Le clonage

Les enzymes de restriction

X-gal: sélection bleu-blanc

La production d’une molécule recombinante

La production des molécules recombinantes-suite

• -ligation avec l’ADN coupé avec un seul enzymepeut donner très peu de recombinantes

• -le rapport plasmide/insert est capital

• -traitement avec une phosphataseplus de recombinantes

• -couper les molécules d’ADN avec 2 enzymesplus de recombinantes

• -la température de la ligation: 20°C est mieux que 37°C• -extrémités franches-ligation plus difficile: réduit la

température et augmente le temp de ligation

Digestion avec 2 enzymes

• 5’-----AAGCTT------------GAATTC---------3’• 3’-----TTCGAA------------CTTAAG---------5’• Plasmide avec une site HindIII et une site EcoR1• Digestion avec les deux enzymes……• 5’-----A AATTC--------3’• 3’-----TTCGA G--------5’

• Une ligase ne peut pas mettre ces deux extrémités ensemble manque de compatibilité des nucléotides

La transformation des bactéries-phase exponentiel

-en présence de Ca++ à 4°C-choque thermique

Gel d’agarose

TP de clonage

• Premier jour• -digestion de l’ADN de la bactériophage lambda et l’ADN de pBS avec des enzymes

Hind III et Eco R1• -inactivation des enzymes de restriction à 70°C• -ligation des produits de la digestion• -électrophorèse des produits de la digestion sur gel d’agarose• -transformation des bactéries compétentes• -étalage des bactéries sur les boîtes de petri amp/x-gal• Deuxième jour• -préparation des plasmides recombinantes• -digestion de l’ADN des plasmides• -électrophorèse des produits de la digestion• -identification des fragments de l’ADN de la phage lambda clonés dans le plasmide