La phase préclinique finale

La phase préclinique

Anouar Hadji (AH)

Euloge Ganpo (EG)

Abréviations5’-DFCR : 5’-désoxy-5-fluorocytidine

5’-DFUR : 5’-désoxy-fluorouridine

5'-DVCR : 5'-désoxy-5-vinylcytidine

5'-DVUR : 5'-désoxy-5-vinyluridine

5-FU : 5-fluorouracil

5-FUMP: Fluorouricine monophosphate

5-FUDP: Fluorouricine diphosphate

5-FUTP: Fluorouricine triphosphate

5-dFUMP: Désoxyfluorouricine monophosphate

5-dFUDP: Désoxyfluorouricine diphosphate

5-dFUTP: Désoxyfluorouricine triphosphate

5-dUMP: Désoxyuridine monophosphate

5-dTMP: Désoxythymidine monophosphate

5-dTDP: Désoxythymidine diphosphate

5-dTTP: Désoxythymidine triphosphate

5-VU : 5-vinyluracil

ADME : Absorption, Distribution, Métabolisme, Élimination

ADN : L’acide désoxyribonucléique

ARN : L'acide ribonucléique

AUC : Aire sous la courbe

BPL : Bonnes Pratiques de Laboratoire

CCPA : Conseil canadien de protection des animaux

Cl : Clairance

Cmax : Concentration Maximale

DPD : dihydropyrimidine déshydrogénase

DPDi : Inhibiteur de dihydropyrimidine déshydrogénase

dThdPase: Thymidine phosphorylase

ECG : L'électrocardiogramme

FBAL: α-fluoro-β-alanine

FUPA: Acide 5-fluorouréidopropionique

HED: Human Equivalent Dose

ICH : International Conference on Harmonisation

IP : Intrapéritonéale

IV : Intraveineuse

MRSD: Maximum Recommended Starting Dose

MTD: Maximum Tolerated Dose

NOAEL: No Observed Adverse Effect Level

SNC : Système Nerveux Central

T1/2 : Temps de demi-vie

Tmax : Temps maximum

TS : Thymidine synthase

Table de matières

2

I- Sommaire : (AH)---------------------------------------------------------------------------------------5

II- La stratégie (AH)-------------------------------------------------------------------------------------6

III- Les espèces et les conditions animales (AH)-------------------------------------------------7

IV- Études pharmacodynamiques (AH)------------------------------------------------------------8

IV.1 Mécanisme d’action (AH)---------------------------------------------------------------------8IV.2 Objectifs de la phase préclinique (AH)--------------------------------------------------10IV.3 Tests in vitro (AH)-----------------------------------------------------------------------------10IV.4 Tests in vivo (AH)-----------------------------------------------------------------------------11

V- Études de pharmacocinétique (ADME) (AH)-------------------------------------------------12

V.1 Absorption (AH)--------------------------------------------------------------------------------12V.2 Distribution (AH)--------------------------------------------------------------------------------13V.3 Métabolisme (AH)------------------------------------------------------------------------------14V.4 Élimination (AH)--------------------------------------------------------------------------------15

VI- Études de toxicité à doses croissantes (AH)-----------------------------------------------15

VII- Études de toxicité à dose unique (AH)------------------------------------------------------16

VIII- Études de toxicité à doses répétées (toxicité chronique): (AH)-----------------------17

IX- Conversion chez l’Homme (HED) : (AH)-----------------------------------------------------19

X- Génotoxicité : (AH)----------------------------------------------------------------------------------20

XI- Cancérogénicité : (AH)----------------------------------------------------------------------------21

XII- Études d’innocuité pharmacologique : (EG)------------------------------------------------21

XIII- Études de tolérance locale (EG)--------------------------------------------------------------24

XIV- Études de reproduction (EG)-----------------------------------------------------------------25

3

La phase préclinique

I- Sommaire : (AH)

Les études précliniques vont permettre d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de la colocitabine et la

provynuril en premier lieu, une fois le profil d’innocuité est évalué on procède aux études

précliniques de l’association de ces 2 derniers, avant leurs administrations chez l’humain.

Le but de l’association est en faite d’augmenter l’efficacité anticancéreuse de la colocitabine en

inhibant la DPD par l’intermédiaire du 5–vinyluracil (5-VU) préférentiellement au niveau des

tissus tumoraux. Les études de pharmacodynamie in vitro ont déterminé que la colocitabine est un

précurseur de la 5-fluorouracil (mécanisme d’activation enzymatique en 3 étapes), alors que la

provynuril est un précurseur de la 5-vinyluracil (mécanisme d’activation enzymatique en 3 étapes).

La 5-FU bloque la voie anabolique de la méthylation de l’acide désoxyuridylique en acide

thymidylique, ce qui perturbe la synthèse de l’acide désoxyribonucléique (ADN).

L’incorporation du 5-FU entraîne également une inhibition de la synthèse de l’ARN et des

protéines. La 5-VU quant à elle, elle inhibe le métabolisme du 5-FU par le DPD qui est

surexprimé au niveau de cellules tumorales permettant ainsi une meilleure efficacité de la 5-

FU. En effet, la pro en inhibant la DPD permet d’éviter la variation circadienne qui est

responsable de la résistance au traitement de la colocitabine (5-FU) seule. (17)

II- La stratégie (AH)

Le développement préclinique joue un rôle clé dans l’évaluation de l’efficacité et l’innocuité

d’un médicament pour l’Homme. Comme premier but du développement préclinique est la

prise de décision de commencer le développement clinique.

Le programme préclinique passe au préalable par l’élaboration d’une stratégie et d’un plan

opérationnel prenant en compte la cible thérapeutique visée, le contexte réglementaire, des

éléments scientifiques et les interactions avec les différents services de R&D.

Définir un programme préclinique, destiné à soutenir le développement clinique et finalement

l’enregistrement du médicament, nécessite donc de s’appuyer sur une argumentation solide sur

laquelle va reposer la stratégie et le plan opérationnel mis en œuvre. (2)

4

Après le développement des molécules prototypiques et leurs optimisations, on procède aux

études chez l’animal afin d’évaluer l’efficacité ainsi que l’innocuité de chacun de nos

molécules, de l’association ainsi que les backups, éventuellement avant leurs administration

chez l’Homme.

Notre stratégie pour la phase préclinique est comme suit :

Tester les différents molécules précurseurs de 5-FU ainsi que de l’inhibiteur de la DPD

séparément, et soumettre les données aux responsables la phase clinique I, afin de les

évaluer et de les tester et de nous retourner leurs suggestions pour le développement de

l’association : Prodrogue 5-FU + Inhibiteur de DPD

Afin de gagner le temps (temps c’est l’argent) et en collaboration avec l’équipe de la

phase clinique I et en se référant aux résultats obtenus préalablement, on procède aux

différents tests sur le lead (chef de file) retenu comme prodrogue de la 5-FU en

association avec l’inhibiteur de la DPD.

Cette étape de développement est composé de plusieurs études qui se chevauchent : Tout

d’abord les études d’escalade de doses chez un rongeur et un non-rongeur afin de déterminer

les doses à utiliser pour les études éventuelles, une fois terminées, les études de toxicités à

court terme ainsi que les études pharmacocinétiques seront entamées. Une fois le profil

d’innocuité et de pharmacologie sont excellents, on procède aux études de toxicité à long terme

ainsi qu’aux études d’innocuité pharmacologique.

Les études de toxicologie chronique, les tests in vitro d’Ames et d’aberration chromosomique

ainsi que les deux premiers segments des études de reproductions devront être totalement

compléter avant d’entamer la phase clinique I.

Les études de génotoxicité in vivo sur les micronoyaux, les études de toxicité subaigüe (doses

répétées pendant 14 jours), le dernier segment des études de reproduction doivent être achevées

avant d’entamer la phase II. Enfin les études de cancérogénicité avant la phase III. (14)

III- Les espèces et les conditions animales (AH)

Un des facteurs importants à considérer quand on fait le design du programme de toxicologie

est la sélection appropriée des espèces animales. En effet cette sélection appropriée permet

d’optimiser la qualité des données générées et donc améliorer la prédiction des effets chez

l’humain. (18)

5

Comme nos molécules sont des prodrogues, pour le choix des espèces animales on a tenu

compte des caractéristiques des molécules de notre association, leurs conversion chez ces

espèces, de la similarité du profile pharmacocinétique incluant la biotransformation et

l’exposition aux principaux métabolites que chez l’humain, sans oublié la littérature actuelle et

les études scientifiques antérieures.

Toutes les expérimentations animales ont été effectuées en conformité avec le guide pour le

soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation du Canada et le CCPA : Conseil canadien de

protection des animaux.

Tous les animaux étaient logés dans des cages et maintenu dans des conditions contrôlées de

température (22 ± 2ºC), humidité relative (55 ± 15%) et un cycle de lumière (12 heures / jour).

Des singes Rhésus (d’environ 3 à 5 kg de poids corporel) ont reçus 100 g / jour /unité du poids

corporel d’un régime spécifique et de l'eau du robinet à volonté. Après les tests hématologiques

et biochimiques sanguines, les singes qui affichent des conditions normales ont été

aléatoirement affectés à un traitement, de même pour les chiens beagle. Des rats Sprague-

Dawley S-D (âgés de 4 semaines) et des souris CD1 (âgés de 4 semaines) ont reçus le régime

CDF1 et de l'eau stérile à volonté. Après une période de réadaptation selon l’espèce (Pour les

souris et les rats : 7 jours, pour les chiens : 4 semaines et pour les singes : 8 semaines), les animaux

ont été aléatoirement affectés à un traitement. (14)

Une randomisation selon le poids et le sexe des animaux a été également effectuée préalablement à

chaque étude, et ce, afin d’obtenir des groupes relativement comparables. Les animaux ont été

achetés des laboratoires Charles Rivers de Montréal, ce qui assure une qualité des modèles

animaux. (12)

IV- Études pharmacodynamiques (AH)

IV.1 Mécanisme d’action (AH)

L’association colocitabine-provynuril est une fluoropyrimidine inhibitrice de la

dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD), administrable par voie orale. La colocitabine et la

provynuril suivent plusieurs étapes enzymatiques. Les trois enzymes impliquées dans la

conversion en 5-FU et en 5-vinylfluorouracil, la carboxylésterase et l’esterase, la cytidine

désaminase et la thymidine phosphorylase qui sont surexprimées dans les tissus tumoraux. (3,

4, 5)

6

La colocitabine traverse la barrière intestinale sans y subir de dégradation puis elle est

métabolisée au niveau hépatique en 5’désoxy-5-fluorocytidine (5’-DFCR) par la

carboxylestérase, puis en 5’désoxy-5-fluorouridine (5’-DFUR, doxifluridine) par la cytidine

désaminase dans le foie et les tissus tumoraux (7, 20). L’étape finale qui aboutit à la formation

de 5-FU se fait préférentiellement au niveau tumoral car elle est médiée par la thymidine

phosphorylase qui est surexprimée dans les cellules tumorales. (8, 9)

La 5-FU bloque dans la voie anabolique de la méthylation de l’acide désoxyuridylique en acide

thymidylique, ce qui perturbe la synthèse de l’acide désoxyribonucléique (ADN).

L’incorporation du 5-FU entraîne également une inhibition de la synthèse de l’ARN et des

protéines. Comme l’ADN et l’ARN sont indispensables à la division et à la croissance

cellulaires, il est possible que le 5-FU agisse en générant une carence en thymidine qui

provoque des déséquilibres de croissance et la mort cellulaire. Les effets de la carence en ADN

et en ARN sont plus intenses au niveau des cellules qui prolifèrent plus rapidement et qui

métabolisent plus vite le 5-FU.

De même pour l’inhibiteur de la DPD : la provynuril traverse la barrière intestinale sans y

subir de dégradation puis il est métabolisé au niveau hépatique en 5’désoxy-5-vinylcytidine

(5’-DVCR) par une estérase, puis en 5’désoxy-5-vinyluridine (5’-DVUR) par la cytidine

désaminase dans le foie et les tissus tumoraux (10). L’étape finale qui aboutit à la formation de

5-VU se fait préférentiellement au niveau tumoral car elle est médiée par la thymidine

phosphorylase qui est surexprimée dans les cellules tumorales.

Comme synthèse, on peut supposer que le nouveau mécanisme de l’association colocitabine-

provynuril va augmenter l’activité anticancéreuse de la colocitabine via 5-FU suite à

l’inhibition irréversible de la DPD (11), préférentiellement dans les tissus tumoraux et donc

une augmentation de l’efficacité couplée à une meilleure innocuité.

7

Mécanisme d’action de l’association la colocitabine et la provynuril PRORACILEX® (16)

IV.2 Objectifs de la phase préclinique (AH)

Les études de la phase préclinique ont pour but de prouver le concept du mécanisme

d’action (efficacité et innocuité) de chacun de nos prodrogues ainsi que de l’association

colocitabine-provynuril dans un environnement in vitro et in vivo, afin de supporter les

8

études cliniques proposées depuis la phase I jusqu’à la demande d’homologation (NDA).

(17)

IV.3 Tests in vitro (AH)

Ces études ont pour but de mettre en évidence l’efficacité, la puissance et la sélectivité de la

colocitabine ainsi que la provynuril sur des cellules tumorales humaines et animales (rat), et

enfin de démontrer que la provynuril augmente l’efficacité et la puissance de la colocitabine

sélectivement sur une grande variété de cellules cancéreuses.

Les cellules tumorales humaines :

Plusieurs lignées de cellules cancéreuses ont été utilisées : LXFL529, MX-1, HT-3, Capan-1,

NCI-H441, NCI-H460, A549, PC-3, HCT116, SW480, COLO201, LXFL529, MX-1,

HCT116-DPD et HCT116-pRC qui expriment une grande activité de DPD.(11)

Pour la colocitabine, cette dernière à été conçu pour générée la 5-FU préférentiellement

dans les cellules cancéreuses. Une fois dans les cellules cancéreuses la 5-FU générée à

partir de la colocitabine bloque la voie de la méthylation de l'acide désoxyuridylique en

acide thymidylique ce qui perturbe la synthèse de l’ADN. L'incorporation de 5-FU

entraîne également une inhibition de l'ARN et la synthèse des protéines. Étant donné

que l'ADN et l'ARN sont essentiels à la division et la croissance cellulaire, l’effet de 5-

FU peut créer un déficit en thymidine qui provoque des déséquilibres de la croissance

et la mort cellulaire.

Il faut noter que l’activité de la colocitabine est freinée par la DPD, surtout pour les

cellules présentant de fortes concentration en ce dernier ce qui nécessite de forte dose

de colocitabine afin de permette une efficacité mais au dépend de l’innocuité.

Pour l’inhibiteur de la DPD, la provynuril : son administration seule n’a pas d’effet sur

la multiplication cellulaire des cellules cancéreuses mais à démontrer qu’il a un fort

effet inhibiteur sur la DPD qui est l’enzyme responsable de la dégradation de la 5-FU et

qui est surexprimée dans les cellules cancéreuses. (voir Figure 1) (11)

L’association colocitabine-provynuril a été conçue et développée comme des pro-

drogues générant, d’une part l'agent cytotoxique 5-FU au niveau intracellulaire et

d’autre part un inhibiteur de la dégradation de ce dernier : le 5-VU permettant ainsi

d’augmenter l’efficacité du 5-FU préférentiellement au niveau des cellules tumoraux.

Les données à partir de culture de lignées de cellules cancéreuses humaines indiquent

que la colocitabine est cytotoxique uniquement après sa conversion en 5-FU (3).

9

Les études d’antiprolifération, ont démontré qu’il ya une augmentation de la sensibilité

des cellules cancéreuses à la colocitabine suite à l’addition de la provynuril; la valeur

de la IC50 de la 5-FU pour les cellules HCT116-DPD en présence de la 5-VU été 1/7

que dans l’absence de ce dernier. (Voir tableau I) (11)

IV.4 Tests in vivo (AH)

Il est très difficile de prévoir l’effet des différents facteurs (génétique, environnement,

physiopathologie) sur l’activité enzymatique, d’où la nécessité des études in vivo. Ces études

permettront de confirmé l’activité de la colocitabine et de l’inhibiteur de la DPD suite aux

résultats in vitro.

Après avoir inoculé des souris de 4 à 5 semaines par des petits morceaux de tissus

tumoraux surexprimants la DPD (HCT116-DPD) par voie sous-cutanée et que les

tumeurs ont atteints 100 mm³, plusieurs tests ont étés effectués.

Ces tests ont permis de confirmer :

Aux différentes doses, l’action inhibitrice de la colocitabine sur la synthèse de l’ADN

et l’ARN ce qui provoque des déséquilibre de la croissance et enfin la mort cellulaire

qui a été visualisé par la réduction de la taille des ganglions tumoraux,

L’action inhibitrice de la DPD préférentiellement dans les cellules cancéreuses (vu la

surexpression de ces enzymes dans les tissus cancéreux),

Les tests de la combinaison colocitabine-provynuril ont étés conduites dans le but de

prédire son efficacité et sa supériorité pour traiter le cancer colorectale métastasique et

le cancer du côlon de stade III (stade B et C de Dukes) comparativement à la

colocitabine seule.

Ainsi la colocitabine seule n’été pas efficace à des doses de 200 mg/kg/jour; cependant,

par contre en présence de la provynuril à doses de 10,1 mg/kg/jour, la colocitabine

devient efficace envers les cellules tumorales même à des doses de 200 mg/kg/jour. Ces

études d’antiprolifération, ont démontré qu’il ya une augmentation de la sensibilité des

cellules cancéreuses à la colocitabine suite à l’addition de la provynuril; la valeur de la

IC50 de la 5-FU pour les cellules HCT116-DPD en présence de la 5-VU été1/4,5 que

dans l’absence de ce dernier. (Voir tableau II) (11)

À des fortes doses de 750 mg/kg/jour la colocitabine à fortement inhibée la croissance

tumorale, par contre le degré d’inhibition été plus élevé lorsque la colocitabine été co-

10

administrée avec la provynuril à des doses de 3.37 et 10.1 mg/kg/jour. (Voir figure 3)

(11)

V- Études de pharmacocinétique (ADME) (AH)

Il est très important de savoir le devenir d’un principe actif dans l’organisme (chez l’animal

vivant) puisqu’il est très difficile de prédire avec certitude le degré d’absorption et l’effet du

premier passage en se fiant uniquement sur les propriétés physicochimiques, les

caractéristiques de dissolution in vitro du médicament ou de sa formulation et des études

métaboliques in vitro à cause de la complexité des phénomènes in vivo. (15)

Pour les études de toxicocinétiques elles aident à définir la relation entre la dose et le profil de

toxicité chez l’animal. (ICH S3A, S3B)

En effet, chez plusieurs espèces animales (chien, rat, souris, et singe) on a procédé à investiguer la

pharmacocinétique.

V.1 Absorption (AH)

Après administration orale, la colocitabine est rapidement et largement absorbée sans y subir

de dégradation, puis transformée de façon importante en ses métabolites : 5'-DFCR et 5'-DFUR

(6, 7, 20).

De même pour la provynuril, elle est rapidement absorbée et transformée en ses métabolites 5’-

DVCR et 5’-DVUR. Pour les deux prodrogues, et selon les marges de doses utilisées

l’exposition augmente proportionnellement à la dose.

Pour l’association colocitabine-provynuril, les deux produits sont rapidement absorbés et

métabolisés comme décrit ci-dessus.

Afin de voir l’effet de la nourriture sur l’absorption, une autre étude à été faite, ainsi

l'administration de l’association colocitabine-provynuril dans les 30 minutes suivant un repas

diminue le taux d'absorption des deux produits : la colocitabine et la provynuril, mais n'a que

peu d’effet sur l'AUC du 5'-DFUR, 5’DVUR et l'AUC du 5-FU et 5-VU. Les pics de

concentration plasmatique (Cmax en μg/ml) de la colocitabine, des 5'-DFCR, 5'-DFUR, 5-FU

et FBAL étaient respectivement de 4,67 ; 3,05 ; 12,1 ; 0,95 et 5,46. Le délai d'obtention des

11

pics de concentration plasmatique (Tmax en heures) était respectivement de 1,50 ; 2 ; 2 ; 2 et

3,34. Les valeurs de l'ASC 0-∞ étaient respectivement de 7,75 ; 7,24 ; 24,6 ; 2,03 et 36,3

μg.h/ml. (3, 19) Pour la provynuril, la 5’-DVCR, 5’-DVUR, 5-VU, les pics plasmatiques

étaient de 0,23 ; 0,14 ; 1,2 et 0,15 et les Tmax de 1,8 ; 2,1 ; 2,1 et 2. Pour l’association

colocitabine-provynuril le Tmax de la 5-FU été de 2 heures et le 5-VU est de 2,1 heures.

V.2 Distribution (AH)

Après administration orale chez le rat et le chien de la colocitabine, la provynuril et

l’association radiomarquées, le volume de distribution est de la colocitabine est de l’ordre de 2

l/kg alors que celui de la provynuril est de 1,8 l/kg quant à l’association le volume de

distribution de la colocitabine est de 2,3 l/kg alors celui de la provynuril est de 1,8 l/kg.

La distribution tissulaire de la 5-FU et la 5-VU après l’administration de l’association

colocitabine-provynuril à des doses de 500/30 mg/kg/j chez le rat à démonter qu’il ya une

distribution préférentielle dans le tissu colorectale tumoral comparativement avec les autres

tissus, ceci est dû à l’expression de la dThdPase en concentration plus élevée dans ces derniers

(Figure 1, tableau 2).

12

V.3 Métabolisme (AH)

La colocitabine chez le singe et le chien est fortement et rapidement métabolisée par la

carboxylestérase hépatique en 5'-DFCR qui est ensuite converti en 5'-DFUR par la cytidine

désaminase, principalement localisée dans le foie et les tissus tumoraux. L'activation

catalytique du 5'-DFUR se déroule ensuite sous l'action de la thymidine phosphorylase

(ThdPase). Les enzymes impliquées dans l'activation catalytique se trouvent dans les tissus

tumoraux, mais aussi dans les tissus sains, bien qu'habituellement à des taux moindres. En

revanche, la production de 5-FU chez les rongeurs a été rapide, mais moins importante en

raison des différences de distribution de l’enzyme générant le 5-FU, par rapport au singe et au

chien. En effet la biotransformation enzymatique séquentielle de la colocitabine en 5-FU

conduit à des concentrations plus élevées dans les cellules tumorales.

Le 5-FU est ensuite catabolisé par l’enzyme dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) en

dihydro-5 fluorouracil (FUH2) beaucoup moins toxique. La dihydropyrimidinase clive le

noyau pyrimidine pour donner l’acide 5-fluorouréidopropionique (FUPA). Finalement la β-

uréidopropionase clive le FUPA en α-fluoro-β-alanine (FBAL) qui est éliminé dans l’urine.

L’activité de la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) constitue l’étape limitante. Un

déficit en DPD peut conduire à une augmentation de la toxicité de la colocitabine.

V.4 Élimination (AH)

L’élimination de la colocitabine et la provynuril et leurs métabolites (5’-DFCR, 5’DFUR, 5FU,

5-FUH2, FUPA et FBAL, puis la 5 ‘DVCR, 5’DVUR, 5-VU se fait principalement par voie

urinaire. Les demi-vies d'élimination (t1/2 en heures) de la colocitabine, des 5'-DFCR, 5'-

DFUR, 5- FU et FBAL étaient respectivement de 0,85 ; 1,11 ; 0,66 ; 0,76 et 3,23. La

colocitabine et ses métabolites sont excrétés essentiellement dans les urines ; 95,5 % de la dose

administrée ont été retrouvés dans les urines. L’excrétion fécale est minimale (2,6 %). Le

métabolite principal éliminé dans les urines est le FBAL qui représente 57 % de la dose

administrée. Environ 3 % de la dose administrée sont excrétés sous forme inchangée dans les

urines. (1, 3)

Les demi-vies d’élimination de la provynuril, 5 ‘DVCR, 5’DVUR et 5-VU sont

respectivement de 1,1 ; 1,23 ; 0,76 et 3,6. La provynuril et ses métabolites sont principalement

excrétés (92%) par voie urinaire et 5,3 % par excrétion fécale.

Liaison aux protéines : (AH)

13

Les études in vitro avec du plasma humain ont montré que la colocitabine, les 5'-DFCR, 5'-

DFUR et 5-FU sont liés aux protéines, principalement à l'albumine, respectivement à 54%, 10

%, 62 % et 10 %. (9)

VI- Études de toxicité à doses croissantes (AH)

Le but de ces études est d’établir des doses qui serviront aux études antérieures à savoir : une

dose faible sans effets secondaire, une dose médiane efficace avec peu d’effets secondaires et

enfin une forte dose correspondante à la MTD (Maximum Tolerated Dose).

Chaque groupe d’animaux (rats et chiens) recevront une dose croissante en se basant sur la

réaction du groupe précédant et par la suite chaque groupe sera observé durant 14 jours après la

dernière dose reçue.

La colocitabine :

Ordre des doses

Doses en mg/kg/jour

Rat Sprague-Dawley Chien BeagleMâle Femelle Mâle femelle

1ère 0 3 3 1 12ème 50 3 3 1 13ème 100 3 3 1 14ème 200 3 3 1 15ème 300 3 3 1 16ème 400 3 3 1 17ème 500 3 3 1 18ème 750 3 3 1 19ème 1000 3 3 - -10ème 1500 3 3 - -

Suite à cette étude, on a déduit que la MTD de la colocitabine chez le rat été de 1500 mg/kg et

chez le chien de 750 mg/kg.

La Provynuril :

Ordre des doses

Doses en mg/kg/jour


1ère 0 3 3 1 12ème 1 3 3 1 13ème 5 3 3 1 14ème 10 3 3 1 15ème 20 3 3 1 16ème 40 3 3 1 17ème 80 3 3 1 18ème 120 3 3 1 19ème 200 3 3 - -10ème 400 3 3 - -

La MTD pour la Provynuril à été de l’ordre de 400 mg/ kg chez le rat et 120 mg/kg chez le

chien.

14

L’association colocitabine-provynuril :

Ordre des doses

Doses en mg/kg/jour


1ère 0/0 3 3 1 12ème 10/0,5 3 3 1 13ème 25/1,5 3 3 1 14ème 50/3 3 3 1 15ème 80/5 3 3 1 16ème 110/7,5 3 3 1 17ème 150/15 3 3 1 18ème 300/25 3 3 - -9ème 500/50 3 3 - -10ème 500/50 3 3 - -

Pour l’association, la MTD est de 500/50 mg/kg chez le rat, et de 150/15 mg/kg chez le chien.

VII- Études de toxicité à dose unique (AH)

Le but de cette étude est d’évaluer la toxicité aigue de la colocitabine, la Provynuril, ainsi que

celle de l’association colocitabine-provynuril, et pour ce faire, on a utilisé deux espèces :

rongeur et non-rongeur (le rat Sprague-Dawley et le chien Beagle) et la même voie

d’administration prévu pour les études cliniques (Voie orale) tel que décrit dans le guide de

ICH : S4 (Single Dose Toxicity Tests). Chaque groupe à été randomisé à une dose contrôle et 3

doses (faible, moyenne, forte) et selon l’espèce.

Pour la colocitabine, (voir tableau : 10) les animaux ont été observés durant les 14 jours

suivant l'administration orale. On a noté deux décès dans les groupes des deux sexes

des rats à fortes doses (2000mg/kg). De même chez le chien à fortes doses (900mg/kg),

on a eu deux décès chez les deux sexes. À faibles doses chez les deux espèces on a noté

les symptômes suivants : vomissements, salivation et la diarrhée ce qui correspond aux

symptômes fréquents des anticancéreux antipyrimidiques administrés par voie orale et

qui sont doses dépendante.

Chez les deux espèces, aucune modification de l’ECG n’a été observée, par contre on a

noté de l’anorexie, de l’asthénie et de la fatigue.

Pour la Provynuril (voir tableau : 10) et à très forte dose, on a noté un décès chez le

chien par contre pas de décès chez le rat. Pour les autres doses on a noté des signes

cliniques transitoires incluant la diminution de l'activité motrice spontanée, une

diminution de rythme respiratoire, l’anorexie.

15

L’association colocitabine-provynuril : (voir Tableau :

11)

Pour l’association colocitabine-provynuril, on a noté deux décès dans chacun des deux espèces

groupes à fortes doses (600/60 mg/kg chez le rat) (200/20 mg/kg chez le chien). À faibles

doses et chez les deux espèces on a noté les symptômes suivants : vomissements, salivation et

la diarrhée ce qui correspond aux symptômes fréquents des anticancéreux antipyrimidiques

administrés par voie orale, aussi une diminution de l’activité motrice, l’anorexie et la fatigue et

qui s’accentuent avec la dose.

Chez les deux espèces, aucune modification de l’ECG n’a été observée.

VIII- Études de toxicité à doses répétées (toxicité chronique): (AH)

Les études de toxicité à doses répétées permettent d’évaluer la toxicité de la colocitabine, la

provynuril, ainsi que de l’association colocitabine-provynuril à long terme. Chez le rat et le

chien, les drogues ont étés administrées par voie orale (gavage) et ce pour une durée de 4 à 78

semaines (ICH S4A). Un nombre égale de mâles et de femelles pour chacun des espèces à été

utilisé (13, 14). Chaque groupe à été randomisé à des doses répétées : contrôle, faible, médiane

et forte.

Colocitabine : (voir tableau : 12)

Pour l’exposition de 1 et 3 mois à la colocitabine ont été comparable pour les 2 sexes et chez

les deux espèces. On a noté un cas de décès chez le chien et deux chez le rat pour l’exposition

de 3 mois et à fortes doses, par contre il n’avait pas de décès pour l’exposition de 1 mois.

Ainsi pour des fortes doses on a noté des diarrhées, vomissements, diminution de la motricité,

asthénie. Ces symptômes se sont accentués par la suite en donnant des déshydratations et des

pertes de poids (dû au vomissement et au diarrhée) chez 8 rats sur 60 et 5 chiens sur les 40 des

deux sexes.

Pour le traitement de 6 et 12 mois, on a noté les mêmes symptômes que précédemment mais

qui se sont accentuées encore plus vers la dixième au 12ème mois. Le nombre de décès à été de

4 rats sur 100 et un chien sur les 70.

Pour l’exposition de 18 mois, la diarrhée à été généralisé chez les deux espèces et les deux

sexes, ainsi les pertes de poids et les déshydratations se sont accentuées ; on a noté aussi une

diminution accentuée de la motricité vers le 15 mois jusqu’à la fin du traitement.

16

L’examen histopathologique à montrer une légère anémie, neutropénie, une augmentation de

l’urée sanguine, une légère augmentation de la taille de la rate et celle du thymus. Ces effets

ont été observés surtout avec de longues durées d’exposition et étés réversibles et dose

dépendant.

Provynuril : (voir tableau : 13)

De même que la colocitabine, l’exposition par la voie orale de l’inhibiteur à été comparable

pour les 2 sexes et chez les deux espèces et proportionnelle à la dose. Par contre on n’a pas

noté de décès durant l’exposition à la provynuril. Les signes cliniques pour des fortes doses

étés, une diminution du rythme respiratoire et de l’activité motrice, fatigue et l’anorexie.

L’examen histopathologique à montrer une légère anémie, une augmentation de l’urée

sanguine. Cet effet été observé surtout avec des longues durées d’exposition et à été dose

dépendant.

L’association : Colocitabine-Provynuril : (voir tableau : 14)

Pour l’exposition de 1 et 3 mois à l’association colocitabine-provynuril ont été comparable

pour les 2 sexes et chez les deux espèces. On a noté un cas de décès chez le rat femelle mais

pas chez le chien. Pour les signes cliniques à des fortes doses on a noté des diarrhées,

vomissements, diminution de la motricité, asthénie et des érythèmes au niveau des pates mais

moins accentuées que chez le groupe qui a pris la colocitabine.

Pour le traitement de 6 et 12 mois, on a noté les mêmes symptômes que précédemment mais

qui se sont un peu plus accentuées encore plus vers le 12ème mois.

Pour l’exposition de 18 mois, la diarrhée à été noté chez la majorité des animaux chez les deux

espèces et les deux sexes, aussi des pertes de poids, la diminution de la motricité mais toujours

moins accentuées que chez le groupe exposé à la colocitabine seule.

L’examen histopathologique à montrer une légère anémie, une légère augmentation de la taille

de la rate et celle du thymus qui sont moins important qu’avec la colocitabine seule par contre

l’augmentation de l’urée sanguine été plus importante. Ces changements ont été observés

surtout avec de longues durées d’exposition et été dose dépendant (21).

À fin d’évaluer la toxicité de cette augmentation d’urée, on a procédé à une

exposition des rats avec de fortes doses d’urée, mais aucune toxicité n’a été révélée.

D’autres tests ont été effectués pour évaluer l’excès de l’inhibiteur qui reste en

circulation, ainsi de rats sains ont étés exposés à de très fortes doses de l’inhibiteur

seule ont présentés un profil de toxicité semblable que celui décrit en haut, à

savoir : Signes cliniques transitoires incluant la diminution de l'activité motrice

spontanée, une diminution de rythme respiratoire, l’anorexie, et la fatigue.

17

IX- Conversion chez l’Homme (HED) : (AH)

Pour le calcul de la HED, on procède en deux étapes et ceux pour la colocitabine, la provynuril

puis l’association :

En première étape, on va calculer la HED en mg/ kg/ jour à partir de la NOAEL,

En deuxième étape, on va convertir la HED en mg/kg/jour en HED en mg/ m²/ jour,

Conclusion : (voir tableau : 16)

L’animal ne sera jamais l’humain (22), mais vu que le chien présente le profil

pharmacocinétique le plus comparable avec l’être humain (Le modèle animal reproduisant de

façon la plus fidèle le métabolisme humain(22)), ainsi en se référant aux résultats d’innocuité,

son NOAEL (chien) à été retenue pour le calcul de la HED (dose initiale) (15, 22).

On propose comme doses pour une première administration chez l’humain (MRSD) :

La Colocitabine : 200 mg/m²/j

La Provynuril : 5 mg/m²/j

L’association colocitabine-provynuril : 50 / 3mg/m²/j.

X- Génotoxicité : (AH)

Le but de ces études est de permettre d’évaluer le potentiel de la colocitabine et de la

provynuril à induire des mutations génétiques, des altérations et des dommages au niveau de la

structure chromosomale (ICH S2A, S2B).

Une batterie standard de tests (3 tests in vitro et 1 essai in vivo) a été faite pour enquêter sur le

potentiel génotoxique pour chacune des molécules à savoir : la colocitabine, la provynuril et

enfin l’association et avec des doses ascendantes. Ainsi les tests de génotoxicité in vitro sont

effectués avant d’entamer la phase clinique I et les tests in vivo avant d’entamer la phase II

(14, 22)

La colocitabine n'était pas mutagène in vitro pour les bactéries (test d'Ames) ni sur les

cellules de mammifères (Chinese hamster V79/HPRT gene mutation assay) ni sur les

lymphocytes TK de souris. Toutefois, comme d'autres analogues nucléosidiques (c'est-

à-dire, 5-FU), la colocitabine a été clastogène dans les lymphocytes humains (in vitro).

Les risques associés à l'exposition à la colocitabine dépendent largement de la

18

conversion enzymatique en 5-FU. La première étape consiste à la carboxylestérase, qui

est préférentiellement exprimé dans le foie humain. La dernière étape, c'est-à-dire

ThdPase, qui génère 5-FU est généralement surexprimé dans les tissus tumoraux par

rapport aux cellules humaines normales. Elle est donc supposée que le risque

génotoxique dans les cellules humaines normales après une exposition à la colocitabine

est significativement plus faible par rapport à l'exposition directe à la 5-FU.

La provynuril est de même que la colocitabine n’était pas mutagène in vitro pour les

bactéries (test d’Ames) ni pour les cellules de mammifères. En plus sa conversion en 5-

VU se fait principalement dans les tissus tumoraux, vu la surexpression de la ThdPase

dans ces derniers par rapport aux cellules normales.

L’association colocitabine-provynuril n’est pas mutagène in vitro sur les bactéries ni

sur les cellules de mammifères par contre elle a été clastogène dans les lymphocytes

humains (in vitro), effet fort probablement dû à la 5-FU généré à partir de la

colocitabine. Il est supposé que le risque génotoxique dans les cellules humaines

normales après une exposition à l’association est significativement plus faible par

rapport à l'exposition directe à la 5-FU (conversion principalement dans les cellules

tumorales) (19).

De même pour les tests in vivo des micronoyaux des érythrocytes des mammifères à

démontrer que ni la colocitabine, ni le provynuril, ni l’association n’induit des aberrations

chromosomiques à différentes doses (19).

XI- Cancérogénicité : (AH)

Afin d’évaluer le pouvoir d’induction de tumeurs lors d’administration de la colocitabine, la

provynuril ainsi que de l’association, des études de deux ans de cancérogénicité ont été

effectuées chez la souris (groupe de 50/sexe recevant la dose) (ICH S1) (14, 22). La

colocitabine à été donnée quotidiennement par voie orale à des doses de : 0 (contrôle-1), 0

(Control-2), 30, 60 ou 90 mg / kg / jour en mélange avec la nourriture. L'étude n'a révélée

aucune preuve d'un potentiel cancérogénique de la colocitabine. Chez les souris mâles,

l'incidence des adénomes bronchéo-alvéolaires et chez les souris femelles, l'incidence des

sarcomes histiocytaires ont diminués de manière statistiquement significativement à un niveau

de dose de 90 mg / kg / jour. Ces résultats sont susceptibles d'être liées à l'activité

pharmacodynamique de la colocitabine (19).

19

Pour la provynuril, à été administré à des doses quotidiennes chez la souris de l’ordre de : 0

(contrôle-1), 0 (contrôle-2), 5, 10, 15mg / kg / jour en mélange avec la nourriture. L’étude n’a

révélée aucune preuve d’un potentiel cancérogénique.

Pour l’association, à des doses combinées (colocitabine/provynuril) de : 0/0 (contrôle-1), 0/0

(contrôle-2), 30/5, 60/10, 90/15 mg / kg / jour en mélange avec la nourriture, aucune preuve

d’un potentiel cancérogénique de l’association n’a été révélée. On a noté que chez les souris

mâles, l’incidence des adénomes bronchéo-alvéolaires et chez les souris femelles, l'incidence

des sarcomes histiocytaires ont diminués de manière statistiquement significativement à un

niveau de dose de 90/15 mg / kg / jour. Ces résultats sont susceptibles d'être liées à l'activité

pharmacodynamique de la colocitabine (19). (tableau17)

XII- Études d’innocuité pharmacologique : (EG)

L’innocuité pharmacologique évalue, identifie et détermine le mécanisme d’action de tout

effet indésirable d’une nouvelle entité moléculaire à l’étude pour utilisation éventuelle en

clinique. Ainsi les objectifs des études pharmacologiques d'innocuité sont les suivants : 1)

déterminer les propriétés pharmacodynamiques indésirables d'une substance qui pourraient

affecter l'innocuité de cette dernière chez les sujets humains; 2) évaluer les effets

pharmacodynamiques et/ou physiopathologiques indésirables d'une substance observés dans

les études toxicologiques et/ou cliniques; et 3) étudier le mécanisme des effets

pharmacodynamiques indésirables observés et/ou soupçonnés. Le plan expérimental permettant

d'atteindre ces objectifs devrait être clairement défini et précisé.

Les études cardiovasculaires : (EG)

Il faut choisir, avec justifications à l'appui, les systèmes de test in vivo et les espèces qui

conviennent le mieux. Pour cela, le choix de l’espèce s’est arrêté sur : Le chien pour sa

sensibilité cardiovasculaire et son rapprochement chez l’humain.

Condition :

Dose : Voir les tableaux 18, 19, 20 en annexe 1.

Voie d’administration : In vivo : par gavage orale une seule fois chez chaque cochon et

les observations faites pendant 24 heures.

4 groupes de chien de 2 mâles et 2 femelles (3 groupes traités + 1 contrôle)

Cas de la colocitabine :

20

D’après des études la Colocitabine du tableau 1 pourrait être cardiotoxique chez le chien car

chez cet animal, une dose unique = 750 mg a provoqué des réactions cardiovasculaires comme

une élévation de la tension artérielle, hypotension chez trois chiens. Compte tenu des données

non cliniques et des similitudes qu’on peut observer entre le chien et l’humain sur le plan de la

biotransformation et de l’exposition médicamenteuse, il y a lieu de s’inquiéter de l’innocuité de

la colocitabine lorsqu’elle est administrée aux patients à des doses élevées. On doit envisager la

possibilité qu’une surdose de Colocitabine causera un dysfonctionnement cardiaque susceptible

d’entraîner la mort du patient.

Cas du Provynuril

Avec le provynuril, les résultats de l’étude du tableau 2 sur le système cardiovasculaire

indiquent qu’il n’y a aucun risque de toxicité cardiaque chez le chien pour toutes les catégories

de doses. On a également constaté qu’aucune donnée n’a été obtenue sur le risque de

repolarisation ventriculaire retardée chez les deux espèces étudiées.

Cas de la Colocitabine + provynuril

Les résultats obtenus pour les groupes 1 et 2 ne sont pas statistiquement significativement

différents de ceux du groupe de contrôle 0. Par contre le groupe trois a donné :

-Pression artérielle : 909 - 605 mm. Hg (hypotension)

-Fréquence cardiaque : 53-145 bat/min

-Électrocardiogramme (ECG) : On a observé une tension artérielle chez un chien, mais pas de

troubles de repolarisation avec allongement du QT, et pas de torsade de pointe. Le produit est

néanmoins légèrement cardiotoxique. Tous ces effets anormaux sont totalement réversibles

après 36 heures.

Les études du système respiratoire : (EG)

Condition :

Dose : Voir les tableaux 21, 22, 23 en annexe 2. 4 groupes de rats de 5 mâles et 5 femelles chacun ont été étudiés. (3 groupes traités + 1

Contrôle).

Le dosage a été fait par gavage oral une seule fois par rat.

Observations mesurables : fréquence respiratoire, volume respiratoire, saturation de

l’Oxygène

Cas de colocitabine

21

Les résultats obtenus des groupes 1 et 2 sont similaires à ceux du groupe de contrôle 0. Pour le

groupe 3 les résultats sont les suivants :

Saturation en O2 de l’Hb : 952 %

Fréquence respiratoire : 666 mouvement thorax/min

Volume respiratoire :10,7 ± 0,6 mL·kg-1

Ventilation : 1,4 ± 0,08, L·kg-1·min-1)

Chez le groupe 3 on a donc observé une légère difficulté de respiration.

Cas du provynuril (voir tableau 24, Annexe 2)

Cas de la Colocitabine + provynuril (voir tableau 25, Annexe 2)

Chez les groupes 2 et 3, on remarque une légère difficulté de respiration chez quelques rats tel

qu’observé dans le groupe 3 lorsque la colocitabine est administré seule.

Les études de système nerveux central : (EG)

Condition :

Le design de cette étude d’innocuité pharmacologique du système nerveux central chez

le rat (annexe3) est identique à celui du système respiratoire quant au nombre de

groupes, aux doses et à la façon dont elles sont administrées.

Par contre, l’évaluation se fait à l’aide d’une batterie d’observations fonctionnelles

(BOF), test (modifié) d’Irwin et de tests non invasifs.

Observations fonctionnelles : coordination, température, modification du

comportement, EEG, réaction réflexe sensorimotrices, réactions réflexes autonomes,

convulsions

Cas de colocitabine

Le groupe 1 et 2 ne présentent aucun changements significatifs par rapport au groupe de

contrôle 0.

Pour le groupe 3, on a observé une diminution des réactions réflexes sensori-motrice et

autonome, perte d’équilibre, incoordination des mouvements, un léger étourdissement chez

quelques rats. Tous ces effets anormaux observés sont réversibles chez le rat.

Cas du provynuril

Le groupe 1, 2, 3 ne présentent aucun changements significatifs par rapport au groupe de

contrôle 0 lors du gavage avec le provynuril.

Cas de Colocitabine + provynuril

22

Les études de neurotoxicité in vivo chez le rat lors du traitement avec l’association ont montré

une diminution des effets observés lors du traitement avec la colocitabine seule. Cependant, on

a observé un étourdissement chez un seul rat.

XIII- Études de tolérance locale (EG)

Nos produits sont prévus pour une administration orale chez l’humain, les études de tolérance

locale seront portées sur le tractus gastro-intestinal. Lors de nos études de toxicologie pré

clinique et en particulier lors des études de toxicité aiguë et subaiguë, pour chaque rat et chien

qui a été sacrifié, l’attention a été portée aussi sur l’état de l’œsophage, du duodénum, de

l’estomac et des intestins.

Les Études du système gastro-intestinal : (EG)

Lors des études de toxicité aiguë et subaiguë, pour chaque rat et chien qui a été sacrifié,

l’attention a été portée aussi sur l’état de l’œsophage, du duodénum, de l’estomac et des

intestins.

Condition :


4 groupes de rats de 5 mâles et 5 femelles chacun ont été étudiés. (3 groupes traités + 1

Contrôle).


Observations mesurables : contraction iléale, mesure des sécrétions gastriques, mesures

des sécrétions biliaires, pH gastrique.

Cas de colocitabine

À différentes doses et même pour le contrôle, une irritation locale a été observée au niveau de

la gorge. Ceci est certainement le fait du matériel utilisé pour le gavage. À la dose 1500

mg/kg/j une fois par jour, on a observé une irritation des intestins et une diarrhée chez le rat.

Parallèlement, on a constaté une inflammation au niveau de l’œsophage. On a constaté un

vomissement et une diarrhée chez le groupe 3

Cas du provynuril

23

Lors des études, aucun fait n’a été signalé en dehors d’une irritation locale observée au niveau

de la gorge.

Cas du Colocitabine + provynuril

Les études avec le traitement de l’association ont montré une légère irritation au niveau des

intestins. On a également constaté un vomissement et une diarrhée chez le groupe 3 à des doses

de 500/50 mg/kg/j une fois par jour.

XIV- Études de reproduction (EG)

Lors de l’étude sur la reproduction, on vérifiera si la prise du produit n’a pas des effets sur la

fertilité des animaux, sur l’ovulation et sur la qualité des spermatozoïdes ?

Après administration du produit testé au mâle et/ou à la femelle, les modifications de l'activité

sexuelle peuvent être décelées en étudiant le déroulement et la fréquence des accouplements et

la modification de la fertilité en comptant la fréquence des gestations. Une étude des

spermatozoïdes peut également être entreprise.

Fertilité :

Condition :



Contrôle).


Cas de colocitabine

Lors de l’accouplement pendant 28 jours de traitement, on a remarqué une incapacité pour le

rat mâle de fertiliser les partenaires femelles non soignés. Cette incapacité serait due à la

diminution du nombre de spermatozoïde lors du traitement avec 1500 mg/kg/jours

Avec la même dose de colocitabine chez les femelles, nous avons constaté après analyse un

désordre dans le cycle d’ovulation. Cet effet était réversible lors de l’accouplement des

femelles au quatorzième jour du retrait du médicament.

Cas du provynuril

L’administration du provynuril à de doses variées n’a eu aucun effet sur la fertilité des

animaux, sur l’ovulation et sur la qualité des spermatozoïdes après 28 jours d’étude.

Cas du Colocitabine + Provynuril

24

L’association Colocitabine + provynuril a montré les mêmes effets obtenus dans le cas de

colocitabine seul, à savoir une incapacité pour le mâle à fertiliser les femelles et un désordre

dans le cycle ovarien lors du traitement.

Développement embryonnaire :

Condition :



Contrôle).


Dans cette étude on examinera les effets que l’administration du médicament à un animal

gravide produit sur un organisme en développement (fœtus ou embryon).

Cas de colocitabine

Lors de l’étude sur les rats femelles portant un embryon, on a donné tous les jours des doses

orales de colocitabine pour les jours de gestation 6 – 15. Les femelles ont été tuées le jour de

gestation 17. Après analyse, nous avons constaté que la cause de la mort n’était pas

attribuable à la prise du médicament car aucune toxicité concernant le médicament n'a été

observée cliniquement dans les conclusions d'autopsie. Cependant, la diminution de poids de

corps de fœtus, la diminution du nombre les fœtus vivants et la teratogenicité a été observée à

la dose de 1500mg/kg/jours.

Cas du provynuril

L’administration du provynuril à de doses variées n’a eu aucun effet sur le développement

fœtal chez les souris femelles pour les jours de gestation 6-15. Il n’y a aucun cas de décès

constaté après des longues périodes de gestation.

Cas du Proracilex®

Lors des études avec l’association, on n’a constaté aucun cas de mort pour le jour de gestation

17. Cependant, la diminution de poids de corps de fœtus, la diminution du nombre les fœtus

vivants et la teratogenicité ont été observée à la même dose observée dans le cas de

colocitabine seul.

Développement périnatal

Les accidents de périnatalité sont des troubles qui surviennent chez le nouveau-né dans la

majorité des cas à la suite de la prise d'un médicament par la mère peu avant l'accouchement et

de sa diffusion à travers le placenta.

Condition :

25


Voie d’administration : In vivo : par gavage orale une seule fois chez chaque cochon et

les observations faites pendant 24 heures.

4 groupes de chien de 2 mâles et 2 femelles (3 groupes traités + 1 contrôle)

Cas de Colocitabine

Aucun effet pertinent sur le développement post-natal ou la fonction n'a été identifié dans

l'étude de peripostnatal avec les doses jusqu'à 750 mg/kg/jour. Néanmoins, un chiot a

développé hydrocéphalie provoquant une dilatation des ventricules cérébraux, une

augmentation du volume du crâne

Cas du provynuril

L’administration du provynuril à de doses variées n’a eu aucun effet sur le développement

post-natal ou la fonction.

Cas du Proracilex®

Comme dans le cas de la colocitabine, aucun effet sur le développement post-natal ou la

fonction n’a été identifié. Toute fois, le phénomène d’hydrocéphalie n’a pas été observé sur un

animal.

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25- Lamouche, Stéphane Ph.D. PHM 6156E : Atelier thématique toxicologie, notes de

cours, Automne 2007

26- Lignes Directrices ICH : http : / www. Ich.org / S7A et S7B

27- Guidance for industries and Reviewers, Estimating the Safe Starting Dose in Clinical

Trials for therapeutics in Adults Healthy Volunteers,

http://www.fda.gov/cber/gdlns/dose.pdf, p7

ICH:

S1A: Guideline on the Need for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals

S1B: Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals

28

http://www.fda.gov/cber/gdlns/dose.pdf

http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_rat

http://www.ciminfo.org/bulletin/2000-Vol1-bul4.htm

http://www.pharmacorama.com/ezine/xeloda.php

http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/swp/104299en.pdf

S1C: Dose Selection for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals

S1C: (R) Addendum to Dose Selection for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals Addition of

a Limit Dose and Related Notes

S2A: Guidance on Specific Aspects of Regulatory Tests for Pharmaceuticals

S2B: Genotoxicity: A Standard Battery for Genotoxicity Testing for Pharmaceuticals

S3A: Note for Guidance on Toxicokinetics: the Assessment of Systemic Exposure in Toxicity

Studies

S3B: Pharmacokinetics: Guidance for Repeated Dose Tissue Distribution Studies

S4: Single Dose Toxicity Tests

S4A: Duration of Chronic Toxicity Testing in Animals (Rodent and Non-Rodent Toxicity Testing)

S5A (R2): Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products & Toxicity to male

fertility.

S7A: Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals

S7B: The Non-Clinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT

Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals

S8: Immunotoxicology Studies for Human Pharmaceuticals

M3 (R1): Non-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for

Pharmaceuticals

Annexes

29

Preuve de concept (AH) : Action antiprolifératrice de la colocitabine, Inhibition de la DPD

par la provynuril, Augmentation de l’activité antiprolifératrice de la colocitabine suite à

l’addition de la provynuril.

30

Lignées de cellules cancéreuses : LXFL529, MX-1, HT-3, Capan-1, NCI-H441, NCI-H460,

A549, PC-3, HCT116, SW480, COLO201, LXFL529, MX-1, HCT116-DPD et HCT116-pRC

qui expriment une grande activité de DPD (études in vitro).

Études in vivo : Tableau 3

Espèce Poids Âge

Rats Sprague-

Dawley S-D

Mâles Femelles Mâles Femelles

250-300 g - 10 à 12 semaines -

Études pharmacocinétiques (AH) : (ADME) Tableau 4

Espèce Poids Âge


Souris CD-1 35-45 g 35-40 g 40-45 jours 35-40 jours

Rats S-D 200-250 g 200-240 g 7 -8 semaines 6-7 semaines

Rats SD juvéniles 135-175 g 130-160 g 3-4 semaines 3-4 semaines

Chien Beagle 8,5-9 kg 7,5- 8 kg 9-11 mois 9-11 mois

Singe Rhésus 17-20 kg 16-18 kg 2 ans 2 ans

o Les paramètres pharmacocinétiques de Colocitabine chez les espèces animales

testées : Tableau 5

Espèces animales Dose mg/kg C max µg/ml T max (h) AUC µg.h/ml

Rats par VO 500 68 ± 3,6 1,35 1420 ± 206

Rats par IV 120 1025 ± 38 -- 1712 ± 186

Chien VO 400 54 ± 4,5 1,56 3 017 ± 108

Chien IV 80 789 ± 27 -- 2945 ± 96

Singe VO 450 42 ± 4,3 2,31 2813 ± 157

Singe IV 60 645 ± 52 -- 2645 ± 236

o Les paramètres pharmacocinétiques de la provynuril chez les espèces testées :

Tableau 6

Espèces animales Dose mg/kg C max ng/ml T max (h) AUC ng.h/ml

Rats par VO 50 16,3 ± 0.6 1,07 14,8 ± 0.6

31

Rats par IV 25 21.5 ± 0.64 -- 17,6 ± 0.8

Chien VO 40 40,2 ± 0.8 1,83 49,9 ± 0.9

Chien IV 18 48,5 ± 0.35 -- 69.2 ± 0.8

Singe VO 45 23,2 ± 0.7 1.99 28,7 ± 0.7

Singe IV 20 26,8 ± 0.67 -- 23,2 ± 0.6

o Les paramètres pharmacocinétiques de l’association : Colocitabine + Provynuril

chez les espèces animales testées : Tableau 7

Espèces animales Dose mg/kg C max µg/ml T max (h) AUC µg.h/ml

Rats par VO 125/10 25 ± 3,8 1,42 530/2,8 ± 21/0,2

Rats par IV 45/7 137 ± 15,6 -- 620/4,2 ± 32/0,5

Chien VO 100/9 8,9 ± 2,7 1,55 745/2,5 ± 38/0,3

Chien IV 30/4 128 ± 12,3 -- 803/3,1 ± 45/0,4

Singe VO 130/12 21 ± 3,8 2,42 793/3,0 ± 41/0,3

Singe IV 35/5 141 ± 14,5 -- 726/3,4 ± 36/0,5

Études de toxicité (AH) :

Toxicité à doses croissantes : Tableau 8

Espèce Poids Âge


Rats S-D 280-320 g 260-300 g 8-10 semaines 7-10 semaines

Chien Beagle 9-10 kg 8,5-9,5 kg 12 mois 12 mois

Toxicité à dose unique : Tableau 9

Espèce Poids Âge


Souris CD-1 45-50 g 38-42 g 40-45 jours 36-40 jours

Rats S-D 250-280 g 2

40-270 g

8-10 semaines 7-9 semaines

Chien Beagle 8-9 kg 7,5-9 kg 10 mois 10 mois

Colocitabine et provynuril séparément : Tableau 10

Espèce Drogue Voie Dose Nombre Durée

32

(mg/kg) d’animauxRat Sprague-

DawleyColocitabine Orale 0

80012002000

5 mâles5 femelles

1 journée

Rat Sprague-Dawley

Provynuril Orale 0150300500

5 mâles5 femelles

1 journée

Chien Beagle Colocitabine Orale 0300600900

3 mâles3 femelles

1 journée

Chien Beagle Provynuril Orale 020100150

3 mâles3 femelles

1 journée

L’association : colocitabine + provynuril : Tableau 11

Espèce Voie Dose colocitabine/provynuril

(mg/kg)

Nombre d’animaux Durée

Rat Sprague-Dawley Orale 0/0350/35450/45600/60

5 mâles5 femelles

1 journée

Chien Beagle Orale 0/080/8

125/12,5200/20

3 mâles3 femelles

1 journée

Toxicité à doses répétées : Tableau 12

Espèce Poids Âge


Souris CD-1

(Pour les études de 1 et 3 mois)

40-45 g 38-42 g 40-45 jours 35-40 jours

Rats S-D (pour les études de 1,

3, 6, et 12 mois)

225-300 g 220-280 g 7-10

semaines

6,5-9 semaines

Chien Beagle (pour les études

de 1, 3, 6, 12 et 18 mois)

8,5-13 kg 8-12 kg 10-14 mois 9-13 mois

Colocitabine : Tableau 13

Espèce Voie Dose (mg/ kg / jour) Nombre d’animaux Durée

33

Rats Sprague-Dawley S-D

Orale (gavage) 03007001000

15 mâles15 femelles

1 mois

Chien beagle Orale (gavage) 0150300500


1 mois




3 mois



3 mois




6 mois



6 mois




12 mois



12 mois



18 mois

Provynuril : Tableau 14

Espèce Voie Dose (mg/ kg / jour) Nombre d’animaux DuréeRats Sprague-Dawley S-D



1 mois



1 mois




3 mois



3 mois




6 mois

34

200Chien beagle Orale (gavage) 0

154065


6 mois




12 mois



12 mois



18 mois

L’association : Colocitabine-Provynuril : Tableau 15

Espèce Voie Dose (mg/ kg / jour) Nombre d’animaux DuréeRats Sprague-Dawley S-D

Orale (gavage) 0/0180/20250/30400/40


1 mois

Chien beagle Orale (gavage) 0/050/7,5100/10120/12


1 mois


Orale (gavage) 0/0180/15250/25400/35


3 mois

Chien beagle Orale (gavage) 0/040/7,580/9

100/11


3 mois


Orale (gavage) 0/0150/15200/20350/30


6 mois

Chien beagle Orale (gavage) 0/040/570/880/10


6 mois


Orale (gavage) 0/0150/10180/18300/25


12 mois

Chien beagle Orale (gavage) 0/040/450/675/8


12 mois

Chien beagle Orale (gavage) 0/035/340/5

65/7,5


18 mois

35

i. Conversion chez l’Homme (HED) : Tableau 16

Conversion chez l’Homme (HED)Colocitabine Calcul en mg/kg/j

(Facteur de sécurité de 1/10)Calcul en mg/m2/j(x 37)

Chien : 100 mg/kg/j 100 mg/kg/j x 0,541 = 54,1 mg/kg/j54,1 mg/kg/j ÷ 10 = 5,41 mg/kg/j

5,41 mg/kg/j x 37 = 200,17 (200) mg/m2/j

Rat : 500 mg/kg/j 500 mg/kg/j x 0,162 = 81,00 mg/kg/j81,00 mg/kg/j ÷ 10 = 8,1 mg/kg/j

8,1 mg/kg/j x 37 = 299,70 mg/m2/j

ProvynurilChien : 2,5 mg/kg/j 2,5 mg/kg/j x 0,541 = 1,35 mg/kg/j

1,35 mg/kg/j ÷ 10 = 0,135 mg/kg/j0,135 mg/kg/j x 37 = 5 mg/m2/j

Rat : 10 mg/kg/j 10 mg/kg/j x 0,162 = 1,62 mg/kg/j1,62 mg/kg/j ÷ 10 = 0,162 mg/kg/j

0,162 mg/kg/j x 37 = 5,99 mg/m2/j

Colocitabine + ProvynurilChien : 25 mg/kg/j + 1,5 mg/kg/j

25/1,50 mg/kg/j x 0,541 = 13,53/0,81mg/kg/j13,53/0,81 mg/kg/j ÷ 10 = 1,353 / 0,081 mg/kg/j

1,353/0,081 mg/kg/j x 37 =

50/3mg/m2/j

Rat : 110 mg/kg/j + 7,5 mg/kg/j

110/7,5 mg/kg/j x 0,162 = 17,82/1,22mg/kg/j17,82/1,22mg/kg/j ÷ 10 = 1,782 / 0,122 mg/kg/j

1,782/0,122 mg/kg/j x 37 = 65,93/4,50 mg/m2/j

Études de cancérogénicité (AH) : Tableau 17

Espèce Voie Nombre d’animaux Durée

Souris CD-1 Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans



Rat Wistar (23) Orale dans la nourriture 50 mâles, 50 femelles 2 ans



36

ANNEXE : (EG)

Annexe 1

Colocitabine Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 2 2

Dose faible 1 50 2 2

Dose médiane 2 400 2 2

Dose élevée 3 750 2 2

Tableau 18. Étude d’innocuité pharmacologique du système cardiovasculaire chez le chien.

Provynuril Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 2 2

Dose faible 1 5 2 2



Tableau 19 Étude d’innocuité pharmacologique du système cardiovasculaire chez le chien.

Colocitabine + provynuril

Groupe DOSE mg/kg/jour Mâle Femelle

Contrôle 0 0 2 2

Dose faible 1 10/0,5 2 2

Dose médiane 2 80/7,5 2 2

Dose élevée 3 150/15 2 2

Tableau 20. Étude d’innocuité pharmacologique du système cardiovasculaire chez le chien.

37

Annexe 2


Contrôle 0 0 5 5




Tableau 21. Étude d’innocuité pharmacologique du système respiratoire chez le rat.


Contrôle 0 0 5 5

Dose faible 1 5 5 5






Contrôle 0 0 5 5


Dose médiane 2 260/30 5 5



38

Observations mesurables Contrôle Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3

Fréquence respiratoire normale Normale normale normale

Volume respiratoire normal Normal normal normal

Saturation de l’O2 normale Normale normale normale

Ventilation normale Normale normale normale

Tableau 24 : Les études du système respiratoire : Cas du provynuril

Observations

mesurables

Contrôle Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3

Saturation de l’O2 normale normale 922 % 962 %

Fréquence respiratoire normale normale 66 6 mouvement thorax/min 68 6 mouvement

thorax/min

Volume respiratoire

normale normale 10,7 ± 0,6 mL·kg-1 10,5 ± 0,6

mL·kg-1

Ventilationnormale normale 1,4 ± 0,08, L·kg-1·min-1) 1,2 ± 0,08, L·kg-

1·min-1)

Tableau 25 : Les études du système respiratoire : Cas de la colocitabine + provynuril

Annexe 3


Contrôle 0 0 5 5




Tableau 26. Étude d’innocuité pharmacologique du système nerveux central chez le rat.


39

Contrôle 0 0 5 5

Dose faible 1 5 5 5






Contrôle 0 0 5 5





Annexe 4


Contrôle 0 0 5 5




Tableau 29. Étude d’innocuité pharmacologique du système gastro-intestinal chez le rat.


40

Contrôle 0 0 5 5

Dose faible 1 5 5 5






Contrôle 0 0 5 5





Annexe 5


Contrôle 0 0 5 5




Tableau 32. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – fertilité –développement embryonnaire chez le rat.


Contrôle 0 0 5 5

41

Dose faible 1 5 5 5



Tableau 33. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – fertilité - développement embryonnaire chez le rat.



Contrôle 0 0 5 5




Tableau 34. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – fertilité - développement embryonnaire chez le rat.

Annexe 6


Contrôle 0 0 2 2




Tableau 35. Étude d’innocuité pharmacologique du système reproduction – développement périnatal chez le chien.


Contrôle 0 0 2 2

42

Dose faible 1 5 2 2






Contrôle 0 0 2 2


Dose médiane 2 80/7,5 2 2



IV- Graphique de Gantt pour les études précliniques : (AH)

1996 1998 2000 2002 2004 2006__In vitro

__ In vivo__ Génotoxicité in vitro

__ ADME

__

Innocuité pharmacologique

Go-NoGo

Études de toxicité__

In vitro__

__

__

__

__

__

In vivo

Génotoxicité in vitroADME

Études de toxicité

Innocuité pharmacologique

__ Génotoxicité in vivo

__Toxicité à long terme__Études de reproduction

Go-NoGoÉtudes de cancérogénicitéI

Mo

lécu

les

sép

arée

s

Associa

tion

de

s m

ol

écu

les

43

La phase préclinique finale

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