La spectrophotométrie uv visible(spectroscopie d’absorption moleculaire)

lorsqu’un faisceau lumineux monochromatique (une longueur

d’onde fixe) de longueur l et intensité I0 traverse une solution

(exp bleu de méthylène + eau) les molécules dissoutes vont

absorber une quantité de la lumière incidente

L’intensité de la lumière transmise I sera inferieur à celle de la

lumière incidente I0

Définition

• La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution,

• Plus cette substance est concentrée plus elle absorbe la lumière (relation entre la concentration et l’absorbance).

• C’est la loi de Beer Lambert Al = el. L .C .donc on peut déterminer la concentration a partir de l’absorbance.

• La spectrophotométrie UV visble utilise des longeures d’onde incluse dans le domaine UV et le domaine du visible.

• Les mesures sont réalisées dans:

l’UV(160nm<l<400nm)

le visible(400<l<800nm)

Les radiations détectées par l’œil humain

sont appelées lumière visible

Spectre d’absorption d’une substance en solution

Obtenue en mesurant l’absorbance (DO) d’une solution de concentration fixe d’une substance X, en modifiant la longueur d’onde dans l’intervalle de L’UV-visible, on trace ensuite la courbe de l’bsorbance (DO) en fonction de la longueur d’onde.

La valeur maximale d’absorbance corresponds a une longueur d’onde appelée l max.

Cette valeur est caractéristique de la substance X

200 400 600 800280

Spectre d’absorption d’un

substance x en solution

Ab

sorb

an

ce

l max

La valeur maximale d’absorbance corresponds a une

longueur d’onde appelée l max.

Cette valeur est caractéristique de la substance X

Longueur d’onde

l(nm)

Spectre d’absorption du KMnO4 dan l’UV-visible

Loi de Beer Lambert

lorsqu’un faisceau lumineux monochromatique (une longueur d’onde fixe) de longueur l et intensité I0 traverse une solution (exp bleu de méthylène + eau) les molécules dissoutes vont absorber une quantité de la lumière incidente

L’intensité de la lumière transmise I sera inferieur à celle de la lumière incidente I0

Détecteur Enregistreur

(Afficheur)

I

Cuve

(solution a

analyser)

L= 1cm

I0

Lumière

incidente Lumière

transmise Source

lumineuse

(lampe) monochromateur

Si :I0= I, milieu transparent

Si :I0> I, milieu partiellement absorbant

Si :I= 0, milieu opaque (absorption totale)

La transmittance (T) de la solution est le pourcentage de lumière transmise T%=I/I0.100

• Selon la loi de Beer Lambert, L’absorbance (A) de la solution ou densité optique (DO) représente la valeur du logarithme décimale de l’inverse de T: Al =log(1/T) =log(I0/I) = el. L .C

• Al = el. L .C

• Al= l’absorbance a une longueur l

• el= coefficient d’absorption molaire (M-1cm-1) de la substance a la

longueur d’onde l définie

• L= trajet optique (cm)

• C= concentration de la solution (M)

• NB: l’absorbance n’a pas d’unité

Relation absorbance concentration

• Loi de Beer-Lambert • Al = el. L .C = l’absorbance est en fonction de la concentration

(droite linéaire)

[C]

Al

Remarque

Une substance peut avoir plusieurs pics d’absorption

maximales et peut donc avoir plusieurs valeurs e a

différentes longueurs d’onde

Condition de validité de la loi de Beer Lambert

• Cette loi n’est pas valable que si les conditions suivantes sont remplies :

1. le monochromatisme (une seule longueur d’onde lmax )

2.Les faibles concentrations (diluées)

3.Température stable(e dépends de la Température)

4.pH stable

5.Clarté du milieu

6.Pas de réflexion ou de fluorescence.

Le spectrophotomètre

• Un spectrophotomètre UV-visible est un appareil qui permet de mesurer l'absorbance d'une solution homogène à une longueur d'onde donnée ou sur une région spectrale donnée.

• Le spectrophotomètre comprend :

Composants de base d’un spectrophotometre

Une source lumineuse

ce sont des lampes utilisant un

filament tungstène, elle

fournissent des radiations

lumineuses dans le domaine du

visible.

Lampes à hydrogène ou deutérium ,

elle fournissent des radiations

lumineuses dans le domaine du UV

Décharge dans les gaz rares

Solide chauffé

Le monochromateurIl permet de sélectionner la longueur d'onde de la

lumière qui traversera la solution à doser.

La cuve

• une cuve transparente dans laquelle on place la solution à étudier. Suivant la qualité et la quantité d'échantillon, il existe différentes cuves, généralement en plastique ou en verre (spectre visible) ou en quartz (UV).

La cellule photoélectrique

• une cellule photoélectrique, permet la transformation de l’énergie lumineuse en énergie électrique, le courant produit est très faible et sera amplifié ultérieurement

• L’amplificateur• un système électronique amplifie le courant

fourni par la cellule photoélectrique.

L’enregistreur

• Permet de mesurer le courant fourni par l’amplificateur , il est généralement relié a un microordinateur qui permet d’afficher les résultats en pic (balayage de spectre) ou des valeurs fixes des absorbances.

Principes des dosages

dosage directe dosage indirecte

Utilisation d’unréactif coloré

Utilisation d’unegamme

d’étalonnage

Méthode de dosage directe

• Si la substance a doser possède un pic d’absorption caractéristique, on mesure l’absorbance à lmax et on calcule directement la concentration par la loi de Beer Lambert(e

doit être connue) ou bien on Etablis une gamme d’etalonnage

• Exp: dosage des protéine a une longueur de 280nm

Méthode de dosage indirecte

• Cette méthode est utilisée dans le cas ou la substance à doser ne possède pas un pic d’absorbance caractéristique (lmax):

– Utilisation d’un réactif coloré

Exemple d’utilisation d’un réactif

coloré

• L’utilisation d’un colorant chimique qui en réagissant avec la substance a doser développe une coloration

• Exp. L’urée sanguin ne possède pas un pic caractéristique, elle forme un produit coloré avec le réactif diacétyl monoamine qui absorbe a 440nm.

L’urée+ diacétyl monoamine produit coloré absorbe a 440nm

Etablissement d’une gamme d’etalonnage

C1 C2 C3 C4 C5 C6

Ab

sorb

an

ce

Concentrations connues

C1 C2 C3 C4 C5 C6

Solution a doser (concentration inconnue) Ci

Voir l’absorbance de cette solution. Exp. A=0.324

0.324

Ci

NB: Le blanc ou témoin

• La lecture au niveau du spectrophotomètre est effectué contre une solution qu’on appelle blanc,(sur la quelle on règle le zéro) qui contient tout les constituants du milieu sauf la substance a doser(échantillon),

• l’absorbance enregistrée sera donc celle de la substance a doser uniquement.

Applications Permet de déterminer la concentration d’une

substance en solution dans un milieu simple ou complexe.

Suivie de la cinétique d’une réaction chimique

Dosage des protéines exp hémoglobine dans le sang à 540nm.

Suivie en continue de l’élution des protéine au cours d’une chromatographie

Vérifier la pureté d’une molécule en solution

Identifier une molécule en solution

Remarque: l’opacimètrie est une méthode qui utilise le spectrophotomètre a 625 nm pour quantifier le nombre de particules dans une suspension (exp: suspension bactérienne ou de globules rouges ).

II) photomètrie d’émission atomiquea) Photomètrie de flamme

• utilisée depuis longtemps pour l'analyse des éléments alcalins et alcalino-terreux.

Principe

• Lorsqu’une solution saline est chauffée dans une flamme à un débit constant, l’eau s’évapore et les sels minéraux restent à l’état d’atomes.

• Les atomes sont alors portés a une haute température et captent donc une partie de l’énergie apporté par la flamme

• Ce ci les fait passer à un état éxcité

• Un atome excité revient obligatoirement à son état basale en libèrant de l’énergie sous forme d’une émission de lumière

• Chaque ion ou atome est caractérisé par une longueur d’onde spécifique . Exp:

Na : jaune

Li : violet

• L’intensité de la lumière est proportionnelle a la concentration de l’ion à doser.

• A chaque élément à analyser correspond un filtre qui sélectionnera la bande de longueurs d'onde utile

• Il suffit alors d'établir une courbe d'étalonnage : I=f(c). Pour déterminer la concentration d’une solution inconnue.

• Pour le dosage simultané de plusieurs élément on doit disposé de plusieurs filtres et plusieurs détecteurs en même temps.

Photomètre de flamme (instrumentation)

• Un photomètre de flamme est composé :

• un nébuliseur qui permet de créer un « brouillard » avec la solution à analyser

• un brûleur : les gaz employés peuvent être de l’acétylène, du butane ou du propane en fonction de la température de la flamme souhaitée

• un filtre ou monochromateur

• un détecteur : cellule photoélectrique.

Température de la flamme :• elle dépend du melange

combustible/comburant 0°C 273,15 Kelvin

Photometre de flamme

Sensibilité d’un photometre de flamme

Préparation des échantillons• Les échantillons doivent être sous forme d’une

solution aqueuse sans débris ou particules solides

• L’eau distillé qui est le solvant de notre échantillon doit être d’une très bonne qualité afin d’avoir des résultats précis

• Les espèces chimiques qui peuvent causer des interférences doivent être éliminées ou bien présentes dans l’étalon et l’échantillon a une même concentration

– Exp : élimination des ions calcium par précipitation a l’acide oxalique

• Les sels peuvent être extraits des échantillons solides par de l’eau distillée ou par des réactifs appropriés exp: CaSO4 saturé pour l’extraction du sodium du sol

• L’usage d’un broyeur ou d’un agitateur donne de meilleurs résultats

• Si l’échantillon est de nature organique, la matière organique doit etre éliminée par incinération (four a moufle).

• Les oxydes restants sous forme de cendre sont solubilisée ensuite par des acides forts

Applications • Dosages d'elements alcalins ou alcalino-terreux Na,

K, Ca, Li, Fe, Ba ...(qui sont en fait sous forme ionisee Na+, K+, Ca2+, Li2+ , Fr2+ avec Ba2+... dans la plupart des echantillons :

• • liquides biologiques comme le plasma sanguin ;

• • produits pharmaceutiques ;

• • produits alimentaires, boissons ;

• • rejets industriels, eaux usees ;

• • produits mineraux utilises en metallurgie.

II) Photomètrie d’émission atomiqueb) Spectrométrie par torche à plasma

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES)

• Fonctionne sur le même principe de la photométrie de

flamme sauf qu’elle utilise une torche a plasma (6000-

10000 k) pour l’atomisation et l’excitation des atomes

de l’échantillon.

• La méthode de ICP-AES permet la détection et le dosage

de presque tout les éléments chimique (sauf les gaz et

certains atomes non métalliques C, N, F, O, H)

Torche a plasma ICP

Spectrometre ICP AES

III) Spectrophotométrie d'absorption atomique

• C’est une méthode d’analyse quantitative qui permet la détermination de la concentration d’une soixantaine d’éléments en solution (Ca, Fe, Mg, Li, Cu, Zn, Na, Pb, Hg, Cd, Sn, Bi, As, Cs, Ge, P, K, Rb, Se, Te, Th…….)

• Sensible et permet la détection de traces (ppm)

• Basée sur le fait qu’un un élément a l’état d’atome est capable d’absorber la radiation (lambda défini) que lui même est capable d’emmètre.

Principe • La solution a analyser est vaporise a un débit constant dans

une flamme et les éléments se trouvent donc a l’état d’atomes

• la température de la flamme(2000 – 3000°C) est plus faible que celle de l’émission atomique pour éviter l’excitation des atomes

• Une source lumineuse fournis une radiation lumineuse (spécifique pour l’élément à analyser) qui traverse le nuage d’atomes.

• L’atome absorbe alors une quantité de lumière incidente

• La quantité absorbée est proportionnelle au nombre d’atomes présent (concentration de l’élément)

• La concentration et determinee a l’aide d’une courbe d’etalonage prealablement etablie

• nb: la loi de Beer Lambert peu etre appliquee

principe du spectrophotomètre d'absorption

atomique

sources de lumière

a) lampe à cathode creuse

constituée : • D’une cathode : cylindre creusé à l’une de ses

extrémités et fait du métal dont on veut produire le spectre d’émission .

• d’une anode ; • d’une enceinte scellée en verre avec une fenêtre

la plus transparente possible aux longueurs d’onde considérées (quartz, verre borosilicate) ; cette enceinte est remplie d’argon (Ar) ou de néon (Ne)

Principe d’une la lampe a cathode creuse

• Lorsqu’une tension électrique est appliquée entre l’anode et la cathode (300 à 400 V), quelques atomes du gaz neutre de remplissage sont ionisés et accélérés vers la cathode.

• Ils arrachent ainsi des atomes métalliques de cette dernière

• Les chocs avec les ions Ar+ ou Ne+ vont ensuite porter les atomes métalliques à un état excité

• (phase d’excitation) dont le retour à l’état fondamental est accompagné de l’émission d’une

• lumière caractéristique (phase d’émission)

sources de lumière

• b) Lampe à décharge EDL (electrodeless discharge lamps).

• La lampe est constituée d’une ampoule scellée en quartz dans laquelle se trouve une petite quantité d’élément sous forme de métal ou de sel.

• Cette ampoule est placée à l’intérieur d’une bobine radiofréquence.

• Lorsqu’on applique un courant à la bobine, un champ radiofréquence est créé.

• Celui-ci vaporise les atomes à l’intérieur de l’ampoule et les porte à un état excité.

• L’émission des raies caractéristiques accompagne le retour à l’état fondamental.

• Remarque

• Un four graphite peut remplacer le bruleur pour l’atomisation

Applications de la photométrie

d’absorption/émission atomique

• Dosages des sels st des métaux dans les liquides biologiques (sang, plasma, urine, homogénat de tissus…..)

• Qualité de l’eau; analyse du contenu en sels est métaux

• Toxicologie dosage des métaux lourd dans les aliment, l’eau et même dans les tissus

• Archéologie; le dosage du Ca, Sr, Zn dans les os

• Géologie l’analyse des éléments pour identification des pierres