La culture de cellules animales,quosse ça donne?

Alain Garnier, Université Laval

Plan

• La culture de cellules animales:

– Qu’est-ce?– Pourquoi?– Comment?

Qu’est-ce?

• Différentes sources

• Différents types

• techniques de transformation

• Caractéristiques générales

Sources

• Insectes

• Poissons

• Mammifères

• Humains

Formes/tissus

• Épithéliales/endothéliales (membranes)

• Fibroblastes (tissus connectifs)

• Myoblastes (muscles)

• Neurones (syst. nerveux)

• Hepatocytes (foie)

• Erythrocytes (sang)

• Lymphocytes (syst. immunitaire)

Formes...

Types

• Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC).

• Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions).

• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.

Transformations

• Naturelles

• Chimiques

• Virales

• Dirigées

Différentes lignées• MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains,

adhérentes, vaccins

• HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche

• CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile

• Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile

• Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression baculovirus

• 293: embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S)

Exemple: l’historique de la mise en culture des 293

Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977

Caractéristiques générales

• Capable d’exocytose• Ne sécrète pas d’enzymes• Modifications post-traductionnelles• Introns/épissage (splicing) • Besoins nutritionnels complexes• Grande taille (10-20 m), pas de paroi• Sensible au contraintes hydrodynamiques • Temps de division lent (approx. 1 jour)• Densité cellulaire faible

Modification post-traductionnelle

• Clivage

• Pont S

• méthylation, phosphorylation, glycosylation

• conformation

• ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)

Glycosylation

Introns/Exons, Epissage (splicing)

Pourquoi?

• Pour l’étude

• Pour la production:– Vaccins– Protéines thérapeutiques

• anticorps• agents immunologiques• Hormones

– Tissus– Vecteurs viraux– Cellules souches

34% des nouveaux médicaments sont produits en culture de cellules de mammifères

34%

21% 22%

12% 12%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

%

Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapiegénique

% de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)

Les anticorps

Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de l’anticorps pour son antigène

Production d’anticorps monoclonaux

MAb

Anticorps monoclonaux - applications

• 37% des nouvelles molécules thérapeutiques biologiques

• Identification/diagnostic• Thérapeutique:

– Contre cancer, Crohn, Asthme, SIDA, etc.– Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent

bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher une réponse immunitaire.

– Ils peuvent aussi être liés à un agent chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet.

Autres protéines• Erythropoïétine (EPO, traitement de l’anémie)

• Hormones de croissance: – Transforming Growth Factor (TGF)– Epidermal Growth Factor (EGF)– Nerve Growth Factor (NGF)

• Anovulants

• Cytokines (Interleukine, interféron, etc)

• Agents coagulants (Facteur viii), anti-coagulants, etc

Interleukin 4

Exemple: Agent anti-angiogénétique (Laboratoires Aeterna)

Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des cellules animales.

Influenza

Herpes Adenovirus

Production de vaccins

Thérapie génique

Maladies traitées

Vecteurs utilisés

AdénovirusRétrovirus

La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.

Culture de tissus

• Cellules de peau (Hopital du Saint-Sacrement, Laboratoire d'organogénèse expérimentale)

• Reconstruction de la moëlle épinière (Organogel inc.)

• Organes (foie, cœur, cerveau, etc)

• Cellules souches

Comment?

Caractéristiques générales– Capable d’exocytose

– Ne sécrète pas d’enzymes

– Modifications post-traductionnelles

– Introns/épissage (splicing)

– Besoins nutritionnels complexes

– Grande taille (10-20 m), pas de paroi

– Sensible au contraintes hydrodynamiques

– Temps de division lent (approx. 1 jour)

– Densité cellulaire faible

Exemple de milieu de culture: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)

• Sels (mg/L)– CaCl2 200.00

– Fe(NO3)3.9H2O 0.10

– KCl 400.00

– MgSO4 97.67

– NaCl 6400.00

– NaHCO3 3700.00

– NaH2PO4.H2O 125.00

• Acides aminés (mg/L)– Arginine 84.00– Cystine.2HCl 63.00– Glutamine 584.00– Glycine 30.00– Histidine 42.00– Isoleucine 105.00– Leucine 105.00– Lysine.HCl 146.00– Méthionine 30.00– Phenylalanine 66.00

– Sérine 42.00

• + mélange d'additifs non-définis

– Méthionine 30.00

– Phenylalanine 66.00

– Serine 42.00

– Thréonine 95.00

– Tryptophane 16.00

– Tyrosine.2Na.2H2O 104.00

– Valine 94.00

• Vitamines (mg/L)– Ca.pantothénate 4.00

– Chlorure de choline 4.00

– Acide folique 4.00

– Inositol 7.20

– Niacinamide 4.00

– Riboflavine 0.40

– Thiamine.HCl 4.00

– Pyridoxine.HCl 4.00

• Autres (mg/L)– Glucose 4500.00

– Rouge de phénol 15.00

– Na.Pyruvate 110.00

Sensibilité aux contraintes hydrodynamiques

= problème d’oxygénation ou d’agitation

•Pourtant les besoins en O2 des cellules animales ne sont pas si élevés

X (densitécellulaire)

QO2 (taux derespirationspécifique)

Oxygenrespiration rate(OUR, mM/L)

Bactéries 5-50 gMS/L 0.01mole/(gMS.h)

50-500

Cellulesanimales

1-50 E6cells/mL

10-20 E-14mole/(cell.h)

0.1-10

Les cellules animales ne supportent que de très petites contraintes hydrodynamiques, ce qui fait en sorte que toutes sorte d’indice de sévérité de l’agitation on été proposés:

ISFD

D D

i

T i

D PE s( / ) / 3 1 4

U PE s ( ) / 1 4

Integrated Shear Factor (Sinskey)

Taille du plus petit tourbillon (Théorie de Kolmogoroff)

Vitesse du plus petit tourbillon

TCS: Turbulent collision severity (Cherry et Papoutsakis)

ICS: Impeller collision severity

C K PE s ( ) /

3 3 4Concentration en plus petit tourbillon

Plusieurs géométries de bioréacteurs ont été proposées:

• différentes formes d’agitateur

– marine

– ruban hélicoïdal

– «voiles»

• gazosyphon

• lits fluidisés

• transfert de gaz par tube de silicone

• enrichissement en oxygène

Agitateur «voiles» Lit fluidisé

Division lente, faible densité

• Facilement contaminable– une bactérie prendra facilement le dessus– Nécessite des conditions d'asepsie très strictes

• Faible rendement en produit– produit à haute valeur ajoutée– produit qui ne peut être synthétisé dans d’autres

systèmes d ’expression– Recherche de moyens pour augmenter la densité

cellulaire...

Au niveau cellulaire: le mécanisme de débordement

-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)

GLUCOSE PYRUVATE

TCA cycle,resp. chain

lactate

glucose pyruvate

GLUTAMINE

GLUTAMATE

OU

glutamine

NH3

NH3

glutamate

Au niveau du procédé• L’optimisation du milieu prend du temps, mais permet

de faire de grandes économies• La cuvée alimentée peut permettre d’augmenter la

densité cellulaire dans le cas d’un substrat inhibiteur ou d’un produit inhibiteur dont la production dépend de la concentration en substrat.

• Le chemostat ou la perfusion vont permettre une augmentation de la densité cellulaire et de la productivité, mais avec un coût plus élevé en milieu de culture

Au niveau du bioréacteur

– Microporteurs (poreux ou non)– Micro-capsules– Fibres creuses– Rétention des cellules (perfusion):

• Spin-filters (intra ou extra bioréacteur)

• centrifugeuse en continu

• Sonosep

Microporteurs

Exemple: Un filtre rotatif intra- bioréacteur, combiné à un aérateur

Fibres creuses

Centrifugeuse en continu

Sonosep: séparation acoustique

Entrée

Sortie

Vidange

Conclusion

• La culture de cellules animales est coûteuse et complexe.

• Elle ne doit être utilisée que pour produire des molécules qui ne peuvent être obtenues autrement.

• Elle permet alors de synthétiser des produits à très haute valeur ajoutée