La fermentation en milieu solide : intérêt pour la...

CONFIDENTIEL

Journées Condorcet 2017 (8 et 9 juin) Loïc LEVAVASSEUR, Directeur R&D, centre de recherche et innovation Soufflet – Ets J. Soufflet Biotechnologies

08/06/2017

La fermentation en milieu solide : intérêt pour la production de complexes enzymatiques performants en alimentation animale et dans la transformation des fruits

SOMMAIRE Qui est Soufflet Biotechnologies ? Valorisation des agro-ressources par Fermentation en milieu solide Criblage et Scale-up pour l’amélioration d’une pectine méthyl estérase impliquée dans la transformation des fruits

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SOUFFLET BIOTECHNOLOGIES

v Division du Groupe Soufflet, groupe agroalimentaire expert des filières céréalières

v Production, commercialisation d’enzymes et de levains v Production d’enzymes par fermentation en milieu solide v Microorganismes non-OGM v Enzymes de haute performance et fiables

v Chiffre d’affaires 17 M€ / Effectif 140 personnes

v 2 sites industriels en France + 1 centre de R&D

Journées Condorcet – 8&9/6/17

CONFIDENTIEL 3 20/06/17

DES AGRO RESSOURCES AUX BIOCARBURANTS, BIOPRODUITS

u  non alimentaire / comestible •  lignocellulosique

•  luserne, phalaris, miscanthus •  Oléagineuse

•  colza, tournesol, jatropha

u  Agro-ressources / Co-produits agroindustriels

•  Céréalières, oléagineuses, fruits, légumes


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STRUCTURES BIOCHIMIQUES COMPLEXES ET VARIÉES

Valorisation enzymatique de la biomasse nécessite l’utilisation de complexes spécifiques



Schematic presentation of (A) parenchyma tissue and (B) type I plant cell wall Van Buggenhout et al. 2009

v 

Catégorie générale

Classification structurale

Lamelle moyenne

Paroi primaire

Paroi secondaire

Cellulose β-(1,4) glucane + +Galacturonane et

Rhamnogalacturonane

Arabinanes + +Galactanes et

Arabinogalactanes

Xyloglucanes +Arabinoxylanes + +

Xylanes +Glucomannanes +

Galactoglucomannanes

Glycoprotéines + +Lignine + + +

Pectines

Hémicelluloses

+ +

+ +

VALORISATION DES AGRO RESSOURCES PAR FERMENTATION EN MILIEU SOLIDE (AVANTAGES / INCONVÉNIENTS)

u Production de concentrés enzymatiques variés •  Induction •  conditions de cultures.

u Valorisation de la biomasse en tant que substrat. u Particulièrement adapté aux moisissures :

•  Nécessite des souches adaptées (sporulation, croissance, sélection).

•  Souches non OGM, GRAS •  Bactéries /levures

u Maitrise et savoir-faire du procédé : •  économe en eau et en énergie. •  Conditions non stériles, pas de régulation de pH •  Physiologie des souches peu connues, Modélisation,

maitrise transfert de masse, de chaleur •  Maitrise du scale-up



« 3S » Enzymes /

Bicoatalyseurs

SOUCHE

SUBSTRAT SYSTEME

EXEMPLE D’APPLICATION : ENZYMES ALIMENTAIRES DANS L’INDUSTRIE DES FRUITS


7

EXTRACTION / PURIFICATION

AMELIORATION DE SOUCHE

FERMENTATION EN MILIEU SOLIDE FORMULATION

u  Enrichir un cocktail enzymatique en Pectine Méthyl Estérase (PE) (coût de revient) •  Productivité améliorée d’un facteur 1,5 de la souche (mutagénèse aléatoire) •  Optimisation du procédé de FMS et scale-up

20/06/17 CONFIDENTIEL

AJOUT DE PECTINASES DANS LES JUS FRUITS / LÉGUMES

u Avant l’extraction •  Augmenter les rendements d’extraction •  Meilleure capacité de pressage •  Meilleure extraction de couleur

u  Avant la clarification •  Clarification plus rapide et plus

efficace •  Turbidité réduite, débit de filtration

amélioré favorisant l’étape de concentration

•  Réduction du trouble au stockage


8 Sources : Toushik et al. 2017 ; AIJN 20/06/17 CONFIDENTIEL

v Molécule complexe •  polysaccharide, principalement d’acides galacturoniques •  Plusieurs domaines (HG, RGI, RGII…), régions lisses vs.

Hérissées •  Composition variable des HG et RGI

v Enzymes principales de dégradation des HG

STRUCTURE DES PECTINES ET ENZYMES DE DÉGRADATION Journées Condorcet – 8&9/6/17

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Schematic presentation of the conventional structures of pectin Pedrolli et al. 2009

Structure of galacturonic acid

CONFIDENTIEL

CRIBLAGE AUTOMATISÉ (PICKING ET DOSAGE) Journées Condorcet – 8&9/6/17

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11000 mutants

3 candidats

u  Résultats préliminaires avant criblage de 11000 mutants •  Choix traitement (chimique + UV) •  Mise au point conditions culture en microplaques

•  Milieu favorisant faible sporulation, efficacité du picking •  Milieu d’induction (détection sensible, reproductibilité) •  Durée de culture en microplaque

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1. SÉLECTION D’HYPERPRODUCTEURS EN PLAQUES

u  Bonne reproductibilité témoin •  Coef. de variation intra-run : 22 %



u  Sélection de 70 candidats •  Ratio de 1,2 à 2 •  homogène selon les « runs » •  Coin : 17% / Ext. : 50% / Int. : 33%

2. CONFIRMATIONS EN FIOLE FMS

u  Le candidat 2 est le plus pertinent •  3 candidats retenus (1, 2 et 6) : PE > 50 % par rapport au témoin •  différences sur l’activité PE entre 3 et 4 jours de FMS •  Forte induction des PL et des PG pour le candidat 2 (et 6) •  Candidat 2 : meilleure stabilité de la souche •  Candidat 6 présente un morphotype différent


CONFIDENTIEL 12

-40

-20

0

20

40

60

80

Candidat1 Candidat2 Candidat3 Candidat4 Candidat5 Candidat6

72h 96h

Pour

cent

age

d’ac

tivité

PE

par r

appo

rt a

u té

moi

n

56% 54% 51%

-40

-20

0

20

40

60

80

Candidat1 Candidat2 Candidat3 Candidat4 Candidat5 Candidat6

PectinLyase Polygalacturonase

Pour

cent

age

d’ac

tivité

PE

par r

appo

rt a

u té

moi

n 20/06/17

3. SCALE UP FMS – FIOLE (10 GMS) u  Procédé de FMS à l’échelle labo

(modèle fiole) v  Validation de l’inoculum liquide v  Optimisation du milieu

v  substrats et [N] solubles, protéines végétales, extraits de levures

v  pH initial et Humidité initiale v  Etude de paramètres FMS et

optimisation en fermenteur


Impact* Productivité FMS (PE)

Milieu 1 -7% // -2% à 3j

Milieu 2 -5% // +2% à 3j

Milieu 3 +8% // +22% à 3j

*impact mesuré par comparaison au candidat 2 sur milieu « témoin »

Agitation

mécanique (rétractable)

Qair out, (H.Rout), Tout(CO2 out), (O2 out)

Qair in, H.Rin, Tin(CO2 in), (O2 in)

Milieu de FMS

Tmilieu

Masse

ΔP

VitesseCycle brumisation

Thermorégulation de la double-enveloppe

Teau in

Teau out

Air saturé en vapeur d’eau

Veau ajoutéeTeau

Eau condensée (Volume évacué)

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3. SCALE UP FMS – FERMENTEUR (10 KGMS) u Maintien des performances en fermenteur

•  Productivité enzymatique similaire pour les 3 milieux (CV < 10 %) à iso-azote, légèrement supérieur au milieu témoin (non présenté) 9000 PE

•  À 4 jours : perte d’activité observée

u  Points d’attention : •  Risque de contamination (pH élevé dès 60-66h) •  Impact différents des milieux sur l’extraction à l’échelle laboratoire

•  Extraction par décantation •  Séparation solide / liquide : meilleure filtrabilité du surnageant milieu 2 •  Filtration MF : Colmatage Milieu 1 •  Filtration UF : Milieu 3 : flux de filtration faible.

u Prochaines étapes / validation du scale-up industriel : •  Approvisionnement pérennes des matières premières •  Inoculum mycélien échelle fermenteur de production •  « Down Stream Process » : réglage des paramètres à l’échelle pilote •  Validation des prototypes par les tests applicatifs (performance et

stabilité).



3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80

milieu1

milieu2

milieu3

pH

Durée de FMS (h)

PE

3

2003

4003

6003

8003

10003

12003

0 10 20 30 40 50 60 70 80

milieu1

milieu2

milieu3

IMPACT DES PECTINASES SUR L’EXTRACTION DE JUS DE POMME

v Rendement en jus amélioré de 10% à > 20% vs. témoin sans enzyme

v Durée de pressage réduite (capacité de presage améliorée)


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Rendement de jus après pressage No enzyme + Pectinase

Fruits frais (pommes) 80-82% 90-92%

Fruits congelés 70-74% 85-90%

volume de jus

marc après pressage

Data and pictures from lab experiments at Soufflet Biotechnologies

Enzymation with pectinases

Microscopic vue after crushing

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STRUCTURE ET PROPRIÉTÉ DES PECTINES Journées Condorcet – 8&9/6/17

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v  Propriétés gélifiantes des pectines à Faible degré de methylation associée à la présence de calcium => formation de gel (egg box model)

--

Sources : Unisciel, Univ Pierre et Marie Curie 20/06/17 CONFIDENTIEL

APPLICATION DES PECTINES METHYLESTERASE EN FRUIT FIRMING

v Raffermissement des structures de fraises

v Alternative à l’alginate de calcium


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Strawberry tissues without (A) or with PME/Ca2+ treatment (B) Van Buggenhout et al. 2009

0 20 40 60 90 120

Increase in firmness with incubation time of PME (in min, enzyme dosage 1,5 kg/T)

Pictures from lab experiments at Soufflet Biotechnologies 20/06/17 CONFIDENTIEL

SOUFFLET A DÉVELOPPÉ UN SAVOIR FAIRE Journées Condorcet – 8&9/6/17


Stratégie de criblage • Mutagénèse

• 11000 mutants • PE x 1,5

Scale-up fiole à fermenteur Validation de l’inoculum Maintien des productivités de la fiole au fermenteur Recommandation sur les milieux, les paramètres de la fermentation Importance d’intégrer les contraintes industrielles dès les premières étapes du changement d’échelle Inoculum, FMS, DSP, tests applicatifs

mg g kg t

PERSPECTIVES

u  Stratégie de criblage / Améliorations des souches : •  Évolution dirigée / Technologies OGM et non OGM •  Critères de sélection « globaux » (et non plus uniquement enzymatiques) •  Caractérisation des souches (génomiques, transcriptomiques, protéomiques) •  Caractérisation des substrats


u Procédé de Fermentation en milieu solide et Extraction

•  Modélisation de fermenteur de 10 kg au fermenteur d’1 t

new ENzymes for Juice Optimal Yield

Merci de votre attention

Œnologie

Transformation des Fruits

Panification

Nutrition animale

Protéines végétales

Amélioration de procédés

Programmes de recherche et innovation de nouveaux produits enzymatiques pour des applications alimentaires

v à haute technicité v adaptés aux nouveaux procédés et aux exigences de qualité des produits v répondant aux problématiques de nos clients

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