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Perméabilité membranaire

TP physiologie générale – BA2 © P. GOLSTEIN et V. SHLYONSKIY

La perméabilité membranaire

A. Introduction

1. Les phénomènes bioélectriques

L’activité électrique de différents organes, mesurée à distance de ces organes, est

couramment utilisée en clinique par différents examens diagnostics:

– l’électrocardiogramme (ECG) mesure l’activité électrique du cœur

– l’électroencéphalogramme (EEG) mesure l’activité électrique du cerveau

– l’électromyogramme (EMG) mesure l’activité électrique du muscle squelettique

– l’électrorétinogramme mesure l’activité électrique de la rétine

L’enregistrement des signaux électriques implique l’existence d’une différence de potentiel

(ddp) entre deux points.

Dans le cas du cœur, l’activité électrique des cellules musculaires cardiaques est enregistrée

par 2 électrodes placées à distance du cœur, au niveau de la peau qui mesurent la ddp

générée, à chaque instant du cycle cardiaque, par les courants de dépolarisation et de

repolarisation des cellules myocardiques qui se propagent au niveau des liquides conducteurs

de l’organisme. L’ECG est obtenu par le placement de différentes combinaisons d’électrodes

et permet de suivre l’activité électrique cardiaque au cours du temps, de manière indirecte

(électrodes extracellulaires et à distance) et globale (activité électrique de l’ensemble des

cellules myocardiques).

L’origine de l’activité électrique des organes prend naissance au niveau de certaines de

leurs cellules et dépend donc des propriétés électriques de ces cellules.

2. Les canaux ioniques

La membrane cellulaire est une bicouche lipidique hydrophobe (imperméable à l’eau),

essentiellement composée de phospholipides et de cholestérol, au sein de laquelle différents

types de protéines sont enchassées (modèle de la mosaïque fluide proposé par J. Singer et

G. Nicolson en 1972).

Les protéines intégrales transmembranaires assurent le passage des molécules hydrophiles

(solubles dans l’eau) à travers la membrane et les ions hydratés qui véhiculent le courant

électrique en solution, traversent la membrane par des canaux ioniques.

Les canaux sont de petits cylindres creux dont la partie hydrophobe externe est ancrée dans

la membrane et la partie centrale forme une cavité hydrophile dont l'ouverture est

intermittente et régulée et au sein de laquelle les ions s’y engagent passivement, selon leur

gradient électrochimique, c’est-à-dire par électrodiffusion.

Les canaux ioniques se caractérisent notamment par leur sélectivité ionique (anionique vs

cationique; sélectivité différente entre anions et entre cations); leur mode d’ouverture et de

fermeture; leur temps d’ouverture et de fermeture; leur conductance (le nombre d’ions

passant par seconde par un canal est de l’ordre de 105 à10

9 ions/sec) et leur rectification

(conductance symétrique ou non).



3. Le potentiel de diffusion

Le potentiel de diffusion au niveau d’une membrane dépend théoriquement de 3 facteurs:

1. d’une différence de concentration ionique de part et d’autre de la membrane

2. d’une différence de mobilité des ions en solution, génératrice d’une séparation

de charge, c’est-à-dire de la formation de dipôles

3. d’une perméabilité différentielle de la membrane aux ions considérés

Au niveau d’une membrane à larges pores qui laisse passer librement les ions, le

potentiel de diffusion résulte d’une différence de concentration ionique et d’une

différence de mobilité ionique.

Au niveau d’une membrane biologique, le potentiel de diffusion résulte d’une

différence de concentration ionique et d’une perméabilité différentielle de la membrane

aux ions considérés.

Un dipôle se constitue lorsqu’un électrolyte, formé de 2 composés de mobilités différentes

(ex : acétate de potassium) se dissocie en solution.

Le composé de plus petite taille et plus mobile (K+) tend à se séparer du composé de charge

opposée, plus gros et moins mobile (acétate) mais la force électrostatique qui s’exerce

mutuellement sur les 2 ions (qui les attire l’un vers l’autre) les empêchent de se déplacer

séparément et crée un dipôle (ou une paire ionique).

Fig.1 Formation d’un dipôle (Byrne et Schultz, An introduction to membrane transport and

bioelectricity, Raven Press, 1988)

Dans une solution homogène, le principe d’électroneutralité est respecté: l’orientation

des dipôles étant aléatoire, à chaque dipôle orienté dans une direction correspondant un

dipôle de même amplitude orienté dans une direction exactement inverse (cette situation

correspond à chacun des compartiments de la figure 2A lorsque la membrane qui les sépare

est totalement imperméable; dans ces conditions, la différence de potentiel entre les 2

compartiments est nulle)



Au niveau d’une membrane à larges pores qui sépare 2 compartiments, la génération

d'un potentiel de diffusion résulte de la formation de dipôles diffusant de façon orientée à

travers la membrane, sous l’effet d’un gradient de concentration entre les 2 compartiments

(figure 2).

Fig.2 Génération d’un potentiel de diffusion (Baertschi, transport membranaire, 2002-2003)

– Les 2 compartiments (1 ou externe et 2 ou interne) contiennent chacun une solution de

Kacétate avec [Kacétate]1 > [Kacétate]2 et sont séparés par une membrane à larges pores

qui n’est pas sélective pour le K+ et l’acétate et les laisse passer librement.

– Les dipôles de Kacétate sont indiqués par les flèches () dont la tête correspond à l’ion

de mobilité plus grande (le K+)

Lorsqu’une partition imperméable amovible est placée d’un côté de la membrane à larges

pores et empêche la diffusion de Kacétate de 1 vers 2, la ddp entre les 2 compartiments est

nulle (figure 2A).

Lorsque la partition amovible est retirée, les dipôles de Kacétate vont diffuser du

compartiment 1, le plus concentré, vers le compartiment 2, le moins concentré, de

manière orientée au niveau de la membrane. La somme de ces dipôles orientés peut se

représenter par un dipôle unique, dont l’extrémité orientée vers le compartiment 2 est

positive et développe une différence de potentiel au niveau de la membrane, le

compartiment 2 devenant positif par rapport au compartiment 1 (figure 2B).

A.

B.



Dans ces conditions où la membrane est à larges pores (perméabilité non sélective pour le

K+ et l’acétate), le potentiel de diffusion se développe suite à la différence de mobilité

entre le K+ et l’acétate et à leur gradient de concentration.

Il faut noter que la séparation de charge responsable de la différence de potentiel

membranaire n’est que de quelques Angstrom et qu’elle correspond au déplacement de

l’ordre de 10-15

moles d’un ion monovalent pour générer une différence de potentiel de

100 mV. Cette quantité infinitésimale n’est chimiquement pas mesurable et le principe

d’électroneutralité, règle macroscopique, reste respecté dans chaque compartiment.

Le compartiment vers lequel diffusent les ions aura toujours le signe de l’ion ayant la plus

grande mobilité.

L’expression générale du potentiel de diffusion à travers une membrane d’un

électrolyte qui se dissocie en un cation et un anion monovalent est donnée par la relation :

(équ.1) où

D+

et D

-

sont respectivement les coefficients de diffusion du cation et de l’anion, en [cm

2.sec

-1]

C1 et C2 : concentration de l’ion considéré dans le compartiment 1(ou externe) et 2 (ou interne)

R: constante des gaz parfaits = 8,31 J.K-1

.mole-1

T: température, en [°K]

F : constante de Faraday = 96.500 C. mol-1

= 96.500 J.V-1

(1 V = 1 J/C)

z : valence de l’ion

Comme, D = u. R.T , l’équation devient :

(équ.2)

où u+

et u

-

sont respectivement les mobilités du cation et de l’anion, en [cm².mole. J

-1.min

-1]

Cette équation se simplifie dans les 2 cas de figure suivants:

1. absence de gradient de concentration: C1

= C2

Vdiff

= 0

2. même mobilité anionique et cationique en présence d’un gradient de concentration:

u+

= u

-

Vdiff

= 0 (même si il existe une différence de concentration)

Il n’y a donc pas de potentiel de diffusion en absence de gradient de concentration et

lorsque la mobilité ionique est identique.



Au niveau d’une membrane biologique, la différence de potentiel Vm mesurée est un

potentiel de diffusion qui respecte le principe d’électroneutralité et dont l’importance est

directement fonction de la différence de concentration des ions de part et d’autre de la

membrane et de leur perméabilité membranaire (la membrane biologique n’est pas une

membrane à larges pores et a une perméabilité différentielle aux ions considérés). Par contre,

la différence de mobilité entre les ions n’intervient pas dans la génération de Vm.

4. Le potentiel d’équilibre ou potentiel de Nernst (Eion)

Lorsqu’il existe un gradient de concentration ionique et que la membrane est imperméable à

une espèce ionique, l’équation 1 se simplifie (D+ ou D

- = 0 au sein de la membrane):

(équ.3)

Cette relation correspond au potentiel d’équilibre de l’ion considéré ou potentiel de

Nernst (Eion) : il s’agit de la valeur du potentiel membranaire pour laquelle le flux net

de l’ion considéré est nul. Le potentiel d’équilibre d’un ion donné ne dépend que du rapport

de ses concentrations de part et d’autre de la membrane.

L’exemple d’une membrane imperméable au Cl- et perméable au K

+ illustre ce

concept (figure 3):

le K+ qui diffuse, selon son gradient de concentration, vers le compartiment extérieur et est

également soumis à un gradient électrique, généré par le passage de charges positives dans le

compartiment externe, qui s’oppose au gradient chimique. Le système aura atteint l’état

d’équilibre lorsqu’il n’y aura plus de flux net, c’est-à-dire lorsque le gradient chimique et le

gradient électrique seront égaux et opposés. La différence de potentiel qui s’oppose

exactement au gradient de concentration d’un ion est le potentiel d’équilibre de cet ion

(Eion) et est de -58,5 mV, calculé par l’équation 3 (le milieu extérieur est la référence fixée à

0 mV).

compartiment int

0 mV -58,5 mV

compartiment ext

Kext+ = 10 mM Kint

+ = 100 mM

gradient de concentration

gradient électrique

Vm = -58,5 mV

EK = -58,5 mV

FLUX NET NUL

Fig.3 Le potentiel de Nernst



Il faut souligner que malgré la mobilité élevée des ions K+ et Cl

- en solution aqueuse, Vdiff est

cependant élevé dans la mesure où la membrane est imperméable au Cl- .

A 25°C, (2,3.RT/F) = 58,5 mV et l’équation 3 devient :

pour un cation (z =1):

(équ.4)

pour un anion (z = -1):

(équ.5)

Le potentiel de Nernst peut s’appliquer aux membranes biologiques qui présentent une

perméabilité hautement sélective pour un ion donné (tout en étant conscient de

l’approximation, les membranes biologiques n’étant pas strictement imperméables à une

espèce ionique donnée).

5. Le potentiel de repos ou potentiel de membrane (Vm)

La différence de potentiel membranaire, mesurée au niveau de toutes les cellules, est

principalement un potentiel de diffusion, qui dépend de la composition ionique de la cellule

(distribution asymétrique du Na+, K

+ et Cl

-), de la mobilité des ions et des perméabilités

ioniques membranaires (canaux ioniques).

Le rôle direct de la Na+,K

+ ATPase (et des transporteurs électrogéniques) dans la

génération de Vm est mineur (±5 mV).

La Na+,K

+ ATPase, située au niveau de la membrane basolatérale de la plupart des cellules,

joue cependant un rôle fondamental dans la génération de Vm , par son action indirecte

qui établit et maintient une asymétrie de concentrations de Na+ et K

+ intra et

extracellulaires, responsables de la génération de potentiels de diffusion (en absence de

gradient, il n’y a pas de diffusion et donc pas de potentiel de diffusion).

L’inhibition de la Na+,K

+ ATPase par l’ouabaïne (glycoside cardiaque) réduit

immédiatement Vm d’à peine quelques mV et Vm ne devient réellement affecté que plus

tardivement lorsque les gradients de concentrations se dissipent.

On rappellera la composition différentes des liquides intra et extracellulaire:

– Le liquide intracellulaire (LIC) est riche en K+

(120-150 mM) et pauvre en Na+ (10-15

mM) et les phosphates organiques (60 mM) et les protéines chargées négativement (30

g/dl) sont les anions majoritaires.

– Le liquide extracellulaire (LEC) est riche en Na+

(135-145 mM) et pauvre en K+ (3,5-5

mM) et le Cl

- (95-105 mM) et le HCO3

- (22-28 mM) sont les anions majoritaires.

L’ion auquel la membrane est le plus perméable conditionne la valeur de Vm de repos:

pour la plupart des cellules, Vm de repos est aux environs de -70 mV (l’intérieur de la

cellule est négatif), proche du potentiel d’équilibre du K+, impliquant une forte perméabilité

membranaire au K+ via des canaux K

+ spécifiques et une faible perméabilité au Na

+ et au Cl

-.

Les protéines et phosphates organiques intracellulaires n’interviennent pas dans la génération

de Vm, la membrane ne leur étant pas perméable.

Lorsque [K+]i = 140 mEq/L et [K

+]e = 4 mEq/L, EK = - 90 mV (calculé par l’équation 4).



6. Vm et la relation de Goldman-Hodgkin-Katz (GHK)

Même si la membrane cellulaire démontre au repos une perméabilité au K+ nettement

supérieure à celles des autres ions, ces derniers ont cependant tendance à traverser la

membrane selon leur gradient électrochimique et à écarter Vm du potentiel d’équilibre du K+.

La valeur de Vm est fonction de la distribution des différents ions diffusibles et dépend du

potentiel de diffusion de chacun d’entre eux.

La relation de Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) permet d’en tenir compte et donne la

valeur du potentiel de repos en considérant les ions dont les concentrations sont les plus

élevées (les autres ions dont les concentrations et perméabilité sont beaucoup plus faibles,

bien que participant également à la valeur de Vm, peuvent être négligés, comme par exemple,

le calcium):

(équ.6) où

P est la perméabilité membranaire de l’ion considéré, en [cm.sec-1

]

et P= Di/x

Di : coefficient de diffusion de i à travers la membrane, en [cm2.sec]

x : épaisseur de la membrane, en [cm]

7. La stabilité de Vm et l’état stationnaire

La stabilité du potentiel de repos, Vm , est liée à l’absence de courant ionique net

transmembranaire: lorsque la somme de tous les courants ioniques est nulle (INa + IK +

ICl = 0), Vm est stable.

Autrement formulé, à la valeur du potentiel de repos, il existe un flux net pour chaque ion

pris séparément mais la somme de ces flux nets est nulle.

Cette situation est rendue possible par l’activité de la Na+,K

+ ATPase qui hydrolyse en

permanence l’ATP pour maintenir une asymétrie de concentrations de Na+ et K

+ intra et

extracellulaires, responsable des potentiels de diffusion.

Un système est dans un état stationnaire lorsque ses conditions restent constantes,

indépendamment du temps, moyennant une dépense permanente d’énergie. La stabilité

de Vm au prix d’une utilisation permanente d’énergie sous forme d’ATP est un état

stationnaire.

Cette situation se différencie de l’état d’équilibre d’un système qui est atteint sans apport

d’énergie externe et qui se maintient indépendamment du temps. L'état d'équilibre est atteint

lorsque le transport net d’un ion est nul, c’est-à-dire lorsque le gradient chimique et le

gradient électrique sont égaux et opposés. La différence de potentiel qui s’oppose exactement

au gradient de concentration de l’ion est le potentiel d’équilibre de cet ion (Eion).



B. Manipulation

1. Matériel (par groupe de 3-5 étudiants)

1 plaque de 6 puits dont 3 seront utilisés

Fig. 4

3 filtres de polycarbonate (Snapwell – 12 mm diamètre)

Fig. 5

1 voltmètre-ohmmètre (8020 Multimeter)

1 paire d’électrodes Ag/AgCl de type chopstick ("home made")

Fig. 6



1 ml de solution Heptanol/Decane (3:2)

1 ml de solution de valinomycine 2 µM en Heptanol/Decane (3:2)

la valinomycine est un ionophore du potassium qui augmente la perméabilité

membranaire au potassium

50 ml de solution de KCl 0,1 M

50 ml de solution de KCl 1 M

50 ml de solution de NaCl 1 M

2. Protocole:

1) Remplir 3 des 6 puits de la plaque par 2 ml de solution de KCl 1 M (puits 1), KCl 0,1 M

(puits 2) et NaCl 1 M (puits 3) (figure 4)

Le puits représente le compartiment externe et [ion]ext est la concentration de l’ion

considéré dans le puits

2) Préparer les 3 filtres de polycarbonate:

– Filtre 1 : non traité ou filtre nu

– Filtre 2 : traité avec 30 µl d’une solution Heptanol/Decane (3:2)

– Filtre 3 : traité avec 30 µl d’une solution de valinomycine 2 µM en Heptanol/Decane

(3:2)

La partie supérieure du filtre représente le compartiment interne et [ion]int est la

concentration de l’ion considéré au niveau de la partie supérieure du filtre

3) Mesures de voltage et de résistance

– Respecter la polarité des électrodes et toujours connecter l’électrode « » (la

terre) sur le symbole correspondant sur le voltmètre-ohmmètre (figure 6: flèches

en pointillés).

– Cette électrode de terre est toujours placée dans le puits (compartiment externe)

Fig. 7



1er

filtre non traité = filtre nu

1) Placer le filtre dans le 1er

puits contenant 2 ml de KCl 1M et ajouter sur sa face

supérieure 0,5 ml de KCl 1M.

Placer les 2 électrodes dans chaque compartiment et mesurer la ddp à l’aide du

voltmètre. Cette valeur de ddp représente le voltage lié aux propriétés du filtre nu, dans

les conditions expérimentales (Eoffset1), et est à soustraire des valeurs de voltage

mesurée dans les conditions 4 et 7.

Mesurer ensuite la résistance.

2) Transférer le filtre dans le 2e puits contenant 2 ml de KCl 0,1M (en ayant

préalablement soigneusement essuyé la partie inférieure du filtre qui était immergée

dans le KCl 1M)






3) Transférer le filtre dans le 3e puits contenant 2 ml de NaCl 1M (en ayant préalablement

soigneusement essuyé la partie inférieure du filtre qui était immergée dans le KCl

0,1M)






2ème

filtre traité par 30 µl de solution Heptanol/Decane (3:2) = filtre H/D





voltmètre. Mesurer ensuite la résistance.



dans le KCl 1M)



6) Transférer le filtre dans le 3e puits contenant 2 ml de NaCl 1M (en ayant préalablement

soigneusement essuyé la partie inférieure du filtre qui était immergée dans le KCl

0,1M)





3ème

filtre traité par 30 µl de solution de valinomycine 2 µM en Heptanol/Decane

(3:2) = filtre H/D + V








dans le KCl 1M)



9) Transférer le filtre dans le 3e puits contenant 2 ml de NaCl 1M (en ayant


dans le KCl 0,1M)





3. Résultats

Pour chaque condition (1 à 9), indiquer les valeurs mesurées dans la table 1 et calculer le

voltage membranaire:

# Conditions Résistance

(kOhms)

Voltage mesuré

(mV)

Voltage

membranaire

(mV)

1 Filtre nu

[KCl]int 1M / [KCl]ext 1M

(conditions symétriques)

2 Filtre nu

[KCl]int 1M /[KCl]ext 0,1 M

3 Filtre nu

[KCl]int 1M / [NaCl]ext 1M

4 Filtre H/D



5 Filtre H/D


6 Filtre H/D


7 Filtre H/D + V



8 Filtre H/D + V


9 Filtre H/D +V


Table 1



4. Questions

1) Expliquer pourquoi la résistance du filtre traité a augmenté par rapport à celle du filtre

nu.

2) Expliquer pourquoi il n’y a pas de ddp de part et d’autre de la membrane lorsque les

conditions sont symétriques.

3) Calculer le potentiel de Nernst pour les ions K+ et Cl

- pour la condition [KCl]in 1M /

[KCl]out 0,1 M, en utilisant les équations 4 et 5 (p.6)

Comparer ces valeurs avec les valeurs de voltage membranaire mesurées (obtenues après

soustraction des valeurs Eoffset) et expliquer les différences constatées.

Calculer le coefficient de sélectivité PK/PCl d’après la formule suivante, dérivée de

l’équation de GHK lorsque [NaCl]in= [NaCl]ext = 0 mM

où Vm = Vmesurée - Eoffset

Commenter la sélectivité K+ versus Cl

- des membranes traitées.

4) Calculer, pour les 2 membranes traitées, le coefficient de sélectivité PK/PNa pour la

condition [KCl]in 1M / [NaCl]ext 1M, en utilisant l’équation de GHK simplifiée ([Cl-]int =

[Cl-]ext càd ICl = 0) (équation 6, p.7) :

selon les conditions expérimentales, [NaCl]in= [KCl]ext = 0 mM, et l'équation est encore

simplifiée:

et comme [KCl]in= [NaCl]ext = 1 M, on obtient finalement la relation suivante:

où Vm = Vmesurée - Eoffset

Commenter la sélectivité K+ versus Na

+ de la membrane traitée.

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