (Arletti et al., 1989; Olson et al., 1991) PACAP N.D. ARC, VMH (Chance et al., 1995; Mizuno et al., 1998) PrRP GPR10 DMH (Gu et al., 2004)

Sérotonine 5HT1, 5HT2 PVH (Dourish, 1995; Currie et al., 2002) Somatostatine N.D. ARC, VMH (Scalera and Tarozzi, 1998)

TRH TRH-‐R1 PVH (Kow and Pfaff, 1991) Urocortine CRH2-‐R VMH, LHA (Ohata et al., 2000; Reyes et al., 2001)

Abreviations: ARC, noyau arqué de l’hypothalamus; DMH, noyau dorsomédian de l’hypothalamus; LHA,

l’aire latérale de l’hypothalamus; PVH, noyau paraventriculaire de l’hypothalamus; VMH, noyau

ventromédian de l’hypothalamus.

19

animaux, indiquant que l’expression de la POMC au niveau de l’ARC est fonction du statut

énergétique de l’organisme (Swart et al., 2002).

Chez la souris, l’invalidation du gène de la POMC induit un phénotype obèse, hyperphage

et hypométabolique, indiquant que la POMC et ses dérivés jouent un rôle essentiel dans le

maintien de l’homéostasie énergétique chez le rongeur (Yaswen et al., 1999; Challis et al., 2004).

De même, plusieurs cas d’obésité sévère diagnostiqués chez l’homme sont associés à la présence

de mutations sur le gène codant pour la POMC (Krude et al., 1998), néanmoins les cas de perte

de fonction complète ont très rarement été répertoriés (Farooqi and O'Rahilly, 2006).

Les premières études pharmacologiques réalisées via l’injection intra-cérébro-ventriculaire

(i.c.v.) d’α-MSH, ou de son analogue cyclique synthétique, le melanotan-II (MTII), montrent une

diminution de la prise alimentaire, qui s’accompagne d’une perte de poids lors d’un traitement

chronique chez le rongeur (Fan et al., 1997), indiquant que l’α-MSH est un puissant facteur

anorexigène. D’autre part, des études réalisées chez le rongeur indiquent que les effets du MTII

sur la prise alimentaire peuvent être abolis par la co-injection d’un antagoniste des MC3/4R

(Rossi et al., 1998). L’utilisation de modèles génétiques a permis de mettre en évidence

l’importance de MC4R dans le contrôle de la prise alimentaire et dans la régulation de la balance

énergétique. En effet, les souris ayant une délétion du gène codant pour MC4R présentent une

hyperphagie accompagnée d’une obésité sévère (Huszar et al., 1997), ainsi qu’une absence

d’inhibition de la prise alimentaire lors de l’administration d’un agoniste aux MC3/4R (Chen et

al., 2000b). D’autre part, la délétion du gène codant MC3R n’entraine par de modification du

comportement alimentaire, cependant ces souris sont obèses, suggérant ainsi un rôle dans la

régulation du métabolisme périphérique (Chen et al., 2000a). Par ailleurs, la présence du MC3R

sur les neurones POMC de l’ARC, suggère que MC3R est un autorécepteur qui module la

synthèse de son propre agoniste, l’α-MSH (Jégou et al., 2000; Lee et al., 2008). Cependant,

l’implication exacte de cette fonction d’autorécepteur dans le métabolisme périphérique reste à

être précisée. Enfin, la double délétion de MC3/4R conduit à une hyperphagie importante et une

obésité extrême chez la souris, démontrant ainsi le rôle primordial du système mélanocortinique

dans la régulation de l’homéostasie énergétique de l’organisme (Atalayer et al., 2010). Chez

l’Homme, les mutations du gène codant pour MC3R sont associées avec de rares cas d’obésités

20

sévères, tandis que des mutations du gène codant pour MC4R sont à l’origine de 5 à 6 % des cas

d’obésité morbide (Yeo et al., 1998; Farooqi and O'Rahilly, 2006).

Le CART est exprimé dans l’ARC au sein des mêmes neurones que la POMC (Elias et al.,

1998a). De façon similaire à la POMC, il voit ses niveaux d’expression diminués chez des rats

soumis à une privation aigue, ainsi que chez plusieurs modèles de souris obèses (Kristensen et al.,

1998), tandis que l’administration de la leptine augmente l’expression de l’ARNm du CART dans

l’ARC (Kristensen et al., 1998). L’administration centrale de CART chez les rongeurs diminue la

prise alimentaire, tandis que l’injection d’anticorps anti-CART l’augmente, démontrant ainsi le

rôle anorexigène de CART (Lambert et al., 1998). De plus, l’injection i.c.v. de CART inhibe

l’effet orexigène du NPY (Kristensen et al., 1998; Lambert et al., 1998). De façon surprenante,

l’injection de CART dans l’ARC augmente la prise de nourriture chez le rongeur (Abbott et al.,

2001). Ces résultats contradictoires suggèrent qu’il existe plusieurs populations neuronales

exprimant le CART et qu’elles exercent des rôles différents dans le contrôle de l’homéostasie

énergétique. Cependant, le récepteur du peptide CART reste à être élucidé (Harrold et al., 2012).

Les neurones NPY/AgRP.

Le NPY est un peptide de 36 acides aminés, dont les extrémités N- et C- terminales sont

constituées de tyrosine (Tatemoto et al., 1982). L’expression de l’ARNm de NPY au niveau de

l’ARC est doublée lors d’un jeûne, aigu ou chronique, puis on observe un retour vers des valeurs

basales après réalimentation des animaux (Sahu et al., 1988; Sanacora et al., 1990; Swart et al.,

2002). L’injection de NPY centralement, ou directement dans le PVH ou le LHA, initie la prise

d’un repas, dont la taille et la durée sont plus importantes que la normale (Stanley et al., 1985).

Par ailleurs, l’injection chronique de NPY chez le rat induit une obésité (Zarjevski et al., 1993).

L’ensemble des effets orexigènes du NPY sont relayés par les récepteurs Y1 et Y5 que l’on

retrouve dans differentes noyaux hypothalamiques et notamment dans le PVH et le LHA (Kopp

et al., 2002; Morin and Gehlert, 2006). Ces résultats montrent l’importance du NPY dans le

contrôle de la prise alimentaire. Cependant, des études sur les modèles de souris transgéniques

n’exprimant pas le NPY montrent que celles-ci ont un poids corporel et une masse adipeuse

normaux, s’ils reçoivent une diète de laboratoire standard (Thorsell and Heilig, 2002), alors que

les animaux nourris avec une diète riche en gras sont résistants à l’obésité (Patel et al., 2006).

21

L’absence d’un phénotype «maigre» chez ces souris transgéniques suggère la présence de

mécanismes orexigènes compensatoires. En effet, une étude réalisée sur ce modèle montre qu’un

jeûne augmente l’expression du gène codant pour l’AgRP dans les neurones de l’ARC et que

l’injection de ce peptide entraine une augmentation importante de la prise alimentaire

comparativement à la souris sauvage (Marsh et al., 1999), indiquant que l’action de ce peptide

pourrait compenser l’absence de NPY chez le rongeur.

L’AgRP fut découverte sur un modèle de souris obèse, hyperphagique et avec un pelage

jaune, dont le phénotype est dû à la surexpression de la protéine agouti, dans l’ensemble de

l’organisme (Lu et al., 1994). Au sein du SNC, l’AgRP est exclusivement synthétisée par des

neurones de l’ARC et 95 % d’entre eux co-expriment le NPY (Broberger et al., 1998b). Lors d’un

jeûne de 24 h l’expression de l’AgRP est augmentée chez la souris suggérant ainsi son

implication dans le contrôle de la prise alimentaire (Swart et al., 2002). En effet, Il a été montré

que comme le NPY, l’AgRP induit des effets orexigènes lorsqu’il est injecté en i.c.v. (Rossi et

al., 1998) ou directement dans le PVH ou le DMH (Kim et al., 2000). L’action de l’AgRP a la

particularité d’être soutenue dans le temps, en effet, l’hyperphagie occasionnée chez le rat peut

durer jusqu'à 7 jours (Hagan et al., 2000). De la même façon que la protéine agouti, l’AgRP agit

comme un antagoniste naturel des récepteurs MC3/4R (Ollmann et al., 1997), le MC4R étant

constitutivement actif en absence de tout ligand, l’AgRP joue conséquemment le rôle d’agoniste

inverse (Nijenhuis et al., 2001).

1.2.1.2 Les neurones de second ordre.

Les principales populations neuronales de second ordre expriment les récepteurs MC3/4R,

Y1 et Y5 et sont présentes dans le LHA, le PVH, le VMH et le DMH.

Dans le LHA, les axones des neurones POMC/CART et NPY/AgRP de l’ARC forment des

contacts synaptiques avec différents neurones secrétant des neuropeptides tels que la melanin-

concentrating hormone (MCH) et l’orexine (Badami et al., 2010). En effet, dès 1998 Broberger et

ses collaborateurs ont montré que les neurones exprimant la MCH et l’orexine dans le LHA sont

les cibles des neurones NPY/AgRP de l’ARC (Broberger et al., 1998a). Par la suite, il a été

montré que l’injection centrale d’AgRP chez des souris nourries ad libitum stimule l’expression

de la MCH, cependant l’AgRP n’a pas d’effet sur l’expression de l’orexine. D’autre part,

22

l’injection i.c.v. d’α-MSH inhibe l’expression de l’orexine sans modifier celle de la MCH dans le

LHA (Hanada et al., 2000). De même, les souris qui présentent une délétion du gène codant pour

la POMC montrent une surexpression de l’orexine dans le LHA (López et al., 2007). L’ensemble

des éléments précédemment cités démontre de façon évidente l’impact des neurones de premier

ordre de l’ARC sur l’expression de la MCH et de l’orexine dans le LHA. Par ailleurs, des études

réalisées à l’aide de certains modèles de souris transgéniques ont permis de mettre en évidence

l’importance de la MCH et de l’orexine dans la régulation de l’homéostasie énergétique. En effet,

la délétion du gène codant pour la MCH entraine une hypophagie chez des souris conduisant à un

phénotype mince (Shimada et al., 1998). De même, l’invalidation du gène codant l’orexine

s’accompagne d’une diminution de la prise de nourriture chez la souris (Hara et al., 2001).

Toutefois, ces souris orexine-/- sont obèses, suggérant une diminution en parallèle de la dépense

énergétique (Cf. 2.2.2.1). Enfin d’un point de vue pharmacologique, il a été montré que ces deux

neuropeptides augmentent la prise de nourriture chez le rongeur, lorsqu’ils sont injectés par voie

i.c.v. (Qu et al., 1996; Székely et al., 2002).

Par ailleurs, la MCH est également secrétée par des neurones du DMH (Badami et al.,

2010). Ces neurones reçoivent également des projections venant des neurones de premier ordre

de l’ARC (Kalra et al., 1999). À leur tour, les neurones à MCH projettent vers différentes

structures du SNC, notamment le PVH et le VMH (Wynne et al., 2005), et ces connexions

pourraient constituer des boucles de rétrocontrôle. Cependant, la population neuronale la mieux

décrite à ce jour dans le DMH est constituée de neurones exprimant le NPY; celle-ci est connue

pour avoir un impact majeur sur la régulation de l’homéostasie énergétique. En effet, l’injection

d’un adenovirus associé avec l’ARNc antisens de NPY dans le DMH inhibe spécifiquement

l’expression de NPY dans le DMH et entraine une diminution de l’hyperphagie et de l’obésité

chez le rat OLETF (Otsuka Long Evans Tokushima Fatty), dont la spécificité est d’être

hyperphage, obèse et diabétique (Yang et al., 2009b; Bi et al., 2012).

Les axones des neurones POMC/CART et NPY/AgRP émettent également des contacts

synaptiques avec d’autres populations neuronales situées dans le PVH. Celles-ci produisent des

neuropeptides anorexigènes tels que la thyréolibérine ou Thyrotropin-Releasing Hormone (TRH)

(Fekete et al., 2000; Harris et al., 2001), la corticolibérine ou Corticotropin-Releasing Hormone

(CRH) (Suda et al., 1993; Valassi et al., 2008) et l’ocytocine (Choy and Watkins, 1977; Parker

23

and Bloom, 2012). Des expériences réalisées chez le rongeur, montrent que l’expression de ces

trois neuropeptides est modifiée suite à une variation du statut énergétique ou à l’injection d’un

agent pharmacologique mimant ce phénomène. En effet, l’expression de l’ARNm de la TRH dans

le PVH est augmentée par l’injection d’α-MSH ou lors d’un jeûne (Fekete et al., 2000), tandis

qu’elle est diminuée après l’administration d’AgRP ou de NPY (Fekete et al., 2004; Valassi et al.,

2008). Par ailleurs, l’infusion de leptine augmente l’expression de l’ARNm de CRH (Masaki et

al., 2003). Ou encore, l’activité des neurones exprimant l’ocytocine est augmentée lors de la prise

d’un repas (Johnstone et al., 2006). De plus, l’injection centrale de TRH ou de CRH chez le rat

diminue sa prise alimentaire et son poids corporel (Valassi et al., 2008). De même, l’injection

centrale d’ocytocine en i.c.v. inhibe la prise de nourriture (Arletti et al., 1989). Il apparaît donc

clairement que le PVH, via la libération de ces neuropeptides dans différentes structures du SNC

est le siège d’une activité neuronale anorexigène.

Au niveau du VMH, les fibres des neurones POMC/CART et NPY/AgRP de l’ARC

forment des contacts synaptiques avec une population de neurones synthétisant un neuropeptide

anorexigène, le brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (Rios et al., 2001; Xu et al., 2003;

Sternson et al., 2005). Il a été montré que la délétion du gène codant pour le BDNF chez l’homme

ou le rongeur, s’accompagne d’une hyperphagie et d’une obésité morbide (Lyons et al., 1999;

Yeo et al., 2004). De plus, chez la souris avec une délétion du gène MC4R, l’expression de

BDNF est réduite dans le VMH suggérant ainsi que l’effet satiétogène induit par le système

mélanocortinique passe par des neurones exprimant le BDNF (Xu et al., 2003). Enfin, les

neurones exprimant le BDNF émettent des projections vers plusieurs structures du SNC,

notamment vers le PVH, le LHA, le DMH et vers le NTS, démontrant ainsi le rôle de modulateur

du VMH dans la régulation du bilan d’énergie (McClellan et al., 2006).

1.2.2 Le rôle du NTS dans la régulation de l’homéostasie.

Le NTS se situe dans le tronc cérébral, où il organise l’action du SNA afin de contrôler

l’activité des différents organes périphériques impliqués dans la régulation de l’homéostasie

(Nonogaki, 1999). Il reçoit aussi un grand nombre d’afférences provenant de différents noyaux

hypothalamiques afin de moduler son activité pour réguler le métabolisme énergétique

périphérique (Horst et al., 1989; Schwartz et al., 2000). Cependant, certaines caractéristiques

24

évoquées précédemment lui permettent d’intégrer les signaux périphériques et de participer avec

l’hypothalamus au contrôle la prise alimentaire (Schwartz, 2006).

1.2.2.1 Le NTS est le centre de l’activité du SNA.

Le SNA est contrôlé par le tronc cérébral et plus particulièrement par le NTS, dont les

projections innervent les neurones préganglionnaires des fibres sympathiques (ou

orthosympathiques) et parasympathiques, qui ont un effet opposé sur les organes cibles

(Robertson et al., 2011). Les fibres ortho- et parasympathiques, dont les neuromédiateurs sont

respectivement la noradrénaline et l’acétylcholine, innervent la plupart des organes périphériques

dont notamment le foie, le pancréas, les muscles squelettiques et les adipocytes (Robertson et al.,

2011). Ces organes sont responsables de la mise en réserve, ainsi que de la mise à disposition du

glucose et des acides gras en périphérie. Ainsi, le système parasympathique favorise le stockage

du glucose et des acides gras libres tandis que le SNS favorise leur libération (Scheurink and

Nolan, 1996).

1.2.2.2 Les interactions du NTS et de l’hypothalamus dans la régulation de l’homéostasie.

Le NTS est plus qu’un simple relais pour les entrées viscérales et gustatives. En effet, de

nombreuses études réalisées notamment chez le rongeur indiquent que le NTS, tout comme

l’ARC, présente des neurones à NPY/AgRP et à POMC/CART (Mountjoy et al., 1994; Wynne et

al., 2005; Morin and Gehlert, 2006). Le NTS a une seconde similitude avec l’ARC, car il est

adossé à une petite structure nommée l’area postrema (AP) qui constitue également un organe

circum-ventriculaire (Blouet and Schwartz, 2012). De par ses caractéristiques morphologiques

l’AP est capable de détecter les hormones circulantes et notamment les hormones gastro-

intestinales telles que la CCK (Hill et al., 1987), le GLP1 (Merchenthaler et al., 1999) ou le PYY

(Stanić et al., 2006). Ainsi, l’AP qui possède des connexions directes avec le NTS l’informe de

l’état du système digestif (Berthoud, 2002). De plus, grâce à ses nombreuses interconnexions

avec l’hypothalamus, il intervient dans la régulation de la balance énergétique (Berthoud, 2002).

A titre d’exemple, des expériences réalisées chez le rongeur ont montré que les neurones du

PVH exprimant de l’ocytocine et innervant le NTS (Blevins et al., 2003) sont capables de

moduler la prise alimentaire (Maejima et al., 2009), indiquant l’existence d’une communication

25

bilatérale entre ces deux structures. D’autres études on mis en évidence que l’activation des

neurones situés dans le LHA stimule l’activité du SNA, alors que la modification de l’activité du

SNA par des organes cibles tels que les intestins et le foie, modulerait en retour, via le NTS,

l’activité électrique des populations neuronales du LHA (Kirchgessner, 2002). Enfin, l’activation

des récepteurs MCR4 exprimés sur les neurones de l’ARC qui se projettent vers le NTS diminue

l’appétit via l’activation du nerf vague (Williams et al., 2000).

26

Figure 6: La régulation centrale de la balance énergétique.

Schéma illustrant l’ensemble des connaissances actuelles sur les relations entre les structures du SNC, les

neuropeptides et leurs récepteurs impliqués dans la régulation de l’homéostasie énergétique.

Abréviations : liste des structures cérébrales; Acb, le noyau accumbens; Am, l’amygdale; ARC, le noyau

arqué de l’hypothalamus; DMH, le noyau dorsomédian de l’hypothalamus; DMV, le noyau moteur dorsal du nerf

vague; IML, la colonne intermédiolatérale de la moelle épinière; LHA, l’hypothalamus latéral; NTS, le noyau du

tractus solitaire; PB, le noyau parabrachial; PVH, le noyau paraventriculaire de l’hypothalamus; SCH, le noyau

suprachiasmatique ; VMH, le noyau ventromédian de l’hypothalamus; VTA, l’aire tegmentale ventrale. Les triangles

représentent des récepteurs aux neuropeptides et les losanges représentent des récepteurs aux signaux périphériques

à l’exception du losange vert qui est un transporteur. Liste des récepteurs; CB1, le récepteur aux cannabinoïdes de

type 1; MC3R et MC4R, les récepteurs aux mélanocortines de type 3 et 4; NPY1R et NPY5R, les récepteurs au

neuropeptide Y de type 1 et 5 et le récepteur au Glucagon-Like Peptide-1 (R GLP-1). Les cercles représentent des

neuropeptides. Liste des neuropeptides : AgRP, Agouti-Related Peptide; CART, Cocaine- and Amphetamine-

Regulated Transcript; CRH, Corticotropin-Releasing Hormone; GABA, Acide γ-aminobutyrique; MCH, Melanin-

Concentrating Hormone; NPY, Neuropeptide Y; POMC, Pro-opiomélanocortine; TRH, Thyrotropin-Releasing

Hormone. Les hormones secrétées par la tige pituitaire; TSH, Thyroid-Stimulating Hormone; ACTH,

Adrenocorticotropic hormone. Les hormones secrétées par la thyroïde; T4, la thyroxine; T3, triiodothyronine.

Traduit du Metabolic Syndrome Eposter de Chun-Xia Yi, Lori Zeltser and Matthias Tschöp dans Nature Medecine.

Tige%pituitaire%

Cortex% Hippocampe%

Glande%surrénale%

Bulbe%olfac:f%

Muscle%

Pancréas%

Foie%

Tractus%%gastro>intes:nal%% Tissu%adipeux%

blanc%

Tissu%adipeux%brun%

Senseur%de%l’adiposité%et%de%la%sa:été%

Contrôle%autonome%du%métabolisme%

Contrôle%comportementale%de%l’alimenta:on%

Régulateur%et%senseur%glycémique%

Horloge%et%synchronisa:on%du%métabolisme%

Contrôle%neuroendocrinien%du%métabolisme%

Glande%thyroïdienne%

Transporteurs%du%glucose%dédié%à%sa%percep:on%%

R%lep:ne%

R%insuline%

R%ghréline%

R%GLP>1%

R%estrogène%

MC3R%

MC4R%

NPY1R%

NPY5R%

CB1%

Dopamine%

Ocytocine%

Vasopressine%

TRH%

CRH%

Glutamate%

Acétylcholine%

NPY/AGRP/GABA%

POMC%

CART%

Orexine%

MCH%

Dynorphine%

GABA%

Hormones%%de%croissance% Innerva:on%%

parasympathique%Innerva:on%%

sympathique%

T4/T3%

ACTH%

TSH%

Adrénaline%Cor:sol%

ARC%

DMH%PVH%

VTA%LHA%

Am% VMH%

SCH%

Acb%

PB%

NTS%DMV%

IML%

27

2 La thermogenèse du tissu adipeux brun.

Il existe dans le règne animal deux types de réponses face aux variations de température de

l’environnement. La première, qui consiste à faire varier la température corporelle au gré de

l’environnement, est utilisée par les espèces dites poïkilothermes. La seconde quant à elle,

nécessite de réguler la température corporelle autour d’un point de consigne propre à chaque

espèce, et est adoptée par les espèces homéothermes tels que les oiseaux et les mammifères. Cette

particularité permet aux organismes homéothermes d’assurer l’ensemble de leurs fonctions

physiologiques de façon permanente (Cannon and Nedergaard, 2004).

La thermogenèse est un processus multifactoriel incluant la thermogenèse obligatoire et la

thermogenèse facultative ou adaptative. La thermogenèse obligatoire est la résultante de l’activité

du métabolisme basal, c’est-à-dire une conséquence de l’ensemble des réactions exothermiques.

Cette thermogenèse représente les deux tiers de la chaleur produite par l’organisme (Clapham,

2012). Les termes de thermogenèse facultative ou adaptative regroupent trois effecteurs qui sont,

(i) les muscles dans le cadre de l’activité physique volontaire ou du frissonnement lors d’une

exposition au froid, (ii) le tractus digestif pendant la digestion et (iii) le BAT qui est stimulé

pendant une exposition au froid ou l’ingestion d’aliments (Silva, 2006; Clapham, 2012). Ces trois

sources de thermogenèse sont dites facultatives ou adaptatives, car elles sont activées par le SNC

de façon temporaire en réponse à une modification de l’environnement. Toutefois, elles sont

essentielles à l’adaptation et à la survie de l’organisme aux modifications de l’environnement

(Cannon and Nedergaard, 2004; Silva, 2006).

A la différence du tissu adipeux blanc, dont la fonction est de stocker les lipides sous forme

de triglycérides pour assurer les besoins énergétiques de l’organisme en tout temps, le BAT met

en réserve des lipides pour réaliser la thermogenèse. Le BAT est un acquît évolutif qui s’est

développé très tôt dans l’évolution des mammifères, qui leur a permis de se libérer des

fluctuations environnementales. En effet, lors de l’exposition au froid, le BAT permet à l’animal

de conserver une température corporelle optimale et ainsi d’assurer le bon fonctionnement de son

métabolisme basal et d’empêcher les contractions musculaires réflexes handicapant la mobilité

(Cannon and Nedergaard, 2004).

28

2.1 Le tissu adipeux brun.

Le BAT peut assurer sa fonction thermogène grâce à des caractéristiques particulières en

termes de localisation, d’histologie, mais surtout grâce à la présence d’une protéine découplante

(uncoupling protein-1 UCP-1), qui fut découverte en 1978 (Nicholls et al., 1978; Nicholls and

Locke, 1984).

2.1.1 Les caractéristiques du tissu adipeux brun.

2.1.1.1 Origine et développement du tissu adipeux brun.

Le tissu adipeux brun fut observé pour la première fois par le naturaliste suisse Konrad

Gessner en 1551, qui décrit le BAT comme n’étant “ni graisse ni chair (nec pinguitudo nec

caro)”. Jusqu'à récemment, de nombreux investigateurs assumaient l’origine commune des

adipocytes bruns et blancs. Cette affirmation était basée sur plusieurs observations, telles que la

proximité de morphologie des adipocytes bruns et blancs, la capacité de stocker des triglycérides

dans des gouttelettes lipidiques, ainsi que la similitude des transcriptomes, à l’exception de

l’expression de UCP-1 (Enerbäck, 2010a). Néanmoins, il existe cependant deux différences

histologiques majeures entre ces deux types de tissus. En effet, les adipocytes blancs sont uni-

loculés et comportent peu de mitochondries, alors que les adipocytes bruns sont multi-loculés et

présentent de très nombreuses mitochondries qui expriment le cytochrome C (de couleur cuivre)

leurs conférant une couleur brune (Cinti, 2012; Wu et al., 2013).

Toutefois, avant 2010, l’existence d’une origine embryologique commune entre le derme,

le muscle et la graisse brune fut proposée (Atit et al., 2006; Seale et al., 2007; Timmons et al.,

2007; Seale et al., 2008; Tseng et al., 2008; Kajimura et al., 2009). Depuis, il est admis que les

adipocytes bruns sont issus du mésoderme paraxial contrairement aux adipocytes blancs qui

dérivent du mésoderme latéral. Ainsi, il a été montré chez le rongeur que lors de l’embryogenèse,

certaines cellules du mésoderme paraxial se différentient en dermomyotomes, des cellules

progénitrices qui sont à l’origine de la formation du derme, du muscle et du BAT (Billon and

Dani, 2012). Les premiers indices de ces différences histologiques furent apportés par Atit et ses

collaborateurs en 2006, qui ont montré que l’invalidation du gène engrailed-1 (En1), un gène

exprimé uniquement durant la différenciation des cellules du dermomyotome, perturbe le

29

développement du derme et des muscles mais aussi du BAT interscapulaire (Atit et al., 2006).

Parallèlement, Timmons et ses collaborateurs ont montré à l’aide du micro-array que les cellules

indifférenciées progénitrices des adipocytes bruns ont un profil transcriptionnel comparable à

celui des cellules musculaires (Timmons et al., 2007), (Figure 7A). Ces cellules expriment en

effet différents facteurs myogéniques et notamment le facteur myogénique 5 (Myf5). Les cellules

progénitrices exprimant ce facteur sont nommées Myf5+, tandis que celles ne l’exprimant pas,

sont des cellules qualifiées de Myf5- (Timmons et al., 2007). Par la suite, Tseng et ses

collaborateurs ont mis en évidence le rôle d’un cocktail hormonal contenant du Bone

Morphogenetic Protein-7 (BMP-7), sur la différenciation des dermomyotomes en pré-adipocytes

bruns et la maturation des pré-adipocytes bruns en adipocytes bruns fonctionnels (Tseng et al.,

2008). Toutefois, cette dernière étape est conditionnée à la formation d’une cassette d’expression

constituée par le facteur de transcription PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain-containing-16

(PRDM16) et la forme active de CCAAT/enhancer-binding protein-β (C/EBPβ) (Kajimura et

al., 2009). Enfin, certains facteurs sont capables d’orienter le devenir des précurseurs des

adipocytes bruns. Ainsi, la forkhead box C2 (FOXC2) et le peroxisome-proliferator-activated

receptor-γ (PPAR-γ) co-activator 1α (PGC1α) favorisent la différenciation en adipocytes

brun, tandis que la retinoblastoma protein (pRB) ou la receptor-interacting protein 140 (RIP40)

agissent à titre de répresseurs de la différenciation (Kajimura et al., 2010).

30

Figure 7: Representation schématique de la différenciation des adipocytes.

A) L’origine des adipocytes bruns et des cellules musculaires squelettiques. B) L’origine des adipocytes

blancs et beiges. (Traduit et adaptée de (Kajimura et al., 2010)).

Abréviation: BMP-7, Bone Morphogenetic Protein-7; En1+, engrailed-1; Myf5, myogenic factor 5;

PGC1α, PPARγ co-activator 1-α; PPARγ, peroxisome-proliferator-activated receptor-γ ; PRDM16,

PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain-containing-16; UCP-1, uncoupling protein-1.

BMP7%

BMP7%

Myoblaste% Muscle%squele1que%

Adipocyte%brun%Pré9adipocyte%brun%

dermomyotome%

4%Précurseur%

d’adipocyte%beige%

Pré9adipocyte%blanc%

BMP4%adipocyte%blanc%

Cellule%souche%mésodermale%

Précurseur%d’adipocyte%brun%(myf59)%du%Dssu%

adipeux%blanc%%%

Adipocyte%brun%«9like»%inducDble%du%Dssu%

adipeux%blanc%%%

pRB;%RIP40%%

PPARγ+;%UCP91+%

PPARγ+%

PPARγ+%

PPARγ+;%PRDM16+;%PGC1α;%UCP91+%

PRDM16+%%

Myf5+;%MyoD+%% MyoD+;%Myogenin+%%

En1+;%Myf5+%%

31

2.1.1.2 Localisation du tissu adipeux brun chez le rat et l’homme.

Les adipocytes bruns sont regroupés en différents dépôts, qui ont été découverts suite à des

nécropsies chez le rat. Ces dépôts sont situés dans les régions interscapulaire (la mieux

caractérisée), cervicale, péri-aortique, péri-rénale, intercostale et médiastinale (Cannon and

Nedergaard, 2004) (Figure 8A).

Chez l’Homme, le BAT fut longtemps considéré comme un organe vestigial régressant

avec l’âge et n’ayant comme seule fonction que le maintien de la température corporelle chez le

nouveau-né (Lean, 1989). Il fallut attendre le développement de l’imagerie médicale et plus

particulièrement de la tomographie par émission de positron (TEP) dans les années 2000, pour

observer des dépôts d’adipocytes bruns actifs chez l’adulte, suggérant que le BAT persiste et

demeure fonctionnel. En effet, en 2002 lors d’un examen de routine en oncologie, l’utilisation du

fluorodésoxyglucose, qui permet de visualiser les tissus métaboliquement actifs en TEP, a révélé

la présence de dépôts symétriques de graisse brune active au niveau supra-claviculaire chez

l’homme (Hany et al., 2002). Par la suite, plusieurs études réalisées chez l’Homme dans des

conditions d’hypothermie ont également permis de révéler l’existence de dépôts cervicaux et

para-spinaux métaboliquement actifs (Figure 8B), (Nedergaard et al., 2007; Cypess et al., 2009;

van Marken Lichtenbelt et al., 2009; Zingaretti et al., 2009; Enerbäck, 2010b; Richard et al.,

2010).

2.1.1.3 Le secrétome du tissu adipeux brun.

Pendant longtemps, le seul rôle connu du tissu adipeux brun était la production de chaleur

dans le but de maintenir la température corporelle. Cependant, des études évaluant l’impact de

l’ablation génétique du BAT et d’UCP1 chez le rongeur ont montré que le BAT a d’autres

fonctions qui vont au-delà de l’oxydation des surplus d’énergie et de la thermorégulation (Lowell

et al., 1993; Enerbäck et al., 1997). Cette découverte a permis de mettre évidence le rôle

autocrine, paracrine mais surtout endocrine du BAT. En effet, le BAT sécrète des facteurs qui

agissent localement, pour favoriser son maintien et son développement. Par exemple,

l’angiogenèse au sein du BAT est favorisée par la libération du vascular endothelial growth

factor-A (VEGF-A) (Xue et al., 2009), la prolifération des précurseurs d’adipocytes bruns est

stimulée par la sécrétion de l’insulin-like growth factor-1 (IGF-1) et du fibroblast growth factor-2

32

(FGF-2) (Yamashita et al., 1994), tandis que la sensibilité des cellules à la noradrénaline (NA) est

maintenue grâce au bone morphogenetic protein-8b (BMP-8b) (Whittle et al., 2012) (figure 9g).

Par ailleurs, certaines études indiquent que le BAT constitue également un organe endocrinien,

capable de libérer des composés de type « Adipokine-like », baptisés batokines (Villarroya et al.,

2013). Plusieurs batokines tels que la triiodothyronine (T3), l’interleukine-6 (IL-6), le fibroblast

growth factor-21 (FGF-21), le BMP-8b, le retinol-binding protein-4 (RBP-4) et la lipocalin

prostaglandin D synthase (L-PGDS), ont ainsi été découvertes chez le rongeur (Villarroya et al.,

2013). Toutefois, seuls l’IL-6 et le FGF-21 ont clairement été identifiés comme intervenant dans

la mise à disponibilité des substrats pour le BAT, la régulation centrale de son activité, ainsi que

sur la sensibilité à l’insuline et l’activité des cellules bêta du pancréas (Villarroya et al., 2013).

A

B

surrénale!!

Para-vertébrale!!

médiastinale!!

supraclaviculaire!!

Le cou!!

intercostale!

Peri-rénale!Peri-aortique!

interscapulaire!

33

Figure 8: Localisation du tissu adipeux brun chez le rat et l’homme.

A. Distribution des dépôts de tissu adipeux brun chez le rat (tirée de (Cannon and Nedergaard,

2004)). B. Distribution des dépôts de tissu adipeux brun chez l’Humain (tirée de (Nedergaard et al.,

2010)).

2.1.1.4 Les adipocytes beiges.

Certaines études récentes ont permis de mettre en évidence la présence de cellules au

phénotype comparable à celui des adipocytes bruns, au sein des dépôts d’adipocytes blancs.

Ainsi, il a été montré chez le rongeur que ces adipocytes (Wu et al., 2013), baptisés adipocytes

beiges ou brite (brown in white), sont présents notamment dans le dépôt adipeux inguinal et que

leur développement est stimulé par l’injection d’agonistes adrénergiques ou par une exposition au

froid (Cannon and Nedergaard, 2012; Wu et al., 2012). À ce jour, les facteurs et les voies

impliqués dans le développement des adipocytes beiges restent indéterminés. Toutefois,

considérant la nature inductible et la localisation des adipocytes beiges, quatre hypothèses sur

leur origine phylogénique sont actuellement proposées. Selon ces différentes hypothèses, les

adipocytes beiges pourraient dériver (i) de précurseurs d’adipocytes bruns présents au sein du

tissu adipeux blanc (Petrovic et al., 2010), (ii) de précurseurs d’adipocytes blancs (Pisani et al.,

2011), (iii) d’adipocytes blancs matures trans-différenciés (Cinti, 2009; 2012) ou, (iv) de

précurseurs spécifiques aux adipocytes beiges (Wu et al., 2012). En effet, des travaux réalisées

chez le rongeur indiquent que les adipocytes beiges ont un transcriptome unique qui diffère de

ceux des adipocytes blancs et bruns (Wu et al., 2012) (Figure 7B). Toutefois, il a été montré par

Seale et ses collaborateurs que le développement des adipocytes beiges est conditionné à la

présence de PRDM16, un facteur de transcription également impliqué dans la mise en place du

BAT (Seale et al., 2011), indiquant que ce facteur de transcription est essentiel au brunissement

du tissu adipeux.

2.1.1.5 La lipogenèse et la lipolyse une compétence commune à tous les adipocytes.

La lipogenèse et la lipolyse sont deux mécanismes assurant le métabolisme des acides gras

libres (AGL) dans les adipocytes. Les AGL constituent un substrat énergétique essentiel pour

l’organisme. Cependant, l’accumulation excessive d’AGL peut devenir cytotoxique pour

l’adipocyte. Afin de préserver l’intégrité cellulaire les adipocytes stockent les AGL sous forme de

34

triglycéride (TG) dans des gouttelettes lipidiques, grâce à la lipogenèse. Le TG est un composé

hydrophobe et biologiquement inerte formé d’une molécule de glycérol estérifiée par trois acides

gras. Néanmoins, les TG doivent être hydrolysés lors de la lipolyse, pour former de nouveau des

AGL et du glycérol, utilisables par l’adipocyte et l’organisme comme substrats énergétiques.

La lipogenèse de novo.

Durant la phase postprandiale, les niveaux circulants d’insuline augmentent et induisent la

translocation du transporteur du glucose de type 4 (GLUT4, glucose transporter type 4) vers la

membrane plasmique de l’adipocyte, permettant ainsi l’entrée de glucose (James and Pilch,

1988). Une fois dans le cytosol, le glucose est phosphorylé permettant ainsi à ses carbones de

servir de précurseur pour la synthèse d’acide gras suite à l’action séquentielle de l'acétyl-

coenzyme A carboxylase (ACC, acyl-coA carboxylase) et de l'acide gras synthétase (FAS, fatty

acid synthetase) (Shi and Burn, 2004).

D’autre part, les AGL à longue chaine sont en mesure de passer la membrane de façon

passive, toutefois leur transport actif peut être stimulé par l’insuline qui favorise la translocation

de la protéine transporteuse d’acide gras 1 (FATP1, fatty acid transport protein 1) du cytosol vers

la membrane plasmique (Lobo et al., 2007). Les AGL sont alors convertis en acyl-CoA dans le

réticulum endoplasmique par l'acétyl-coenzyme A synthase (ACS, acyl-coA synthase).

Par la suite, cet acyl-CoA est à un glycerol-3-phosphate (G3P) par une réaction d’acylation

réalisée par le glycérol-phosphate acyltransférase (GPAT) pour former un acide

lysophosphatidique (ALP) (Gimeno and Cao, 2008). Puis, l'acylglycérol-phosphate

acyltransférase (AGPAT) lie un second groupement acyl-Coa à ALP pour générer l'acide

phosphatidique (APp) (Shindou et al., 2009). Ensuite, l’APp est converti en diglycéride (DG) par

l’activité phosphatidate phosphatase de la lipine (Reue and Dwyer, 2009). Finalement, l'action de

la diacylglycérol acyltransférase (DGAT) conduit à l'ajout d’un dernier acide gras nécessaire pour

obtenir un TG (Yen et al., 2008). Les TG sont ensuite entreposés dans des gouttelettes lipidiques,

dont la périlipine permet le maintien en inhibant l’action des lipases (Tansey et al., 2001).

35

La lipolyse intracellulaire.

Lors de la lipolyse, les TG contenus dans les gouttelettes lipidiques sont hydrolysés, pour

produire des AGL et du glycérol. Ces produits sont libérés dans la circulation sanguine par les

adipocytes blancs ou utilisés comme source d’énergie pour effectuer la thermogenèse par les

adipocytes bruns (Jaworski et al., 2007) (Cf. 2.1.2.2). Pour réaliser la lipolyse, trois lipases sont

nécessaires, la lipase des TG du tissu adipeux (ATGL, adipose triglyceride lipase), la lipase

sensible aux hormones (HSL, hormone-sensitive lipase) et la lipase du monoacylglycérol (MGL,

monoacylglycerol lipase) (Jaworski et al., 2007). Ces lipases interviennent successivement,

libérant ainsi un acide gras à chaque étape. L’ATGL hydrolyse donc le TG en DG, la HSL

hydrolyse le DG en monoacylglycérol (MAG) et la MGL hydrolyse le MAG en AGL.

Néanmoins, la lipolyse ne serait pas possible sans la phosphorylation de la périlipine par la

protéine kinase A (PKA), qui entraine la fragmentation des gouttelettes lipidiques permettant

ainsi l’accès de l’ATGL au TG. De plus, la PKA phosphoryle les différentes lipases pour

favoriser la production d’AGL (Jaworski et al., 2007).

2.1.2 Les mécanismes cellulaires permettant la production de chaleur.

En réponse au froid ou à l’ingestion de nourriture le SNS libère de la NA au niveau du

BAT. Celle-ci va se lier à un récepteur adrénergique et permet ainsi l’augmentation de l’activité

et de la capacité thermogène du BAT (Richard et al., 2012; Chechi et al., 2013).

2.1.2.1 L’activation de l’adipocyte brun : la cascade adrénergique.

Les adipocytes bruns expriment plusieurs types de récepteurs adrénergiques. Cependant,

seul le récepteur β-3 (ADRB3) stimule la thermogenèse, alors que le récepteur β-1 intervient dans

la maturation du pré-adipocyte brun (Cannon and Nedergaard, 2004). L’ADRB3 est couplé à une

protéine G dont la sous unité alpha est stimulatrice (Gs), celle-ci active l’adénylate cyclase afin

d’augmenter la synthèse d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). L’AMPc permet

l’activation de la PKA (Collins, 2011; Chechi et al., 2013; Harms and Seale, 2013). Le rôle de la

PKA est de phosphoryler différentes protéines situées à la fois dans le cytosol et dans le noyau

(Figure 9a). Ces protéines sont impliquées dans la transformation des triglycérides stockés dans

les gouttelettes lipidiques en AGL et en glycérol (Cf. 2.1.2.2) afin de stimuler la thermogenèse,

36

ainsi que dans les processus transcriptionnels permettant la synthèse des différents acteurs

nécessaires à l‘activité thermogène du BAT (Cf. 2.1.2.3).

Figure 9: L’activation de l’adipocyte brun.

a. La cascade moléculaire du récepteur adrénergique β3 régulant l’activation de PKA. b. La

phosphorylation des protéines impliquées dans la lipolyse et la transformation de l’acide gras en acide

gras-CoA ou acyl-CoA. c. L’acide gras-CoA traverse la membrane de la mitochondrie à l’aide des

carnitine palmitoyl transférases 1 et 2 puis il est pris en charge dans la beta-oxydation et le cycle de

Krebs pour donner des FADH2 (Flavine adénine dinucléotide H2) et des NADH, H+ (Nicotinamide

adénine dinucléotide H, H+) nécessaires au fonctionnement de la chaine respiratoire. d. Le

fonctionnement de la chaine respiratoire. e. Schéma illustrant l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement

de UCP-1 (adapté de (Kajimura and Saito, 2013)). f. La phosphorylation de P38 permet la

phosphorylation des acteurs impliqués dans la transcription des gènes mitochondriaux, des co-activateurs

d’UCP-1 et d’UCP-1 (extrait de (Richard et al., 2010)). g. Schéma récapitulatif des molécules libérées

par différents organes et agissant sur l’adipocyte brun (extrait de (Harms and Seale, 2013)).

Abréviations : AC, adénylate cyclase; ACS, acyl-CoA synthétase; AG, acide gras; AGLC, AG à longue

chaine; ADP, Adénosine diphosphate; AMPc, adénosine monophosphate cyclique; ATGL, adipose

triglyceride lipase; ATP, Adénosine triphosphate; β3, récepteur adrénergique β3; β-ox, β-oxidation; CdK,

cycle de krebs; CPT1, carnitine palmitoyl transférase 1; CPT2, carnitine palmitoyl transférase 2; DG,

Diglycéride; Gs, protéine G stimulatrice; HSL, hormone-sensitive lipase; MG, Monoglycéride;

MGL, monoacylglycerol lipase; NA, noradrenaline; P38, P38α mitogen-activated protein kinase; PKA,

protéine kinase A; PLA2, la phospholipase A2; TG, Triglycerides ; UCP-1, uncoupling protein-1.

37

Gs#

β3#

AMPc#ATP#

PKA#inac/ve#

PKA#ac/ve#

+#

AC#

HSL#

lipides#

TG#

SL#

DG#

MG#

AG#ACS#

Acyl<CoA#

Acyl<CoA#

β<ox#

acétyl<CoA#

NADH+,H#FADH2#

CdK#NADH+,H#FADH2#

NADH+,H#

I#II#

III# IV#

H+#H+# H+#

Q#

NAD+#

C#

e<#

FADH2#FAD#

2H+#+#½#O2# H2O#

IV#C#

H+#

V#

2O#H+#

UCP1#

ADP#+#Pi#

ATP#

PLA2#

<#

ATP?#

+

Chaleur#

P38#

? ?

Membrane#externe#mitochondriale#

Membrane#interne#mitochondriale# {#Espace#inter<membranaire#

Matrice#mitochondriale#

NA#N #

a#

b#

c#

e#

NADHd#

? f#

g#

AGLC#

38

2.1.2.2 Les mécanismes de l’activité thermogène.

Suite à l’activation de l’ADRB3, la PKA stimule la lipolyse afin de générer des AGL

(Zechner et al., 2009), (Cf. 2.1.1.5), (Figure 9b). Les AGL à longue chaine carbonée (C16 et plus)

sont alors transformés en acyl-CoA par l’acyl-CoA synthétase. L’acyl-CoA est ensuite pris en

charge par la navette de la carnitine. Dans le détail, la carnitine palmitoyl transférase 1β

(CPT1β) déplace le groupe acylé de l’acyl-CoA sur la carnitine, car le CoA ne passe pas les

membranes de la mitochondrie. L’acyl-carnitine est alors transportée dans la matrice

mitochondriale par une translocase. Une fois dans la matrice mitochondriale, la carnitine acyl

transférase 2, transfère le groupement acyl de l’acyl-carnitine à un CoA présent dans la

mitochondrie, l’acyl-CoA peut alors servir de substrat à la β-oxydation. La prise en charge de

l’acyl-CoA dans la β-oxydation génère un acétyl-CoA, une Flavine adénine dinucléotide H2

(FADH2) et une Nicotinamide adénine dinucléotide H, H+ (NADH, H+) par tour d’hélice de

Lynen (un cycle de β-oxydation). Les acétyl-CoA produits vont être pris en charge par le cycle de

Krebs pour générer des FADH2 et des NADH, H+ supplémentaires. Les protons (H+) ainsi

récupérés par la NAD et la FAD vont être utilisés par la chaine respiratoire (Nicholls and Locke,

1984; Richard and Picard, 2011), (Figure 9c).

La chaine respiratoire est composée de 4 complexes fixes et de 2 transporteurs mobiles

d’électrons. Elle est insérée dans la membrane interne de la mitochondrie et utilise les NADH, H+

et FADH2 pour transporter les H+ de la matrice vers l’espace inter-membranaire de la

mitochondrie. Ce pool de H+ est utilisé par l’ATP synthase afin d’ajouter un groupement

phosphate à l’adénosine diphosphate (ADP) pour obtenir de l’adénosine triphosphate (ATP)

(Nicholls and Locke, 1984; Richard and Picard, 2011). Toutefois, dans les adipocytes bruns

UCP-1 a la capacité de découpler la chaine respiratoire en transportant les protons de l’espace

inter-membranaire vers la matrice mitochondriale. Le découplage de la chaine respiratoire a pour

conséquence de vider la réserve en protons de l’espace inter-membranaire. En réponse, la chaine

respiratoire va s’activer de façon intense et donc générer une quantité très importante de chaleur

en comparaison avec une cellule n’exprimant pas UCP-1 (Nicholls and Locke, 1984; Richard and

Picard, 2011), (Figure 9d). À propos de l’activation et du fonctionnement d’UCP-1 plusieurs

modèles sont envisagés (Divakaruni and Brand, 2011). En effet, la protéine UCP-1 n’est pas

constitutivement active puisque dans des conditions de thermoneutralité et de jeûne, des purines

39

comme l’ATP et l’ADP notamment, sont capables de l’inhiber. Mais très récemment, une étude

utilisant la méthode de patch-clamp réalisée par l’équipe du docteur Kirichok (Fedorenko et al.,

2012) a permis de proposer un mécanisme expliquant l’activation de UCP-1 et le passage des

protons au sein du canal UCP-1. Ce mécanisme implique les AGL à longue chaine chargées

négativement (AGLC-) issus de l’activation de la phospholipase A2 (PLA2), qui est localisée sur

la membrane interne de la mitochondrie. Les AGLC- vont par la suite activer UCP-1 et servir de

substrat pour transporter les protons (Fedorenko et al., 2012; Kajimura and Saito, 2013), (Figure

9e).

2.1.2.3 Les mécanismes de la capacité thermogène.

La protéine UCP-1, est une protéine de 33kDa codée par un gène localisé sur le

chromosome 4 chez l’homme et 8 chez la souris (Puigserver et al., 1992; Picó et al., 1994).

L’expression d’UCP-1 est augmentée par une stimulation adrénergique ou par l’administration

d’un agoniste de PPARγ (Nedergaard et al., 2005). En effet, suite à une stimulation adrénergique,

la PKA est activée et phosphoryle la P38α mitogen-activated protein kinase (Collins et al., 2010).

Celle-ci entraine alors la phosphorylation d’un dimère d’activating-transcription factor-2 (ATF2)

situé sur le cAMP Response Element (CRE) du promoteur de PGC1α induisant de ce fait la

transcription de ce dernier (Puigserver et al., 1998). Ensuite, PGC1α interagit directement avec

les nuclear respiratory factor 1 et 2 (NRF1 et NRF2) pour stimuler la synthèse de novo de gènes

mitochondriaux tels que CPT1β, qui interviennent également dans la thermogenèse (Richard et

al., 2010).

Le promoteur d’UCP-1 contient plusieurs séquences régulatrices appelées éléments de

réponse, permettant la fixation et l’activation de l’ARN polymérase afin de générer des ARNm

d’UCP-1 (Cannon and Nedergaard, 2004). Parmi ces éléments de réponse qui sont le thyroid

response element (TRE), le retinoic acid response element (RARE), le CRE et le PPAR response

elements (PPRE), ces deux dernier sont les plus étudiés, cependant PPRE engendre la plus forte

expression d’UCP-1 à ce jour (Cao et al., 2004a; Chen et al., 2013). Lors d’une activation

adrénergique, un hétérodimère composé de deux récepteurs nucléaires, le retinoid X receptor-α

et le PPARγ va se former et se fixer sur le PPRE. Toutefois, pour que l’expression d’UCP-1 soit

activée, cet hétéromère s’associe à PRDM16 et PGC1α, qui peut alors être phosphorylé et activé

40

par la P38α map kinase. Cette kinase intervient également dans la phosphorylation et l’activation

d’ATF2, qui lie alors le site CRE du promoteur d’UCP-1 et participe ainsi à la mise en place de la

cassette d’expression nécessaire à l’expression d’UCP-1 et à la préparation du BAT aux futurs

modifications environnementales (Cao et al., 2004a; Richard et al., 2010; Collins, 2011). Enfin,

l’expression d’UCP-1 peut être inhibée par un mécanisme impliquant le liver X receptor-α et un

co-répresseur de PPARγ connu sous le nom de RIP140, qui entre en compétition avec le

complexe PGC1α/PRDM16 situé sur le PPRE du promoteur d’UCP-1 (Debevec et al., 2007),

(Figure 9f).

2.1.2.4 Les facteurs endocriniens périphériques influençant l’adipocyte brun.

Outre le SNS, une variété de facteurs circulants identifiés chez le rongeur et chez l’homme

sont également capables de stimuler directement la capacité et l’activité thermogène des

adipocytes bruns classiques, ou encore de favoriser le recrutement des adipocytes beiges

(Kajimura and Saito, 2013; Schulz and Tseng, 2013), (Figure 9g).

Les hormones thyroïdiennes.

La deiodinase iodothyronine 2 (DIO2) permet le passage de la forme inactive, la thyroxine

(T4) en triiodothyronine (T3) active. Des études réalisées chez le rongeur indiquent que la

délétion du gène codant pour la protéine DIO2 entraine une diminution importante de

l’expression d’UCP-1, qui s’accompagne d’un dysfonctionnement de la thermogenèse et a pour

conséquence une hypothermie lors de l’exposition au froid (de Jesus et al., 2001). Cette

expérience démontre que la T3 est indispensable au maintien de l’expression d’UCP-1 et que la

thyroïde et le SNS agissent en synergie dans le maintien de la température corporelle.

Les peptides natriurétiques.

Parmi les peptides natriurétiques (PNs), les plus communément étudiés sont ceux provenant

de l’oreillette du cœur tel que l’atrial natriuretic peptide (ANP), ceux provenant du cerveau tel

que le brain-derived natriuretic peptide (BNP) et ceux de type-C (C-type natriuretic

peptide_CNP) produit par le SNS, les chondrocytes et les cellules de l’endothélium vasculaire

(Lancha et al., 2012; Kajimura and Saito, 2013). Des études récentes ont montré que les PNs

contrôlent la prise alimentaire et la thermogenèse du BAT (Inuzuka et al., 2010; Bordicchia et al.,

41

2012). En effet, l’utilisation d’un modèle de souris déficiente pour le récepteur de la clairance aux

PNs (Bordicchia et al., 2012), récepteur qui a pour fonction de retirer l’ANP et le BNP de la

circulation sanguine (Maack et al., 1987), montre que l’ANP et le BNP stimulent l’expression

d’UCP-1, et le développement des adipocytes beiges au sein du tissu adipeux blanc (Bordicchia

et al., 2012). De plus, l’exposition au froid est associée à une augmentation des niveaux d’ANP et

de BNP circulants, indiquant leurs possibles implications dans la thermorégulation (Bordicchia et

al., 2012). Par ailleurs, les CNP inhibent la thermogenèse en atténuant l’activité du SNS sur le

BAT (Inuzuka et al., 2010). Il apparaît donc clairement que les PNs constituent une nouvelle

cible de recherche dans la compréhension des mécanismes de régulation de la thermogenèse et de


Le FGF-21.

Le FGF-21 est principalement produit par le foie, il est impliqué dans le métabolisme du

glucose et des lipides. Chez le rongeur nouveau-né, la libération hépatique de FGF-21 qui

survient en réponse aux acides gras du lait, augmente l’expression de plusieurs gènes impliqués

dans la thermogenèse du BAT dont UCP-1 (Hondares et al., 2010). De plus, le FGF-21 est

exprimé et secrété en réponse au froid ou à un traitement avec des agonistes adrénergiques

(Chartoumpekis et al., 2011). Par ailleurs, une étude récente réalisée sur une souris déficiente

pour le gène codant la protéine FGF-21 montre une diminution du nombre d’adipocytes beiges

dans le tissu adipeux blanc sous-cutané. De plus, des études réalisées sur ce modèle indiquent

également qu’une exposition au froid s’accompagne d’une chute plus importante de la

température corporelle (Fisher et al., 2012), suggérant l’implication de FGF-21 dans la

thermorégulation. Enfin, chez l’humain le FGF-21 est augmenté lors d’une exposition modérée

au froid et pourrait donc représenter un bon indicateur de la capacité thermogène (Lee et al.,

2013a).

L’irisine.

L’irisine est une hormone qui a été récemment identifiée chez la souris et chez l’humain

(Boström et al., 2012). C’est la forme clivée et secrétée de la protéine membranaire FNDC5. Elle

est exprimée dans le muscle sous le contrôle de PGC1α en réponse à l’exercice (Boström et al.,

2012). Une augmentation des niveaux circulants d’irisine est associée à une augmentation de 10 à

42

20 fois de l’expression de UCP-1 dans le dépôt adipeux blanc sous-cutané (Boström et al., 2012).

De plus, l’irisine stimule certains gènes impliqués dans la différenciation des pré-adipocytes

beiges (Wu et al., 2012), suggérant ainsi que cette hormone pourrait participer activement à

l’augmentation de la capacité thermogène de l’organisme.

2.2 Le contrôle central de l’activité thermogène du tissu adipeux brun.

Le contrôle central de l’activité thermogène du BAT est avant tout réalisé dans le but de

réguler la température corporelle de l’organisme. Cependant, le SNC est aussi impliqué dans le

contrôle de l’activité thermogène du BAT lors de modifications physiologiques, telles que

l’inflammation ou l’hypoglycémie, cela dans le but de contrôler les dépenses énergétiques.

2.2.1 Le contrôle central du tissu adipeux brun lors de la thermorégulation.

Le contrôle de la température corporelle nécessite la mise en place d’un certain nombre de

mécanismes. En effet, la thermorégulation est réalisée grâce aux afférences sensitives informant

l’hypothalamus, et celui-ci va intégrer les signaux environnementaux afin d’agir adéquatement

sur le SNS, qui stimule l’activité du BAT interscapulaire (iBAT) (Morrison et al., 2012) (Figure

10).

Figure 10: Représentation de la circuiterie neuronale contrôlant l’activité du iBAT.

Abréviation : 5HT, la sérotonine; AC, l’acétylcholine; BAT SC, neurone sensible au chaud; CD, la

corne dorsale; DMH, le noyau dorsomédian de l’hypothalamus; GABA, l’Acide γ-aminobutyrique GLU, le

glutamate; iBAT, tissu adipeux brun interscapulaire; IML, la colonne intermédiolatérale de la moelle

épinière; LHA, l’hypothalamus latéral; MnPO, noyau préoptique médian; MPO, noyau préoptique

médial; MVL, la médulla ventrolatérale; NA, noradrénaline; NTS, le noyau du tractus solitaire; PBLd, le

noyau parabrachial latéral (dorsal); PBLle, le noyau parabrachial latéral (latéral externe); PVH, le

noyau paraventriculaire de l’hypothalamus; RPar, le noyau du raphé pallidus rostral; TRPV1/3 et

TRPM8, transient receptor potentiel V1/3 and M8. Adapté et traduit de (Morrison et al., 2012).

43

2.2.1.1 Les afférences de la perception thermique cutanée et centrale.

La perception thermique est realisée par des cellules nerveuses dont le corps cellulaire se

situe au niveau du derme. Cependant, celles-ci emettent des projetions vers l’épiderme où elles

expriment des récepteurs sensibles à la température externe. Le message nerveux est ensuite

transmis grace à des prolongements axonaux vers la corne dorsale où a lieu la divergence entre la

perception thermique et la nociception. Ensuite, le message codant la température transite par le

noyau parabrachial latéral (PBL) où deux sous régions prennent en charge les stimuli codant pour

le froid et les stimuli codant pour le chaud, tandis que le message nociceptif est conduit vers le

thalamus (Morrison et al., 2012).

CD#

PBLd#

peau#

chaud# froid#

TRPV1/3# TRPM8#

+# +#

+# +#

+# +#

BAT#SC#

_#

DMH#

MPO#

MnPO#

+#

LHA#

iBAT#

RPar#

IML#

PVH#

MVL#NTS#+#+#+#

IML#

MVL#NTS#

GLU#

GLU#+#

GABA#

_#

5HT#_#

GABA#

GABA#

GLU#GABA#

GLU#

GLU#

+#AC#+#

+#+#

+#

NA#

PBLle#

44

Les récepteurs impliqués dans la perception thermique.

Lorsqu’une modification de la température de l’environnement intervient, la température de

la peau change, cette variation de la température est alors détectée par des thermorécepteurs

cutanés situés à la terminaison des nerfs sensitifs primaires, ce qui initie la thermorégulation et

permet ainsi d’éviter une variation de la température corporelle néfaste pour l’organisme. Ces

thermorécepteurs font partie de la famille des récepteurs à potentiels de transition des canaux

cations (transient receptor potentiel (TRP) familly of cation channels) et sont exprimés au niveau

de l’épiderme, du SNC et de l’abdomen pour y permettre le maintien des conditions idéales au

bon fonctionnement des organes vitaux (Morrison et al., 2012). Dans la famille des TRP on

trouve un récepteur sensible au froid, le TRPM8, et trois récepteurs sensible au chaud, les

TRPV1, 3 et 4. Le TRPM8 est réactif à un faible stimulus du froid et la délétion du gène codant

pour ce récepteur s’accompagne d’une réduction de la sensibilité au froid (Dhaka et al., 2007)

pouvant conduire à l’hypothermie. D’autre part, les souris déficientes pour les gènes codant les

protéines TRPV3 et 4 sont incapables de discriminer les températures chaudes (Lee et al., 2005).

Enfin, ces récepteurs présentent un grand intérêt dans la lutte contre l’obésité par le froid, car ils

sont sensibles à certaines molécules. En effet, le menthol entraine une réponse physiologique

comparable à celle produite par le froid (Peier et al., 2002) et pourrait être utilisé comme

molécule anti-obésité tel que le suggère en 2012 Ma et ses collaborateurs (Ma et al., 2012). De

plus, le TRPV1 peut être activé par de la capsaïcine (Tominaga et al., 1998), cette dernière est

aussi considérée comme une drogue anti-obésité (Leung, 2014).

La corne dorsale est le centre de la divergence entre les perceptions thermique et

nociceptive.

Le ganglion nodal, situé en bordure de la corde spinale, contient les neurones de premier

ordre ou fibres somatosensorielles thermales primaires. Ces neurones émettent des projections à

la fois vers les récepteurs thermiques de l’épiderme et vers les neurones de la lamina I situés dans

la corne dorsale de la corde spinale, afin de leur transmettre l’information thermique. Les

neurones de second ordre de la lamina I sont capables de répondre de façon graduelle à des

stimuli froid et chaud (Craig et al., 2001), participant ainsi à la finesse de la réponse centrale. De

plus, c’est au sein des neurones de la corne dorsale que se séparent la voie neuronale impliquée

45

dans la perception consciente de la température (Craig, 2002) et la voie neuronale impliquée dans

la thermorégulation. La première voie fait intervenir le thalamus et le cortex somatosensoriel

primaire et son altération n’a aucun effet sur la réponse sympathique thermogène au froid

(Nakamura and Morrison, 2008a). La seconde voie implique des neurones glutamatergiques qui

émettent des axones vers le PBL, un relais majeur vers les noyaux hypothalamiques contrôlant le

iBAT (Hylden et al., 1989; Li et al., 2006).

Le noyau parabrachial.

Le PBL est subdivisé en deux sous parties. Le PBL latéral externe (PBLle) contient des

neurones glutamatergiques qui se projettent vers le noyau préoptique médian (MnPO), et sont

activés suite à une exposition au froid (Bratincsák and Palkovits, 2004; Nakamura and Morrison,

2008a). Le PBL dorsal (PBLd) contient lui aussi des neurones glutamatergiques qui se projettent

vers le MnPO, mais ceux-ci sont activés suite à une exposition au chaud (Bratincsák and

Palkovits, 2004; Nakamura and Morrison, 2010). Le rôle des neurones du PBL dans la

transmission cutanée et viscérale des signaux thermiques vers l’hypothalamus a été montré par

Kobayashi et Nakamura, et leurs collaborateurs (Kobayashi and Osaka, 2003; Nakamura and

Morrison, 2008a). En effet, lorsque les neurones du PBL sont inactivés par l’injection d’un

antagoniste des récepteurs au glutamate aucune activité du iBAT n’est observée suite aux

variations de température de la peau (Kobayashi and Osaka, 2003; Nakamura and Morrison,

2008a).

2.2.1.2 Les mécanismes hypothalamiques impliqués dans le contrôle du BAT.

Au sein du réseau neuronal régulant la température corporelle, l’hypothalamus et

notamment l’aire préoptique occupent une place centrale entre l’intégration des sensations

cutanées de la température externe et le contrôle de l’activité du iBAT. Grace à ses multiples

interconnexions, l’hypothalamus intègre les signaux sur l’état homéostatique de l’organisme afin

de générer une réponse thermogène adaptée (Morrison et al., 2012).

Le MnPO reçoit les signaux thermiques cutanés et génère la réponse thermogène.

Au sein de l’aire préoptique, les signaux du froid et du chaud sont transmis par des

afférences glutamatergiques provenant du PBL et dirigées vers des neurones respectivement

46

GABA(Acide γ-aminobutyrique)ergiques et glutamatergiques localisés dans le MnPO.

L’importance du MnPO dans la réponse thermogène au froid a été montrée

pharmacologiquement. En effet, l’inhibition de l’activité neuronale du MnPO par l’injection de

glycine ou d’un antagoniste des récepteurs au glutamate bloque la thermogenèse du iBAT induite

par le froid ou par l’activation du PBLle. De plus, la stimulation glutamatergique des neurones du

MnPO entraine une augmentation de la thermogenèse du iBAT similaire à la réponse au froid

(Nakamura and Morrison, 2008b; 2008a). Finalement, l’effet de la stimulation des neurones du

MnPO sur l’activité du BAT peut être renversé par l’administration d’un antagoniste au récepteur

GABAA dans le MPO, suggérant la présence d’interneurones GABAergiques au sein du MnPO

projetant vers le MPO. Dans la littérature plusieurs observations anatomiques supportent cette

hypothèse. En effet, (i) des neurones du MnPO innervent le noyau préoptique médial (MPO)

(Uschakov et al., 2007), (ii) le MnPO contient de nombreux neurones GABAergique (Nakamura

et al., 2002), (iii) il y a beaucoup plus de neurones activés (déterminé par l’expression de la

protéine C-Fos) dans le MnPO que dans le MPO lors d’une exposition au froid ou au chaud

(Bratincsák and Palkovits, 2004), (iv) la concentration extracellulaire de GABA dans l’aire

préoptique augmente lors de l’exposition au froid et diminue lors de l’exposition au chaud

(Ishiwata et al., 2005).

Les neurones sensibles au chaud du MPO, clés de voute de la thermorégulation.

Le MPO contient une population de neurones appelés neurones sensibles à la chaleur. Des

études de patch-clamp, réalisées sur coupe de cerveaux, montrent qu’ils émettent des potentiels

d’action lorsque la température du milieu de survie dépasse les 35 °C (Kobayashi and Osaka,

2003). Cependant, les mécanismes membranaires impliqués dans ce phénomène ne sont pas

encore élucidés. D’autre part, ces neurones libèrent du GABA et sont activés par les afférences

glutamatergiques provenant du MnPO et relayant les stimuli thermiques cutanés chauds. A

l’inverse ils sont inhibés par les afférences GABAergiques provenant du MnPO et relayant les

stimuli thermiques cutanés froids. Ils sont aussi inhibés lors d’une réponse immunitaire grâce à la

présence du récepteur 3 aux prostaglandines E (EP3-R), qui participent à la pyrogénèse (Cf.

2.2.2.2). Ces neurones, qui déchargent de façon spontanée en conditions de thermoneutralité,

voient leur taux de décharge diminuer proportionnelement à la baisse de la temperature, afin de

lever graduellement l’inhibition sur les neurones situé en aval tels que le DMH et le noyau du

47

raphé pallidus (RPa) (Lundius et al., 2010). Enfin, le taux de décharge des neurones sensibles au

chaud du MPO est le principal mécanisme neurophysiologique permettant l’équilibre de la

thermorégulation, lequel est déterminé par les afférences thermosensorielles de la peau et la

température locale du cerveau (Romanovsky, 2004).

Le DMH ou l’origine de l’excitation sympathique.

L’implication du DMH dans le relais de l’information vers le iBAT fut premièrement

suggérée par des expériences de transsection. En effet, une transsection réalisée caudalement à

l’aire préoptique augmente la thermogenèse du iBAT (Chen et al., 1998), alors qu’une

transsection réalisée caudalement à l’hypothalamus n’a aucun effet sur l’activité thermogène du

iBAT (Rothwell et al., 1983). Il en a été conclu qu’il existait une structure au sein de

l’hypothalamus dont l’activité stimule la thermogenèse du iBAT, mais qui est inhibée par les

neurones sensibles au chaud GABAergiques du MPO.

Dans un second temps, il a été montré que l’exposition au froid augmente l’expression de la

protéine C-Fos dans le DMH (Cano et al., 2003) et que la désinhibition des neurones du DMH

augmente à la fois l’activité du SNA du iBAT et la thermogenèse induite par celui-ci (Zaretskaia

et al., 2002; Cao et al., 2004b). Ensuite, Nakumura a montré qu’il y a bien un tonus inhibiteur

GABAergique provenant du MPO qui module l’activité des neurones du DMH (Nakamura et al.,

2005). D’autre part, l’injection d’un antagoniste des récepteurs au glutamate empêche toute

activité thermogène en réponse au froid (Madden and Morrison, 2004). Cependant, l’origine de

cette activation glutamatergique qui pourrait accompagner la levée d’inhibition GABAergique

reste encore obscure. Néanmoins, deux hypothèses sont proposées. La première fait appel aux

neurones qualifiés de sensibles au froid ou de thermiquement insensibles situés dans le MPO

(Boulant, 2006), la seconde pourrait faire intervenir des neurones glutamatergique situés dans la

substance grise périaqueducale (PAG) (de Menezes et al., 2009).

Le DMH ne projette pas directement vers les neurones sympathiques préganglionnaires du

iBAT, mais vers la médulla ventromédiale rostrale (MVMR) (Nakamura et al., 2005), plus

particulièrement vers le RPa rostral (RPar), qui est la région du SNC contenant les neurones pré-

moteurs sympathiques. Une étude de rétrotraçage neuronal réalisée chez le rat a permis de

colocaliser un traceur rétrograde monosynaptique provenant du RPar, avec la protéine C-Fos

48

exprimée dans le DMH suite à une exposition au froid (Sarkar et al., 2007). Enfin, il y a des

évidences qui montrent que le DMH projette aussi vers le PAG pour contrôler l’activité du BAT.

En effet, les neurones du PAG expriment C-Fos en réponse à une exposition au froid (Yoshida et

al., 2005) et sont capables de bloquer l’effet thermogène de la désinhibition du DMH (Rathner

and Morrison, 2006). Cependant, l’implication du PAG comme relais du DMH dans le contrôle

de la thermogenèse du iBAT reste à être plus amplement investiguée.

2.2.1.3 Le système nerveux sympathique.

Le SNS contrôlant le iBAT se situe dans les segments thoraciques 3 à 6 de la colonne

intermediolatérale de la moelle épinière (IML) (Cano et al., 2003; Fan et al., 2005). Celui-ci est

sous l’influence de neurones prémoteurs sympathiques localisés notamment dans le RPa, afin de

libérer la noradrénaline qui active la thermogenèse du iBAT (Morrison et al., 2012).

Les neurones prémoteurs sympathiques du BAT au sein du RPa.

L’inhibition des neurones de la MVMR entraine une chute dramatique de la température

corporelle chez le rat vigile (Zaretsky et al., 2003). De plus, Cano et ses collaborateurs montrent

en 2003 que le RPar est l’une des premières régions infectées par un virus (traceur rétrograde

polysynaptique) injecté préalablement dans le iBAT et que celui-ci est largement colocalisé avec

l’expression de C-Fos induit par l’exposition au froid dans le RPar (Cano et al., 2003). Ces

résultats montrent que le RPar occupe une position fondamentale au sein du réseau neuronal de la

thermorégulation, car il est à l’origine des neurones pré-moteurs sympathiques qui excitent les

ganglions sympathiques du iBAT situés dans la moelle thoraco-lombaire. Cependant, le RPar

n’est pas le seul noyau contenant des neurones pré-moteurs sympathiques du iBAT. En effet,

Cano et ses collaborateurs montrent que le PVH pourrait aussi participer à l’activation des

ganglions sympathiques du iBAT (Cano et al., 2003).

Les neurones pré-moteurs sympathiques du iBAT sont sous l’influence d’afférences

excitatrices glutamatergiques et inhibitrices GABAergiques avec une prédominance inhibitrice

afin de conserver les ressources énergétiques. En effet, l’injection dans le RPar d’un agoniste aux

récepteurs au glutamate ou d’un antagoniste aux récepteurs GABA augmente l’activité du SNA

dans le iBAT ainsi que la thermogenèse (Morrison, 1999; Madden and Morrison, 2003). A

49

l’inverse, l’inhibition de l’activité neuronale du RPar ou le blocage des récepteurs au glutamate

annule toute augmentation de l’activité du SNA du iBAT induit par le froid ou la fièvre

(Nakamura and Morrison, 2007; Ootsuka et al., 2008). De plus, plusieurs autres stimuli

d’origines diverses voient leurs effets sur la thermogenèse du iBAT bloqués par l’inhibition de

l’activité neuronale dans le RPar tel que, (i) le LHA (Cerri and Morrison, 2005), (ii) l’activation

des récepteurs aux opioïdes de type mu (Cao and Morrison, 2005), (iii) l’activation des récepteurs

au CRH dans l’aire préoptique (Cerri and Morrison, 2006), (iv) l’administration systémique de

leptine (Morrison, 2004), (v) l’activation centrale des récepteurs aux mélanocortines (Fan et al.,

2007).

La moelle épinière.

Le relais de l’action du SNC sur le contrôle de l’activité du iBAT dans la moelle épinière se

situe dans l’IML. Parmi les neurones du RPar projetant vers l’IML, la plupart sont

glutamatergiques mais certains expriment ou co-expriment de la sérotonine. En effet, le

transporteur vésiculaire au glutamate de type 3 qui constitue un bon marqueur phénotypique pour

les neurones glutamatergiques se trouve colocalisé dans le RPar, soit avec un virus de la pseudo

rage injecté dans le iBAT, soit avec C-Fos induit par une exposition au froid (Nakamura et al.,

2004). On trouve aussi quelques neurones du RPa qui projettent vers l’IML marqués pour la

glutamate décarboxylase 67, un marqueur phénotypique des neurones GABAergiques (Stornetta

et al., 2005). D’un point de vue fonctionnel, la mise en évidence de projections glutamatergiques

sur l’IML a été réalisée par l’administration de substances pharmacologiques directement dans

l’IML d’un rat anesthésié. En effet, des nano-injections de glutamate ou de l’acide N-méthyl-D-

aspartique (NMDA) active le SNA du iBAT ainsi que sa thermogenèse (Nakamura et al., 2004;

Madden and Morrison, 2006), alors que l’utilisation d’un antagoniste des récepteurs au glutamate

bloque l’augmentation de la thermogenèse suite à l’injection de bicuculine dans le RPa

(Nakamura et al., 2004). Le rôle de la sérotonine dans l’IML pour contrôler l’activité du iBAT fut

rapporté par des expériences pharmacologiques et génétiques. Le blocage des récepteurs à la

sérotonine dans la moelle épinière contrecarre les effets du froid sur le SNA du iBAT (Madden

and Morrison, 2010), tandis que l’injection de sérotonine dans l’IML stimule l’activité du SNA

du iBAT et potentialise même les effets d’une injection de NMDA dans l’IML sur l’activité du

SNA du iBAT ainsi que sa thermogenèse (Madden and Morrison, 2006). Enfin, le rôle significatif

50

des neurones sérotoninergiques dans la réponse normale au froid est supporté par l’absence

d’activité thermogène et la diminution de la température corporelle chez des souris

génétiquement modifiées qui n’ont pas de neurones secrétant la sérotonine (Hodges et al., 2008).

Les mécanismes permettant l’interaction entre les neurones glutamatergiques et sérotoninergiques

au sein de l’IML afin de contrôler l’activité du iBAT restent à être définis. Cependant, quelques

indices sont disponibles. Tout d’abord, Deuchars et ses collaborateurs en 2005 révèlent la

présence d’interneurones GABAergiques capables d’influencer la décharge des neurones

préganglionnaires sympathiques de l’IML (Deuchars et al., 2005). Ensuite, les terminaisons

synaptiques sérotoninergiques de l’IML se trouvent à proximité des neurones GABAergiques

(Morrison et al., 2012). Enfin, l’activation des récepteurs 5-HT1A sur les neurones

GABAergiques de l’IML potentialise l’excitation de neurones préganglionnaires sympathiques

(Madden and Morrison, 2006; 2008).

Par la suite, les neurones préganglionnaires sympathiques de l’IML se projettent vers le

ganglion nodal où ils libèrent de l’acétylcholine, qui active des récepteurs cholinergiques de type

nicotinique N1 situés sur les neurones postganglionaires. Ces derniers se projettent vers le tissu

adipeux brun et libèrent de la noradrénaline pour activer principalement le récepteur β3

adrénergique, qui stimule la thermogenèse.

2.2.2 Les autres mécanismes impliqués dans le contrôle central de l’activité du iBAT.

Au-delà des mécanismes centraux impliqués dans le contrôle de la thermogenèse du iBAT

lors de l’exposition au froid, d’autres systèmes interviennent pour contrôler l’activité du iBAT de

façon chronique comme lors du cycle éveil/sommeil et ultradien ou dans des situations

exceptionnelles telles que le stress, la fièvre, l’hypoglycémie et l’hypoxie.

2.2.2.1 Rythme ultradien et stress : rôle de l’orexine.

La perte des neurones à orexine conduit à différentes altérations, comme des désordres dans

les phases du sommeil, des perturbations métaboliques menant à un risque accru d’obésité et

affecte la thermorégulation associée au rythme ultradien (Hara et al., 2005; Mochizuki et al.,

2006; Plazzi et al., 2011). L’orexine est un neuropeptide synthétisé dans des neurones de

l’hypothalamus latéral, dorsal et périfornical, dont les projections sont dirigées vers le RPar.

51

Récemment, il a été montré que l’injection d’orexine dans le RPar active la thermogenèse

(Tupone et al., 2011). De plus, la toxine du choléra B injectée dans le iBAT migre directement

dans le RPar et est colocalisée avec des neurones orexinergiques (Tupone et al., 2011). D’autre

part, le stress lié à la manipulation des animaux induit une thermogenèse qui implique les

neurones à orexine (Zhang et al., 2010). Enfin, outre son action dans l’activité thermogène du

iBAT, l’orexine joue un rôle important pour la maturation et le maintien fonctionnel du iBAT. En

effet, lors des stades précoces du développement, l’orexine intervient dans la différenciation du

BAT, par la suite, elle est responsable du maintien de la fonctionnalité du iBAT lors du

vieillissement chez la souris (Sellayah et al., 2011; Sellayah and Sikder, 2013). L’ensemble de

ces éléments témoigne de l’impact de l’orexine sur toute la machinerie thermogène.

2.2.2.2 La fièvre.

La fièvre est définie par une température corporelle supérieure à 38°C et elle témoigne de

l’activité du système immunitaire en réponse à une infection ou à une inflammation. Tout

d’abord, la fièvre est considérée comme un mécanisme favorisant la survie de l’hôte à une

infection bactérienne ou virale, car l’élévation de la température corporelle à 39°C diminue la

virulence et le développement de la plupart des organismes pathogènes (Kluger and Vaughn,

1978). Cependant, une fièvre d’une forte intensité peut avoir des effets délétères sur l’organisme

et lorsque la température corporelle approche 43°C la mort de l’hôte peut survenir (Banet, 1986).

La fièvre se décompose en plusieurs phases lors desquelles on observe une élévation de la

température corporelle. Lors d’une induction pharmacologique de la fièvre chez le rat par

l’injection périphérique de lipopolysaccharide (LPS), une molécule présente sur la surface des

bactéries, il est observé une phase précoce à l’intérieur de la première heure et une phase tardive

entre une heure et six heures après l’injection (Elmquist and Scammell, 1996). Néanmoins, ces

deux phases sont dépendantes de la prostaglandine (PGE2) et de son action sur le récepteur EP3-

R situé dans l’aire préoptique et en particulier dans le MnPO et le MPO (Elmquist and Scammell,

1996; Oka et al., 2003). Toutefois, le lieu de synthèse de la PGE2 varie entre ces deux phases. En

effet, 40 minutes après l’injection de LPS, les niveaux d’expression de la cyclooxygenase-2 qui

participe à la biosynthèse de la PGE2 sont très élevés dans les poumons et le foie, alors qu’ils

restent identiques dans l’hypothalamus. De plus, l’injection par voie sanguine d’un anticorps

dirigé contre PGE2 lors de l’injection de LPS inhibe l’augmentation de la température corporelle

52

observée pendant la première phase, suggérant que la PGE2 est synthétisée par les macrophages

hépatiques et pulmonaires (Steiner et al., 2006). Ensuite, il a été montré que la seconde phase fait

intervenir de la PGE2 synthétisée par le réseau vasculaire situé à proximité de l’aire préoptique.

En effet, l’injection d’un inhibiteur de la cyclooxygénase 2 dans l’aire préoptique inhibe

l’élévation de la température corporelle induite par l’administration périphérique de LPS

(Scammell et al., 1998). Enfin, Ootsuka et ses collaborateurs montrent en 2008 qu’une injection

intraveineuse de PGE2 active le iBAT (Ootsuka et al., 2008), suggérant ainsi que l’élévation de la

température corporelle lors d’un épisode de fièvre est la conséquence d’une activation soutenue

du iBAT par l’action de PGE2 sur EP3-R dans l’aire préoptique.

2.2.2.3 L’hypoglycémie

Depuis le début des années 70, il est connu que l’hypoglycémie ou la glucoprivation

entraine une hypothermie chez la souris comme chez l’humain (Freinkel et al., 1972). Dans le cas

d’une hypoglycémie, la baisse de la température corporelle constitue un mécanisme de protection

afin de ralentir le métabolisme et ainsi conserver l’énergie utile au cerveau et au cœur. en effet,

les rats maintenus à leur température d’origine décèdent tous après un hypoglycémie induite par

infusion continue d’insuline (Buchanan et al., 1991). Parmi les centres glucosensibles du SNC, la

médulla ventrolatérale (MVL) est connue pour sa capacité d’inhibition de la thermogenèse du

BAT (Buchanan et al., 1991; Cao et al., 2010). Il a donc été logique pour Madden et ses

collaborateurs en 2012 d’injecter du 5-thio-D-glucose dans la MVL afin de mimer les effets

d’une glucoprivation, avec pour conséquence une inhibition totale de l’activité du SNA du iBAT

induite par le froid (Madden, 2012). Par la suite, celui-ci a réalisé la même expérience, en

effectuant préalablement une transsection ponto-médullaire qui prévient les effets de l’injection,

montrant ainsi la présence d’un relais neuronal situé vers le rostre (Ritter et al., 2011; Madden,

2012).

2.2.2.4 L’hypoxie.

Le tronc cérébral contient des voies neuronales impliquées dans l’inhibition de la

thermogenèse du iBAT qui répondent à l’hypoxie artérielle ; cela participe à un réflexe

permettant de diminuer la consommation d’oxygène par les organes considérés comme non

vitaux afin de permettre une meilleure disponibilité de l’oxygène sanguin pour le SNC. Dans une

53

étude de 2005, l’équipe du Dr Morrison montre que l’hypoxie entraine un arrêt brutal de la

stimulation du iBAT induite par une hypothermie ou par l’administration de PGE2 dans l’aire

préoptique (Madden and Morrison, 2005). Par ailleurs, la forte inhibition de l’activité thermogène

du iBAT provoquée par l’hypoxie est totalement contrecarrée par la section du nerf de Hering

permettant de faire remonter l’information issue de chémorécepteurs situés dans le sinus

carotidien vers le tronc cérébral. De plus, l’inhibition du NTS par une injection de muscimol (un

agoniste du récepteur GABAA) bloque totalement les effets hypothermiques de l’hypoxie

(Madden and Morrison, 2005). Néanmoins, la voie neuronale utilisée entre le NTS et les

neurones préganglionnaires sympathiques activant le iBAT reste à caractériser. Enfin, un étude

canadienne de 2009 indique que la thermosensibilité de l’aire préoptique est diminuée lors d’une

hypoxie entrainant ainsi un déplacement du point de consigne chez le rat de 38°C vers 30°C de

façon concentration dépendante (Tattersall and Milsom, 2009).

55

3 Implication du système mélanocortine dans la régulation de

l’homéostasie énergétique : son rôle dans la thermogenèse.

3.1 Le système mélanocortine.

Le système mélanocortine est phylogénétiquement bien conservé, il est présent chez les

invertébrés, les poissons, les amphibiens et bien sûr les mammifères. Chez ces derniers, ce

système est présent dans l’ensemble de l’organisme et est impliqué dans de nombreuses fonctions

physiologiques, tels que la pigmentation, la reproduction, l’anxiété ou la régulation de


3.1.1 Ses principaux acteurs.

Les fonctions physiologiques du système mélanocortine sont définies par l’action opposée

des agonistes (les peptides dérivant de POMC) et des antagonistes (l’agouti et l’AgRP) sur les 5

récepteurs aux mélanocortines connus à ce jour (Pritchard et al., 2002; Mountjoy, 2010;

Biebermann et al., 2012).

3.1.1.1 Localisation et synthèse des ligands endogènes.

La POMC est une pro-hormone de 31-kDa dont la synthèse a lieu dans de nombreux

organes. En effet la POMC est exprimée dans la tige pituitaire et le SNC (uniquement dans

l’ARC et le NTS) (Joseph et al., 1983), mais également au niveau de la peau, de l’intestin, du

placenta et du pancréas (Smith and Funder, 1988).

La clivage de la POMC dépend du tissu (Pritchard et al., 2002). En effet, chaque tissu

synthétisant la POMC exprime aussi des pro-hormones convertases (PC) et d’autres protéines

nécessaires au clivage de celle-ci en neuropeptides actifs. Dans le SNC la présence des PC

(PC1/3, PC2 et PACE4), de la carboxypeptidase E et de la n-acetyltransférase permet la synthèse

de l’α-MSH, de la β-MSH et de la γ-MSH, à l’exception des rongeurs qui ne possèdent pas le site

de clivage nécessaire à la synthèse de la β-MSH (Pritchard et al., 2002). Tandis que l’absence de

PC2 dans la glande pituitaire arrête la clivage de POMC à l’étape de l’adrénocorticotrophine

(ACTH) (Shimizu et al., 2007; Biebermann et al., 2012). Enfin, la dernière étape de la régulation

de POMC a été mise en évidence en 2009 dans une étude de Wallingford et ses collaborateurs,

56

décrivant le rôle de la prolyl carboxypeptidase, dans la dégradation de l’α-MSH (Wallingford et

al., 2009). Par ailleurs, ces processus sont reconnus comme étant essentiels au maintien de la

spécificité de fonction des tissus, car les récepteurs aux mélanocortines n’ont pas la même affinité

pour les dérivés de la POMC, et notamment le MC2R qui ne lie que l’ACTH (Pritchard et al.,

2002; Biebermann et al., 2012).

Le système mélanocortine est unique parmi les systèmes de neuropeptides connus, car il

est aussi régulé par deux antagonistes endogènes (Ellacott and Cone, 2006), l’Agouti (Bultman et

al., 1992; Woychik and Young, 1992) et l’AgRP (Ollmann et al., 1997; Shutter et al., 1997).

L’Agouti est exprimé en périphérie et particulièrement dans la peau et les cheveux où il intervient

dans la couleur (Bultman et al., 1992), tandis que l’AgRP est uniquement produit par des

neurones de l’ARC (Ollmann et al., 1997; Shutter et al., 1997). Tout comme la POMC, l’AgRP

est une pro-hormone. Cependant, la forme clivée et non clivée sont actifs et son clivage, réalisé

en une seule étape par la PC1/3, permet la formation de 3 neuropeptides dont seul l’AgRP 83-132

semble activer les MC3/4R (Biebermann et al., 2012).

3.1.1.2 Localisation et fonction des récepteurs.

Dans les années 90, les cinq récepteurs aux mélanocortines MC1-5R connus actuellement

ont été caractérisés (Mountjoy et al., 1992; Chhajlani et al., 1993; Gantz et al., 1993a; 1993b;

Labbé et al., 1994). Ces récepteurs sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires

couplés aux protéines G stimulatrices dont les fonctions sont nommées ci-dessous (Ellacott and

Cone, 2006; Mountjoy, 2010). Parmi ces récepteurs, on distingue ceux dont l’expression a lieu en

périphérie, le MC1R, le MC2R et le MC5R, et ceux dont l’expression a lieu dans le SNC, le

MC3R et le MC4R. Leur lieu de synthèse, leurs affinités et leurs principales fonctions sont

recensés dans le tableau 2.

Le MC3R est exprimé dans le SNC et particulièrement dans l’hypothalamus (Roselli-

Rehfuss et al., 1993). À l’instar du MC3R, le MC4R est exprimé dans le SNC mais de façon

beaucoup plus importante. En effet, des études d’immunohistochimie et d’hybridation in situ ont

relevé la présence de MC4R dans de très nombreuses structures cérébrales telles que

l’hypothalamus et le tronc cérébral (Kishi:2003jy Gelez et al., 2010). Le MC4R est essentiel pour

la régulation de l’homéostasie énergétique (Cf. 1.2 et 3.3), mais participe également à la

57

régulation du stress et de la reproduction notamment (Mountjoy, 2010). Enfin, dans le système

mélanocortine, l’expression des récepteurs ainsi que sa liaison avec son ligand sont contrôlés par

des protéines accessoires. Pour exemple, les melanocortin receptor accessory protein 1 et 2

diminuent l’expression de MC4R (pour revue (Cerdá-Reverter et al., 2013)) alors que syndecan-3

régule le site de liaison de l’AgRP sur MC4R, afin de stimuler la prise alimentaire (Reizes et al.,

2006).

Tableau 2: Résumé des principales fonctions, sites d’expression et de l’affinité des ligands

pour les récepteurs aux mélanocortines.

Les récepteurs

L’affinité pour les ligands

Les sites d’expressions

La principale fonction références

MC1R α-MSH = ACTH > β-MSH > γ-MSH, Agouti Mélanocytes Pigmentation (Rees, 2003)

MC2R ACTH, Agouti Glandes surrénales Stéroïdeogenèse

(Mountjoy et al., 1992; Ellacott and

Cone, 2006)

MC3R α-MSH = ACTH = β-MSH = γ-MSH, AgRP SNC Homéostasie

énergétique

(Roselli-Rehfuss et al., 1993; Butler et

al., 2000)

MC4R α-MSH = ACTH > β-MSH > γ-MSH, AgRP SNC Homéostasie

énergétique (Gelez et al., 2010; Mountjoy, 2010)

MC5R α-MSH > ACTH > β-MSH > γ-MSH, Agouti

Glandes exocrines

Régulation de la sécrétion des

glandes exocrines

(Chen et al., 1997)

58

3.1.2 Ses partenaires dans le contrôle de la prise alimentaire.

Le système mélanocortine est très impliqué dans le contrôle de la prise alimentaire. Par

conséquent, l’expression de la POMC est largement influencée par d’autres acteurs importants

tels que la leptine, l’insuline ou les endocannabinoïdes.

3.1.2.1 L’effet de la leptine et de l’insuline sur l’expression de la POMC.

Comme nous l’avons vu, la leptine est produite par les adipocytes blancs, elle est ensuite

libérée dans la circulation sanguine et agit centralement sur les neurones POMC de l’ARC et du

NTS, grâce à la présence de son récepteur au sein de ces deux populations neuronales (Cheung et

al., 1997). D’autre part, l’effet anorexigène de la leptine est partiellement bloqué par

l’administration d’un antagoniste des MCR, confirmant ainsi que le système mélanocortine est

l’un des principaux médiateurs de la leptine dans ces effets pro-cataboliques (Seeley et al., 1997).

Par la suite, Munzberg et ses collaborateurs ont montré que l’administration périphérique de

leptine chez le rongeur phosphoryle la Janus Kinase 2 (Jak2) qui active une cascade de

signalisation impliquant la phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3

(pSTAT-3) (Münzberg et al., 2003), Parallèlement, l’expression de la POMC est augmentée dans

l’ARC. De plus, la délétion du gène codant pour STAT-3 chez la souris entraine une diminution

de l’expression de la POMC qui s’accompagne d’une obésité sévère (Gao et al., 2004), suggérant

de ce fait que pSTAT-3 est le relais de l’action de la leptine sur la POMC en agissant comme

facteur de transcription (Xu et al., 2007).

L’action de la pSTAT-3 comme facteur de transcription nécessite la dimérisation de deux

pSTAT-3 puis sa liaison avec le complexe SP1-POMC sur le promoteur de la POMC (Morton et

al., 2006). Parallèlement, la Jak2 phosphoryle l’insulin receptor substrate proteins 1 and 2, qui

activent la voie phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), qui aboutit à la phosphorylation et à

l’exclusion du noyau de la Forkhead box containing protien 1 (FOXO1) (Yang et al., 2009a).

L’exclusion nucléaire de FOXO1 qui inhibe la liaison du dimère de pSTAT3 sur le complexe

SP1-POMC favorise l’expression de la POMC. De plus, la voie PI3K est également utilisée par

l’insuline pour agir sur FOXO1 et ainsi favoriser l’action de pSTAT3, suggérant que l’insuline et

la leptine agissent en synergie sur l’activité du promoteur de la POMC (Varela and Horvath,

2012). À l’inverse, dans les neurones AgRP, pSTAT-3 inhibe le promoteur de l’AgRP alors que

59

FOXO1 le stimule (Kitamura et al., 2006). Enfin, pSTAT-3 agit simultanément comme facteur de

transcription du gène suppressor of cytokine signaling 3, lequel inhibe la phosphorylation du

récepteur à la leptine (Elias et al., 1999; Bjorbak et al., 2000) dans le but de réduire la

transcription de la POMC.

3.1.2.2 Les endocannabïnoides.

Le système endocannabïnoide est constitué de deux principaux récepteurs aux

cannabinoïdes : le récepteur aux cannabinoïdes de type 1 (CB1) est exprimé dans le SNC alors

que le récepteur aux cannabinoïdes de type 2 est exprimé en périphérie (Matsuda et al., 1990;

Munro et al., 1993). De plus, il possède deux principaux ligands endogènes dérivant de

phospholipides contenant de l’acide arachidonique, l’anandamide (AEA) (Devane et al., 1992) et

le 2-arachidonylglycerol (2-AG) (Mechoulam et al., 1995), mais son ligand le plus connu est le

delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) (Gaoni and Mechoulam, 1964). Le système

endocannabïnoide a quelques particularités. En effet, le récepteur CB1 sous sa forme protéique

est exprimé au niveau pré-synaptique, alors que ses ligands sont libérés à la demande du coté

post-synaptique (Wilson and Nicoll, 2001). L’activation de CB1 qui est un récepteur à sept

domaines transmembranaires couplé à une protéine Gi/o (Pertwee, 1997) inhibe la libération de

neurotransmetteur dans la fente synaptique par un mécanisme désinhibant les canaux potassiques

de type A, lesquels vont faire sortir du K+ du neurone conduisant à son hyperpolarisation (Ameri,

1999).

L’injection d’un agoniste CB1 dans l’hypothalamus ou le noyau accumbens augmente la

prise alimentaire chez le rongeur (Jamshidi and Taylor, 2001; Kirkham et al., 2002), alors que le

jeûne augmente la concentration d’AEA et de 2-AG dans ces structures cérébrales (Kirkham et

al., 2002), montrant ainsi que le système endocannabïnoide est étroitement lié au comportement

alimentaire. Enfin, les souris ayant une délétion du gène codant pour CB1 montrent une

augmentation de la thermogenèse (Quarta et al., 2010) suggérant que le système

endocannabïnoide est impliqué dans la régulation de la balance énergétique.

Le système endocannabïnoide influence le système mélanocortine. En effet, l’injection

chronique de Δ9-THC en périphérie augmente l’expression de la POMC dans l’ARC et le NTS,

suggérant que les neurones exprimant les récepteurs aux mélanocortines ont besoin de plus de

60

ligands pour réaliser leurs actions après l’inhibition opérée par le Δ9-THC (Corchero et al., 1997;

1999). De plus, Verty et ses collaborateurs ont observé que la co-injection centrale d’un agoniste

des récepteurs aux mélanocortines et d’un antagoniste CB1, inefficace seul, inhibent en synergie

la prise alimentaire chez le rat (Verty et al., 2004). Enfin, l’expression de l’ARNm de CB1 est

très fortement exprimée dans le PVH, un noyau hypothalamique très impliqué dans le contrôle de

la balance énergétique et qui exprime également le MC4R (Richard et al., 2009).

3.2 La thermogenèse induite par l’alimentation

La thermogenèse réalisée par le BAT a pour principale fonction de réguler la température

corporelle, et les mécanismes relatifs à cette fonction ont été développés dans le chapitre 2. Par

ailleurs, le BAT participe activement à la régulation de l’homéostasie énergétique (Richard et al.,

2012; Carey and Kingwell, 2013). En effet, il permet de dissiper le surplus d’énergie ingérée lors

d’un repas ou en réserve dans le tissu adipeux blanc, par un phénomène appelé la thermogenèse

induite par l’alimentation (TIA) (Rothwell and Stock, 1979). Celle-ci survient en concomitance

avec l’ingestion d’aliments. Néanmoins, elle ne doit pas être confondue avec la thermogenèse

issue directement des processus de la digestion des aliments. En effet, la TIA résulte de l’action

du SNC sur le BAT, suite à l’intégration des signaux périphériques, traduisant à la fois la quantité

d’énergie procurée par le repas et l’état des réserves énergétique de l’organisme (Rothwell and

Stock, 1979; 1981; Golay et al., 1982). Bien que la TIA soit largement argumentée, le débat sur

sa pertinence physiologique reste ouvert. En effet, dès les années 70-80, il a été mis en évidence

que la masse du BAT, l’expression protéique de gènes impliqués dans la thermogenèse comme

UCP-1 et la calorimétrie indirecte sont augmentées suite à un régime riche en graisse, en sucre ou

en protéine (Rothwell and Stock, 1979). Cependant, l’équipe du docteur Kozak remet en question

ce phénomène ; la dissipation d’énergie sans nécessité physiologique apparait pour eux comme

un non sens évolutif (Kozak, 2010). En montrant que la perte de fonction thermogène du BAT,

par la délétion du gène codant pour la protéine UCP-1 chez des souris hébergées à

thermoneutralité et soumises un régime riche en graisse, n’entraine pas de diminution de la

consommation d’oxygène, ni d’augmentation de la masse corporelle, le docteur Kozak et ses

collaborateurs ont suscité le débat (Anunciado-Koza et al., 2008; Kozak, 2010). Enfin, une étude

récente d’imagerie chez l’homme vient appuyer leur hypothèse. En effet, une expérience de

captage de fluoro-deoxyglucose (FDG) en tomographie par émission de positrons (TEP), indique

61

que le BAT n’est pas activé lors de la suralimentation chez l’humain (Schlogl et al., 2013).

Cependant, d’autres équipes de recherche ont observé un développement accru de l’obésité chez

des souris hébergées à thermoneutralité nourries avec une diète riche en graisse dont le gène

codant pour la protéine UCP-1 a été invalidé (Feldmann et al., 2009), ainsi qu’une augmentation

du captage de FDG dans le BAT chez l’humain après un repas, traduisant ainsi une activation

postprandiale du BAT (Vosselman et al., 2013). Malgré cette contradiction dans la littérature, la

grande majorité des auteurs s’accordent sur le rôle majeur de l’activité thermogène du BAT dans

la survenue de l’obésité ainsi que sur ca capacité à dissiper des calories. D’ailleurs, une

dysfonction du BAT est corrélée avec l’apparition de l’obésité chez l’humain (Cypess et al.,

2009; Ouellet et al., 2011), alors que lorsque le BAT est pleinement activé pendant 1 an, il

pourrait consommer plus de 4 kilogrammes de lipides selon une projection menée par Virtanen et

ses collaborateurs (Virtanen et al., 2009). Enfin, d’après Butler et ses collaborateurs, la TIA est

sous le contrôle du système mélanocortine, car la délétion du gène codant pour MC4R chez la

souris inhibe l’augmentation de la consommation d’oxygène induite par le changement de régime

alimentaire (Butler et al., 2001; Butler, 2006). La mesure de la consommation d’oxygène permet

d’évaluer la dépense énergétique, mais constitue aussi une mesure indirecte reconnue de la

thermogenèse (Simonson and DeFronzo, 1990).

3.3 La mise en évidence de l’implication du système mélanocortine dans le contrôle de

la thermogenèse.

L’utilisation de modèles génétiques du système mélanocortine, mais aussi l’injection

d’agonistes et antagonistes du système mélanocortine déjà connus pour affecter la balance

énergétique chez l’humain et les rongeurs (Cone, 1999; Butler and Cone, 2002; Farooqi and

O'Rahilly, 2006; Myers and Olson, 2012) ou encore, des techniques de traçage neuronal associées

à de l’immunohistochimie et d’hybridation in situ sur tranche de cerveau de rongeur (Voss-

Andreae et al., 2007; Song et al., 2008), ont permis d’améliorer notre compréhension du role du

système mélanocortine, et ainsi mis en évidence son implication dans le contrôle de la dépense

énergétique.

62

3.3.1 Les évidences génétiques

La diminution de la consommation d’oxygène constatée chez des souris dont le gène

POMC est invalidé, suggère que certains neuropeptides dérivés de celui-ci ont un rôle essentiel

dans la dépense énergétique (Challis et al., 2004; Tung et al., 2007). Parallèlement, l’utilisation

d’un modèle de souris présentant une délétion pour le gène de l’AgRP présente une augmentation

de la consommation d’oxygène (Wortley et al., 2005), suggérant ainsi que les neurones exprimant

la POMC et l’AgRP participent au contrôle de la dépense énergétique.

D’autre part, des études sur MC3R et MC4R, les deux seuls récepteurs aux mélanocortines

présents au sein du SNC, montrent que seul le MC4R est impliqué dans le contrôle de la dépense

énergétique (Garfield et al., 2009). En effet, les souris présentant une délétion pour le gène

MC4R consomment 20% d’oxygène de moins que les souris sauvages (Ste Marie et al., 2000).

De plus, lorsque ces souris sont nourries avec une diète riche en gras, elles sont incapables de

diminuer leur prise alimentaire ainsi que d’augmenter leur consommation d’oxygène, tel que le

font les souris sauvages (Butler et al., 2001). Par ailleurs, l’effet de la leptine sur l’expression

d’UCP-1 est absent chez ces souris transgéniques (Ste Marie et al., 2000), alors que celles-ci

conservent une température corporelle similaire à celle des souris sauvages lors d’une exposition

de 120h à 4°C (Butler et al., 2001). Il apparaît donc évident que le système mélanocortine joue un

rôle capital dans le contrôle de la dépense énergétique et conséquemment sur la thermogenèse via

son récepteur MC4R, dans le but de réguler la balance énergétique.

3.3.2 Les évidences pharmacologiques.

Des études utilisant des ligands endogènes et synthétiques ont été réalisées chez le rat afin

de compléter et d’affiner les connaissances sur le rôle des acteurs révélés par des études

génétiques chez la souris. En effet, l’injection i.c.v. de MTII, un agoniste des récepteurs aux

mélanocortines, augmente la consommation d’oxygène lors d’un traitement aigu (Hwa et al.,

2001) ou chronique (Jonsson et al., 2001). De plus, l’administration répétée de MTII sur une

journée augmente significativement l’expression d’UCP-1 dans le iBAT (Williams et al., 2003).

Enfin, l’injection centrale de MTII augmente le renouvellement de la noradrénaline dans le iBAT,

ainsi que sa température (Brito et al., 2007; Skibicka and Grill, 2008), suggérant de ce fait que la

63

stimulation des récepteurs aux mélanocortines permet l’augmentation de la dépense énergétique

via l’activité du iBAT.

À l’inverse, la consommation d’oxygène et la température corporelle diminuent lors de

l’injection centrale d’un antagoniste MC3/4R chez le rat (Adage et al., 2001; Small et al., 2003).

De plus, l’administration centrale et chronique de SHU9119 (un antagoniste MC3/4R) chez le rat

diminue fortement l’expression d’UCP-1 dans le iBAT (Nogueiras et al., 2007). De même, l’effet

de la leptine sur l’expression d’UCP-1 est inhibé par l’injection de SHU9119 (Satoh et al., 1998).

Enfin, il a été constaté que la température du iBAT diminue chez le hamster sibérien après

l’injection i.c.v. de l’antagoniste endogène (AgRP) des MC3/4R (Brito et al., 2007), suggérant

donc que les agonistes du système mélanocortine exercent un tonus positif sur la dépense

énergétique et ses acteurs.

3.3.3 Les évidences anatomo-fonctionnelles.

Les effets centraux du système mélanocortine sur la thermogenèse du iBAT sont

principalement relayés par le SNS. En effet, l’injection de MTII augmente le renouvellement de

la noradrénaline dans le iBAT (Brito et al., 2007) et la dénervation du iBAT conduit à un blocage

de l’augmentation de l’expression d’UCP-1 dans le iBAT suite à une injection de MTII dans le

3ème ventricule chez le rat (Williams et al., 2003).

L’activité du SNS contrôlant le iBAT est gouvernée par plusieurs structures du SNC (Cf.

2.2.1.3). Cependant, l’injection d’un virus de la pseudo-rage (traceur rétrograde polysynaptique)

dans le iBAT chez des rats sacrifiés à différents temps, suivie d’une hybridation in situ ou d’une

immunohistochimie dirigées contre MC4R, a permis d’établir une chronologie d’infection des

structures du SNC innervant le iBAT. Cette méthode a aussi permis de quantifier les neurones

exprimant le MC4R et le virus de la pseudo-rage au sein des même structures (Voss-Andreae et

al., 2007; Song et al., 2008). L’étude menée par Song, en collaboration avec notre laboratoire, a

révélé que parmi les differentes structures du SNC connectées au iBAT, le PVH, le PAG et l’aire

préoptique présentent le plus grand nombre de neurones marqués par le virus de la pseudo-rage

(Song et al., 2008). Enfin, 84, 83 et 77% des neurones exprimant MC4R dans le PVN, le PAG et

l’aire préoptique, respectivement, sont marqués aussi par le virus de la pseudo-rage, traduisant

64

ainsi les connexions indirectes de ces neurones avec le iBAT (Song et al., 2008) et le rôle

potentiel de MC4R au sein de ces structures, dans le contrôle de l’activité thermogène du iBAT.

Ces trois structures cérébrales sont connues pour leurs actions sur la thermogenèse du

iBAT. En effet, Le PVH est connecté au iBAT (Bamshad et al., 1999; Oldfield et al., 2002).

Cependant, le rôle du PVH sur le iBAT est controversé ; les premières études ont montré que le

PVH stimule le iBAT via une connexion directe sur l’IML (Zhang et al., 2000) et que sa lésion

n’affecte pas la réponse au froid de l’organisme (Lu et al., 2001). À l’inverse, l’activation du

PVH par l’injection de bicuculline inhibe la thermogenèse du iBAT et bloque la réponse au froid

(Madden and Morrison, 2009). Enfin, l’injection de NPY dans le PVH diminue l’activité du SNS

du iBAT (Egawa et al., 1991), suggérant existence d’au moins deux sous populations de neurones

dans le PVH dont les effets sont opposés (Morrison et al., 2012). La controverse est aussi

présente quant au rôle des neurones du PVH exprimant MC4R. En effet, Balthasar et ses

collaborateurs ont rapporté que la restauration de l’expression de MC4R dans le PVH chez des

souris transgéniques ne l’exprimant pas, permet un retour à l’état normal du contrôle de la prise

alimentaire, mais pas de l’augmentation de la consommation d’oxygène postprandiale, suggérant

ainsi que l’action de MC4R sur la dépense énergétique est relayé par une autre structure du SNC

(Balthasar et al., 2005). D’autre part, deux groupes de recherche ont montré que l’injection de

MTII dans le PVN augmente la température du corps ou du iBAT (Song et al., 2008; Skibicka

and Grill, 2009), suggérant ainsi que les neurones du PVH exprimant MC4R jouent un rôle

essentiel dans le contrôle de la thermogenèse du iBAT. Enfin, les rôles de l’aire préoptique et du

PAG dans le contrôle de la thermogenèse ont été abordés dans la section 2.2. Quant au rôle du

système mélanocortine dans le contrôle de la thermogenèse au sein de ces structures cérébrales, il

n’y a rien de décrit à ce jour.

Cependant, le système mélanocortine peut aussi influencer la libération d’hormones

thyroïdiennes, via son action sur l’axe hypothalamus-pituitaire-thyroïdien, permettant ainsi la

synthèse de la T3, dont les effets sur l’augmentation de l’expression d’UCP-1 dans le iBAT sont

connus (de Jesus et al., 2001). En effet, chez le rat les neurones du PVH exprimant de la TRH

sont innervés par des fibres qui libèrent de l’α-MSH et de l’AgRP (Fekete et al., 2000). De plus,

certains neurones du PVH expriment conjointement l’ARNm de MC4R et de la pro-TRH (Harris

65

et al., 2001). Enfin, l’injection centrale d’α-MSH chez des animaux à jeun augmente de 2,5 fois

la concentration de la T4, le précurseur de la T3 (Fekete et al., 2000).

67

Problématique et Objectifs généraux des travaux.

69

Problématique.

L’obésité est la conséquence d’une dérégulation de l’homéostasie énergétique et se définit

par un excès de masse adipeuse. Tout d’abord, il est connu que les signaux périphériques, tels que

la leptine, informent le SNC de l’état des réserves énergétiques de l’organisme afin de réguler

l’homéostasie énergétique. Ensuite, il a été montré que le système mélanocortine est l’un des

relais majeurs du SNC dans la régulation de l’homéostasie énergétique en contrôlant l’apport

énergétique, mais également la dépense énergétique via son action sur le BAT, qui réalise la

thermogenèse. Enfin, la découverte récente de BAT physiologiquement actif chez l’homme

adulte offre de nouvelles perceptives thérapeutiques dans la lutte contre l’obésité.

Actuellement le BAT est connu pour assurer deux grandes fonctions. Tout d’abord, il

participe au maintien de la température corporelle des animaux homéothermes, et à un

phénomène appelé la TIA. Il est établi que la TIA participe à la régulation de l’homéostasie

énergétique et nécessite l’implication du système mélanocortine. En effet, la délétion du gène

codant pour la protéine MC4R chez la souris a pour conséquence de bloquer la TIA. De plus,

differentes études ont mis en évidence le rôle du MTII, un agoniste des récepteurs aux

mélanocortines dans la thermogenèse du iBAT. Enfin, il a été mis en évidence que le iBAT est

indirectement connecté à différents noyaux hypothalamiques, parmi lesquels le PVH et le MPO

présentent un nombre important de neurones marqués avec le rétrotraceur préalablement injecté

dans le iBAT et dont environ 80% de ces neurones sont colocalisés avec le MC4R, suggérant

ainsi que ces deux noyaux hypothalamiques sont impliqués dans le contrôle du iBAT via leurs

activités mélanocortiniques.

Actuellement, il est connu que l’injection de MTII dans le PVH entraine une augmentation

de la température du iBAT. De plus, de nombreux neurones du PVH expriment CB1, un

récepteur du système endocannabïnoide connu pour être impliqué dans la thermogenèse et dont

l’interaction avec le système mélanocortine participe déjà au contrôle de la prise alimentaire chez

le rat. Par ailleurs, le MPO est un relais majeur au niveau de l’aire préoptique dans le contrôle de

la thermorégulation, et l’action du MPO sur le iBAT passe par le DMH. Il apparaît donc que les

systèmes mélanocortines et endocannabinoïdes pourraient interagir dans le PVH pour contrôler

l’activité du iBAT, mais aussi que les neurones exprimant le MC4R dans le MPO sont

susceptibles de contrôler le iBAT via leurs actions sur le DMH.

71

Objectifs généraux des travaux.

1) Mettre en évidence l’interaction entre les systèmes mélanocortine et endocannabinoïde

dans le contrôle de la thermogenèse du tissu adipeux brun.

2) Montrer l’implication des récepteurs MC4R exprimés par des neurones du noyau

préoptique médial dans la thermogenèse.

Objectifs spécifiques.

1.a) Mesurer différents paramètres de la thermogenèse du iBAT, lors de l’injection par voie

i.c.v. d’un agoniste des récepteurs aux mélanocortines et la modulation de cette réponse,

lors de l’injection par voie i.c.v. d’un agoniste ou d’un antagoniste des récepteurs aux

endocannabïnoides.

1.b) Montrer que les effets observés sur la thermogenèse du iBAT lors de l’injection par voie

i.c.v. d’un agoniste des récepteurs aux mélanocortines, sont imputable à l’activation de

MC4R.

1.c) Déterminer si la modulation de l’action du système mélanocortine sur la thermogenèse du

iBAT par le système endocannabïnoide passe par le récepteur CB1.

1.d) Mettre en évidence que l’interaction entre les systèmes mélanocortine et

endocannabïnoide dans le contrôle de la thermogenèse du iBAT a lieu dans les neurones

du PVH exprimant MC4R et CB1.

2.a) Déterminer le rôle des neurones du MPO exprimant MC4R dans le contrôle de la

thermogenèse du iBAT.

2.b) Évaluer le rôle des neurones du DMH répondant au glutamate dans la transmission de

l’activation MC4R du MPO sur la thermogenèse du iBAT.

73

Chapitre 1

75

The cannabinoid receptor 1 is involved in thermogenesis induced by the brain stimulation of the melanocortin-4 receptor in male rats.

Boris Monge-Roffarello*, Sebastien M. Labbé*, Marie-Claude Roy, Marie-Laurence

Lemay, Estelle Coneggo, Damien Lanfray et Denis Richard

Centre de Recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de

Québec, Université Laval, Québec, Canada.

Article soumis à Endocrinology

77

Résumé

Cette étude a été conçue dans le but d’investiguer l’implication du récepteur aux

cannabinoïdes de type 1 (CB1) sur la stimulation de la dépense énergétique et de la thermogenèse

du tissu adipeux brun (BAT) induite par un agoniste du récepteur aux mélanocortines 4 (MC4R).

Dans la première série d’expérimentation, la dépense énergétique et la thermogenèse du BAT

sont évaluées chez des rats injectés dans le 3éme ventricule avec un agoniste MC4R, le Melanotan-

II (MTII) et un agoniste CB1, le delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) ou un antagoniste CB1,

l’AM251. La dépense énergétique a été mesurée par calorimétrie indirecte, alors que la

thermogenèse du BAT a été mesurée par l’enregistrement de la température du BAT

interscapulaire (iBAT). L’effet du MTII sur la dépense énergétique et la thermogenèse du iBAT

est inhibé par l’administration de Δ9-THC alors qu’il a tendance à être potentialisé par l’injection

d’AM251. Le Δ9-THC bloque aussi les effets du MTII sur le captage de C14-bromopalmitate et de

H3-désoxyglucose par le iBAT. En plus, le Δ9-THC attenue les effets du MTII sur l’expression de

l’ARNm du peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (Pgc1α), de

la désiodinase iodothyronine 2 (Dio2), la carnitine palmitoyltransférase 1B (Cpt1b) et la protéine

découplante 1 (Ucp1). Dans la seconde série d’expérimentation, nous avons traité de

l’implication du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVH) dans les effets du CB1 sur

l’activation de la thermogenèse du iBAT induite par le MTII, lesquels ont été évalués par

l’injection de MTII dans le PVH et de Δ9-THC dans le 4éme ventricule du cerveau. Nous avons

confirmé la présence de l’ARNm de CB1 dans les neurones MC4R du PVH et démontré la

capacité du Δ9-THC à bloquer l’augmentation de la température du iBAT induite par le MTII. Le

Δ9-THC bloque aussi l’effet du MTII dans le PVH sur le captage de C14-bromopalmitate aussi

bien que sur l’expression de Pgc1α et de Dio2 dans le iBAT. Tout compte fait, ces résultats

démontrent l’implication du CB1 dans la stimulation centrale de la thermogenèse induite par le

MTII et mettent l’emphase sur le rôle potentiel du PVH dans cette stimulation.

79

Abstract

The present study was designed to investigate the involvement of the cannabinoid receptor

1 (CB1) in the stimulating effects of melanocortin-4 receptor (MC4R) agonism on whole body

and brown adipose tissue (BAT) thermogenesis. In a first series of experiments, whole body and

BAT thermogeneses were assessed in rats infused in the third ventricle of the brain with the

MC4R agonist melanotan II (MTII) and the CB1 agonist delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC)

or the CB1 antagonist AM251. Whole body thermogenesis was measured by indirect calorimetry

and BAT thermogenesis from interscapular BAT (iBAT) temperature. Δ9-THC blunted the

effects of MTII on whole body and iBAT thermogenesis, whereas AM251 tended to potentiate

the MTII effects. Δ9-THC also blocked the stimulating effect of MTII on 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose uptakes in iBAT. Additionally, Δ9-THC attenuated the effect of MTII on

peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (Pgc1α), type II

iodothyronine deiodinase (Dio2), carnitine palmitoyltransferase 1B (Cpt1b) and uncoupling

protein 1 (Ucp1). In a second series of experiments, we addressed the involvement of the

paraventricular hypothalamic nucleus (PVH) in the CB1-mediated effects of MTII on iBAT

thermogenesis, which was assessed by injecting MTII in the PVH and Δ9-THC in the fourth

ventricle of the brain. We confirmed the presence of CB1 mRNA in PVH MC4R neurons and

demonstrated the ability of Δ9-THC to blunt MTII-induced increase in iBAT temperature. Δ9-

THC also blocked the PVH effect of MTII on 14C-bromopalmitate uptake as well as on Pgc1α

and Dio2 expression in iBAT. Altogether the results demonstrate the involvement of the CB1

receptor in the brain stimulation of thermogenesis by MTII and emphasize the potential

involvement of the PVH in such stimulation.

81

Introduction

The melanocortin system plays a key role in energy homeostasis (1,2) and there is strong

evidence that this system is involved not only in energy intake but also in energy expenditure

(1,3-6). Consistently, activation of the brain melanocortin-4 receptor (MC4R) with melanotan II

(MTII), a peptide analogue of alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), decreases food

intake (7) and body weight (8). Moreover, loss-of-function mutations of proopiomelanocortin

(POMC) (9,10) and the MC4R (11-13) lead to massive obesity in laboratory animals as well as in

humans, providing evidence for the catabolic role of the stimulated brain melanocortin system.

MC4R agonists exert their catabolic effects not only by reducing food intake but also by

inducing energy expenditure likely through brown adipose tissue (BAT) thermogenesis (14-16).

The role of the melanocortin system in the control of BAT thermogenesis is further supported

anatomically. In that regard, we (14) and others (17) have identified numerous brain populations

of MC4R mRNA-expressing neurons that are (poly)synaptically connected to interscapular BAT

(iBAT) (14,17). The brown adipocyte represents a thermogenesis effector, whose role in energy

homeostasis has been postulated (18-20). The interest for the study of BAT thermogenesis has

recently been rejuvenated by the demonstration of active BAT in adult humans (21-23).

The mechanisms whereby the melanocortin system influences energy homeostasis remain

to be fully delineated. Recently, the suggestion was made that the endocannabinoid system could

modulate MC4R-mediated catabolic activity (24-26). Activation of the endocannabinoid system

is anabolic in that it stimulates food intake while reducing energy expenditure (24,27-30). Recent

experiments (25) demonstrated that the orexigenic effect of Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC)

was blocked by the concomitant administration of α-MSH and that rimonabant, a cannabinoid

receptor 1 (CB1) antagonist, impaired the hyperphagia led to by the MC4R antagonist JKC-363.

The neuronal circuit behind the metabolic interaction of the melanocortin and endocannabinoid

systems remains to be determined. CB1 is known to exert its action at the presynaptic levels (31)

and it could involve the PVH, where both the CB1 and MC4R are expressed (24). Furthermore,

the PVH hosts neurons projecting to the intermediolateral column (IML) (32) and a large

proportion of these neurons, which likely control the SNS activity in BAT, express the MC4R

(14).

82

The aim of the present study was to further investigate the interaction of the

endocannabinoid and melanocortin systems on energy expenditure and whole-body and iBAT

thermogenesis in rats. Two series of experiments were carried out (i) to test the ability of

intracerebroventricular (icv) infusions of Δ9-THC (CB1 agonist) and AM251 (CB1 antagonist) to

modulate the stimulating effect of the MC4R agonist MTII on whole body and iBAT

thermogenesis and (ii) to assess the implication of the PVH as a potential site of the CB1-

mediated effect of MTII on iBAT thermogenesis.

83

Research Design and Methods

Animals

Male Wistar rats (Charles River Laboratories, St. Constant, QC, Canada), initially

weighing ~300 g, were individually housed, one week before the surgery, at 23 ± 1°C under a

12:12-h light-dark cycle (light on at 06:00). The rats had ad libitum access to water and pelleted

standard chow (Charles River Rodent Diet no. 5075). All animal treatments and procedures were

approved by Université Laval Animal Ethics Committee and in agreement with the Canadian

Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Drugs

Δ9-THC (Tocris Bioscience, Bristol, UK) was first mixed in ethanol containing a few

drops of Tween 80. The suspension was stirred continuously under a steady stream of nitrogen

gas until all ethanol was evaporated. Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) was then added and the

solution was stirred until the Tween 80 / Δ9-THC suspension was well dispersed. The final

vehicle solution contained 15 µl Tween 80 / 2 ml aCSF. Δ9-THC was administered at doses of 0

(vehicle only) or 3 µg in a volume of 3 µl. The CB1 antagonist AM251 (Tocris Bioscience,

Bristol, UK) was mixed with ethanol solution and was administered at doses of 0 or 3 µg in a

volume of 3 µl. The MC4R agonist MTII (Phoenix Pharmaceutical Inc, Burlingame CA, USA)

was dissolved in aCSF and administered at doses of 0, 30 or 300 ng in a volume of 3 µl in the

third ventricle or at doses of 0 or 100 ng in a volume of 200 nl (100 nl in each side of the PVH).

The MC4R antagonist HS024 (Tocris Bioscience, Bristol, UK) was dissolved in aCSF and

administered at doses of 0 or 100 ng in a volume of 3 µl. All doses and volumes of MTII and Δ9-

THC are in accordance with previous studies (25,33). Doses of HS024 and AM251 are in

accordance with previous studies, and volumes are in accordance with Δ9-THC volume.

Brain icv cannulation and drug infusions

Rats were chronically implanted with guide-cannulas (Plastics One, Roanoke, VA, USA),

aimed at the third ventricle (22-gauge), PVH (26-gauge bilateral guide-cannula) or caudal fourth

84

ventricle (22-gauge). The stereotaxic coordinates were as follows: third ventricle, 0.8 mm

posterior to bregma on the midline and 5.0 mm ventral to the brain surface; PVH, 1.8 mm

posterior to bregma on the midline with 1.0 mm center to center bilateral cannula and 7.0 mm

ventral to the brain surface; the caudal fourth ventricle, 2.5 mm posterior to interaural on the

midline and 6.0 mm ventral to the brain surface (34). The guide-cannulas were secured with

screws and cranioplastic cement (Lang Dental Manufacturing co., Inc, Wheeling, IL, USA). To

prevent clogging, sterile obturators were inserted into the guide-cannulas. The viability of the icv

cannulations was tested by evaluating the dipsogenic response to angiotensin II (Sigma-Aldrich;

50 ng). Only rats drinking more than 10 ml in a 30 minute period were included in the

experiments. The placement of the cannulas was further confirmed by the observation of the

infusion site on the brain slices at the end of the study.

Prior to every brain infusion, rats were familiarized with the testing procedures for at least

three days (only for free moving rats experiments). While animals were gently handled an

infusion cannula [26 gauge (third and fourth ventricle) or bilateral 30-gauge (PVH)] was inserted

into the guide-cannula. Brain infusions were carried out using a 50 µl Hamilton syringe

connected to a syringe pump (Harvard Apparatus 55-2226). In each protocol, the solutions were

carefully infused during 1 minute (3 µl/min) or 30 sec (200 nl/min) for PVH infusion.

Effects of third ventricle infusions of MTII, ΔΔ9-THC and AM251 on thermogenesis

Whole body thermogenesis

Twelve (12) groups of rats were used to test the effects of Δ9-THC and AM251 on the

stimulating effect of MTII on whole body thermogenesis, which was assessed by indirect

calorimetry. Figure 1A illustrates the experimental schedule for whole body thermogenesis

measurements. Indirect calorimetry was used as previously described (35,36). Rats were placed

in metabolic cages 48-h prior to monitoring oxygen consumption (VO2) and carbon dioxide

production (VCO2). This enabled animals to become accustomed to their new surroundings

before drug infusion. Measurements were made continuously using an open-circuit system. Air

was circulated through the metabolic cages at the rate of 1800-ml/min. VO2 and VCO2 were

measured using gas analyzers (model S-3A, Applied Electrochemistry Incorporated, Sunnyvale,

85

CA, USA). The animals were fasted for 8 hours, to completely blunt diet-induced thermogenesis,

before the infusion of MTII, which was preceded by the infusion of Δ9-THC or AM251. MTII

was infused at either 0, 30 or 300 ng per rat.

IBAT thermogenesis and metabolic activity

Eight (8) groups of rats were used to assess the effects of HS024, Δ9-THC and AM251 on

the stimulating effect of MTII on iBAT thermogenesis, which was assessed by measuring iBAT

temperature in isoflurane-anesthetized animals. iBAT temperature was monitored using a copper-

constantan thermocouple (Physitemp Instruments, Inc. Clifton, NJ, USA) inserted into the intact,

right iBAT pad. During the measurement, core temperature was monitored with a second

thermocouple inserted 6 cm into the rectum (37). Skin temperature was also assessed with a third

copper-constantan thermocouple being placed on the left-rear leg. The last two measurements

were used to control the animal state before and during the beginning of the experiment. The first

injection was done when the core body temperature was between 37.0 and 37.5°C. Measurement

of CO2 production was performed during the acute treatment and was used as a surrogate of VO2

to assess whole body thermogenesis. For technical reasons inherent to the use of the isoflurane

mask, VO2 could not be measured.

In addition to measuring iBAT temperatures we also measured iBAT 14C-bromopalmitate

([1-14C]-2-bromopalmitic acid) and 3H-deoxyglucose ([1,2-3H(N)]-Deoxy-D-glucose) uptakes to

further validate changes in iBAT thermogenic/metabolic activity. Both tracers (Moravek

Biochemicals, Inc. Brea, CA, USA) were dissolved in normal saline supplemented with 4%

bovine serum albumin and administered at 20-µCi doses. 14C-bromopalmitate is routinely used to

determine fatty acid uptake (38,39), oxidation (39-41) and esterification (39) and 3H-

deoxyglucose for the determination of glucose uptake (42). Figure 1B shows the timeline for the

determination of 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose uptakes in iBAT depots after icv

infusions. Thirty minutes after the third ventricle infusion of MTII, an intravenous bolus of 20

µCi of each tracer was injected in the tail vein, in a volume of 350 ul. Arterial blood sampling

from the carotid was done at 31, 32, 33, 35, 40, 50 and 60 minutes post MTII infusion for

clearance determination according to a procedure previously described (38). Sixty minutes after

MTII infusion, animals were euthanized by an overdose of anaesthetic and iBAT, liver, heart and

86

skeletal muscle (gastrocnemius) were removed on ice, weighed and stored at -80°C pending

future analyses. Tissue-specific uptakes of 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose were

determined on samples of tissues (~250 mg), which were homogenized (Polytron PT10-35,

Kinematica, inc. Bohemia, NY, USA) in ice-cold Chappell-Perry buffer (0.075 M sucrose, 0.225

M sorbitol, 1 mM EGTA, 0.1% fatty-acid-free BSA, and 10 mM Tris–HCl, pH 7.4). An aliquot

was kept to determine total [14C and 3H] activity in the tissue as previously described (39).

Fractional uptakes of 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose were determined by measuring

[14C] and [3H] activity in tissue extracts using a scintillation counter (liquid scintillation analyzer

Tri-Carb 2900TR, PerkinElmer, Montreal, QC, Canada). They were expressed as the percentage

of injected dose (%ID) of [14C] and [3H] recovered per gram of tissues.

IBAT gene expression

Eight (8) groups of rats were used to assess the effects of MTII on iBAT gene expression

in the presence or absence of HS024, Δ9-THC or AM251. Rats were killed either 60 minutes after

MTII and the CB1 ligands or 24 hours after drug treatments, which were administered 3 times at

12-hour intervals.

The expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha

(Pgc1α), Type II iodothyronine deiodinase (Dio2), carnitine palmitoyltransferase 1B (Cpt1b),

uncoupling protein 1 (Ucp1) was assessed as previously described (43). Briefly, RNA was

isolated from the iBAT depot with QIAzol and the RNeasy Lipid Tissue Kit (QIAGEN,

Mississauga, ON, Canada). For cDNA synthesis, expand reverse transcriptase (Invitrogen,

Burlington, ON, Canada) was used following manufacturer's instructions, and cDNA was diluted

in DNase-free water (1:25) before quantification by real-time PCR. mRNA transcript levels were

measured in duplicate samples using a Rotor Gene 3000 system (Montreal Biotech, Montreal,

QC, Canada). The primers used for the PCR reactions are shown in Table 1. At the end of each

run, melt curve analyses were performed, and a few samples representative of each experimental

group were run on agarose gel to ensure the specificity of the amplification. Results were

expressed as the ratio of the expression of the target gene to that of the housekeeping gene Arbp,

which was selected as no significant variation in its expression was observed after treatments.

87

Involvement of the PVH in the CB1-mediated effects of MTII on thermogenesis

MC4R colocalisation with CB1 and vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2) mRNA

in the PVH

Untreated rats were used to determine whether MC4R neurons expressed CB1 mRNA.

We hypothesized that MCR4-containing neurons were stimulatory and therefore verified if they

were glutamatergic by colocalizing MCR4 and VGLUT2.

Colocalisations were performed by histochemistry as performed previously (44). Rats

were anesthetized with 1.5 ml mixture containing 20 mg/ml ketamine and 2.5 mg/ml xylazine.

Once the animals showed no more reflexes, they were intracardially perfused with 50 ml of ice-

cold isotonic saline followed by 500 ml of paraformaldehyde (4%) solution. Brains were

removed and kept in paraformaldehyde for an additional period of 7 days. They were then

transferred overnight to a solution containing paraformaldehyde (4%) and sucrose (10%) and

sliced using a sliding microtome (Histoslide 2000, Reichert-Jung, Heidelberg, Germany). Thirty-

micrometer thick sections of the PVH were collected and stored at −30°C in a cold

cryoprotecting solution containing sodium phosphate buffer (50-mM), ethylene glycol (30%),

and glycerol (20%).

In situ hybridization histochemistry was used to reveal CB1 mRNA and VGLUT2 mRNA

on the brain sections taken from the whole brain sections in the antero-posterior level around the

hypothalamus. The protocol used was largely adapted from the technique described by Simmons

et al. (45).

Briefly, one out of every six brains sections were mounted onto poly-L-lysine coated slides.

The sections were then successively fixed in paraformaldehyde (4%), digested with proteinase K

(10-µg/ml in 100-mM Tris–HCl containing 50-mM EDTA (pH 8.0)), acetylated with acetic

anhydride (0.25% in 0.1 M triethanolamine (pH 8.0)), and dehydrated through graded

concentrations (50, 70, 95, and 100%) of alcohol. Thereafter, 100 µl hybridization mixture, which

contains an antisense 35S-labeled cRNA probe, were spotted on each slide. The slides were sealed

with coverslips and incubated overnight at 70°C in a slide warmer. The next day, the coverslips

88

were removed and the slides were rinsed four times with SSC (0.6 M NaCl, 60 mM trisodium

citrate buffer (pH 7.0)), digested with RNAse A (20 µg/ml in 10 mM Tris–500-mM NaCl

containing 1 mM EDTA), washed in descending concentrations of SSC (2×, 10 min; 1×, 5 min;

0.5×, 5 min; 0.1×, 30 min at 60°C) and dehydrated through graded concentrations of alcohol. An

X-ray film (Kodak) was exposed to the slides. Once removed from the autoradiography cassettes,

the slides were defatted in toluene, dipped in NTB2 nuclear emulsion (Eastman Kodak), and

exposed for 7 days, before being developed in D 19 developer and fixed in rapid fixer (Kodak).

The cRNA probes (Table 2) were generated from cDNA fragments subcloned into pGem-

T plasmid (Promega, Madison, WI, USA), and linearized with restriction enzymes (New England

Biolabs, Whitby, ON, Canada) and transcribed in vitro using RNA polymerases (Stratagene, La

Jolla, CA) in the presence of 35S-labeled UTP (PerkinElmer, Boston, MA) to generate sense and

antisense probes. To measure the specificity of each probe, a confirmation by the absence of

positive signal in sections hybridized with the sense probe was done.

MC4R was immunostained (46-48) after the in situ hydridization. Briefly, brain slices

were incubated overnight at 4°C with the MC4R antibody (1/400) (#ab24233; Abcam Inc.,

Toronto, ON, Canada) in KPBS (50-mM) with Triton X-100 (0.3%) goat serum (1%) and BSA

(5%). Following incubation at 4°C with the first antibody, the brain slices were rinsed in sterile

KPBS and incubated with the same previous mixture of KPBS in which we added a biotinylated

goat anti-rabbit second antibody (1/150) (Vector Laboratories Inc., Burlington, ON, Canada) for

2 hours. Sections were then rinsed with KPBS and incubated at room temperature for 60 min

with an avidin–biotin–peroxidase complex (Vectasain ABC Elite Kit; Vector labs, Burlingame,

CA). After several rinses in sterile KPBS, the brain slices were allowed to react in a mixture

containing sterile KPBS, the chromagen 3,3′ -diaminbenzidine tetrahydrochloride (DAB,

0.05%) and 0.3% hydrogen peroxide. Thereafter, tissues were rinsed in sterile KPBS and covered

with a coverslip.

All slides were examined using an Olympus BX61 microscope (Olympus Canada,

Richmond Hill, ON, Canada). Images were acquired with a DVC-2000C digital camera (DVC

Company Inc., Austin, TX, USA).

89

BAT thermogenesis

Four (4) groups of rats were used to determine BAT thermogenesis and metabolic

activity. Anesthetized rats were infused in the PVH (bilaterally) with MTII at the dose of 50-ng

administered in each side and with Δ9-THC at the dose of 3-µg in the fourth ventricle. The doses

were selected based on the observations made in the previous series of experiments. In this series

of experiments, we did not use AM251 but rather focused on Δ9-THC. BAT thermogenesis and

metabolic activity were measured as described above. We also examined the expression of

Pgc1α, Dio2, Cpt1b and Ucp1 in rats killed 60 minutes after the administration of the drugs.

Statistical analyses

Values obtained from rats with improper placement of cannula were excluded from the

statistical analyses. Results are expressed as means ± SEM. Comparisons were done on normally

distributed data using Mann-Whitney or two-way ANOVAs followed by Bonferroni post hoc

tests (when appropriate) to assess the differences between various conditions with Graph pad

Prism Software version 6.0 for Mac (San Diego, CA, USA). Differences were considered

statistically significant when P values were less than 0.05.

91

Results

Effects of third ventricle infusions of MTII, ΔΔ9-THC and AM251 on thermogenesis.

Figure 2 illustrates the effects of third ventricle infusions of Δ9-THC and AM251 on

MTII-induced whole body thermogenesis. Acute icv infusion of MTII dose-dependently

increased VO2 and energy expenditure. Neither Δ9-THC nor AM251, given alone, influenced

those variables. However, Δ9-THC blunted the stimulating effects of MTII (Fig. 2, A-D); rats

treated with MTII and Δ9-THC had VO2 and energy expenditure values lower than those of

animals treated with MTII alone. On the other hand, AM251 tended to potentiate the MTII effects

on VO2 and energy expenditure (Fig. 2, E-H) since rats treated with 30 ng of MTII and AM251

had higher VO2 and energy expenditure than rats treated with MTII. The latter effects

disappeared at the MTII dose of 300 ng, likely because that dose led to a near maximal effect.

None of the treatments used altered the respiratory quotient (Fig. 2, C and G).

The effects of third ventricle infusions of Δ9-THC and AM251 on MTII-induced iBAT

thermogenesis, whole body CO2 production and 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose

uptakes are shown in Figure 3. Δ9-THC and AM251 blunted and potentiated, respectively, the

effects of MTII on iBAT temperature (Fig. 3, A-B). Δ9-THC also blocked the stimulating effects

of MTII on whole body CO2 production and 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose uptakes

whereas AM251 was without effect on those variables (Fig. 3, C-F). There were significant

correlations between iBAT temperature and VCO2 and between iBAT temperature and 14C-

bromopalmitate uptake (Fig. 3, G-H).

Figure 4 demonstrates the effects of MTII, Δ9-THC and AM251 on the expression of

mRNAs coding for proteins involved in BAT thermogenesis. We looked at the expression of

Pgc1α, Dio2, Cpt1b and Ucp1 in rats euthanized one hour after the infusion of the drugs (Fig. 4,

A-B). Δ9-THC blocked the stimulating effect of MTII on Pgc1α and Dio2 (Fig. 4A) whereas

AM251 was without effect (Fig. 4B). Δ9-THC and AM251 alone did not affect the expression of

the genes. MTII did not change the expression of Cpt1b and Ucp1 when rats were killed 60

minutes after infusion. However, significant effects of MTII were observable after 3 infusions of

the drugs given at 12-hour intervals over a period of 24 hours. In that context, Δ9-THC again

92

attenuated the inducing effect of MTII on Cpt1b and Ucp1 (Fig. 4C) whereas AM251 was

without effect (Fig. 4D).

To conclude the series of experiments on third ventricle infusions, we confirmed the role

of the MC4R and CB1 on the respective effects of MTII and Δ9-THC on iBAT thermogenesis.

The selective MC4R antagonist HS024 blocked the stimulating effects of MTII on iBAT

thermogenesis (Fig. 5, A-B), whole body CO2 production (Fig. 5, C-D), expression of Pgc1α and

Dio2 (Fig. 5E) and 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose uptakes (Fig. 5F). On the other

hand, AM251 prevented the inhibitory effects of Δ9-THC on MTII-induced BAT thermogenesis

(Fig. 5, G-H).

Involvement of the PVH in the CB1-mediated effects of MTII on thermogenesis.

To test the hypothesis that PVH was involved in the CB1-mediated effects of MTII on

thermogenesis, we conducted experiments to first demonstrate the neuronal colocalisation of

MC4R with CB1 mRNA in the PVH and then to verify whether Δ9-THC could prevent the BAT

thermogenic response induced by the PVH infusion of MTII.

Figure 6 illustrates the co-localization of the MC4R with CB1 mRNA (Fig. 6, A-B). The

MC4R also appeared to be present in glutamate stimulatory neurons as it co-localized with

VGLUT2 mRNA (Fig. 6, C-D). When infused in the PVH, MTII activated iBAT and whole body

thermogenesis and those effects were blocked by Δ9-THC when injected into the fourth ventricle

(Fig. 7, A-D). We injected Δ9-THC into the fourth ventricle to irrigate the brainstem and the

intermediolateral column (IML), possible sites of CB1 projections. It is noteworthy that the rise

in iBAT temperature following PVH infusion of MTII was higher than that observed following

the third ventricle infusion. Δ9-THC also blocked MTII-induced Pgc1α and Dio2 expression in

iBAT (Fig. 7E). Finally, MTII raised iBAT uptake of 14C-bromopalmitate and this effect was

blocked with Δ9-THC (Fig. 7F). None of the treatments altered the uptake of 3H-deoxyglucose

and the expression of Cpt1b and Ucp1 in rats killed 60 minutes after infusion (Fig. 7G-H).

93

Discussion

The present results confirm the modulating role of the CB1 on the stimulating effects of

MC4R agonism on thermogenesis. Icv administration of Δ9-THC and AM251 blunted and

potentiated, respectively, the stimulation by MTII of whole body and BAT thermogenesis. Δ9-

THC blunted iBAT expression of genes involved in thermogenesis and BAT uptakes of the

glucose and NEFA tracers 3H-deoxyglucose and 14C-bromopalmitate respectively. The present

results also demonstrate the implication of the PVH in the CB1-modulated effects of the MC4R

stimulation of iBAT thermogenesis and metabolic activity. Indeed, icv administration of Δ9-THC

blocked the stimulating effect of intra-PVH administration of MTII on BAT thermogenesis,

iBAT expression of genes involved in thermogenesis and uptake of 14C-bromopalmitate. We also

confirmed the presence of CB1 mRNA in the PVH MC4R neurons and demonstrated that the

latter were in large part glutamatergic neurons (expressing VGLUT2), therefore, stimulatory

neurons.

The present study further emphasizes the role of MC4R agonism in stimulating

thermogenesis. We confirmed that the ability of MTII to stimulate thermogenesis (49) could be

blocked by the specific MC4R antagonist HS024. MTII not only elevated whole body

thermogenesis and iBAT temperature but also the uptake 3H-deoxyglucose and 14C-

bromopalmitate, which are used as markers of glucose (42) and NEFA uptakes (38,39). The

importance of the MC4R in thermogenesis has been claimed before from investigations carried

out in MC4R KO mice (50) and is supported anatomically by retrograde transneuronal viral tract

tracing studies, which have demonstrated, in mice (17) and hamsters (14), the link between the

brain MCR4-expressing neurons and iBAT. In fact, in regions such as the PVH, preoptic area and

raphe, it has been estimated that more than 80% of MC4R neurons govern the SNS outflow to

iBAT (14).

This study emphasizes the role played by the CB1 in modulating the stimulating effect of

MC4R agonism on thermogenesis. The CB1 agonist Δ9-THC blocked the stimulating effects of

the MC4R agonist MTII on whole body VO2 and VCO2, iBAT temperature, iBAT uptakes of

glucose and NEFA and iBAT expression of genes involved in thermogenesis. Consistently, the

CB1 antagonist AM251 proved capable of potentiating the stimulating effects of MTII at the dose

94

of 30 ng. This effect was not seen when the 300 ng dose of MTII was used as that dose possibly

produced a ceiling effect on most variables studied. The modulating effect of CB1 ligands on the

stimulating effect of MC4R agonism on whole body thermogenesis had not been extensively

investigated but was predictable from the work of Verty et al (25), who demonstrated that CB1

signaling could prevent the melanocortin system from acting on food intake. The melanocortin

and endocannabinoid systems are known to exert opposite actions on energy balance due to

effects exerted on both food intake and energy expenditure (24,51). In this study, Δ9-THC and

AM251 given alone did not affect thermogenesis at the doses that were selected and acutely

administered. There is, however, evidence that subchronic administration of rimonabant (52) or

Δ9-THC (53) can enhance or prevent thermogenesis, respectively.

Our results demonstrate the role of the PVH as a potential site for the CB1-modulated

thermogenic effect of MTII. The PVH plays a major role in energy balance and has been

demonstrated to be a site for the melanocortin action on energy homeostasis (14,54). MTII

injection in the PVH has been reported to increase iBAT thermogenesis (14). Additionally, the

PVH has been reported to host a large number of MC4R-expressing neurons, which are

connected to BAT (14) and which express the CB1 (Fig. 6, A-B). In this study, we were able to

block the thermogenic action of the PVH infusion of MTII with Δ9-THC. We infused Δ9-THC in

the fourth ventricle as we expected the action of the drug on presynaptic CB1 synthesized in PVH

neurons projecting down in the IML. The CB1 is in fact known to exert its action at the

presynaptic levels (31). The CB1 would control the activity of PVH MC4R neurons harbouring

CB1 receptors on their terminals and projecting to the spinal cord. Those neurons could be

stimulatory as suggested by the neuronal colocalization in the PVH of MC4R and VGLUT2. This

circuitry however needs to be fully delineated. Similar to the CB1 modulation of the MC4R-

mediated hypophagic effect (25), that of MC4R-mediated thermogenic effect appears located

downstream from the melanocortin receptors.

In conclusion, the present results confirm the thermogenic role of the melanocortin

system. They emphasize the involvement of the CB1 in modulating the brain stimulation of

thermogenesis by MC4R agonism and they demonstrate a potential involvement of the PVH in

that stimulation.

95

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes of Health Research

(CIHR — MOP-119436) to D.R. and was performed at the Quebec Heart and Lung Institute

Research Center, which is funded by the Fonds de la recherche du Québec — Santé (FRQ-S). B.

Monge-Roffarello holds a fellowship from the CIHR Training Program in Obesity/Healthy Body

Weight Research. SM Labbé is the recipient of a CIHR postdoctoral fellowship. We are grateful

to Julie Plamondon and Pierre Samson for their helpful laboratory assistance.

97

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103

Tables

Table 1: qPCR gene information.

Gene Forward sequence Reverse sequence Annealing temperature °C

Arbp TAAAGACTGGAGACAAGGTG GTGTAGTCAGTCTCCACAGA 60

Cpt1b CGGAAGCACACCAGGCAGTA GCAGCTTCAGGGTTTGTCGGAATA 64

Dio2 ATGGGACTCCTCAGCGTAGA GCACAGGCAAAGTCAAGAAG 60

Pgc1α TCCTGTTACTATTATGAATCAAGCC AAACCATAGCTGTCTCCATCATCC 64

Ucp1 TGGTGAGTTCGACAACTTCC GTGGGCTGCCCAATGAATAC 64

Table 2: probes characterizations.

Probes Accenssion number Bp number Sequence Restriction

enzyme S/AS RNA polymerase

S/AS

CB1 NM_012784 400 294-693 Not-Nco1 T7-SP6

VGLUT2 NM_053427 829 2889-3717 Nco1-Nde1 SP6-T7

105

Figure Legends

Figure 1. Experimental protocol. A. Experimental protocol for the measurement of whole

body thermogenesis by indirect calorimetry. B. Experimental protocol for the measurement of

iBAT thermogenesis, metabolic activity and gene expression with 3rd ventricle injections. C.

Experimental protocol for the measurement of iBAT thermogenesis, metabolic activity and gene

expression with PVH and 4th ventricle injections.

Figure 2. Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on whole body

thermogenesis. Twelve distinct groups of 7-10 rats were used to test the effects of MTII (0, 30

and 300 ng) with Δ9-THC or AM251. Drugs were infused in the third ventricle of the brain (3V).

Δ9-THC and AM251 were infused 15 minutes before MTII. The measure of oxygen

consumption: curves (A, F) and the area under the curve (AUC — from baseline) (B, G). The

AUC of energy expenditure (C, H). The AUC was measured over 180 min following the MTII

infusion. The measures of respiratory quotient: curves (D, I) and bar graphs during the last hour

(E, J). * P < 0.05 vs. Vehicle-Vehicle, # P < 0.05 vs. Vehicle-MTII (30 ng) and † P < 0.05 vs.

Vehicle-MTII (300 ng).

Figure 3. Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT thermogenesis,

whole body thermogenesis and metabolic activity. Six distinct groups of 6-8 rats were used to test

the effect of MTII (0 or 300 ng) with Δ9-THC (3 µg) or AM251 (3 µg). Drugs were infused in the

third ventricle (3V). Δ9-THC and AM251 were infused 15 minutes before MTII. The area under

the curve (AUC — from baseline) for Δ-iBAT temperature (A, B), Δ-CO2 exhaled (indirect

assessment of whole body thermogenesis) (C, D) was measured over 60 min following the MTII

infusion. The 14C-bromopalmitate (E) and 3H-deoxyglucose (F) uptakes in iBAT (over 30

minutes prior to euthanasia) are expressed as % of the injected dose per gram of tissue. The

Pearson correlations between the AUCs of Δ-iBAT temperature and Δ-CO2, and the AUCs of Δ-

iBAT temperature and the % bromopalmitate uptake are illustrated in G and H, respectively. * P

< 0.05 vs. Vehicle-Vehicle, # P < 0.05 vs. Vehicle-MTII 300 ng.

Figure 4. Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT gene expression. A

and B. Six distinct groups of 6-8 rats were used to test the effect of MTII (0 or 300 ng)

administered with Δ9-THC (A) or AM251 (B). The drugs were infused in the third ventricle (3V).

106

Δ9-THC and AM251 were infused 15 minutes before MTII. Pgc1α, Dio2, Cpt1b and Ucp1

mRNA expressions in iBAT were measured in rats sacrificed 1 hour after the last infusion. C and

D. Twelve distinct groups of 6-7 rats were used to test the effect of three doses of MTII (0, 30

and 300 ng) given with Δ9-THC (3 µg) (C) or AM251 (3 µg) (D). Drugs were infused in the third

ventricle (3V) over a period of 24 hours with 12 hours between each treatment. Δ9-THC and

AM251 were infused 15 minutes before MTII. Rats were killed 2 hours after the last infusion. *

P < 0.05 vs. Vehicle-Vehicle, # P < 0.05 vs Vehicle-MTII (30 ng), † P < 0.05 vs. Vehicle-MTII

(300 ng).

Figure 5. Effect of HS024 or Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT

thermogenesis, whole body thermogenesis and metabolic activity. Ten distinct groups of 6-8 rats

were used to test the effect of MTII (0 or 300 ng) given with HS024 (1 µg) (A-F) and the effect

of MTII (0 or 300 ng) given with Δ9-THC (3 µg) and AM251 (3 µg) (G-H). Drugs were infused

in the third ventricle (3V). HS024 or Δ9-THC and AM251 were infused 15 minutes before MTII.

The area under the curve (AUC — from baseline) for Δ-iBAT temperature (B), Δ-CO2 exhaled

(D) were measured over 60 min following the last infusion. The Pgc1α and Dio2 mRNA

expression in iBAT, 1 hour after the MTII infusion is illustrated in E. The 14C-bromopalmitate

and 3H-deoxyglucose uptakes in iBAT (over 30 minutes prior to euthanasia) are expressed as %

of injected dose per gram of tissue in F. The AUC — from baseline) for iBAT temperature was

measured over 60 min following the MTII infusion (H). * P < 0.05 vs. Vehicle-Vehicle, # P <

0.05 vs. Vehicle-MTII.

Figure 6. Colocalization of MC4R with CB1 and VGLUT2 mRNA in the PVH. The

MC4R was revealed in brown by immunohistochemistry staining. CB1 mRNA (A-B) and

VGLUT2 mRNA (C-D) were revealed as clusters of silver gains following in situ hybridization.

Neurons presenting a colocalization are highlighted by red arrows.

Figure 7. Effect of Δ9-THC on the PVH MTII infusion effect on iBAT thermogenic

activity and capacity. Four distinct groups of 6-7 rats were used to test the effect of MTII (0 or

100 ng) given with Δ9-THC (3 µg). MTII was infused in the PVH, bilaterally, and Δ9-THC was

administered in caudal fourth ventricle (4V). Δ9-THC was infused 15 minutes before MTII. The

area under the curve (AUC — from baseline) for Δ-iBAT temperature (B), Δ-CO2 exhaled (D)

was measured over 60 min following the last infusion. The Pgc1α and Dio2 mRNA expression

107

(E) or Cpt1b and Ucp1 (G) mRNA expression in iBAT was measured in rats killed 1 hour after

the MTII infusion. The 14C-bromopalmitate (F) and 3H-deoxyglucose (H) uptakes in iBAT (over

30 minutes prior to euthanasia) are expressed as % of injected dose per gram of tissue. * P < 0.05

vs. Vehicle-Vehicle, # P < 0.05 vs. Vehicle-MTII.

109

Figures

Figure 1: Experimental protocol.

110

Figure 2: Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on whole body

thermogenesis.

111

Figure 3: Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT thermogenesis,

whole body thermogenesis and metabolic activity.

112

Figure 4: Effects of Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT gene expression.

113

Figure 5: Effect of HS024 or Δ9-THC and AM251 on the MTII effects on iBAT

thermogenesis, whole body thermogenesis and metabolic activity.

114

Figure 6: Colocalization of MC4R with CB1 and VGLUT2 mRNA in the PVH.

115

Figure 7: Effect of Δ9-THC on the PVH MTII infusion effect on iBAT thermogenic activity

and capacity.

117

Chapitre 2

119

The medial preoptic nucleus as a site of the thermogenic and metabolic actions of

Melanotan II in male rats.

Boris Monge-Roffarello, Sebastien M. Labbe, Alexandre Caron, Damien Lanfray,

Pierre Samson, Denis Richard

Centre de Recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de

Québec, Université Laval, Québec, Canada.

Article soumis à American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism

121

Résumé

Cette étude a été élaborée afin d’investiguer le rôle du noyau préoptique médial (MPO)

comme site d’action des effets thermogènes et métaboliques d’un analogue de l’α−MSH, le

Melanotan II (MTII). Nous avons aussi évalué l’implication du noyau hypothalamique

dorsomédian (DMH), grâce à l’étude des effets de l’infusion de MTII dans le MPO chez des rats

donc le DMH a subi des lésions par l’injection d’acide kaïnique. L’injection de MTII dans le

MPO conduit à l’augmentation de la température et du captage de C14-bromopalmitate dans le

tissu adipeux brun interscapulaire (iBAT). La température et le captage de C14-bromopalmitate

sont deux variable corrélées (r=0.63, p<0.001). Ces deux augmentations sont bloquées par des

lésions du DMH. Les lésions du DMH bloquent aussi l’effet du MTII sur l’expression des ARNm

codant pour des protéines impliquées dans (i) la thermogenèse [déiodinase iodothyronine de type

II (Dio2) et le peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (Pgc1α)],

(ii) la lipolyse [hormone sensitive lipase (Hsl)] et (iii) la lipogenèse [diacylglycérol O-

acyltransférase 2 (Dgat2) et la fatty acid synthase (Fas)], dans le iBAT de rats sacrifiés une heure

après l’infusion de MTII dans le MPO. L’expression de gènes dans le tissu adipeux blanc

inguinal est aussi stimulée par le MTII, mais seulement chez les rats avec des lésions du DMH.

Ces gènes incluent le glucose transporter member 4 (Glut4), la glycerol-3-phosphate

acyltransférase 3 (Gpat3), la Dgat1, la Dgat2, la triglyceride lipase (Atgl), la Hsl et le Cpt1β.

L’ensemble de ces résultats révèle que le MPO est un site majeur des effets thermogènes et

métaboliques du MTII. En outre, ils contribuent aussi à établir que le duo MPO-DMH est une

cible importante dans la modulation de l’homéostasie énergétique par les mélanocortines.

123

Abstract

The present study was designed to investigate the role of the medial preoptic nucleus

(MPO) as a site of the thermogenic and metabolic effects of the α−MSH analog Melanotan II

(MTII). We also assessed the involvement of the dorsomedial hypothalamic nucleus (DMH) by

investigating the effects of the MPO infusion of MTII in rats with DMH lesions produced by

kainic acid. Injection of MTII in the MPO led to increases in interscapular BAT (iBAT)

temperature and iBAT uptake of 14C-bromopalmitate. Both increases were blocked by DMH

lesions. iBAT temperature increase (area under curve) and 14C-bromopalmitate uptake emerged

as two correlated variables (r=0.63, p<0.001). DMH lesions also blocked MTII-induced

expression of mRNAs coding for proteins involved in (i) thermogenesis [type II iodothyronine

deiodinase (Dio2) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha

(Pgc1α)], (ii) lipolysis [hormone sensitive lipase (Hsl)] and (iii) lipogenesis [diacylglycerol O-

acyltransferase 2 (Dgat2), fatty acid synthase (Fas)], in iBAT of rats killed one hour after MPO

infusion of MTII. MTII also stimulated expressions of genes in iWAT but only in rats with DMH

lesions. These genes included glucose transporter member 4 (Glut4), glycerol-3-phosphate

acyltransferase 3 (Gpat3), Dgat1, Dgat2, triglyceride lipase (Atgl), Hsl and Cpt1β. Altogether,

the present results reveal the MPO as a site of the thermogenic and metabolic actions of MTII.

They also contribute to establish the MPO-DMH duet as a significant target for melanocortins to

modulate energy homeostasis.

125

Introduction

The role of the brain melanocortin system in energy balance regulation is acknowledged (7,

13, 18, 32, 43). This system comprises the proopiomelanocortin (POMC) neurons of the

hypothalamic arcuate nucleus (ARC) and the widely distributed melanocortin-4 receptors

(MC4R), which are important partners in controlling food intake and energy expenditure. POMC

and Mc4r knockout or loss-of-function mutations are associated with severe obesity in laboratory

rodents (20) as well as in humans (16). Consistent with this, the POMC product

alpha-melanocyte-stimulating hormone (α−MSH) and the α−MSH synthetic analog Melanotan

II, which represent MC4R/MC3R agonists, suppress food intake and stimulate energy

expenditure (14, 21).

In addition to reducing food intake, MC4R agonism has been reported to increase energy

expenditure through stimulating brown adipose tissue (BAT) thermogenesis (6, 15, 38, 39, 41).

Increases in BAT temperature (38, 39), BAT sympathetic nervous system (SNS) activity (15) and

BAT expression of uncoupling protein 1 (UCP1) and accessory thermogenic genes (42) have all

been observed after brain ventricular and parenchymal injections of MC4R agonists. BAT

involvement in MC4R-mediated thermogenic effects is also supported by observations obtained

in Mc4r knockout or SHU9119 (MC4R antagonist)-treated animals, which exhibit diminished

BAT thermogenic capacity/activity (21, 41). Additionally, the role of the MC4R in controlling

BAT thermogenesis is anatomically supported by retrograde viral transneuronal tracing studies,

which have demonstrated the strong connection between MC4R mRNA-expressing neurons and

the SNS outflow to iBAT (39).

There is good evidence that the paraventricular hypothalamus (PVH) (39), ARC (12), and

brainstem (38) are sites of the thermogenic action of MC4R agonists. However, the brain circuits

involved in the MC4R-mediated control of BAT thermogenesis remain to be fully unraveled.

Several brain regions expressing the MC4R have not been systematically investigated as sites of

the MC4R-mediated action on BAT thermogenesis. Among those regions, the preoptic area

(POA) is certainly a worthy candidate. The POA represents the second hypothalamic region, next

to the PVH, with the highest proportion of neurons connected to BAT (via the SNS) that express

the MC4R (39). Within the POA, MC4R mRNA is widely expressed in the medial preoptic

126

nucleus (MPO) (23), which is involved in thermoregulatory thermogenesis (29, 30). The MPO

hosts inhibitory neurons that modulate the activity of the excitatory neurons of the dorsomedial

hypothalamic nucleus (DMH) that control interscapular BAT (iBAT) activity via the raphe

pallidus (RPa) (26, 34). The observation that inhibition of neurons found in the rostral RPa

blocks the thermogenic effect of ventricular injection of MT II (15) supports the involvement of a

MPO-DMH-RPa-SNS circuit in the MC4R-mediated effect on iBAT activity.

The objective of the present study was to verify whether the MPO could be a site where

MTII could stimulate brown fat thermogenesis and metabolism with the complicity of the DMH.

The effects of the MPO infusion of MTII on iBAT temperature as well as on iBAT 14C-

bromopalmitate and 3H-deoxyglucose uptake were assessed in male Wistar rats with or without

DMH lesions. The uptake of the radiolabelled energy substrate was also measured in inguinal

white adipose tissue (iWAT), liver and heart. Furthermore, iBAT and iWAT expression of

thermogenic and metabolic genes was measured in animals killed one hour following MTII with

or without DMH lesions. iWAT was studied since it represents a WAT depot where brown

adipocytes can develop under appropriate adrenergic stimulation (3) and since it is, similar to

iBAT, connected to the MPO-MC4R neurons via the SNS (40).

127

Research Design and Methods

Animals

Male Wistar rats (Charles River Laboratories, St. Constant, QC, Canada), initially

weighting ~300 g, were individually housed at 23 ± 1°C under a 12:12-h light-dark cycle (light

on at 06:00). The rats had ad libitum access to water and pelleted standard chow (Charles River

Rodent Diet no. 5075). All animal treatments and procedures were approved by the Université

Laval Animal Ethics Committee and were in agreement with the Canadian Guide for the Care

and Use of Laboratory Animals.

Drugs

The MC4R/MC3R agonist MTII (Phoenix Pharmaceutical Inc, Burlingame CA, USA)

was dissolved in aCSF and administered at dose of 200 ng in a volume 200 nl (100 nl in each side

of the MPO). Kainic acid (1 mg/ml, Sigma) was dissolved in sterile saline and adjusted to pH

7.2–7.4 by using 0.1 M NaOH. The dose of MTII (21) and kainic acid (25) were selected from

previous studies (25).

MPO MTII infusions

Rats were chronically implanted with bilateral (1.0 mm between tubes) guide-cannulas

(26-gauge — Plastics One, Roanoke, VA, USA), aimed at the MPO, using the following

coordinates relative to bregma: 0.5 mm on each side of the midline, 0.6 mm posterior and 6.5 mm

ventral to the brain surface (36). The cannula was fixed in place using dental cement (Lang

Dental Manufacturing co., Inc, Wheeling, IL, USA) and anchoring screws. Sterile obturators

were inserted into the guide-cannulas to avoid blockage. The placement of the cannulas was

further confirmed under microscope the end of the study and the injection sited were estimated.

(Figure 1, A). Each surgery was done 1-week before the experiment to allow complete recovery

at the time of infusion. Brain MTII infusions were carried out using a 50 µl Hamilton syringe

connected to a syringe pump (Harvard Apparatus 55-2226). In each protocol, the solutions were

carefully infused in the brain during 30 sec (200 nl/min).

128

DMH lesions

DMH lesions were performed prior to the MPO guide-cannula implantation. Briefly, a 26-

gauge bilateral (1.0 mm between tubes) injection cannula (Plastics One, Roanoke, VA, USA) was

stereotaxically aimed at the DMH. The coordinates were as follows: 0.5 mm on each side of the

midline, 3.2 mm posterior to bregma and 8.5 mm ventral to the brain surface (36). Bilateral

infusions of 200 nl of kainic acid or sterile saline (control animals) were performed over a 10-

minute period. The cannula was left in place for another 10 minutes to allow the complete

diffusion of the kainic acid. Kainic acid damages perikarya and dendrites of neurons harboring

kainate receptors while preserving the fibers of passage of other neurons having their bodies

outside the targeted nuclei (4). DMH-lesions are illustrated in figure 1B. DMH-lesioned rats were

subjected to the MT II infusions 10 days after the injections of kainic acid. Their averaged weight

at that time was significantly lower (p<0.05) than that of sham-lesioned animals (331.9 ± 3.9 vs

347.8 ± 4.2). Such an effect had been reporter before (4).

iBAT thermogenesis and iBAT and iWAT energy substrate uptakes

Four (4) groups of rats with of without DMH lesions were used to assess the effects of

aCSF or MPO-infused MTII on iBAT thermogenesis. iBAT temperature was assessed under

isoflurane anesthesia, using a copper-constantan thermocouple (Physitemp Instruments, Inc.

Clifton, NJ, USA) inserted into the right iBAT pad. During the measurement, core temperature

was monitored with a second thermocouple inserted 6 cm into the rectum (19). Skin temperature

was also assessed with a third copper-constantan thermocouple placed on the left-rear leg. Core

and skin measurements were performed before the MPO infusions in order to avoid body

temperature variations. Measurement of CO2 production was assessed using a CO2 analyser

(model S-3A, Applied Electrochemistry Incorporated, Sunnyvale, CA, USA). CO2 production

was used to gauge whole-body thermogenesis. VO2 could not be measured for technical reasons

inherent to the use of the isoflurane mask during the MPO infusions of MTII.

In addition to the iBAT temperature and CO2 production measurements, we also

measured iBAT, iWAT, liver and heart 14C-bromopalmitate ([1-14C]-2-bromopalmitic acid) and 3H-deoxyglucose ([1,2-3H(N)]-Deoxy-D-glucose) uptakes. 14C-bromopalmitate was used to

assess non-esterified fatty acid (NEFA) uptake (27, 28) and to estimate lipid oxidation (10, 27,

129

35) and esterification (27), whereas 3H-deoxyglucose was used to trace glucose uptake (17). Both

radioactive tracers (Moravek Biochemicals, Inc. Brea, CA, USA) were dissolved in normal saline

supplemented with 4% bovine serum albumin (BSA). Thirty minutes after the MPO infusion of

MTII, an intravenous bolus of 20 µCi of each tracer were injected in the tail vein, in a total

volume of 350 µl. Arterial blood sampling was done from carotid prior to the MTII infusion at

time -30, -15, 0 minutes for the measurement of plasma levels of insulin, NEFA and triglycerides

(TG) as previously described (28). Additionally, blood was sampled at time 31, 32, 33, 35, 40, 50

and 60 minutes post MTII infusion to determine the radioactivity clearance. Sixty minutes after

MTII infusion, animals were euthanized with an overdose of anesthetic and tissues were collected

on ice, weighed and stored at -80°C pending analyses. iBAT, iWAT, liver and heart-specific

uptakes of 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose were determined on samples of tissues

(~250 mg), which were homogenized (Polytron PT10-35, Kinematica, inc. Bohemia, NY, USA)

in ice-cold Chappell-Perry buffer (0.075 M sucrose, 0.225 M sorbitol, 1 mM EGTA, 0.1% fatty-

acid-free BSA, and 10 mM Tris–HCl, pH 7.4). An aliquot was kept to determine total [14C and 3H] activity in the tissue as previously described (27). Fractional uptakes of 14C-bromopalmitate

and 3H-deoxyglucose were determined by measuring [14C] and [3H] activity in tissue extracts

using a scintillation counter (liquid scintillation analyzer Tri-Carb 2900TR, PerkinElmer,

Montreal, QC, Canada). Uptakes data were expressed as the percentage of injected dose (% of

ID) of [14C] and [3H] recovered per gram of tissues.

iBAT and iWAT expression of metabolic genes

We determined the expression of genes involved in (i) energy substrate uptake [fatty acid

binding protein 1 (Fabp1) and glucose transporter member 4 (Glut4)], (ii) lipid synthesis

[diacylglycerol O-acyltransferase 1 and 2 (Dgat1 and Dgat2), fatty acid synthase (Fas), glycerol-

3-phosphate acyltransferase 3 (Gpat3)] (iii) lipolysis [triglyceride lipase (Atgl), hormone

sensitive lipase (Hsl)] and (iv) thermogenesis-related genes [carnitine palmitoyltransferase 1β

(Cpt1β), Type II iodothyronine deiodinase (Dio2), peroxisome proliferator-activated receptor-γ

coactivator 1-alpha (Pgc1α), Ucp1]. Briefly, RNA was isolated from iBAT and iWAT depots

with QIAzol and the RNeasy Lipid Tissue Kit (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada). Expand

reverse transcriptase (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) was used for cDNA synthesis,

accpording to manufacturer's instructions. cDNAs were diluted in DNase-free water (1:25) before

130

quantification by real-time PCR. mRNA transcript levels were measured in duplicate samples

using a Rotor Gene 3000 system (Montreal Biotech, Montreal, QC, Canada). The primers used

for the PCR reactions are shown in Table 1. At the end of each run, melt curve analyses were

performed, and a few samples, representative of each experimental group, were run on agarose

gel. Results were expressed as the ratio of the expression of the target gene to that of the

housekeeping gene acidic ribosomal phosphoprotein (Arbp), which was selected as no significant

variation in its expression was observed after our treatment.

Statistical analyses

Values obtained from rats with improper placement of cannula were excluded from the

statistical analyses. Results are expressed as means ± SEMs. Comparisons were done on normally

distributed data using two-way ANOVAs followed by Bonferroni post hoc tests (when

appropriate) to assess the differences between various conditions with Graph pad Prism Software

version 6.0 for Mac (San Diego, CA, USA). Differences were considered statistically significant

when P values were less than 0.05.

131

Results

MTII infusion in the MPO led to an increase (above aCSF) in iBAT temperature, which

was abolished by DMH lesions (Figure 2, A-B). The infusion of MTII also produced an elevation

in CO2 production (Figure 2, C-D), which did not reach statistical significance in rats with DMH

lesions. The correlation between iBAT temperature elevation and whole body CO2 production

(Figure 2, E) proved to be highly significant (r = 0.79, P < 0.001).

Together with measuring iBAT thermogenesis and VCO2 production, we also measured 14C-bromopalmitate and 3H-deoxyglucose uptake in iBAT, iWAT, liver and heart (Figure 3).

MPO infusion of MTII led to an increase (above aCSF) in 14C-bromopalmitate uptake in iBAT,

which was prevented by DMH lesions (Figure 3, A). However, we did not observe any increase

in iBAT 3H-deoxyglucose uptake following MTII (Figure 3, B), revealing NEFA uptake as a

better predictor of BAT thermogenesis than glucose uptake in the context of the present study.

Correlation analyses, which showed a significant Pearson's r (0.63, p < 0.001) solely between

iBAT temperature elevation and 14C-bromopalmitate uptake (Figure 3, C-D), support this

deduction. MTII infusion in MPO increased (above aCSF) 14C-bromopalmitate and 3H-

deoxyglucose uptakes in iWAT (Figure 3, E-F). The effect was however statistically significant

(p < 0.05) only for the 14C-bromopalmitate uptake. MPO infusion of MTII also stimulated liver 14C-bromopalmitate uptake, which was prevented by DMH lesions (Figure 3, G). MTII and DMH

lesions did not influence liver 3H-deoxyglucose uptake (Figure 3, H). Finally, MTII did not

increase heart 14C-bromopalmitate uptake (Figure 3, I), whereas DMH lesions significantly

(p<0.05) reduced heart 3H-deoxyglucose uptake, regardless of whether aCSF or MTII was

injected in the MPO (Figure 3, H).

The effects of MTII and DMH lesions on the expression of genes involved in iBAT

thermogenesis and metabolism are illustrated in figure 4A. We observed that MTII increased

expression of genes involved in lipogenesis (Fas and Dgat2), lipolysis (Hsl) and thermogenesis

(Pgc1α and Dio2) in sham-lesioned rats. The effects of MTII were however abolished following

DMH lesions. As revealed by the correlations presented in Figure 4, B-C, 14C-bromopalmitate

uptake in iBAT correlated well with the expression of Hsl (r = 0.62, P < 0.001), which is

implicated in lipolysis, and Dgat2 (r = 0.51, P < 0.01), which is implicated in the synthesis of

TG. Figure 4, D illustrates the effects of the various experimental treatments on the iWAT

132

expression of the genes reported for BAT in Figure 4, A. In sham-lesioned animals, MTII did not

lead to any increase in gene expression. In fact, it reduced Glut4 and Gpat3 expressions.

However, in DMH-lesioned rats, MTII induced Glut4, Gpat3, Dgat1, Dgat2, Hsl, Atgl and Cpt1

β. As illustrated in Figure 4, E-F, the mRNA coding for Fas, which is implicated in the

synthesis of TG correlated well with 14C-bromopalmitate (r = 0.46, P = 0.02) and 3H-

deoxyglucose (r = 0.59, P < 0.01) uptake in iWAT.

Table 2 presents the differences (Δ) between post- and pre-infusion levels of circulating

NEFA, TG, and insulin. DMH-lesioned rats showed a Δ insulin that was significantly lower than

that of aCSF-sham-lesioned animals.

133

Discussion

The present results point to the MPO as a site of the thermogenic and metabolic actions of

MTII, the synthetic analog of α-MSH and a MC4R/MC3R agonist. The MPO injection of MTII,

led to an increase in iBAT temperature, which was accompanied by increases in iBAT 14C-

bromopalmitate uptake and iBAT expression of genes involved in the thermogenesis and energy

metabolism. This study also demonstrated the role of DMH in the effect of the MPO infusion of

MTII. DMH lesions caused by a neurotoxic dose of kainic acid blunted the MTII-induced

increases in iBAT temperature, 14C-bromopalmitate uptake and iBAT expression of

metabolic/thermogenic genes. Finally, the present results also suggest that the MPO melanocortin

receptors could, through the MPO-DMH duet, be involved in energy substrate metabolism in

other tissues such as iWAT and liver.

The injection of MTII into the MPO led to an increase in iBAT temperature, which was

abolished by DMH lesions. Together with revealing a new site of the thermogenic action of

MTII, these findings further support the role of the POA (which comprises the MPO) and DMH

in the control of iBAT thermogenesis. These two structures have indeed been flagged to for their

participation in cold-induced thermogenesis (29). The POA has also been reported to be the site

of thermogenic action of corticotropin-releasing factor (8, 11) and prostaglandin E2 (2, 26),

which seemingly act by releasing the inhibitory effect of POA GABA neurons on the DMH to

stimulate the RPa neurons governing the SNS outflow to iBAT (8, 29). Within the POA, both the

MC4R and MC3R are expressed in relative abundance in the MPO (32). However, the MC4R is

most probably the melanocortin receptor mediating the thermogenic effect of MTII since it is

expressed in neurons that are polysynaptically connected to iBAT (39) and iWAT (40) via the

SNS. Further supporting this assumption are recent results from our group demonstrating the

ability of HS024, a specific MC4R agonist, to block the iBAT-stimulating effect of the third

ventricle infusion of MTII in rats (Monge-Roffarello, B; Labbé, S and Richard, D, unpublished

results). Finally, the observation that the MTII infusion in the MPO caused an increase in BAT

thermogenesis further supports the integrative role of the POA in the effects of the melanocortins

in energy balance regulation. This role was suggested in a previous investigation pointing to the

MPO as one of the major sites of the hypophagic action of α-MSH (22).

134

The DMH-dependent stimulating effect of the MPO infusion of MTII on iBAT

temperature was accompanied by an increase in iBAT 14C-bromopalmitate uptake. This tracer is

taken up by cells as native NEFA and is trapped in mitochondria (27). 14C-bromopalmitate

uptake correlated well with the change in iBAT temperature. This was not the case with 3H-

deoxyglucose uptake, which appeared, in this study, as a poor predictor of the MTII effects on

BAT thermogenesis, both in sham- and DMH-lesioned groups. 14C-bromopalmitate uptake also

significantly correlated with iBAT Hsl and Dgat2 mRNA expression further indicating that 14C-

bromopalmitate uptake can be used to predict lipid oxidation (10, 27, 35) and esterification (27).

Noteworthily, Hsl (lipolysis) and Dgat2 (lipogenesis) were among those genes, which also

included Fatp1 (fatty acid uptake), Fas (de novo lipogenesis) and Pgc1α and Dio2

(thermogenesis), whose expression underwent a DMH-dependent stimulating effect of MTII. We

did not observe any induction of Ucp1 following MTII, this likely because of the short period

time (one hour) elapsing between the MTII treatment and the killing of the rats.

We also observed DMH-dependent metabolic effects of the MPO infusion of MTII in

tissues other than BAT. Indeed, MPO infusion of MTII increased 14C-bromopalmitate uptake in

the liver and iWAT and DMH lesions blunted those effects. Such findings further support the

extensive role for the MPO melanocortin receptors and POA/DMH duet in energy metabolism

(29, 37). Given the recognition of iWAT as a WAT depot capable of developing brown

adipocytes (beige depot) (3) and the neuroanatomical link between iWAT and the POA via the

SNS (40), we choose to examine the same panel of genes in this fat depot as the one we

scrutinized in iBAT. The stimulating effects of MTII were however only seen in iWAT of rats

with DMH lesions. Indeed, in those rats, MTII induced genes involved in the glucose transport

(Glut4), lipogenesis (Gpat3, Dgat1 and Dgat2), lipolysis (Hsl, Atgl) and

thermogenesis/metabolism (Cpt1β). The different effects seen in iBAT and iWAT cannot be

easily explained. Nonetheless, these findings demonstrate the importance of the DMH in

modulating and potentially fine-tuning energy homeostasis. DMH comprises excitatory

glutamatergic neurons that were reported to be key players in the control of SNS-mediated iBAT

thermogenesis (30, 31, 33). It seems reasonable to assume that those glutamatergic neurons were

affected by kainic acid (1, 4), which prevented the temperature rise in iBAT induced by the MPO

infusion of MTII. On the other hand, the increased expression of genes such as Hsl, Atgl and

Cpt1β, which we saw in iWAT after MTII only in rats with damaged DMH, suggests an

135

enhanced iWAT metabolic activity, reminiscent of the effects seen after DMH NPY knockdown

(5). Knockdown of DMH NPY has indeed been reported to stimulate metabolism and the

browning of iWAT (due to the development of brown adipocytes) (5). The DMH neurons can

produce NPY in neurons that also expressed CART (24) and enhanced expression of NPY in the

DMH has been associated with excess fat deposition (44), high fat feeding (24) and lactation (9).

The possibility that the NPY-expressing neurons could have been damaged by kainic acid cannot

be excluded. Further studies are however needed to verify this possibility and further clarify the

complex interplay the POA and DMH in iWAT metabolism.

In conclusion, the present results revealed the MPO as a site of the thermogenic and

metabolic actions of MTII. They also established the MPO-DMH duet as a target for the

melanocortin effects on energy homeostasis.

137

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes of Health Research

(CIHR — MOP-119436) and was performed at the Quebec Heart and Lung Institute Research

Center, which is funded by the Fonds de la recherche du Québec — Santé (FRQ-S). B. Monge-

Roffarello holds a fellowship from the CIHR Training Program in Obesity/Healthy Body Weight

Research. SM Labbé is the recipient of a CIHR postdoctoral fellowship. A. Caron holds a

fellowship from the CIHR Training Program in Obesity/Healthy Body Weight Research. We are

grateful to Julie Plamondon for its helpful laboratory assistance.

139

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143

Tables

Table 1: qPCR gene information.

Gene Forward sequence Reverse sequence Annealing temperature °C

Arbp TAAAGACTGGAGACAAGGTG GTGTAGTCAGTCTCCACAGA 60

Atgl CACTTTAGCTCCAAGGATGA TGGTTCAGTAGGCCATTCCT 60

Cpt1b CGGAAGCACACCAGGCAGTA GCAGCTTCAGGGTTTGTCGGAATA 64

Dio2 ATGGGACTCCTCAGCGTAGA GCACAGGCAAAGTCAAGAAG 60

Dgat1 TATTACTTCATCTTTGCTCC AAAGTAGGTGACAGACTCAG 60

Dgat2 TGCCCGCAGCGAGAACAAGAATAAA GGCGTGTTCCAGTCAAATGCCA 64

Fabp1 GCCAAGAGAACTTTGAGCCC CTTGTAGACGATGTCACCCAGT 60

Fas GAGTCCGAGTCTGTCTCCCGCTTGA GCCGTGAGGTTGCTGTTGTCTGTAG 64

Glut4 AGTGACTGGGACACTGGTCCTT ACATTGTTGGCCAGCATAGC 64

Gpat3 TGGACTGATGGGGATCATTCAGAGA GCCCAGCTTGTCATTATCCGAA 64

Hsl CCTGCTGACCATCAACCGAC CCTCGATCTCCGTGATATTCCAGA 60

Pgc1α TCCTGTTACTATTATGAATCAAGCC AAACCATAGCTGTCTCCATCATCC 64

Ucp1 TGGTGAGTTCGACAACTTCC GTGGGCTGCCCAATGAATAC 64

144

Table 2: Effects of MTII infusion in MPO on blood variation of insulin, NEFA and

triglycerides in DMH-lesioned rats.

Groups Δ-Insulin (pmol/L) Δ-NEFA (mmol/L) Δ-TG (mmol/L)

aCSF-Sham-lesioned -28.29±5.99 -0.127±0.028 -0.168±0.248

MTII-Sham-lesioned -25.37±10.62 -0.011±0.050 -0.104±0.071

aCSF-DMH-lesioned -29.18±8.76 0.020±0.073 0.048±0.117

MTII-DMH-lesioned -71.08±10.50* -0.035±0.029 -0.002±0.150

145

Figure Legends

Figure 1. Histological verification. A) Schematic representation of the MPO infusions of

MTII in the MPO. The different groups are presented as follows: white circles, aCSF-Sham-

lesioned; black circles, MTII-Sham-lesioned; white squares, aCSF-DMH-lesioned; black squares,

MTII-DMH-lesioned). B) Pictures of brain coronal sections taken at the level of DMH in Sham-

and DMH-lesioned rats.

Figure 2. Effects of the MPO infusion of MTII in Sham- and DMH-lesioned rats on iBAT

and whole body thermogenesis. Four distinct groups of 6-7 rats were used to test the effect of

MTII (0 or 100 ng). The area under the curve (AUC — from baseline) for Δ-iBAT temperature

(A, B), Δ-CO2 exhaled (indirect assessment of whole body thermogenesis) (C, D) were measured

over 60 minutes following the MTII infusion. (E) Correlation between the AUC of Δ-iBAT

temperature and Δ-CO2 exhaled. * P < 0.05 vs. aCSF-Sham-lesioned, # P < 0.05 vs MTII-Sham-

lesioned.

Figure 3. Effects of the MPO infusion of MTII on iBAT, iWAT, liver and heart metabolic

activity in Sham- and DMH-lesioned rats. Four distinct groups of 6-7 rats were used to test the

effect of MTII (0 or 100 ng) on 14C-bromopalmitate (A) and 3H-deoxyglucose (B) uptake in

iBAT, on 14C-bromopalmitate (E) and 3H-deoxyglucose (F) uptake in iWAT, on 14C-

bromopalmitate (G) and 3H-deoxyglucose (H) uptake in liver and on 14C-bromopalmitate (I) and 3H-deoxyglucose (J) uptake in heart. (C) Correlation between 14C-bromopalmitate uptake and

AUC of Δ-iBAT temperature. (D) Correlation between 3H-deoxyglucose uptake and AUC of Δ-

iBAT temperature. * P < 0.05 vs. aCSF-Sham-lesioned, # P < 0.05 vs MTII-Sham-lesioned.

Figure 4. Effects of the MPO infusion of MTII on iBAT and iWAT gene expression in

Sham- and DMH-lesioned rats. Four distinct groups of 6-7 rats were used to test the effects of

MTII (0 or 100 ng) on iBAT (A) and iWAT (D) mRNA expressions, which were measured in

146

rats sacrificed 1 hour after MTII infusion. (C) Correlation between 14C-bromopalmitate uptake

and Hsl mRNA expression in iBAT. (D) Correlation between 14C-bromopalmitate uptake and

Dgat2 mRNA expression in iBAT. (E) Correlation between 14C-bromopalmitate uptake and Fas

mRNA expression in iWAT. (F) Correlation between between 3H-deoxyglucose uptake and Fas

mRNA expression in iWAT. * P < 0.05 vs. aCSF-Sham-lesioned, # P < 0.05 vs MTII-aham-

lesioned, † P < 0.05 vs aCSF-DMH-lesioned.

147

Figures

Figure 1: Histological verification.

A"

"B"

"

Bregma'(0.48mm'

Bregma'(0.60mm'

Bregma'(0.72mm'

Bregma'(0.84mm'

DMH$Sham) DMH$lesioned)

148

Figure 2: Effects of the MPO infusion of MTII in Sham- and DMH-lesioned rats on iBAT

and whole body thermogenesis.

0 15 30 45 60

-1

0

1

2

Time (min)

Δ-iB

AT

Tem

pera

ture

°`C

inj.

Sham-lesioned-MTIIDMH-lesioned-aCSFDMH-lesioned-MTII

Sham-lesioned-aCSF

-20

0

20

40

60

80

AU

C Δ

-iBA

T te

mpe

ratu

re

*

#

Sham-lesioned DMH-lesioned

0 15 30 45 60

90

100

110

120

Time (min)

Δ-V

CO

2 %

inj.

-200

0

200

400

600

AU

C Δ

-VC

O2


*

-50 0 50 100 150 200

-500

0

500

1000

1500

2000

AUC Δ-iBAT temperature

AU

C Δ-V

CO

2

P < 0.001 r = 0.788

A B

C D

E

aCSF MTII

149

Figure 3: Effects of the MPO infusion of MTII on iBAT, iWAT, liver and heart metabolic

activity in Sham- and DMH-lesioned rats.

A B

C D

E F

G H

I J

Brown adipose tissue

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

% In

jecte

d do

se o

f [14

C]-b

rom

opal

mita

te / g

ram


*

#

-50 0 50 100 150

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

AUC Δ-iBAT temperature

% In

ject

ed d

ose

of

[14C]

-bro

mop

alm

itate

/ gr

am

P < 0.001r = 0.632

Inguinal white adipose tissue

0.0

0.1

0.2

0.3

% In

jecte

d do

se o

f [14

C]-b

rom

opal

mita

te / g

ram


*#

Liver

0

1

2

3

4

% In

jecte

d do

se o

f [14

C]-b

rom

opal

mita

te / g

ram


*

Heart

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

% In

jecte

d do

se o

f [14

C]-b

rom

opal

mita

te / g

ram



0.0

0.1

0.2

0.3

% In

jecte

d do

se o

f [3 H

]-deo

xygl

ucos

e / g

ram


-50 0 50 100 150

0.00

0.05

0.10

0.15

AUC Δ-iBAT temperature%

Inje

cted

dos

e of

[3 H

]-deo

xygl

ucos

e / g

ram

P = 0.11 r = 0.31


0.0

0.1

0.2

0.3

% In

jecte

d do

se o

f [3 H

]-deo

xygl

ucos

e / g

ram


#

Liver

0.0

0.1

0.2

0.3

% In

jecte

d do

se o

f [3 H

]-deo

xygl

ucos

e / g

ram


Heart

0.0

0.1

0.2

0.3

% In

jecte

d do

se o

f [3 H

]-deo

xygl

ucos

e / g

ram


aCSFMTII

aCSFMTII

aCSFMTII

aCSFMTII

aCSFMTII

aCSFMTII

aCSFMTII

aCSFMTII

150

Figure 4: Effects of the MPO infusion of MTII on iBAT and iWAT gene expression in

Sham- and DMH-lesioned rats.

Fatp1Glut4 Fas

Gpat3Dgat1

Dgat2 HslAtgl

Pgc1α Dio2Cpt1βUcp1

0

1

2

3

4

5

iBAT g

ene e

xpres

sion /

ARBP

mRN

A

aCSF-Sham-lesionedMTII-Sham-lesionedaCSF-DMH-lesionedMTII-DMH-lesioned

**

* *

*

#

Fatp1Glut4 Fas

Gpat3Dgat1

Dgat2 HslAtgl

Pgc1αDio2Cpt1βUcp1

0

2

4

6

8

10

iWAT

gene

expre

ssion

/ ARB

P mRN

A

aCSF-Sham-lesionedMTII-Sham-lesionedaCSF-DMH-lesionnedMTII-DMH-lesionned

†

*

*

*

*

* *#

#

#

#

#

# #

†

†

†

ND

A

B C

D

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

1

2

3

% Injected dose of [14C]-bromopalmitate . gram-1

Dgat2

mRN

A ex

pres

sion


r = 0.51P < 0.01

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

1

2

3


Hsl m

RNA

expr

essio

n


r = 0.62P < 0.001

0.00 0.05 0.10 0.15 0.200

1

2

3


Fas m

RNA

expr

essio

n


r = 0.46P = 0.02

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.250

1

2

3

% Injected dose of [3H]-deoxyglucose . gram-1

Fas m

RNA e

xpres

sion


r = 0.59P < 0.01

E F

151

Discussion générale, perspectives de recherche et conclusion.

153

Chapitre 1

Le système mélanocortine est un acteur majeur de la régulation de l’homéostasie

énergétique (Butler, 2006; Pandit et al., 2011), il agit aussi bien sur la prise alimentaire que sur la

dépense énergétique et en particulier sur le BAT, qui comme il a été vu dans l’introduction est le

tissu effecteur de la thermogenèse sans frisson (Cannon and Nedergaard, 2004; Clapham, 2012).

En effet, la délétion du gène codant pour MC4R, le principal récepteur aux mélanocortines

impliqué dans la régulation de la balance énergétique a pour conséquence une réduction de

l’activité du BAT et notamment en réponse à une suralimentation (Butler et al., 2001). De plus,

l’injection de MTII, un agoniste du système mélanocortine, en i.c.v. ou dans le PVH entraine une

augmentation de la thermogenèse du iBAT (Song et al., 2008). Par ailleurs, le PVH est la

structure centrale qui compte le plus de neurones innervant indirectement le iBAT et dont 80% de

ceux-ci expriment MC4R (Song et al., 2008). Enfin, il a été montré que le système

endocannabinoïde interagit avec le système mélanocortine dans le contrôle de la prise alimentaire

(Verty et al., 2004) et que son récepteur central, CB1, est très exprimé au niveau du PVH

(Richard et al., 2009), suggérant ainsi que ces deux systèmes pourraient interagir dans le contrôle

de la thermogenèse du iBAT.

Dans un premier temps, nos résultats confirment les observations décrites dans la littérature

à propos de l’action des mélanocortines sur la dépense énergétique. En effet, l’injection centrale

de MTII entraine une augmentation de la dépense énergétique qui se traduit par une élévation de

la consommation d’oxygène sans modification significative du quotient respiratoire (Cowley et

al., 1999). De plus, la mesure directe de la température du iBAT (Fan et al., 2007; Song et al.,

2008; Vaughan et al., 2011) associée à l’injection de C14-bromopalmitate et de H3-désoxyglucose

qui sont des marqueurs respectivement des NEFAs (Ménard et al., 2009; 2010) et du glucose

(Ferré et al., 1985), permet d’établir avec force, l’effet stimulateur du MTII sur l’activité

thermogène du iBAT. Ensuite, l’augmentation de l’expression des gènes Pgc1α, Dio2, Cpt1β et

Ucp1, connus pour être impliqués dans la thermogenèse lors d’un traitement aigu ou sub-

chronique confirme le rôle du système mélanocortine dans la mise en place de la capacité

thermogène du iBAT (Williams et al., 2003; Richard et al., 2010).

154

Cette étude apporte des éléments nouveaux concernant le rôle du système

endocannabinoïde dans la modulation de la dépense énergétique induite par l’activité du système

mélanocortine. En effet, il est déjà connu que le système endocannabinoïde interagit avec le

système mélanocortine dans le contrôle de la prise alimentaire (Verty et al., 2004) et qu’il a des

effets opposés au système mélanocortine sur la thermogenèse. Néanmoins, notre étude va plus

loin en montrant que le système endocannabinoïde agit comme régulateur de l’activité du

système mélanocortine sur le contrôle de la thermogenèse et pas comme un compétiteur. En effet,

l’injection préalable dans le 3eme ventricule de Δ9-THC, un agoniste des récepteurs aux

cannabinoïdes à une dose qui n’a pas d’effet propre observé, bloque l’augmentation induite par

l’administration de MTII dans le 3eme ventricule sur de nombreuses composantes de la

thermogenèse telles que la consommation d’oxygène, la température du iBAT, le captage du C14-

bromopalmitate et l’expression génique de Pgc1α, Dio2, Cpt1β et Ucp1. De plus, l’utilisation de

l’AM251, un antagoniste sélectif de CB1, potentialise une partie des effets du MTII sur la

dépense énergétique, comme l’augmentation de la consommation d’oxygène lors de l’injection de

la faible dose de MTII (30ng) et étonnant de la température du iBAT avec la forte dose de MTII

(300ng), alors que la production de CO2 ne varie pas, laissant suggérer que le iBAT dissipe plus

de chaleur sans pour autant oxyder plus de substrats énergétiques. L’absence de potentialisation

du captage de C14-bromopalmitate et de H3-deoxyglucose vient supporter cette hypothèse. Enfin,

les expériences de mesure de la température et de captage de substrat du iBAT n’ont été réalisées

qu’avec la forte dose de MTII, celle-ci occasionnant un effet plateau, il ne nous est pas possible

de démontrer une potentialisation de l’utilisation des substrats énergétiques par un antagoniste du

système endocannabinoïde.

Notre étude s’est par la suite intéressée aux récepteurs impliqués dans la modulation du

système mélanocortine par le système endocannabinoïde. L’injection d’un antagoniste sélectif du

récepteur MC4R (HS024) a permis de mettre en évidence l’implication unique de MC4R dans les

effets positifs du MTII sur les différentes composantes de la thermogenèse citées précédemment.

En effet, l’administration de HS024 15 minutes avant le MTII bloque l’intégralité des effets de

celui-ci sur l’élévation, (i) de la température du iBAT, (ii) de la production de CO2 systémique et

(iii) du captage de substrats énergétiques par le iBAT, démontrant ainsi le rôle primordial de

MC4R au sein du système mélanocortine dans la régulation de l’homéostasie énergétique.

Parallèlement, on observe que l’administration concomitante de l’AM251 puis de Δ9-THC avant

155

le MTII n’entrave pas la potentialisation de la température du iBAT induite par l’AM251,

suggérant que les effets obtenus lors de l’injection du Δ9-THC sont relayés par le récepteur CB1.

Par ailleurs, la particularité du système endocannabinoïde qui consiste à exprimer ses récepteurs

au niveau pré-synaptique nous à permis d’envisager que la modulation opérée par CB1 ait lieu

en aval de l’activation MC4R, soit sur l’un des neurones relayant le message nerveux soit sur le

même neurone.

La seconde partie de nos résultats s’intéresse au rôle du PVH dans la modulation du

système mélanocortine par le système endocannabinoïde et s’appuie sur deux études menées en

collaboration avec notre laboratoire (Song et al., 2008; Richard et al., 2009). Celles-ci avaient

déjà mis l’emphase sur le PVH en démontrant que 80% neurones exprimant MC4R le constituant

sont connectées au iBAT (Song et al., 2008) et que l’expression de l’ARNm de CB1 y est très

largement retrouvé (Richard et al., 2009). Dans un premier temps, nos travaux

d’immunohistochimie dirigés contre la protéine MC4R, couplés à une hybridation in situ dirigée

contre l’ARNm de CB1 pour tenir compte de la spécificité du système endocannabinoïde, nous

ont permis de montrer que certains neurones du PVH expriment les deux récepteurs et donc

d’envisager que la modulation de l’activité du système mélanocortine par le système

endocannabinoïde pouvait avoir lieu dans ces neurones du PVH. De plus, la colocalisation dans

certains neurones du PVH de la protéine MC4R avec l’ARNm de Vglut2, un marqueur

phénotypique des neurones glutamatergiques, associé à la précocité de l’infection du PVH par un

virus rétrograde injecté dans le iBAT (Voss-Andreae et al., 2007) laissent supposer une

projection stimulatrice directe du PVH vers l’IML. Ensuite, d’un point de vue fonctionnel,

l’injection de MTII dans le PVH entraine une élévation de la température du iBAT comme cela

avait été observé lors d’une étude menée en collaboration avec notre laboratoire, mais aussi à une

augmentation (i) de la production de CO2, (ii) du captage de C14-bromopalmitate et (iii) de

l’expression de l’ARNm de Pgc1α et de Dio2, confirmant ainsi le rôle du PVH dans le contrôle

de la thermogenèse du iBAT. Enfin, l’injection de Δ9-THC dans le 4éme ventricule au plus près

de l’IML conduit à une inhibition totale de l’action du MTII dans le PVH, confirnant ainsi que

l’action des endocannabinoïdes sur l’activité des neurones MC4R du PVH a lieu en aval du PVH.

156

En conclusion, nos résultats affirment le rôle du système mélanocortine dans le contrôle de

la thermogenèse, dans lequel le récepteur MC4R a le rôle principal. Ensuite, ils mettent en

lumière la modulation du système mélanocortine par le système endocannabinoïde, avec le

récepteur CB1 comme acteur de premier plan. Enfin, ils mettent l’emphase sur la place du PVH

dans cette modulation.

157

Chapitre 2

La thermorégulation est contrôlée par un réseau neuronal complexe qui a été décrit dans

l’introduction. Au sein de celui-ci, le MPO occupe une place centrale en recevant les messages

thermiques en provenance de la peau, puis après les avoir intégrés grâce à des neurones

spécialisés dans la perception de la température, il émet des projections vers le DMH afin de

contrôler l’activité thermogène du iBAT (Morrison et al., 2014). D’autre part, une étude conduite

en collaboration avec notre laboratoire a montré que des neurones du MPO expriment des

récepteurs MC4R, et parmi ceux-ci plus de 75% sont connectés indirectement avec le iBAT

(Song et al., 2008). Enfin, il a été montré que l’injection d’un agoniste ou d’un antagoniste du

système mélanocortine dans le MPO, conduit respectivement à une hypophagie ou une

hyperphagie chez le rat (Kim et al., 2000). Il apparaissait donc évident que notre étude s’intéresse

aux rôles des neurones exprimant MC4R au sein du MPO dans le contrôle de la thermogenèse du

iBAT.

Notre étude est la première à notre connaissance à montrer que l’injection de MTII, un

agoniste MC4/3R, dans le MPO augmente la température du iBAT et la production de CO2

systémique. Néanmoins, plusieurs études avaient déjà suggéré que le POA dont fait partie le

MPO est impliqué dans le contrôle de la thermogenèse du iBAT. En effet, l’injection de CRH

(Cerri and Morrison, 2006) et de PGE2 (Madden and Morrison, 2005) dans le POA augmente la

température du iBAT, alors que l’injection d’un antagoniste GABAa inhibe la stimulation du

BAT évoquée par une baisse de la température de la peau (Nakamura and Morrison, 2007). Nos

travaux viennent aussi confirmer que le système mélanocortine joue un rôle déterminant dans la

régulation de la balance énergétique. En effet, il avait déjà été mis en évidence que l’injection

d’α-MSH et d’AgRP ont respectivement des effets hypophagiques et hyperphagiques (Kim et al.,

2000). Enfin, l’action du MTII dans le MPO sur la thermogenèse du iBAT se fait probablement à

travers l’activation de neurones exprimant le MC4R du MPO. Cette hypothèse est soutenue par la

colocalisation importante de MC4R avec le traceur rétrograde provenant du iBAT dans le MPO

(Song et al., 2008) et par l’inhibition des effets du MTII sur la thermogenèse lors de l’injection

i.c.v. de HS024, un antagoniste sélectif du MC4R (résultats observés dans le premier chapitre)

158

Les résultats décrits dans cet article montrent que lors de lésions du DMH obtenues par

l’injection d’acide kaïnique, le MPO perd sa capacité à stimuler la thermogenèse du iBAT suite à

l’injection de MTII, suggérant ainsi que le DMH est le relais majeur de l’action mélanocortinique

sur la thermogenèse dans le MPO. Nos résultats montrent que l’augmentation de la température

du iBAT suite à l’injection de MTII dans le MPO est dépendante du DMH mais que c’est aussi le

cas pour le captage du C14-bromopalmitate, un traceur permettant de mesurer l’entrée de NEFA

dans les cellules. Dans le cas de cette étude le captage du C14-bromopalmitate est corrélé

significativement avec la température du iBAT, ce qui en fait un bon indicateur de l’activité

thermogène du iBAT pour l’ensemble des groupes. De plus, le C14-bromopalmitate est

significativement corrélé avec l’expression génique de Hsl and Dgat2 dans le iBAT, faisant aussi

du C14-bromopalmitate un bon indicateur de l’oxydation des lipides (Ci et al., 2006; Oakes et al.,

2006; Ménard et al., 2010) et de leur estérification (Ménard et al., 2010). Fait intéressant,

l’administration de MTII augmente l’expression d’un certain nombre de gènes impliqués dans le

métabolisme des lipides et la thermogenèse, tels que Hsl (la lipolyse) et Dgat2 (la lipogenèse),

mais aussi Fatp1 (le captage des acides gras), Fas (la lipogenèse de novo) ou encore Pgc1α et

Dio2 (la thermogenèse) de manière dépendante du DMH. Enfin, nous n’observons aucun effet de

l’injection du MTII sur les niveaux d’expression de l’ARNm de Ucp1. Cependant, le délai entre

l’injection et le sacrifice de l’animal est trop court pour observer une augmentation. En effet,

l’étude précédente et Williams et ses collaborateurs montrent qu’il faut une stimulation de 24h

pour entrainer des variations de l’expression d’Ucp1 (Williams et al., 2003) (résultats décrits dans

le premier chapitre).

En parallèle, nous avons aussi observé que de façon dépendante du DMH, l’injection de

MTII dans le MPO avait des conséquences métaboliques sur d’autres tissus que le iBAT. En

effet, l’injection de MTII dans le MPO augmente le captage de C14-bromopalmitate dans le foie

et le tissu adipeux blanc inguinal, alors que chez les animaux ayant des lésions du DMH cet effet

est complètement aboli. Ces données confortent l’idée selon laquelle les récepteurs aux

mélanocortines du MPO et le duo MPO-DMH ont un rôle très large dans le métabolisme

énergétique (Morrison et al., 2012; Richard et al., 2012; Morrison et al., 2014). À la vue des

connaissances sur le iWAT, lequel est capable de développer des adipocytes bruns au sein du

tissu adipeux blanc (Bartelt and Heeren, 2014) et de sa forte connexion avec le POA à travers le

SNS (Song et al., 2009), nous avons choisi d’étudier les mêmes gènes que ceux analysés dans le

159

iBAT. Cependant, fait surprenant, les effets de stimulation du MTII ne sont observés que chez les

rats avec des lésions du DMH. En effet, chez ces rats, le MTII induit des gènes impliqués dans le

transport du glucose (Glut4), dans la lipogenèses (Gpat3, Dgat1 et Dgat2), dans la lipolyse (Hsl

et Atgl) et dans la thermogenèse et le métabolisme (Cpt1β). La différence dans les résultats entre

le iBAT et le iWAT sur l’expression génique n’est pas évidente à expliquer. Cependant, ces

résultats montrent l’importance du DMH dans la modulation de l’homéostasie énergétique.

Néanmoins, le DMH contient de nombreux neurones glutamatergiques excitateurs, qui sont l’un

des acteurs clés du contrôle de la thermogenèse du iBAT par le SNS (Morrison et al., 2008;

Nakamura and Morrison, 2008a; Morrison, 2011). Il semble donc raisonnable d’assumer que ces

neurones glutamatergiques sont affectés par l’injection de l’acide kaïnique (Bellinger and

Williams, 1983; Acosta-Galvan et al., 2011), ce qui pourrait donc inhiber l’élévation de la

température du iBAT induite par l’injection de MTII dans le MPO. D’un autre coté,

l’augmentation de l’expression des gènes comme Hsl, Atgl et Cpt1β observée dans le iWAT après

l’injection de MTII, seulement chez des rats ayant subi des lésions du DMH, suggère un

renforcement de l’activité métabolique du iWAT qui rappelle les effets de la délétion du gène

NPY dans le DMH (Bi and Li, 2013). En effet, il a été rapporté que la délétion du gène codant

pour NPY dans le DMH stimule le métabolisme et le brunissement du iWAT grâce au

développement d’adipocytes brun/beige (Chao et al., 2011). Tandis que la surexpression de NPY

dans les neurones du DMH est associée avec un excès d’accumulation de gras (Zheng et al.,

2013), de consommation de diète riche en gras (Lee et al., 2013b) et de lactation (Chen et al.,

2004b). La possibilité que les neurones exprimant le NPY soient altérés par l’acide kaïnique ne

peut être exclue. Cependant, d’autres études seront nécessaires pour vérifier cette hypothèse et

approfondir nos connaissances sur l’interaction complexe entre le MPO et le DMH qui gouverne

le métabolisme du iWAT.

En conclusion, ces résultats révèlent que le MPO est un site d’activation thermogène et

métabolique du MTII. Ils permettent aussi d’établir que le duo MPO-DMH est une cible

privilégiée pour l’action des mélanocortines sur l’homéostasie énergétique.

161

Perceptives de recherche et conclusion

Nos travaux ont mis en lumière le rôle du système mélanocortine hypothalamique dans le

contrôle de l’activité thermogène du iBAT et permettent d’envisager de nouvelles interactions

pharmacologiques et anatomiques dans la régulation de l’homéostasie énergétique. Cependant,

des études complémentaires pourraient être réalisées afin d’élaborer une stratégie

pharmacologique impliquant les systèmes aux mélanocortines et endocannabinoïde, et d’affiner

nos connaissances sur les connexions neuroanatomiques impliquées dans le contrôle du iBAT.

Dans le chapitre 1 nous avons montré que l’action du système mélanocortine sur l’activité

thermogène du iBAT est modulée par le système endocannabinoïde. Cependant, notre étude met

plus l’emphase sur l’inhibition des effets du système mélanocortine et n’approfondit pas la

potentialisation des effets du système mélanocortine par un antagoniste CB1. Il serait donc

intéressant de poursuivre cette étude en raffinant les doses de MTII et d’AM251 utilisées afin

d’obtenir un cocktail pharmacologique efficace sur la stimulation du iBAT et/ou la diminution de

la prise alimentaire comme l’ont montré Verty et ses collaborateurs en 2004 (Verty et al., 2004).

Néanmoins, l’utilisation d’un antagoniste du système endocannabinoïde comme piste de

recherche pour lutter contre l’obésité a déjà subi un revers important avec le Rimonabant à la fin

des années 2000 (Christensen et al., 2007; Buggy et al., 2011), et cela pourrait expliquer

l’absence de poursuite de recherche dans cette voie. Toutefois, le retour sur expérience découlant

de l’utilisation du Rimonabant à grande échelle nous permettrait d’élaborer des études

investiguant les effets de notre cocktail pharmacologique sur la dépression et ainsi prévenir un

nouvel échec de la thérapie pharmacologique dans la lutte contre l’obésité.

Toujours dans le chapitre 1, nous avons mis en avant le rôle du PVH dans la modulation de

l’action du système mélanocortine sur l’activité thermogène du iBAT par le système

endocannabinoïde. Nous avons aussi émis l’hypothèse que les endocannabinoïdes agissent au

niveau pré-synaptique des neurones du PVH projetant dans la moelle épinière. Cette hypothèse se

base sur nos travaux qui montrent que l’injection de Δ9-THC dans le 4éme ventricule inhibe les

effets induits par l’injection de MTII sur l’activité thermogène du iBAT et sur des travaux

réalisés par Voss-Andreae et ses collaborateurs qui montrent que lors de l’injection d’un traceur

rétrograde dans le iBAT le PVH est l’une des premières structures cérébrales à être marquées

162

(Voss-Andreae et al., 2007). Nous proposons donc une étude permettant de vérifier cette

hypothèse. Il nous semble que l’injection d’un traceur antérograde dans le PVH suivie d’une

colocalisation du traceur antérograde avec la protéine CB1 dans l’IML de la moelle épinière

permettrait d’éclaircir ce point.

Dans le chapitre 2, nous avons mis en évidence le rôle du système mélanocortine au sein du

MPO dans le contrôle de l’activité thermogène du iBAT ainsi que l’importance du relais DMH

dans cette stimulation du iBAT. Cependant, il serait intéressant de déterminer la nature des

neurones impliqués. Morisson et ses collaborateurs ont montré que les neurones qui participent à

la thermorégulation au sein du MPO et qui innervent le DMH sont de nature GABAergique

(Morrison et al., 2014). Néanmoins, dans notre contexte d’étude, il paraît plus probable qu’ils

soient glutamatergiques dans le cas d’une connexion directe entre le MPO et le DMH. Toutefois,

la présence d’interneurones GABAergiques ne peut être exclue. Donc, dans le but d’identifier la

nature des neurones impliqués, nous pourrions réaliser une colocalisation entre MC4R et un

marqueur phénotypique des neurones GABAergiques ou glutamatergiques, puis valider nos

observations histologiques par la mesure de la température du iBAT après injection de MTII dans

le MPO et d’un antagoniste des récepteurs GABA ou glutamate dans le DMH. Enfin, concernant

l’hypothèse émise dans la discussion du chapitre 2 sur l’implication de neurones exprimant NPY

dans les effets observés sur l’expression génique du iWAT, nous pourrions quantifier

l’expression de l’ARNm de NPY dans le DMH chez des animaux avec des lésions du DMH

avant d’aller plus loin. Nous pourrions aussi injecter un antagoniste des recepteur Y1/Y5 dans le

DMH afin de regarder le brunissement du iWAT.

Par ailleurs, il reste encore d’autres centres pouvant participer au contrôle mélanocortinique

du iBAT, tel que le MnPO ou le PAG ventrolatéral que l’on pourrait investiguer avec la méthode

de mesure de la température du iBAT développée au sein du laboratoire (Song et al., 2008).

En conclusion, la compréhension des réseaux neuronaux impliqués dans le contrôle du

BAT et de la prise alimentaire va nous permettre d’élaborer des thérapies pharmacologiques

ciblant plus efficacement les acteurs impliqués dans la régulation de l’homéostasie énergétique

tout en minimisant les effets secondaires. Cependant, la complexité des réseaux neuronaux

impliqués, la multipotence des systèmes neuropeptidiques et les échecs successifs des traitements

pharmacologiques de l’obésité (Adan, 2013) nous obligent à avoir un discours prudent sur la

163

possibilité à court ou moyen terme d’une issue pharmacologique à l’obésité vis à vis de la

société, et par conséquent encourager en tant que scientifique et citoyen la prévention et

l’éducation des saines habitudes de vie.

165

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Le rôle du système mélanocortine dans le contrôle de l'activité thermogène du tissu adipeux...

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