La collecte des données.

Pr Eric Chabriere

Une fois les cristaux obtenus, il faut les faire diffracter.

La diffraction d'un cristal (réseau 3D) est un réseau 3D.

Le but de l'enregistrement est de mesurer l'intensité et le bruit de chaque taches qui correspond à chaque nœud du réseau (Ihkl)

RX

180 images

Rappel

Ihkl=|Fhkl|2

|Fhkl|+hkl

TF-1

Transformée de Fourier

Cartes de densité électronique

Par conséquent, si on veut de belle cartes, il faut avoir le jeux de données le plus complet

(+ résolution+ bien mesurée)

Modules des facteurs de structures

Phases calculées(remplacement moléculaire, MIR, MAD,…)

Le "radiation damage"

On doit collecter un certain nombre d'images. Problème: Le cristal va subir des dommages a cause de rayons X.

Dégâts primaires: des électrons sont éjecté de leurs orbites par les rayons X.Coupure liaison, formation de radicaux. Indépendant de la température.Dépendant du flux de rayons X.

Dégâts secondaires: Les radicaux vont réagir. Coupure de liaison….Dépendant de : Température, solvant, présence des ‘scavengers’, mobilité et réactivité des radicaux

Dégâts tertiaires: Auto-effondrement du réseau cristallin (perte de diffraction)Dépendant de la stabilité du réseau (nombre et sorte des interactions cristallins)

Les acides aminées les plus sensibles

Les acides aminés contenant du souffre ou un groupe carboxylique (cys, met, asp, glu) sont les plus sensibles aux rayons X

Les rayons X détruisent le cristal

Durée de vie d'un cryo cristalAnode tournante => 5 ansSynchrotron (1990) => 24 heuresSynchrotron (2000) => 1 jeux de données

Optimiser la collecte pour diminuer la dose, viser un autre endroit du cristal (microfocus)Rajouter des antioxydants.

Solution. Cryodiffraction.

Montages des cristaux

2 techniques principales:

-capillaire (température ambiante)

-boucle de nylon (température cryogénique)

Montage en capillaire

Solution mère, pour que l'eau du cristal ne s'évapore pas

Peu utilisé, sauf en cas de problème avec la cryogénieRadiation damage très important

Montage sur une boucle de nylon

On pêche le crystal avec une boucle de taille adaptée

Le cristal est sous un flux d'azote 100K

Problèmes avec la cryogénie.

Il faut éviter la formation de glace.

-Le cristal protéine peu se détruire (le volume de la glace augmente).

-La glace cristalline diffuse

Anneaux de diffusion(diffraction de poudre)

Flash cooling et solution cryo-protectante

But vitrifier rapidement le solvant de la boucle en la trempant dans l'azote liquide 80K.

Si le refroidissement est suffisamment rapide, l'eau est vitrifiée (amorphe).

Pour favoriser le processus on ajoute un ajout un cryoprotectant (glycérol, sucrose, PEG, ..)Ces produits perturbent le réseau de liaisons hydrogène de l'eau.

Comment tester le cryoprotectant.

Version lourde.Solution mère + cryo (20-30%), boucle, flash cooling test de diffusionSi il n'a y pas d'anneau de diffusion OK

Version lightSolution mère + cryo (20-30%), petit cône pipette, flash cooling.

Si transparent (vitreux) OKSI blanc, la solution n'est pas cryogénique

Les cristaux congeler sont stockés dans l'azote liquide.Réservoir pouvant rester froid pendant plus de 6 mois.

Pour transporter on utilise un Dewar sec (sans azote liquide)Ils sont très performant et peuvent conserver le froid pendant plus d'un mois

On peut les stocker "indéfiniment" même si on a piégé un état intermédiaire

Le cristal n'ai jamais décongelé

Montage sur le diffractomètre

manuel

Automatique synchrotron(gain de temps)

Alignement du cristal sur le diffractomètre

Sphère de confusionPoint ou se coupent tous les axes du diffractomètre

Le point de confusion est représenté sur la lunette ou l'écran de réglage.On aligne le cristal. On fait tourné l'axe de 90°On réaligne.

Si tout est bien réglé, il y une zone immobile du cristal qui ne bouge pas lors des rotations. Elle coïncide avec le faisceau de rayons X.Le cristal reste aligné pendant la collecte

Tête goniométre

La taille du faisceau de rayons X.

En général la taille du faisceau est d'environ 300m

Sur certaine ligne, le faisceau peu être beaucoup plus fin (microfocus). Utile pour les petit cristaux

On peut choisir la zone à étudier

On peut visualiser la forme du faisceau superposé à l'image de l'objet à diffracter grâce à une camera situé dans l'axe du faisceau et un écran de phosphore

Le flux très intense dégrade les cristaux

Loi de Friedel

(Sans diffuseur anomaux)

lkhhkl

hklhkllkhlkhlkhhklhklhkl

hkl

N

j

lzkyhxilkh

N

j

lzkyhxihkl

II

FFFFIFFI

FeF

eF

jjj

jjj

.. .

f

f

1

)(2j

1

)(2j

C'est la loi de Friedel

Le réseau réciproque possède un centre de symétrie

Symétrie du réseau réciproque

N

j

lzkyhxihkl

jjjeF1

)(2jf

Ex P2: positions équivalentes (x,y,z);(-x,y,-z)

)(f

)(f

)(2

1

)(2j

)(2

1

)(2j

jjjjjj

jjjjjj

lzkyhxiN

j

lzkyhxilhk

lzkyhxiN

j

lzkyhxihkl

eeF

eeF

lhkhkl FF

On a la symétrie d'ordre 2 dans le réseau réciproque

Le réseau réciproque possède la symétrie du groupe ponctuel

(symétries sans translation)

Le réseau réciproque (sans diffuseur anomaux) possède un centre de symétrie et

la symétrie du groupe ponctuel (général).

Ceci donne la symétrie de Patterson

extinctions

Les operateurs de translation peuvent crée des extinctions systématiques

Ex C. positions équivalentes (x,y,z);(x+1/2,y,z+1/2)

))1()1((f

)(f

)(2

1

)(2j

1

))2

1()

2

1((2)(2

j

jjjjjj

jjjjjj

lzkyhxilhN

j

lzkyhxi

N

j

zlkyxhilzkyhxi

hkl

ee

eeF

Si h+l impair extinction

P21 :positions équivalentes (x,y,z);(-x,y+1/2,-z)

))1((f

)(f

)(2

1

)(2j

))2

1((2

1

)(2j

jjjjjj

jjjjjj

lzkyhxikN

j

lzkyhxi

lzykhxiN

j

lzkyhxihkl

ee

eeF

Il y a extinction pour les réflexions 0,k,0 K impair.Extinction sur l'axe b

Indiquée dans les tables

Ces extinctions caractérisent les éléments de translations

La collecte des données

2dh,kl,l sin=

Plus la maille est grande (d), plus les taches de diffraction seront resserréesPlus est grand, plus les taches de diffraction seront espacées

Pour améliorer la résolution (augmenter au bord du détecteur, on approche le détecteur. On peut aussi décaler le détecteur (attention à la complétude)(éventuellement on diminue la longueur d'onde).

En général, avec une petite longueur d'onde (1Å), la zone aveugle est faible. Une rotation de 180° selon suffis pour avoir un jeux complet (180 images si oscillation de 1°). (faire TD nombre de réflexion, résolution max), différente maille

180 images

mesure

bruitBeam stop

Support du beam stop

Anneau de diffusion(boucle, solvant,…)

Le signal ?

Suite à une mesure, on peut obtenir de l’information.

Obtenir la meilleure information à partir de ces mesures, c’est le traitement du signal.

Mesure seule: longueur, potentiel, intensité …..

La mesure peut dépendre d’un autre paramètre :Potentiel en fonction du temps, vitesse de réaction en fonction de la concentration ….Absorption lumineuse en fonction la longueur d’onde.

Parfois, c’est la variation de la mesure qui est le paramètre intéressant.Fréquence, longueur d’onde … RMN, Spectroscopie infrarouge … Comment mesurer la fréquence d’un signal périodique ?

Notion de signal

Dans chaque mesure, il y a des erreurs ou des mesures non désirées : le bruit.Comment déterminer la pertinence d’un signal?Il faut que la mesure sorte du bruit.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 10 20 30 40 50 60

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 10 20 30 40 50 60

Bien que la mesure soit plus faible dans le deuxième cas, le signal est plus pertinent

Moyenne, écart type

Plus une mesure se détache de la valeur moyenne du bruit, plus elle est significative.

La moyenne : xN

xN

i

i

1

221

2

2)(

xxN

xxN

i

i

Variance :

Moyenne des carrés moins le carré des moyennes

L’écart type, montre la dispersion des données

Ecart type : 2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 10 20 30 40 50 60

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 10 20 30 40 50 60

Moyenne: 0.45Ecart type : 0.29

Moyenne: 0.05Ecart type : 0.03

Le signal:2.3-0.45=1.85=6.4

Le signal:1-0.05=0.95=31.7

Le signal devient pertinent au dessus de 2-3

Attention il faut enlever "le signal" du bruit. pour le calcul de la moyenne et de l ’écart type.

C’est un processus itératif

Signal/bruit

signal

La Gaussienne

Très souvent une distribution (histogramme) a la forme d’une Gaussienne.

C’est un phénomène statistique (théorème centrale des limites)Car la mesure fluctue autour d’une moyenne avec un certain écart type à cause d’erreurs de mesures ou à cause de la dispersion naturelle de l’échantillon

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

-6 -4 -2 0 2 4 6

2

2

2

2

1)(

x

exf

Exemple classique : mesure de la radioactivité

La fonction de Gauss:2

2

2

)(

2

1)(

xx

exf

Sert à normaliser la fonction définit la largeur de la fonction

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

-6 -4 -2 0 2 4 6

2

1max y

Largeur à mi-hauteur2ln22

C’est une fonction très répandue, C’est la distribution naturelle en statistique.

Si je me déplace dans une dans une direction quelconque d’une distance l:Au bout de N pas je me serai éloigné d ’une distance (ref tintin au pays de l’or noir) L= lN

Généralité.Si je répète N fois une mesure de moyenne m et d’écart type J’aurai comme résultat:

Conclusion.Je ramène le résultat à une mesure moyenne

N

mN

NmRm

1 1

;

NN

L’erreur

En toute rigueur. Pour 1 mesure, il n’y a pas d’écart type

En accumulant N mesures on fait baisser l’erreur ( ou le bruit) d’un facteur N

NmNR .

lN

Accumulation de mesure.

Moyennation

Initial

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 10 20 30 40 50 60

Bruit:Moyenne: 0.45Ecart type : 0.29

Le signal:2.3-0.45=1.85=6.4b

R= 1.85±b

16 mesures

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 10 20 30 40 50 60

Série1

Bruit:Moyenne: 0.45Ecart type b: 0.29/4=0.072

Le signal: S ± n

2.3-0.45=1.85=6.4x4 b=25 b

Final

l’erreur =

R=1.85 ± (+b)

16

n

Amélioration du signal en détection et en précisionEvolue en racine du nombre de mesures

Dispersion et erreur systématiques

On a la même dispersion

Le traitement statistique améliore la précision du résultat mais ne permet pas de détecter une erreur systématique.

Les erreurs aléatoires sont réduites par la répétions de la mesure

Les erreurs systématiques sont mises en évidence en changeant les conditions expérimentales

aléatoiresystématique

Sélections d'un cristal

-On fait un cliché.

-On regarde la résolution maximale.

-Les tâches doivent être fines et uniques

Optimisation de la collecte

-Si il y a des tâches au bord du détecteur, on rapproche ou on décale le détecteur. Plus on est éloigné du détecteur moins il a aura de bruit et plus les taches seront séparées). Néanmoins, la résolution est cruciale

- Si on a une grande maille, et que les tâches se chevauchent, on diminue l'oscillation

-On allonge le temps d'exposition pour essayer d'augmenter la résolution. (compromis entre résolution et radiation dommage).

-On regarde la saturation.

Il faut profiter au maximum de la dynamique du détecteur sans saturer

Si il y a taches surexposées on diminue le temps d'exposition ou on attenue le faisceau

Si les taches surexposées sont à basse résolution on fera une autre collecte pour la basse résolution avec moins d'exposition ou avec un faisceau atténué

Le traitement des données

Informations nécessaires

-géométrie du diffractomètre

-type de détecteur

- centre du détecteurs

-oscillation (en générale 1°)

-longueur d'onde

-distance du détecteurs

-Correction spatiale du détecteur (les détecteurs sont souvent plats)

(projection d'une grille)

-détermination du bruit et des zones actives du détecteur (beam stop, ombres …)

détecteur (dark current) et diffusion des rayons X

-paramètres de la maille et orientation du cristal

-Mesure des intensités

-Corrections des intensités

paramètres de la maille et orientation du cristal

On collecte sur une (ou plusieurs images) les taches les plus intenses.On les positionne sur la sphère d'Ewald. On a leurs postions dans l'espace réciproque.On regarde les vecteurs qui relient ces points de l'espace réciproque. Les plus petit paramètres correspondent à la maille primitive.

En fonction de la géométrie de la maille on peut faire des suppositions sur le groupe d'espace.On peut calculer une pénalité qui tient compte de la déformation de la maille pour satisfaire la contrainte géométrique du groupe d'espace

On choisit normalement le groupe d'espace avec la plus grande géométrie et une pénalité satisfaisante.

Attention, la géométrie de la maille n'est pas suffisante pour déterminer le groupe ponctuelle, il faut aussi que les tâches de diffraction obéissent aux

symétries

Mesure des intensités

Chaque image doit être mise à l'échelle. Le rayonnement du synchrotron baisse au cours du tempsle volume du cristal baignant dans le faisceau n'est pas constant.

On détermine un profil type à partir des taches les plus intenses (signal, bruit)Il y a 9 profils différents pour couvrir le détecteur.

Ce sont des profils 3D (sur plusieurs images) car une tache peut diffracter sur plusieurs images

La taille du profil est déterminé par la divergence du faisceau et par la mosaicité du cristal (tache sur plusieurs images)

Le profil permet de mesurer l'intensité et le bruit (efficaces sur les faibles réflexions)

Divergence du faisceau

Mosaicité du cristal

Corrections

Correction de polarisationLa contribution n'est pas la même selon l'angle d'incidence

p

Des corrections sont appliquées aux intensités mesurées

Correction cinématique de LorentzLes nœuds du réseau réciproque ne traversent pas la sphère d'Ewald à la même vitesse

Autres correctionsAbsorption (affiné en comparant les réflexions équivalentes)

Eliminations des "misfit" Réflexion qui diverge trop de la moyenne des réflexions équivalentes

Combinaison de plusieurs jeux de données

A partir d'un cristal on peut avoir plusieurs jeux de données (basse résolution, autre orientation, autre zone)

Il faut mettre à l'échelle et combiner ces différents jeux de données.

Attention il faut éviter de combiner les jeux de données provenant de plusieurs cristaux provenant de cristaux différent (problème

d'isomorphisme)

Statistiques finales

Donne la dispersion des taches équivalentes par symétrieAttention si il y a de la diffusion anomale, la loi de Friedel est brisée

h i

ihh

ihh IIIRsym ,, /ˆ

Le plus faible possible

La complétude. Le jeux doit être complet

I/ donne le rapport signal sur bruit. (baisse avec la résolution)

La redondance: Nb-obs/Nb-unique. La redondance améliore la qualité des données. redondance

A la fin

On a un fichier avec pour chaque indice HKL-une intensité ou une amplitude-une erreur

H K L F sigFI sigI

Le facteur Rsym permet de vérifier que le réseau réciproque possède la symétrie ponctuelle (+ centre d'inversion si il n'y a pas de diffuseurs anomaux).Rsym faible à basse résolution (ou tâches intenses)

L'analyse des extinctions sur les axes permet de déterminer les axes hélicoïdaux.

confirmation du groupe d'espace

Réflexion sur la qualité d'un jeu

Un jeu à haute résolution aura:-un fort I/c (données précises)-un grand nombre de mesures (amélioration statistiques)- La haute résolution donne des cartes de densités plus fine

Un bonne redondance peut compenser des mauvaises donnée.

Ainsi, si il n'y pas de diffusion anomale (loi de Friedel centrosymétrique), on fait avec une collecte de 180°

-on est sur d'avoir un jeu complet même en P1- si le cristal a des symétries, on aura une bonne redondance

On fait une stratégie de collecte pour optimiser les symétries si -Le cristal est sensible aux radiation damage-pb de temps

exemple

Le Wilson plot

22j

222j

2

)2

(

j2

1

).(2)2

(

j

2)fln()(ln f)(

f)(

.f

2

2

2

SB

NsIeNsI

eNsF

eeF

SB

SB

N

j

rsiS

B

hkljhkl

hkl

La pente (B/2) nous indique l'agitation du cristal

Linéaire seulement à partir de 4Å

Ln(I)

S2

)fln( 2jN

Les macles

Parfois, le cristal est maclé: il y a plusieurs domaines avec des orientations différentes collés les un aux autres.L'image de la densité électronique est déformée si on ne fait pas attention

Ceci se détecte par l'analyse des moments des intensités

<I2>/<I>2 =2 normalement =1.5 si cristal maclé

Réseau bizarre, symétrie improbable ….