KERATINES LE MAINTIEN LA SOURIS Mémoire · immmofluorescence, microscopie 61ectmnique. colorations...

SOPHIE DUCLOS

ROLE DES KERATINES DANS LE MAINTIEN DE L'IIYTEGRITE TISSULAIRE KEPATIQUE CHEZ LA SOURIS

Mémoire présen té

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

Biologie cellulaire et moléculaire FACULTE DE MEiDECINE

UNIVERSITE LAVAL

Août 1997

O Sophie Duclos, 1997

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Ce travail a pour but de definir le r61e des filaments intermédiaires dans les cellules de i'épithélium simple non kémthké et fonction métabolique, en prenant comme m d I e les hépatocytes. L'approche expérimentale repose sur l'utilisation de souris transghiques déficientes en kératine 8 et les études portnit sur la caractérisation du phhotype hépatique =lit à cette mutation qui entraûie I'absence totale de filaments intermédiaires dans les hépatocytes. Les méthodes enipIoyées sont: immmofluorescence, microscopie 61ectmnique. colorations histologiques, analyses de type Western, hepatectomie partielle. isolement et culture primaire d'hépatocytes. Les résultats montrent que les h6patocytes des souris déficientes en kératine 8 sont très sensibles au stress induit par I'hépatectomie partiene et i'isolement des ceiIuIes. Des données préliminaires montrent aussi que I'absence de filaments interrn6diaires innuence I'expression et la distribution des autres éI6ments du cytosquelette. L'ensemble des résultats met en lumière un rôle pour les khtines dans le maintien de l'int6grité tissulaire hépatique.

Sophie Duclos, B.Sc.

Normand Marceau, Ph.D.

REMERCIEMENTS

Je tiens tout d'abord 2 remercier mon directeur de thèse, Dr. Nomiand Marceau, pour ses conseils et ses encouragements tout au long de œ travail.

Je veux egaiement remercier mes compagnons de travail: Andde Grenier, Donald Mailhot, Qaude

Chamberland et Nadine Valois, autant pour leur collaboration au point de vue scientifique que pour leur bonne humeur qui ont permis la réalisation de œ iravail dans une atmosphère agréable. Je remercie Dr. Anne Loranger pour m'avoir initiée au travail avec les animaux. ainsi que Dr. Mutsumi Satoh qui m'a montré sa technique de perfusion.

Merci à tous les membres du Centre de recherche, ainsi qu'aux photographes de L'Hôtel-Dieu de Québec, Guy Langlois et Pierre Paquin, qui ont facilité la réaiisation de ce travail.

Enfui, je voudrais remercier spécialement ma famille et mes amis qui, par leur soutien constant, m'ont grandement aidée pendant tout mon cheminement à la miu"trise.

TABLE DES MATIERES

......................................................................................... INTRODUCTION -2

.................... .............................. 1 . FILAMENTS INTERMEDIAIRES ..... .... ..... 2

................. 1.1 Structure. assemblage et expression différentielle des protéines de FIS -3

1.2 Fonctions des FIS .......................... .............. .................................. 8 1.2.1 Fis de type III ........................................................................... 8

1.2.2 FIS de type IV ........................................................................... 10 ................................................. 1.2.2.1 Neurofdamen et a - m e 10

1.2.3 FIS de type V ............................................................................ 10 1.2.3.1 Lamines .............................................................................. 10

1.2.4 FIS de type VI ..................... .... ........................................... 11 ........................................................................... 1 . 2.4. 1 Filensine 11

1.2.4.2 Phakinine .......... ... ......................................................... 11

1.2.5 FIS de type I et II ........................... ... ................................... i l .............................................. ....................... 1.2.5.1 Kératines ... 1 1

.................... 1.3 Interactions des kératines avec d'autres constituants intracellulaires 14

................... 1 A Interactions des kératines avec les autres 6léments du cytosquelette 16

............................. 1.5 Implication des kératines dans divers processus cellulaires 16

...... 1.6 Modifications pst-traductionnelles: implication dans la fonction des khtines 17

..................................... 2 . SOURIS TRANSGENIQUES DERCIENTES EN K8 18

....................... 2.1 Phhotype obtenu dans les cellules souches embryonnaires (ES) 19

2.2 Phénotypes obtenus chez les souris de souche C57BU6 ..................... ...... 19

.................................. 2.3 Phhotypes obtenus chez les souris de souche FVBN 21

3 . METHODES SE RAPPORTANT A L'ANALYSE DU PHENOTYPE HEPATIQUE . . 22

...................................................... 3.1 Repense à une hépatectomie partieue 22

........................................... 3.2 Perfbsion du foie et isolement des hépatocytes 22

............................................................ 3.3 Mise en culture des hépatocytes 23

..................................................................... 4 . AFERÇU DES TRAVAUX 24

MATERIELF;TMETHODES.. ........................................................................ 26

1 . MATERIEL ......................................................................................... 26 ...................................................................................... 2 . METHODES 27

.......................................................................................... 2.1 S O ~ S 27

..................................................................................... 2.2 Histologie 27

.................................................................... 2.3 Microscopie 6lectronique 27

........................................ 2.4 I[mmunofluorescence sur coupes de tissu congele 27

..................................................................... 2.5 Ht5patectomies partielles 28

2.6 Perfusion. isolement et mise en culture des cellules ....................................... 28

............................................... 2.7 Immirnofluorescence sur cellules en culture -2 9

2.8 Détachement des htpatocytes en culture sur une matrice de collagène ................. 29

................................................................... 2.9 Analyses de type Western 30

......................................................... RESULTATS ......................... .. .... .. 31

1 . OBSERVATIONS MICROSCOPIQUES .................................................... 31

........................................................... 1.1 Histologie ................... ... 31

.................................................................... 1 -2 Microscopie électronique 31

......................................................................... 1.3 Immunofluorescence 31

3 . CONTENU COMPARATIF EN K8 ET KI8 CHEZ LES SOURIS TS. HTZ ET HMZ ...........................................................................*..................... 37

4 . REPONSE DES HEPATOCYTES A L'ISOLEMENT PAR LA METHODE DE PERFUSION ....................................................................................... 40

5 . CULTURE PRIMAIRE DES HEPATOCYTES .............................................. -42

........................................................................ 5.1 Aspect morphologique 42

5.2 Contenu comparatif en protéines du cytosquelette entre les cellules des souris TS et HhrlZ ......................................................................................... 43

.................................... 5.3 Distribution des MTs et MFs en inimunofluorescence 43

DISCUSSION ............................................................................................ 50

................................................................. CONCLUSION ET PERSPECTIVES 56

iW@WE A............ ............................................................................... ....58

....................................................................................... BIBLIOGRAPHIE 60

LISTE DES ABBREVIA'MONS

a.a.

ADN ADNc ALS ALT ARN

ARNm AST ATP C- Cellules ES DEX DMSO m E U EDTA

EGF FBS FIS mc GFAP h H f m HK8 HMZ HSV-tk Enz IFAPs

j kb

kDa Ka MAPs

acide(s) aminé(s) acide désoxyn'bonuc~6ique ADN comp16mentaire scl6mse amyotrophique latérale alanine aminoûansf6rase acide ninucl6ique ARN messager aspartate afninotransf6rase adénosine triphosphate carboxy- cellules souches embryonnaires dexamethasone diméthylsulfoxy de dithiothreitol

enhanced cherniluminescence »

ethylenediamine tetraacetic acid * facteur de croissance épidermique sérum foetal bovin filaments intermédiaires fluorescéine isothiocyanate protéine fibrillaire gliale acide heure h6matoxyline et éosine kkratine 8 hyperphosphorylée homozygote gène de la thymidine kinase du virus herpes simplex h6térozygote protéines associées aux nlarnents intermédiaires jour kilobase kiloDa1 ton kératine, n représente le sous-type protéines associées aux microtubdes

MEC a- ou D-MEM MFs min ml MSB M m C MT'S N- neo NFs NF-II NF-L NF-M PBS PCR PKC PMSF PtK2

RER RNAse

SDS TR TS v

matrice extraceUulaire milieu essentiel minimum, modification a ou Dulbecco microfilaments minute millilitre

tampon de stabilisation des microtubules centre organisateur des microtubules microtubules amino-

gène de résistance à la n h y c i n e nemfilaments sous-unit6 lourde des newofilarnents sous-unité légère des neuronlaments sous-unité moyenne des neurohlaments tampon de phosphate de sodium réaction de polym6rase en chahe protéine kinase dépendante du calcium phenyhethyl-sdfonyl fluonde cellules épitheliales de reins de rat-kangourou réticulum endoplasmique rugueux ribonucléase sodium dodécyl sulfate Texas Red type sauvage volt

LISTE DES FIGURES

Figure 1.

Figure 2.

Figure 3 A.

Figure 3 B.

Figure 4.

Figure 5.

Figure 6.

Figure 7.

Figure 8.

Figure 9 A.

Figure 9 B.

Figure 10.

Figure 11.

Figure 12.

Figure 13.

Structure des protéines de filaments intennéûiaires, modèle des kératines ......... 5

Mod&le d'assern blage des k6ratines en filaments.. .........~~~.~~.~~~~............... -6

Expression differentielle des k h t i n e s épidermiques.. ............................. 1 3

Localisation des mutations connues sur les g h e s de Leratines de type 1 e t II ........................................................................................ 13

Caractéristiques ultrastnicturaies des jonctions desmosomdes et hémidesrnosomales.. ................................................................... -15

Constructions utilisées pour effectuer l'inactivation des allèles de la K8 ......... 2 0

Colorations histologiques i ' h e m a t o n e n e (Ha) de coupes ............. ............ congelées de foie de souris 8g&s de 20 semaines .... 3 2

A) Foie de souris TS, zone @riportale. B) Foie de souris HMZ comportant des pigments de lipofuscine. C) Foie de souris HMZ présentant une zone de nécrose coagulante.

Ultrastructure des cellules de foie de souris TS (A) et HMZ (B) par ............................................................. microscopie électronique ..3 3

Distribution comparative par immunofluorescence indirecte des K8, K18 et actine dans des sections de foie de souris de 20 semaines TS et HMZ......... 3 4

Aspect des foies de souris TS et HTZ avant et après h6patectomies partielles de 213. ................................................................................... .3 8

Coloration histologique (H&E) et au Rouge de Nile démontrant l'accumulation de vacuoles de lipides dans le foie de souris HTZ après

........................................................ h6patectomies partielles de 213 38

Détermination des quantités relatives de Kg et de KI8 dans des échantillons ........... ............... de foie de souris par analyses de type Western .... 3 9

Aspect morphologique en microscopie optique des hépatocytes de souris ..................... TS et HMZ après 3 h et 24h de culnire sur collagène de type 1 4 4

Détermination des quantités relatives d'actine et de tubuline par analyses de type Western sur des échantillons de foie, ainsi que sur des h6patocytes de souris TS et HMZ fraîchement isolés et après 3h et 24h de culture sur col lagène de type 1.. .................................................................... .4 5

Distribution de I'actine par immunofluorescence indirecte dans les h6patocytes de souris TS et HMZ après 3h et 24h de culture sur collag2ne de type 1.. ..................... ...... .......-......................................... -4 7

Figure 14. Distriiution de la tubuline par immunofluorescence indirecte dans les hépatocytes de souris TS et HMZ après 3h et 24h & culture sur collaghe de type I .................. ...............t.............. . ......................4 8

Figure 15. Distribution des K8/K18 par immunofluorescence indirecte dans les hépatocytes de souris TS et H M 2 après 3h et 24h de culture sur coIlaghe de type 1. ................. ~.~~.~.~~..~.~.~..~...................................4 9

Figure 16. Diagramme montrant les differents lobes du foie de SOL& ..... ... .. .. .... ........59

LISTE DES TABLEAUX

.......... Tableau 1 . Distribution des proteines de fdaments intermédiaires chez les vertébrés 7

...... Tableau 2 . Survie des souris TS. IITZ et HM2 3 jours après hépatectomies partielles 36

Tableau 3 . Nombre de souris de plus de 20 semallies présentant un foie gras après htpatectomies partielles de 2/3 ......................................................... 38

Tableau 4 . Rendement et viabilité des h6patocytes de souris après pefision (J3epes 10 xnl/min pour les souris TS et 5 d m i n pour les Hl2 et les HMZ. et collagénase 5 d m i n pour toutes les souris) ................................... 4 1

Les kératines caiistituent le groupe de protéines le plus diversif16 de la famille des filaments

intermédiaires. Eiies s'expriment de f e n diff6mtielle sous f m e d'h~thpo~ym&res obligatoires dans les cellules épithdIiales kératinisées ou non. Maigré de nombreuses &des sur

la structure des fdaments de k6ratines et leur régulation spaiiotempore~e dans les tissus nomaux

et nimorig~niques, peu de do~mées existent concernant leur(s) fonction(s). De nombreux

travaux ont montré que les keratines exprimées dans l'dpiderme sont requises pour le maintien

de l'intégrité structurale de la peau. Par contre, le rôle de ces protéines dans les cellules

6pithéliales non kdratinisées n'a pas encore &té élucididé. Dans les présents travaux, des souris

transgéniques déficientes en kératine 8 sont utilisées comme modèle d'étude des fonctions des

kératines dans l'6pithéiïum simple. Ces souris présentent différentes anomalies selon la souche

dans laquelle la mutation a eté introduite (C57B116 ou FVBM), mais dans les deux cas, le foie semble affecté. Les cellules epithéliales du foie comprennent entre autres les hépatocytes et les

cellules épithéliales des duchiles biliaires. Dans les h6patocytes. qui exercent un grand &ventail de fonctions m&aboliques, les seuls As qui s'expriment sont constitués de la paire fom& par les kératines 8 et 18. Le foie représente donc un organe privilégié pour 1 'étude de la fonction des

Rs dans un épithélium simple à fonction hautement mdtabolique. Les résultats provenant de

l'observation microscopique effectuée sur les souris FVBM deficientes en kératine 8 montrent

que cette mutation entraîne une d@h5-exence précoce des hépatocytes. Suite à une hepatectomie de 213 sur des souris ggées de plus de 20 semaines, les homozygotes pour la

mutation sont incapables de maintenir les fonctions métaboliques du foie en cours de

reg6n6rescence. Par ailleurs, une perfusion du foie in situ selon un protoco1e standard pour les

souris de type sauvage entraîne une chute de viabilité zéro pour les cellules des souris homozygotes, ce qui suggère une très grande sensibiiite des hfpatocytes déficients en K8 à des

stress mécaniques. De plus, des données pdirninaires sur les hépatocytes en culture primaire à

court terme montrent que l'absence de FIS dans ces cellules influence la morphologie des cellules

ainsi que l'organisation et la distribution des réseaux de microfilaments et microtubules. Dans

l'ensemble, ces résultats indiquent que les kdratine-s sont nécessaires au maintien de I'intégrite

tissulaire hépatique.

Pendant de nombreuses années, la cellule a et6 considérée comme un regroupement d'organelles physiquement indépendants et suspendus dans un fluide amorphe. Cependant, l'avénement de

la microscopie électronique et le dtveloppement de techniques cytochimiques sophistiquées ont permis de réaiiser que les cellules eucaryotes contiennent en fait des réseaux de fibres et de

filaments interconnectés, qui ensemble constituent un échafaudage tridimensionnel dynamique, nommé le cytosquelette. Trois types de filaments, classés selon leur diamètre, leur structure et

leur fonction font partie de cette structure. Les microtubules (MTs) se composent de fibres ayant le plus large diam&tre, suivis des filaments intermédiaires (FIS) et des microfilaments (MFs).

Alors que les fonctions spécifiques des MTs et les MFs ont été étudiées de façon exhaustive, tel n'est pas le cas pour les FIS. Les MTs et les MFs exercent plusieurs fonctions dans la cellule, dont ceiles de m i i i n t e ~ l'architecture cellulaire, d'ancrer des cellules les unes aux autres, de

transporter des substances dans le cytosol et de faciliter la motilité cellulaire. Les protéines des

FIS, quant à elles, se divisent en plusieurs sous-classes et démontrent un patron d'expression spécinque selon le tissu et le type cellulaire, qui varie suivant des changements

développementaux ou pathologiques. Tout porte à croire que cette grande diversité dans I'expression des FIS est fonctionnellement significative.

Les études sur les fonctions des FIS ont jusqu'à maintenant principalement porté sur les protéines de cette famille exprimées dans des cellules de l'épith6ium squameux. Il a été

demontré dans ce cas que les FIS de l'épithélium (ies kératines) sont importants dans le maintien de i'intégrité cellulaire, jouant en quelque sorte un rôle de support mécanique. Cependant, la

question demeure ouverte à savoir si ce rôle est le même pour les khtines qui s'expriment dans des types cellulaires exerçant des fonctions plus complexes, par exemple au niveau métabolique.

Les travaux réalisés ici portent sur l'analyse du phénotype hepatique entraîn6 par l'absence de FIS dans les hépatocytes, qui sont des cellules de I'épithélium simple à fonction hautement métabolique.

1 FILAMENTS INTERMEDIAIRES

Au début des années 1980, des travaux ont montré que les FIs ciiffihient de façon marquée dans

leur composition et leurs propriétés structurales des MFs et des MTs, et représentaient ainsi la

troisième composante majeure du cytosquelette de la plupart des cellules eucaryotes (Lazarïdes,

1980 et 1982). A la suite de diverses observations, une hypoîh8se a été élaborée, selon -elle ces trois &seaux seraient intégrés de façon spatiale et temporelle afin d'assurer diff6rentes activités cellulaires, comme le d6veloppement et le maintien & la morphologie, l'organisation structurale du cytoplasme, le mouvement intraceiiulaire de molécules a d'organelles, la transduction de signaux, etc. (Paulin-Levassew, 1992; Marx' 1983). Alors que les fonctions

Specifiques des MTs et des MFs ont 6té étudiées de d & r e exhaustive, celles des FIS demeurent relativement peu connues. Dans les cellules en interphase, le réseau de FIs s'&end de

la membrane plasmique jusqu'à la région périnucléaire. Comme les lamines nucléaires font également partie de la f d e des FIS, certains chercheurs ont 6voqu6 la possibilité d'une int6gration physique du cytosquelette et de la matrice nucléaire via un continuum de FIs (Paulin-

Levasseur, 1992; Carmo-Fonseca et David-Ferreira, 1990). Les caractéristiques qui distinguent le plus ces filaments de ceux des autres réseaux du cytosquelette sont sans aucun doute leur polymorphisme moléculaire, ainsi que leur remarquable résistance la solubilisation par des detergents non-ioniques. Considérant que ces attributs pouvaient être critiques quant au rôle

physiologique de ces protdines, les efforts de recherche se sont concentrés intensivement vers une meilleure compréhension des mécanismes de régulation gouvernant I'expression des protéines de FIS, ainsi que des bases structurales de l'organisation de ces filaments (Paulin- Levasseur, 1992).

1.1 Structure, assemblage et expression différentielle des protéines de FIS

Les protéines des FIS font partie d'une f d e multigénique très complexe partageant une structure moléculaire hautement conservée. tout en différant les unes des autres par plusieurs

critères biochimiques et immunologiques (Paulin-Levasseur, 1992). Ces protéines ont en commun un domaine central en h 6 k a d'environ 310-350 acides amines (a-a.), flanque de

domaines carboxy et amino- (C et N-) terminaux non-hélicaux dont la longueur et la composition varient de façon extensive entre les différentes protéines (Coulombe, 1993). Le domaine en htlice a se compose de 4 segments contenant des répétitions de 7 a.a. dont le premier et le quatriéme résidu sont apolaires dans 75% des cas, interrompus par de courtes séquences

linker » riches en rdsidus proline et glycine. Dans les régions N et C-terminales du domaine central se trouvent de courtes séquences présentant des homologies de 90 à 99% entre les diff'rentes prot6ines de FIS. Ces régions semblent importantes pour l'assemblage des protéines en filaments et des Waments en rkseaux (Sévier, 1994). Les domaines terminaux des FIS ont été

divises en plusieurs sous-domaines: H 1, H2, VI, V2, El et E2 (figure 1). Les petits sous- domaines H1 et H2, siniés de part et d'aune du domaine a-hélicoïdal, sont bien conservés entre

autres chez les FIS de type II. Par contre, chez le type 1. Hl est variable et H2 est absent. Les

régions VI et V2, quant à elles, sont variables en longueur et en séquence et donnent leur identité propre ii chaque protéine. Aux extrémités des protéines se trouvent les dgions El et E2, qui sont conservées pour un même FI entre dB6rentes espèces, mais pas entre les diff6rents FIS d'une même espèce (Madean et Lane, 1995; Steinert et Rwp, 1985; Roop et COU, 1984).

Les FIS ne nécessitent pas la présence de protéines accessoires, de cofacteurs ni d'ions particuliers pour s'assembler. En solution, ces protéines forment spontan&nent des dimères r coiled-coil » . La stabilité de ces dimères est assurée par les interactions hydrophobes entre les résidus apolaires 1 et 4 de chaque heptade. L'unité de base pour l'assemblage des prot6ines en filaments de 10 am consiste en un tétramère' nommé protonlament, formt & deux dimères « coiled-coil » associ6s de fqon antipadkle et &ai&. L'assemblage de deux protonlaments donne une protofibrille, qui par la suite va se multim6riser pour foxmer un filament (figure 2). Dépendamment du type de protéine, les filaments matures de 10 nm contiennent entre 24 et 40

unités de base (Coulombe, 1993). L'association des protéines en filaments se fait g6n6ralement sous foxme d'homopolymères, sauf en œ qui concerne les nemfilaments (NFs), alors que les sous-unités lourde (NF-H) et moyenne (NF-M) forment des hétéropolymikes avec la sous-unité legère (NF-L), qui elle possède la propnétt5 de s'autoassembler (Lee et Cleveland, 1994). Egalement, les filaments formes par les protéines de la famille des kératines sont des hétéropolymères obligatoires se composant d'une kératine & type 1 et d'une kératine de type II dans un rapport 1 : 1.

Mal@ leur grande résistance aux détergents ioniques, les FIS sont des structures hautement dynamiques, mmme le demontrent plusieurs données. Par exemple, leur organisation change

lors du cycle cellulaire. II a été demontré que I'incorporation de nouvelles protéines était

constante. et que leur réaction à une perturbation était très rapide. Egalement, des expériences de transfections montrent une incorporation rapide de protéines exogènes au réseau déjà en place, ce qui a été confirmé par des essais de microinjection de proteines marquées permettant de suivre la dynamique d'incorporation de nouvelles sous-unités dans un filament (Virkstrorn et coll., 1989; Miller et COL. 199 1 ; Miller et coll., 1993). En se basant sur leur séquence en a.a. et leur distribution tissulaire, les protéines des FIS sont subdivisées en 6 classes (tableau 1). Les réseaux formés par les Fls de type 1, II, III et IV et VI se retrouvent dans le cytoplasme, alors que celui fornié par les lamines (type V) est nucltaire. D'autres FIS ont 6té dt5couverts rtcemment, mais n'ont pas encore été classifiés dans une famille particuli&re. Par exemple, X N I F est une protkine de FI retrouvee dans les neurones de Xenopus, alors que la plasticine et la gelfdtin ont étt trouvées dans le nerf optique du « goIdfish >B. Cependant, il n'est pas encore certain que ces protéines existent chez les mammifères (K1ymkowsky, 1995).

Figure 1.

Stntcturc des protéines & filaments intermédiaires. exemple des kératines. Ces protéiacs possè- dent un domaine central fomt de 4 régions htlicoïddes (IA, 1B. 2A et 23) séparées par 3 courtes

séquences (Ll. L 12. L2) ainsi que des domaines N- et C-terminaux composés de petites régions spécifiques H. V et E.

Ti6 de Steinea et Roop, 1985.

A : - Head - Rod *-Tail -

Non Helica Termini

subunit

o.o* d Coil O

Protofilament 2-3nm

Figure 2.

Modèle d'assemblage des keratines en filaments.

A) Structure d'un dimère de kératines B) Filment formé de 4 protofibnïles enroulées en hélice, chacune contenant une pain de

protofilaments fomé de l'association des dimères de keratines.

A= Tiré de Osbom et Weber, 1986a. B= Tiré de Bloemendal et Pieper, 1989.

Tableau 1. Distribution des protéines de filaments intermédiaiFes chez les ver&&

Type Protéine

kératines acides

kératines neutres ou basiques

vimentine

desmine

GFAP

périphérine

neurofilaments

a-internexine

nestine

lamines

filensine

phakiniae

Origine

cellules épithéliales

cellules 6pith6liales

cellules d'origine rnésenchymateuse

cellules musculaires

cellules gliales et astrocytes

neurones du système nerveux

périphérique

neurones

neurones

cellules souches oeuroépithéliales

lamina nucléaire

cristallin

cristallin

Nombre

Tiré de Steinert et Roop, 1988; Fiiegner et coll., 1990; Lendahl et coll, 1990; KIymkowsb, 1995.

1.2 Fonctions des FIS

Relativement peu de choses sont connues de façon certaine concernant les fonctions

physiologiques des FIs, maigré tout ce qui a 6té découvert B propos de leur stnicture, expression

a organisation. L'existence de types cellulaires d6pourvus de FIs Laisse présumer que ces

protéines n'exercent pas de rôle directement lié B la croissance et B la proIif6ration (Venetianer et coll., 1983; Hedberg a Chen, 1986). Cependant, 1 ne faut pas oublier que ces cellules

pourraient contenir des FIS n'ayant pas encore eté d6couverts. Ii demeure toutefois que la

grande diversité des types de FIS, la modification de leur expression au cours du dtveloppement

et de la differenciaîion, ainsi que leur conservation dam I'6volution (capetaniiki et cou., 1990) suggerent qu'ils pourraient être impliqu& dans des fonctions spécifiques de la cellule.

Alon que des expériences en culture indiquent que ni la quantité ni le type de filaments n'exercent une influence sur la morphologie ou la fonction de la cellule, des travaux sur des

modèles animaux ont montré l'apparition de phknomènes pathologiques suite à la surexpression,

la modification ou l'absence de filaments intermédiaires (Lu et Lane, 1990; Guidice et Fuchs,

1987; Domenjoud et coll., 1988; Kuiesh et COL, 1989).

Par exemple, l'augmentation de neurofilaments provoque une maladie dégdnérative des

neurones, et I'augmentation de l'expression de la vimentine dans le cristaIlin entraîne l'apparition

de cataractes (Côté et coll., 1993; Capetanaki et coll., 1989). Egaiement, l'expression ectopique

de la k6ratine 1 (Kl) dans les îlots du pancréas entraîne une diminution de la sécrétion d'insuline

et la mort cellulaire, résultant en diabète (Blessing et con., 1993).

1.2.1 FIS de type H f

1-2.1.1 Vimentirte

Plusieurs fonctions ont jusqu'k présent été envisagées pour la vimentine. Cette protéine s'exprime principalement dans les cellules d'origine mésenchymateuse, mais également au cours du développement embryonnaire, dans diff6rentes cellules ayant en commun la motilité (Colucci-

Guyon et coll., 1994). Par exemple, eile se retrouve dans les cellules musculaires au début du

développement, où elle est par la suite remplacée par la desmine. De plus, eile se retrouve dans

un grand nombre de cellules en culture et de lignées permanentes, transformées ou non, où elle

s'exprime en plus du FI nonnalement présent. Les Fis forment alors un r6seau composé des

deux types de protéines, ou deux réseaux distincts. Il est donc possible que la vimentine exerce des fonctions rnultîples, qui varient selon le type cellulaire dans lequel elle s'exprime.

Des expériences ont entre autres hdiqu6 un rôle pour la vimentine dans la neuritog6nèse (Shea et

COU., 1993), ainsi que dans le métabolisme cies 1ipoprotéines (Sania et COU.. 1992). De f v similaire, le réarrangement du réseau de vimentine en forme de cage autour des iipides en formation suggère un rôle pour cette protéine dans I'adipogénèse (Franke et COU., 1987).

Des souris déficientes en vimentine ont tt6 générées (Colucci-Guyon et coli., 1994), et les premiers résultats n'ont démontré aucun phhotype majeur, impliquant que la vhentine exercerait des fonctions subtiles dans I'organisme. Toutefois, des ttudes récentes sur les souris &ficientes en vimentine ont montré que l'absence de vimentine dans les astrocytes où eile se retrouve normalement exprimée avec la GFAP empêche la fomtion d'un réseau de GFAP.

Donc la vimentine serait nécessaire pour la stabilisation de la GFAP dans ces ce11ules (Gatou et coll., 1996). Egdement, des fibroblastes provenant de ces mêmes souris ont d6montré une fiagilité extrême face à des manipulations comme la microinjection, comparativement à des

fibroblastes de souris normales (Goldrnan et cou., 1996). Ces résultats viennent appuyer la possibilité de l'implication de la vimenthe dans le maintien de l'intégrité cellulaire, rôle qui avait été suggbré par des analyses in vitro sur les propn6t6s viscoélastiques de cette protéine. Des 6tudes comparatives avec les MFs et les MTs avaient alors montré que la vimentine possédait des propriétés uniques, en ce sens qu'elle pouvait se rigidifier sous l'application d'une force mécanique suffisante à la désorganisation du réseau des MFs et des MTs (Janmey et coll., 1991).

1.2.1.2 Desmine

L a desmine s'exprime dans les cellules musculaires, et comme pour la plupart des autres FIS, un rôle d76Ement mécanique dans les muscles lui a été attribue. Des anomalies dans l'accumulation

etlou l'organisation de filaments de desrnine ont blé n o t h dans un certain nombre de

myopathies (Goebel et Bomemann, 1993)' mais la question n'est pas encore résolue quant à

savoir si des altérations dans l'expression de la desmine entrainent des pathologies musculaires spécifiques.

En fait, la desmine pourrait agir au niveau de la régulation génique, car un antisens contre la

desmine introduit dans des myoblastes inhibe non seulement la synthèse de cette proteine, mais kgalement la différenciation myogenique, la fusion de myoblastes ainsi que la formation de

myotubes (Li et cou., 1994). Cette hypothèse avait d'abord été iancée par Traub et Shoeman (Traub et Shoeman. 1994). qui se basaient sut la capacité des FIs iî lier l'ADN pour proposer un rûle de ces protéines dans la moddation & I'expression génique.

I.2.1.3 GFAP et périphérine

Un rôle & stabilisation est attriibue B ces deux protéines: stabilisation des prolongements des

cellules gIiales dans le cas de la GFAP. et des axones en regdneration du système nemeux

périphérique pour la périphérine (Weinstein et COU., 1991; Liem, 1993).

1.2.2 FIS de type IV

1.2.2.1 Neurofiaments et a-intemexine

De nombreuses methodes ont été utilisées pour l'étude des neurofilaments (NFs), telles la

surexpression, l'ablation des protéines ou la perturbation des réseaux de filaments. Cependant, comme dans le cas des autres FIS, le rôle des NFs demeure incertain. Jusqu'à maintenant, les

résultats montrent que ces protéines seraient importantes pour la régulation du calibre des axones

(Lee et Cleveland, 1994). D'autres évidences laissent croire que les NFs jouent un rôle dans la

pathoghése de plusieurs maladies neurod6g6n&atives, telle la sclérose amyotrophique latérale

(ALS). En effet, des souris surexprimant soit la sous-unité NF-H ou la NF-L présentent des

défauts neurologiques ressemblant à ceux retrouves dans les pathologies humaines des neurones

moteurs, incluant 1'ALS (Côté et COU., 1993; Xu et cofl., 1993).

L'a-htemexine, une autre proteine de type IV, pourrait quant à elle servir d'échafaudage pour aider à l'assemblage des NFs au cours du développement (Lx et Cleveland. 1994).

1.2.3 FIS de type V

1.2.3.1 Lamines

Les lamines reprbsentent les seuls FIS qui s'expriment dans le noyau, et non pas dans le

cytoplasme. Elles y forment un réseau perpendiculaire sur la face interne de i'enveloppe

nucléaire. Leur rôle n'est pas clairement détermine. mais elles pourraient être impliquées dans le

maintien de la forme du noyau et des complexes de pores nucléaires. De plus, il a été suggér6

qu'elles seraient responsables de diriger I'assemblage de l'enveloppe nucléaire à la f i de la

télophase, de par leur proprieté de s'attacher aux chromosomes (Skalli et Goldman, 199 1).

1.2.4 FIS & type VI

Au cours des dernières années, un nouveau groupe de protéines de Rs a été identifi6. Ces

fdaments se retrouvent uniquement dans le cristallin, sont conservés dans l'évolution et ont

même 6té identifiés chez les invertébrés. La fdensine d i f h des autres prot6ines de R s , en œ

sens qu'elle contient 29 aa de moins dans son domaine a-hélicoïdal. Elle semble se localiser

au niveau des membranes périph&iques, et s'avère incapable de former des filaments par elle-

même,

Tout comme la filensine, la phakinine s'exprime de façon conse~vée dans le cristallin. En ce qui concerne sa structure, elle possède un domaine a-hélicoïdal complet, mais pas de dgïon C-

terminale comme les autres protéines de FIS. Sa séquence en aa demontre une grande

similarité avec les keratines de type 1.

La phakinine et la filensine mplymdrisent dans un rapport 1:3 et forment des filaments

d'apparence normale in viho (Klymkowsky, 1995). Aucune fonction n'a encore été attribuée à

ces deux prot&ines.

1.2.5 FIS de type I et II

1.2.5.1 Kératines

De toutes les prot6ines de FIS, les kératines forment le groupe le plus abondant et le plus

diversifié. Il s'agit d'une trentaine de protéines, regroupées en deux types selon leur poids

moléculaire, leur point idlectxique, leur séquence nucleique et protéique, ainsi que leur

ùnmunoréactivité(Mol1et coli., 1982; Sun etcoll., 1984; Maginetcoll., 1983). Dans un même

groupe, I'homoIogie de séquence en aa est de 50 a 95%, alors qu'entre kératines de type different, t'homologie est inf&ieure à 30%. Les deux-tiers de ces proteines sont exprimees dans

les différents épi thdia, alors que les autres se retrouvent dans les cheveux, les ongles et les poils

(Heid et d l . , 1988). Chaque type de cellule épithéhie peut contenir de 2 à 10 kératines

diffdrentes, qui varient selon le type d'dpithéiium et son stade de différenciation, Les paires de

kdratines retrouvées sont relativement constantes. Par exemple, la K8 s'associe pn5fémtieilement à la K18, la K1 à la K10 et la K5 à la K14. Les Rs de types 1 et II peuvent représenter jusqu'8 30% des protéines tdales de caiains types cellulaires (Lia0 et coll, 1995).

Les données recueillies jusqu'h maintenant sur les fonctions des kéxaines de type 1 et II concernent surtout celles qui s'expriment dans les épithdia de type squameux, mmme celui de

la peau. Des 6tude.s récentes ont indiqué que les kbratines retrouvées dans les ceildes

épithéliales de la peau (kératinocytes) exercent un r61e important dans le maintien de l'intégrité

cellulaire. Les évidences œ t effet proviennent de découvertes de mutations ponctuelles dans certaines kkratines chez des patients atteints de maladies bulleuses de la peau. Par exemple,

1'6pidemolyse bulleuse de type simple qui entraîne la formation d'ampoules à n'importe quel site de I'6piderme subissant un choc physique, est causée par des mutations soit dans la K5 ou h K I 4 qui s'expriment dans la couche basale de l'epideme (Coulombe et coll., 1991 ; Lane et

coil., 1992; Lane, 1994). 11 y a égaiement d'autres maladies de la peau connues qui peuvent être

reliées à des mutations dans les kératines. C'est le cas de l'hyperkératose ichtyosifome,

caractérisée par le bris des cellules menant un épaississement des couches supérieures de l'épiderme. Cette pathologie est due à des mutations ponctuelles soit dans la KI ou la K10, qui s'expriment en paire dans les couches suprabasales (cornée et épineuse) de I'dpiderme (figure 3)

(McLean et Lane, 1995 ) .

En ce qui a trait au rôle des kkratines spécifiques aux épithdia de type simple, la situation est

moins claire étant donné que conaairement aux kératinoc ytes, ces cellules épi théliales exercent souvent des fonctions caractère beaucoup plus métabolique que structural. La K8 représente une kdratine typique de l'épithélium simple. Or, sa séquence en a.a. diffère drastiquement de

celie des keratines Cpidermiques de la même famille (type II) au niveau de la portion C-terminale.

Ceci implique des fonctions différentes pour ces r6gions des kdratines de type II, selon que

I'épithéhum est simple ou stratifié (Magin, 1986). Les kératines exprimées dans 1'6pipithdiurn simple sont probablement impliquées d'abord dans le maintien de l'intégrité cellulaire, mais tout

porte à croire qu'elles pourraient exercer d'autres fonctions, notamment par le biais

d'interactions avec différents éléments ceilulaires.

Figure 3.

A. Diagramme de I'epideme montrant l'expression differentielle des ktratines dans les diff6rentes couches de ceilules. Les couches affectées par des mutations caractérisées dans les kératines sont indiquées droite. Les parenthèses indiquent les protéines exprimées spécifiquement dans l'épiderme palmoplantaire.

B. Structure des protéines de FIS de type I et II. Les flhhes indiquent les positions des sites connus de mutations. et les nombres comspondent B la quantit6 de mutations publiées pour les kératines de l'bpiderme.

Tirés de McLean et Lane, 1995.

1.3 Interactions des kératines avec d'autres constituants intracellulaires

De nombreuses interactions ont &é decrites entre les kkratines et divers autres constituants

intracellulaires. Par exemple, les FIS des cellules épithéliales sont ancrés à des protéines tIsiasmembranaires en des sites spéciaux de la membrane plasmique (desrnosornes et

h6midesmosomes, figure 4). Le r 8 1 d n & œ v serait de disperser unifom6ment

les forces de tension dans un tissu, qu'une œiiule isolée ne soit -pas disloquée (Lowe,

1990).

Uant donné que les FIS s'étendent de la membrane nucléaire il la membrane plasmique, les

organelles retrouvés dans le cytoplasme tels les mitochondries, lysosomes, polyribosomes et

endosornes pouriaient très bien être attachés à ce réseau de filaments (Skdli et Goldman, 199 1).

Certaines de ces interactions, et spécialement celles avec des structures membmnaires,

impliquent des associations lipides-protéines. Une étude a justement montré que les keratines pouvaient s'associer à des lipides membranaires. Ces interactions pourraient indiquer des rôles

autant stmcturaux que fonctionnels pour les filaments de kdratines (Asch et al ., 1993).

Récemment, il a été démontn5 que la distribution des mitochondries dans des cellules c5pithéIiale-s

PtK2 en culture s'effectuait principalement sous la tutelle de la vimentine (Sévier, 1994). Wns

les cellules de I'épithélium simple où la vimentine n'est pas exprimée, l'association des

mitochondries se fait peut-être avec les réseaux de keratines, mais aucune &idence n'existe

encore à cet effet.

Les K8 et K18 s'associent de façon dependante de I'ATP aux protéines de choc thermique de 72

et 73 kDa (hsp 70, respectivement induite par le choc thermique et exprimée constitutivement)

(Liao et coll., 1995). Les travaux d90mary et coll. ont montré égaiement qu'une activité kinase reliée ii un des isotypes de la protéine kinase dépendante du calcium, la PKCE, s'associe et

phosphoryle les K8 et K18 (Omary et coll., 1992). Ceci suggkre que ces kkratines pourraient

être impliquées dans la transduction de signaux.

De plus, les protéines de As auraient un haut potentiel d'interaction avec l'ADN simple brin et

l ' A m riche en G ('ïraub et wll. 1986). Il a 6té suggéré entre autres que les Fis pourraient

servir de système pour cibler I'ARNm à diff6rents compartiments intracellulaires et que

l'attachement des ARNm au cytosquelette serait nécessaire à la traduction. Les donnees à cet

effet montrent qu'un choc thermique qui induit une aggrégation périnucléaire des FIS produit de

façon simultanée un arrêt de la synthèse des protéines (Shyy et mil.. 1989).

R existe egatement une série de protéines associées aux filaments internédiaires (ENS), dont

une quinzaine ont été décrites jusqu'à maintenant. Parmi celies-Ià se retrouvent la nlaggrine, la IFAP-30, la IFAP-4ûûa et la plectine @aie et coll., 1997; Skailï et COU., 1994; Simard et COU., 1992; Duval et COU., 1994; Wiche et COU., 1983). Le r81e de ce- demi&= progine pourrait êtn

de relier entre eux les cW6rents réseaux de filaments retrouvés dans le cytosquellette, 6tant d o ~ t - qu'elle possède des sites de liaison pour les Fis ainsi que pour des protéines associées aux MT'S

(MAP 1 et MAP II) et aux MFs (spectrine) (Wiche et COU., 1993).

1.4 Interactions des kératines avec les autres éléments du cytosquelette

Plusieurs évidences indiquent que les trois réseaux du cytosquelette sont intemli6s. Par exemple, des expériences de déstabilisation des W s et des MFs par l'emploi de drogues

cytostatiques dans des ceiiuies épithdliales induisent des altérations signincatives dans

l'organisation des filaments de kératines (Knapp et COU., 1983).

Également, l'expression ectopique des K8 et K18 dans des fibroblastes conferent 2 ceuxci une

résistance aux drogues anti-cancéreuses, et plus particulièrement ii celles utilisées pour perturber les MTs. Les kératines dans ce cas agiraient avec le &seau de MTs de façon à le stabiliser et r e n b moins efficaces les agents perturbateurs (Bauman et coii., 1994).

Les MFs interagissent avec les kératines, notamment avant et pendant la formation des desmosomes dans les kératinocytes, alors que ces deux réseaux de nlaments se retrouvent

associés (Green et coll., 1987). L'infusion de cytochaiasine B dans un foie de rat VI vivo

provoque la perturbation de l 'ache filamenteuse, et les keratines se trouvent &aiement affectées dans leur organisation et leur conformation. Le même phknornhe est observé in vitro, dors que

se produit une réorganisation des kératines après perturbation de I'actine par la cytochalasine (Ohta et coll., 1988).

1.5 Implication des kératines dans divers processus cellulaires

Des travaux rCcents ont indique un rôle possible pour la K8 dans l'autophagie, définie comme le processus de dégradation des organelles et prot6ines cytoplasmiques par les lysosomes. En effet, il a &té démontr6 que l'acide okadaïque, un inhibiteur de phosphatases, entrahait une perturbation spécfique du réseau de k6ratines d'hépatocytes de rats en culture, et inhibait en

même temps l'autophagie (Blankson et coll., 1995). Un autre processus dans lequel les kératines pourraient être impliquées est celui de l'invasion des tissus par des ceIiuies tumorales.

Des niveaux elevés de K8 ont 6té rapportés dans de nombreuses études sur des ceUules

malignes. Il a 6té démontré aussi que la transfection des ADNc de K8 et K18 dans des

fibroblastes, qui n'expriment pas habituellement ces protéines, augmentait la motilité et le potentiel de pénétration de ces cellules B travers le Matrigel (Chu et COU., 1993). Selon certains

travaux, les K8, K18 et KI9 s'exprimeraient il la surface de cellules de carcinomes mnmmaires,

alors que ces protéines sont absentes de la Suffixe de cellules epithéliales des glandes

mrmmains normales (Godfioid et co11.,199 1). Dans la même veine, la pdsence d'une protéine I< KI-like » a été d6montrée B la surface des hkpatocytes, des cellules HepG2 et de lignées de

cellules de carcinomes mammaires (Hembrough et cou., 1995). Cette protéine aurait la propn6té de lier le plasminogène, qui est active par clivage pour donner la plasmine. Celle-ci fait partie

de la f d e des protéinases, et participe entre autres au clivage de composantes

glycoprot6iques de la matrice extraceIIdaire (Liotta et cou., 198 1). II est donc possible que la

K8 exerce une fonction de récepteur de protéhase, œ qui expliquerait le potentiel augmenté de

migration et d'invasion de cellules exprimant des niveaux élevés de cette protéine B leur surface cellulaire.

1.6 Modifications post-traductionneiles: implication dans la fonction des

kératines

Les kératines subissent plusieurs modifications post-traductiomelles, dont les plus importantes

sont la glycosylation et la phosphorylation.

La glycosylation s'effectue par l'ajout de résidus N-acétylglucosamine sur une sérine ou une thréonine (O-glycosylation) (Chou et coll., 1992). Toutefois, la signification fonctionnelle de

cette modification est encore inconnue.

La phosphorylation s'effectue surtout au niveau de résidus sérine. Cette modification jouerait un rôle dans le réarrangement des fdaments in vivo et d vitro . Par exemple, la phosphorylation in

vitro des K8K18 par plusieurs kinases dont la PKC est toujours associée avec la perturbation et le réarrangement du réseau de kératines (Yano et COU., 1991; Ku et Omary, 1994). De plus, la mutation de sites majeurs de phosphorylation physiologique de la K18 humaine semble interférer avec la capacité des filaments de K8/K18 à se reformer après une perturbation induite

par l'acide okadaïque ou la colcemide (Ku et Omary, 1994). Egalement, les sites de

phosphorylation de ces protéines se retrouvent principalement dans les domaines N- et C-

terminaux, qui sont les plus impliqués dans l'assemblage des FIS. Parmi les autres fonctions

suggdrées pour la phosphorylation des kdratines. se retrouvent l'interaction avec des IFAPs et la

transduction de signaux (Ku et Omary, 1994).

Les K8 et K18 deviement hyperphosphorylées et hypergiyoosylées en rdponse à un choc

thermique ou un amet en G2/M induit par des agents anti-microtubdes ou l'acide okadaïque.

Une forme distincte de K8 hyperphosphorylée (HK8) est @alement induite dans ces conditions.

La focmation de cette HK8 se produit toujours en mndation avec des situations de stress

cellulaires importants, et il est intéressant de noter que cette hyperphospho~ylation est sélective.

Il a été spéculé que la HK8 proaimait un avantage de swie aux cellules stressées. Par

exemple, elle pounait servir de réservoir potentiel de phosphate ou créer un micrœnvironnement

cellulaire, qui d'une certaine f q n minimiserait les dommages e h permettrait une meilleure

récupération des ce11ule.s soumises un stress (Gao et d l . , 1995).

2. SOURIS TRANSGENIQUES DEFICIENTES EN KS

De nombreux essais ont 6té effectués sur des cellules en culnue afin de déterminer Ia fonction

des kératines. La stratégie consistait à pertuber le réseau de filaments et 2 observer le résultat sur

differentes fonctions cellulaires. Ces expériences ont dbmontré que la destruction des Fis

n'interfère pas avec les fonctions normalement associées aux protéines du cytosquelette. telles la migration, 1 'adhésion et le maintien de la forme cellulaire (KI ymkowsQ et col1 ., 1983 ; Boller et

coll.. 1987; Baribauit et Oshima, 1991). C'est à partir de ces résultats intrigants mais négatifs

que s'est formee l'idée que la fonction des filaments de keratines pounait être révdlte dans le contexte d'un organisme entier.

Plusieurs &idences, provenant autant d'etudes chez des souris transgeniques que de mutations

retrouvées chez l'humain, indiquent que les keratines de I'dpideme sont requises pour assurer

l'intégrité structurale de la peau (McLean et Lane, 1995). Les kératines s'assemblent en un

réseau rigide et stable. qui procure une résistance physique aux cellules de la peau et leur permet

ainsi d'assurer leur rôle de protection (Albers et coll., 1995). Cependant, les cellules de

l'épi théiium simple sont compos6es de keratines qui diffèrent des kkratines 6pidermiques dans

leurs propriétés physiques, demontrant plus de flexibilité ainsi qu'une plus grande solubilité

(Chou et c d . , 1993). Ces diff6rences de propri6& pourraient signifier pour ces kératines un

rôle plus adapté aux fonctions de l'épithélium simple. qui comporte également des cellules à

fonction hautement m&abolique, comme par exemple les hkpatocytes.

Des souris transghiques déficientes en K8 ont &té gén6rées afin d'observer l'effet de la perte de fonction d'une kératine représentative de l'épithélium simple dans l'organisme en entier

(Baribadt et COU., 1993). La K8 s'exprime dans presque toutes les celIules épithélides de type

simple (Mo11 et al., 1982). Il s'agit de la seule kératine de type II exprimSe dans le

trophectodeme, l'endoderme, certaines cellules de l'intestin, de l'utérus. des glandes

mammaireî et du foie (Bariibadt et al.. 1993). De plus, la paire K8/K18 constitue les premiers FIs a apparaître dans l'embryog&&se de la souris (Jackson et al., 1980; Keder et al., 1981;

Oshima et al., 1983)' et représente les seuls FIS retrouvés dans les hépatocytes.

2.1 Phénotype obtenu dans les cellules souches embryonnaires (ES)

Des cellules ES ont été utilisées pour introduire la mutation de la K8 dans des ceildes germinales de souris et produire &entuellement une colonie de souris déficientes en K8. L+s d u l e s ES ont s e ~ tout d'abord comme modèle d'étude in vitro du rôle de la K8 dans I'organisation et la formation de l'épithélium au tout début du developpement embryonnaire.

En l'absence de la K8, ses partenaires complémentaires, la KI8 et la KI9 sont incapables de

former des Narnents dans des cellules diffkrenciées. Cependant, les cellules ES avec la mutation

se sont différenciées en corps embryonnaires avec des epithelia apparemment normaux. Les analyses d'ultrastnicture ont montré que ces epithelia comportaient des microvilli à la membrane apicale, des jonctions serrées et des desmosomes sur la membrane latérale, et qu'une membrane basale était également présente. De plus, il n'y avait pas de diffiknces notables dans les

niveaux de synthèse et de sécrétion de l'a-foetoprotéine et de la laminine entre les corps embryonnaires de type sauvage et ceux déficients en K8. Ces résultats démontrent clairement que la K8 n'est pas essentielie pour la formation de l'épithélium simple de I'endodenne extraembryonnaire (Baribault et Oshima, 199 1).

2.2 Phénotypes obtenus chez les souris de souche C57BL16

La mutation de la K8 a été par la suite introduite chez des souris afin de déterminer l'effet de

cette déficience génétique sur leur développement. Des souris chim&iques ont d'abord été

obtenues par injection de cellules ES mutées dans des blastocystes de souris C57BU6, puis la mutation a été transmise par croisements entre les chimères. L'ablation du gène a été effectuée à

l'aide du vecteur de ciblage illustré à la figure 5. En résum6, il s'agissait d'inactiver le &ne de la K8 prkent dans le génome de souris, qui contient un gène fonctionnel de la K8 et 8 pseudogènes (Vasseur et al., 1985). Un vecteur a été construit à partir du plasmide Bluescript, dans lequel deux bras d'homologie au gène de la K8 (3 kb de l'exon 1) interrompus par le g h e

Notl

I

Figure 5.

A. Strucnire génomique de la K8 de souris

B. Vecteur de ciblage Bluescript (BS) contenant deux bras d'homologie avec l 'exon 1 du

@ne de la K8, interrompus par le géne neo qui remplace cet exon en grande partie, dont le codon d'initiation de la traduction ATG, ainsi que le g&ne HSV-tk pour la double sélec-

tion.

C. Gène de K8 inactivé après recombinaison homologue avec le vecteur de ciblage dans des

cellules souches em bryo~aires (ES).

ne0 ont dté clonés, suivis en 3' du gène HSV-tk, Par recombinaison homologue dans des

cellules ES ûansfectées avec le vecteur de ciblage, le gène neo s'insère dans le premier exon du

gène K8, dmdtant une partie de cet exm incluant le d o n d'initiaîion ATG. Ceci empêche la

synthèse de protéine, à supposer qu'il y aurait une transaïptian résiduelle au locus muté. La séiectïon des aiiules ayant subi des 6vénements de recombinaison homologue s'effkctuait sur la

base de leur résistance au G418. Une double deztion etait assurée par la présence de

gancyclovir, qui aiait les cellules ayant intégré le gène de HSV-tk, donc ayant subi une

recombinaison aberrante (Baribault et Oshima, 1991).

Le phhotype observé dans œ cas s'est révélC beaucoup plus sévère que pur les cellules ES.

En effet, 94% des souris homozygotes pour la mutation (HErlZ) ne se rendent pas ii maturité.

Le taux de mortaiité le plus important est obse1~6 au jour embryomaire 12.5. Les embryons

analyses démontrent un retard de croissance et souffrent d'h6rnorragie interne. Egaiement, ils

présentent une accumulation a n o d e d'érythrocytes embryonnaires nucléés dans le foie et les

tissus environnants. C'est aux environs du douPeme jour embryonnaire chez la souris que le

systkme hématopoïétique migre du sac vitellin vers le foie (Mucenski et coll., 199 1). Donc, le phénotype a kté en partie explique par le fait que le foie des souris F M 2 est incapable de

supporter la croissance h6matopoï6tique. p u r des raisons fonctionnelles ou s tmcturales, ce qui entraîne le bris des hépatwytes, permettant aux 6lythrocytes de diffuser dans les tissus

enviromants (Bari baul t et al., 1993).

2.3 Phénotypes obtenus chez les souris de souche FVB/N

Les souris CS7BU6 qui ont échappe au phhotype létal embryonnaire ont été crois6es avec des

souris de souche FVBM, de f apn à transférer la mutation p u r la K8 dans un nouveau

« background B genétique (Baribault et coll., 1994).

La première observation intéressante dans ce contexte est l'effet que 55% des souris HMZ de souche FVBM parviennent au stade adulte. Cependant, 80% d'entre elles d6veloppent un phénotype intestinal se traduisant par l'apparition d'un prolapse anorectal entre 9 semaines et un an. Ce désordre intestinal affecte uniquement le colon. alon que le petit intestin demeure tout ii

fait normal. La pathologie est caractéris& par une hyperplasie au niveau des cellules epithéliales

des caecum, colon et région anorectde, avec une élongation des villis de ces trois tissus

dans des proportions de 5 à 10 fois. Une inflammation de la lamina propria et de la sous-

muqueuse est observee, mais semble secondaire à l'hyperplasie colorectale.

Parmi les autres phénotypes observes chez les souris HMZ, iI y a présence d'une 16g8re

spldnomégalie. De plus, il semble que l'absence de K8 nuise à la bonne fonction de l'appareil reproducteur, car les femelles H M Z sont stériles. Des données préliminaires provenant

d'analyses sériques et histologiques ont également montré que le foie des souris HMZ semblait affecté par la déficience en K8.

3. METHODES SE RAPPORTANT A L'ANALYSE DU PHENOTYPE HEPATIQUE

Trois essais principaux ont été choisis pour analyser le phhotype hépatique entraîne par

l'absence de FIS. Premi&rernent, il y a la méthode de l'htpakctomie partielle, qui permet d'évaluer l'état du foie en genéral. Puis, les méthodes de perfusion et d'isolement des h6patcxytes constituent un essai permettant d'6valuer I7int6grit6 htpatocytaire. Enhn, la mise en culture des hépatocytes s'inscrit dans le cadre des analyses in vitro du phénoty- hépatique chez

les souris W. L'essentiel de ces essais est introduit ci-dessous.

3.1 Réponse à une hépatectomie partielle

Le foie possède une extraordinaire capacite à se regénérer. Cette propri6tt5 est generdernent exploitée pour ttudier la prolifération des cellules hépatiques adultes. Le procédé employé pour induire la regénération consiste en une ablation chirurgicale de portions de foie de grosseur variable, appelée hépatectomie partielle (Higgins et Anderson, 1 9 3 I ) . Cette technique peut également servir d'essai pour evaher Mat général du foie, car les cellules qui restent après l'intervention doivent à la fois regénérer la masse perdue et maintenir les fonctions mdtaboliques normales du foie, afin que l'animal demeure en vie.

3.2 Perfusion du foie et isolement des hépatocytes

La perhsion du foie est une technique qui permet d'isoler les hépatocytes, et en même temps constitue un bon essai d'intégrité des cellules car ceilesci doivent résister au stress mécanique du débit de perfusion. La methode standard consiste en une perfusion en deux Ctapes, d'abord etablie pour le rat puis transférée chez la souris, moyennant des ajustements surtout au niveau des débits de perfusion (Seglen, 1973a; Seglen, 1973b; Williams et coll., 1978; Renton et coll.. 1978, Guguen-Guillouzo, C., communication personnelle).

La première 6tape consiste à laver le foie avec une solution d'Hepes sans calcium, pour affaiblir

les jonctions intercellulaires. Ensuite, les cellules sont dissociées par la pemision d'une solution

de collagenase. C m étape cunstitue un autre stress pour les cellules, car la coilaghse détache

les cellules les unes des autres et eues doivent par la suite reformer lem liens pour swiv re dans

l u plats de culture.

Une fois la perfusion termin&, les hépaîocytes sont isolés des autres cellules par centrifbgation

diff6rentielle. et peuvent &tre mis en culture.

3.3 Mise en culture des hépatocytes

Le choix des conditions de culture s7av&re très important pour le maintien d'une bonne culture

primaire d 'h6patocp. La majorité des parami?tres relatifs à la culture primaire d7h6patocytes

ont etc5 établis B partir de travaux sur des cellules de rats. Très peu d76tudes ont porte sur

l'établissement de conditions de culture sp&ifiques aux hépatocytes de souris, donc en g6n6rd

les conditions trouvees pour le rat sont appliquees directement ou adaptées Mgkrement pour les souris. Des milieux de culture ont 6ié mis au point, et divers éI6ments ont kté trouvés

nécessaires ou très importants pour la croissance et le maintien du caractère différencié des

hepatocytes en culture primaire.

Parmi ces éléments se retrouvent I'insuline et le facteur de croissance épidermique (EGF) qui agissent en synergie pour assurer la prolif6ration cellulaire (Weber-Benarous et coll., 1993).

L'insuline est un facteur permissif nécessaire l'obtention d'une croissance et d'une

prolifkration optimale pour un grand nombre de types celluiaires (Czech, 1989). Des travaux

ont demontré que l'absence de cette hormone dans des cuitures d'hépatocytes de rats adultes

provoquait une dég6ndration rapide des cellules dans une période allant de 24 à 48 h (Bucher et

Swaffield, 1975). Le EGF est d é f i comme un mitogène complet, c'est à dire qu'il est capable

par lui-même de stimuler la synthhe d'ADN et la mitose dans un milieu sans sénun (Lamas, 1990; McGowan et coll., 198 1). IE foie constitue une cible majeure pour le EGF, car les

hépatocytes possWent 2 leur surface un grand nombre de récepteurs pour ce rnitogène. Plusieurs évidences dkmontrent un rBle important du EGF dans la croissance et la regdneration

au niveau du foie. Il stimule la synhèse d'ADN et la proliferation in vivo dans le foie nématal

et adulte, aussi bien qu'in vin0 dans les h6patocytes en culture primaire (Baribault et coll.,

1985; St-Hilaire et Jones, 1982).

La nicotinamide et la dexarneihasone (DEX) ont comme r6Ie d'assurer le maintien des fonctions

différenciées des h6patocytes (Weber-Benarous et coll ., 1993). L'ajout de nicotinamide dans des cultures primaires d 'hdpatocytes permet de prolonger leur survie de façon appréciable, sans

perte des caractéristiques phénotypiques & ces cellules. Chez des hépatocyfes adultes in vitro, l'utilisation de ce produit stimule la synthèse d'ADN, la proW6ration. la synthese d'albumine, et

prolonge la suMe des cellules en culture jusqu'à un mois (McGowan, 1986). La aicotinamide permet de conserver un niveau intraceIliilaire de nicon'namide adénine dinuc1éotide (NAD),

essentie1 à la croissance et au maintien des fonctions dBérenciées, en empêchant sa dégradation

et en agissant &galement comm précurseur pour sa synthèse (Johnson, 1980). Les giucocorticoïdes, telle la DEX, favorisent l'attachement initiai et prolong6 des h6patocytes,

possiblement par la stimulation de prot&ines d'attachement dérivées des hépatocytes (Baffet a coll., 1982). lî a été égaiement démontré qu'ils pexmettent une augmentation maqutk & la fixation d'EGF aux récepteurs des hépatocytes (Lin et cou.. 1984).

Le glucose et le galactose sont quant à eux utilises conmie source d'énergie (Block et coll.,

1996). La transferrine diferrique s'est avérée essentielle pour promouvoir la croissance des

hepatocytes, mais elle aurait également une fonction commune avec l'albumine, qui est de

détoxiner le milieu cellulaire en liant des substances pouvant endommager la cellule (Bames et

Sato, 1980).

Divers oligo-éléments sont 6galement ajoutés aux milieux de culture, mais le plus important

semble être le selenium qui est une composante de la giutathion peroxydase, une enyme

protégeant les cellules contre les effets toxiques du peroxyde (Barnes et Sato. 1980). Le sérum

foetal bovin (FBS) constitue un élément essentiel pour un attachement optimal des ceildes à la

matrice lors des premières heures de mise en culture (Klaunig et coll., 198 lb).

Finalement, la présence d'une matrice extracelluiaire (MEC) s'avike extrêmement importante

pour l'établissement et le maintien d'une culture primaire d'hepatocytes. En effet, l'attachement

et i'étalement des cellules sur un substrat sont essentiels à la survie, la diff6renciation et la prolif6ration des hépatocytes en culture primaire (Johansson et coll., 198 1). Dfltkentes dtudes

démontrent egalement que le choix et la concentration de la MEC idluencent directement les

cellules proliférer ou à maintenir des fonctions differenciées (Sudhakaran et coll., 1986; Bisseil

et cou., 1987; Caron, 1990; Reid, 1990).

4. APERÇU DES TRAVAUX

Les travaux expérimentaux présentés dans ce merno& ont pour but l'analyse du phhotype

hkpatique chez des souris FVBM deficientes en K8, qui avec la KI8 constitue la seule paire de

FIS retrouvée dans les hépatocytes. L'approche utilisée comprend premièrement des

comparaisons au niveau microscopique (histologie, immunofiuorescence, mimscopie électronique) entre les cellules de souris HMZ et TS. Ensuite, I'hépatectomie partieue est utilisée

comme essai pour evaluer la capacit6 des souris H M 2 regenérer leur masse hépatique tout en conservant leurs fonctions métaboliques vitales. Puis, l'intégrité hépatocytak chez les souris

HMZ est etudiée par des essais de pemision, d'isolement et de mise en culture des hepatocytes. Laviabilité des hépatocytes après la perfkion et I'isolernent, ainsi que I'aspea morphologique des cehies en culture sont 6valués.

Enfin, un autre aspect dont I'analyse a 6té a m o h dans le cadn & œ travail concerne l'observation d'altérations possibles dans les W s et les MFs chez les souris HMZ, &tant donné

les interactions supposées entre ces diff6rents réseaux. Ces observations ont été effectuées par la quantincation des niveaux de protéines in situ et in vino à. differents temps après la mise en culture, et également au niveau des patrons d'expression en imrnunofluorescence.

Les résultats amènent de nouvelles perspectives quant au rôle des FIS dans les cellules épithéliales de type simple, comme les ht5patocytes.

1. MATERIEL

Les produits de KR, soit la Taq polym6rase et le SSB proviennent de Pharmacia, Baie d'Urf6 (Qc), alors que les oligonucléotides sont préparés daos notre centre de recherche par M. Mich1

Lambert. La protéinase K provient de GIBCO, Burlington (Ont.). La formaldéhyde tamponnée est achetée de BDH, Toronto (Ont). La résine Araldite 502 ainsi que les autres produits pour la microscopie 6Iectronique sont achetés de M.E.C.A. Ltée, Montréal (Qc). L'0.C.T. provient de

Miles Inc., Eikhart, IN. Les anticorps TROMA 1, II, III, proviement du Dr Rolf Kemier, Friburg, Allemagne. L'anti-nibuline a 6té fournie par le Dr. D. Brown, Ottawa, alors que l'anti- actine est un don du Dr. James L. Lessard, Université de Cincinnati, Ohio. La phalioïdine marquée au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) ainsi que k Rouge de NiXe proviennent de chez SIGMA, St-Louis, MO. L'anti-rat ainsi que l'anti-souris marqués au Texas Red

(sulfortiodamuie) proviennent de Jackson Immuno R-h-Bio/Can Scientinc, Mississauga (Ont.). Les solutions de cherniluminescence ainsi que l'anti-rat et l'anti-souris marqués à la

peroxydase sont achetées chez Amersham Canada, Oakville (Ont.). Les inhibiteurs de protéases (aprotinhe, leupeptine, pepstatine, PMSF) et le D'ïT (dithiothreitol) proviennent de SIGMA, St- Louis, MO. Le Triton X-100 ainsi que le Tween-20 sont achetés chez Bio-Rad, Mississauga

(Ont.). Le SDS (sodium dodecyl sulfate), le Bleu de Coomassie et I'acrylarnide proviennent de ICN Biomedicals Inc., Aurora, Ohio. Les membranes de nitrocellulose pour les analyses Western sont acheth de Mandel Scientinc Company Ltd., Guelph (Ont.). Le pentobarbital provient de W C Pharmaceuticais, Cambridge (Ont.).. La coilaghase ainsi que la RNAse sont

achetées de Boehringer Mannheim, Montréal (Qc). Le sérum foetal bovin (FBS) est obtenu de

Biotech, Lachine (Qc). Le EGF est prépar6 dans notre laboratoire à partir d'extraits d'hypophyse selon la méthode de Savage et Cohen (1972). L'insuline provient de Calbiochem, Laloua, CA. Le D-MEM, l'a-MEM ainsi que les Pétris de 35 mm sont obtenus de GIBCO, Burlington (Ont.). La tramferrine provient de chez Collaborative Research, Bedford (MA). Les antibiotiques (penicilline et streptomycine) ainsi que la DEX proviennent de chez Pharmacia, Baie d'Urfé (Qc); la nicotinamide est achetée de SIGMA, St-Louis, MO. Le coUag8ne & type 1 est isolé à partir de queues de rats dans notre laboratoire (méthode tir& de Freshney, 1987). Les cathéters pour la pemision (24 GA, 3 1/2 IN) proviennent de Becton-Dickinson, Sandy , Utah.

2. METHODES

2.1 Souris

Les souris FVBM déficientes en K8 sont géntrées partir de fa colonie établie et f d e par Dr Hélène Baribault (Baribault et coll., 1994). Le génofype de chaque animal est détermin6 par la réaction de polyrnénise en chaîne (PCR), sur l'ADN des queues de souris à partir des amorces

déjadecrites (Bdbaultet coll., 1994).

2.2 Histologie

Les analyses histologiques sont faites sur des tissus fixés dans la fonnaldéhyde 10%

tampom6e, deshydratés à l'alcool, enrobés dans la paraffine et color& avec une combinaison

d'hkmatoxyline et d'éosine (H&E) selon des procédures de routine (Sainte-Marie, 1% 1).

2.3 Microscopie électronique

Les morceaux de foie prélevés sur les souris sont émincés et immergés dans le fixatif de

MXbwell et Tnimp (fomaidéhyde 4% et glutaraldéhyde 1% dans un tampon sodium

phosphate, pH 7.2) (McDowell et Tmmp, 1976). Ils peuvent être conserv6s ainsi à4C pendant

plusieurs jours. Par la suite, les échantillons sont fixés de nouveau dans un tampon de Sorensen

0.2M contenant 1% d'oxyde d'osmium, puis déshydratés de f a p n graduelle et enrobés dans

une résine de type Araldite 502. Des sections de 600 A sont effectu&s puis colorées au citrate

de plomb et à l'acétate d'uranyle avant d'être observees à l'aide d'un microscope Je01 1200CX.

2.4 Immuno~uorescence sur coupes de t issu congelé

A partir de morceaux de foie congelés dans le milieu d'enrobage O.C.T., des coupes de 6 pm

sont effectuées à l'aide d'un cryostat. Les coupes sont deposées sur des lames et séchées sur

une plaque chauffante& 37C. Les lames sont ensuite fix- par immersion dans 1'6thanol

100% pendant 10 min à -2OC, puis rincés 3 fois au PBS (tampon phosphate). Pour la

détection des K8 et K18, l'incubation avec l'anticorps primaire se fait à la température de la pi&

pendant 30 min. Les lames sont de nouveau rin& au PBS avant d'être incubées avec

l'anticorps secondaire pour un autre 30 min à la température de la pièce. Pour la détection de

I'actine, une seule incubation de 30 min avec la phalloidine marquée au RTC est effectuée.

Après 3 autres lavages au PBS, un milieu de montage contenant un m6lange 1:1 de tampon

glyc&ol est déposé sur la lame, qui est ensuite recouverte d'une lamelle. Les Lipides sont

détectes par coloration au Rouge de Nile (Fowler et Greenspan, 1985). Une solution stock &

Rouge de Nile (500 mg/rnl dans l'acétone) est préparée et conservée à l'abri de la lumi5re. Au moment de la coloration. une solution naîche est préparée en ajoutant 10 pl de la solution stock

dans 1 ml de glycérol 75%. Une goutte de cette solution est déposée sur la coupe de tissu congelé et la préparation est recouverte d'une larne11e. Les sections sont observées après une

incubation de 5 min. Les observations se font à l'aide d'un microscope confocal Bio-Rad MRC- 600 équipé d'un microscope inversé Nikon Diaphot et d'un laser krypton-argon émettant à 488

et 512 nm. Les images sont imprimées sur papier UPC-5020A avec une imprimante vidéo

couleur Mavigraph de Sony. . -

2.5 Hépatectomies partielles

Les expériences sont effectuées sur des souris de type sauvage (TS), hétérozygotes (HTZ) et FM2 âgées de 8 et/ou 20 semaines. Les animaux sont soumis à des hépatectomies partieiles de

1B ou î/3, sous anesthésie intrapéritonéale avec du pentobarbital (54 mg&g de poids corporel).

Pour I'h6patectorn.e lB, c'est le lobe médian qui est enlevé d o n que pour ceiie de 23 , le lobe

latéral droit est égaiement- prélevé (Annexe A). Les portions de foie enlevées lors de

I'hépatectomie ainsi que les foies 3 j après l'opération sont examinés à l'aide des techniques

d'histologie, imrnunofluorescence et microscopie électronique. Des souris << sham w sont

incluses dans chaque groupe d'hépatectomies: eiles sont anesthésiées de la même façon que les

autres, et leur foie est sorti de la cavité intrapéritonéale, puis remis en place sans prelèvement de

lobes.

2.6 Perfusion, isolement et mise en culture des cellules

Les souris, âgées d'environ 20 semaines, sont tout d'abord anesthésiées au pentobarbital (90

mgkg de poids corporel). Puis, les hépatocytes sont isolés selon la technique de perfusion en

deux étapes par la veine porte originalement décrite par Seglen (Seglen, 1973) et modifiée dans

le laboratoire d'accueil. La première étape consiste à pefiser une solution d ' H e p sans calcium à pH 7.4 à un deoit de 10 d m i n pendant 5 min. afin de laver le foie (enlever le sang et

le calcium). La veine cave inférieure sous-hépatique est sectionnée aussitôt que la solution

commence à circuler pour laisser le liquide sortir du foie. La seconde partie du protocole permet

la dissociation des cellules par la pemision de la solution de collagénase à 5 mg/d. à un deoit

de 5 mYmin pendant 10 min (jusqu'a ce que la capsule de Glisson décolle (couche de cellules mésothéliales entourant les lobes du foie)). Pour les hépatocytes de souris HTZ et HMZ, la

perfbsion de I'Hepes s'effectue à un debit de 5 Wmin. Les cellules isolées sont ensuite

recueillies dans un milieu DMEM e ~ c h i (bicarbonate de sodium 20 mM, proline 0.26 mM, galactose 11 mM, albumine 2 g/l, Hepes 20 rnM. CuS0,-SE-O 0.8 pMT MnSO/U&O 0.33 pM,

2nSOa-7&0 2.6 PM, NqSeO, 0.03 ph4, penicilline et streptomycine 0.2 mV1, pH 7.4). et

centrifugées 3 min à 50 g. Puis, dew lavages sont effectués avec le même milieu et selon les

mêmes paramètres de centrifugation. Par la suite, les cellules sont comptées et mises en culture

sur du collagène de type 1 (5xlV cellules par Pétri de 35 mm) dans du D-MEM emichi avec 5%

de FBS. Après 3 h d'attachement, le milieu est changé pour du D-MEM modifié, qui contient

en plus 1mM de nicotinamide. 0.66 pM de transferrhe, 0.5 pg/ml d'insuline, 10 nglml

d'EGF, 10-~ M de DEX et 2% de FBS. Après 3 h et 24 h de culture, les cellules sont observées - -

à l'aide d'un microscope inversé Nikon Diaphot équipé d'une chambre d'incubation à 37C.

Des photographies en contraste de phase de plusieurs champs sont prises avec un film noir et

blanc TMX 100.

2.7 Inzmuno~uorescence sur cellules en culture

Pour les cellules en culture sur le collagène, un lavage au PBS est effectué après l'aspiration du

milieu de culture. La fixation se fait 2 l'éthanol 100% pendant 7 min à - 2 K pour la détection

des K8 et K18. Pour la détection de la tubdine et de l'ache, la fixation consiste tout d'abord Ci

stabiliser le réseau de MTs avec un tampon spécifique à cet effet (MSB), contenant 0.2 M sucrose, 35 mM Pipes, 5 mM MgSO,, 5 mM EGTA et 0.1% Triton X-LOO pendant 1 min à

37" C. Puis, les cellules sont fixées dans une solution de glutaraldéhyde 0.25% dans le MSB,

5 min à 3? C. Un traitement de 30 min à la température de la pièce au borohydrure de sodium

lrng/ml dans du PBS est ensuite effectué pour éliminer la fluorescence non spécifique causée

par le glutaraldéhyde. Finalement, les cellules sont incubées pendant 30 min à 37" C dans une

solution de RNAse O. 1 m g / d dans du PBS (Novikoff, 1996). Les cellules sont incubées avec

les anticorps primaires ou la phaiioïdine-FITC il 4 C pour la nuit. Après rinçages au PBS, les

cellules sont exposées à l'anticorps secondaire pour un minimum de 2 h, la température de la

pièce. Le détergent Tween-20 est ajouté dans une proportion de O. 1 % à tous les anticorps. Le montage et I'observation se font de la même façon que pour les coupes congelées.

2.8 Détachement des hépatocytes en culture sur une matrice de collagène

Les cellules sont d'abord rincées à l'tiepes 1X puis traitées à la collagénase 2mglml dans un

milieu a-MEM pour des temps de 5 à 20 min selon leur degré d'attachement. Puis 3 lavages à

I'Hepes 1X sont effectués avec centrifugations h 50 g pour 2 min.

2.9 Analyses de type Western

Le culot de cellules détachées du collagène (ou de cellules fraîchement isolées), est resuspendu

dans un tampon de solubilisation des prot6ines composé de Tris-HC1 0.0625 M, SDS 2.346, DTT 1 M , gtycérol IO%, plus les inhibiteurs de protéases EDTA (SmM), pepstatïne (lm,

aprotinine (0.3pM), PMSF (ImM) et leupeptine ( l m . Puis, les cellules sont soniquées

pendant quelques secondes, chauffées à 10BC pendant 3 min, centnhgées 5 min, aliquotées et

conservées à -8WC. Le dosage s'effectue selon la méthode de Bio-Rad, avec l'albumine pou

faire la courbe standard de concentration des protéines. Des quantités de protéines de l'ordre de

20 pg sont analysées. Dans le cas des protéines provenant du foie total, 100 mg sont

hornogénéis& dans 1 mi de tampon de solubilisation immédiatement suivant le prélèvement sur

l'animal. Puis, l'échantillon est congelé et conservé à -800 C. Juste avant I'électrophorèse, l'échantillon est décongelé, chauffé, centrifugé et dosé de la même façon que pour les protéines

d'hépatocytes en culture. La quantité de protéines déposée sur le gel est alors de 30 pg.

L'électrophorèse est exécutée sur un gel de polyacrylamide-SDS IO%, pendant 45 min à 160 V, puis une moitié du gel est colorée au bleu de Coomassie alors que l'autre est transférée sur une

membrane de cellulose à 35 V pour la nuit. La membrane est hybridée avec les anticorps primaires puis secondaires marqués à la peroxydase, et la révélation s'effectue par

cherniluminescence selon le protocole ECL #Amersham. Les membranes sont ensuite exposées

sur nIm Kodak pendant le temps nécessaire à l'apparition des bandes.

RESULTATS

1. Observations microscopiques

1.1 Histologie

Afin de caractériser le phénotype hépatique entraîné par la déficience en K8, la première étape a

consisté à observer i'apparence générale des hépatocytes en coloration H&E. Il n'y a pas de

différence marquante dans l'aspect et l'arrangement des cellules de souris TS et HMZ. Cependant, c e d e s auornalies sont observées chez les souris HMZ, comme par exemple la . - présence de pigments de lipofuscine (figure 6). Ceuxci peuvent être retrouvés dans les foies de

souris TS âgées de plus d'un an mais dans le cas présent, ils sont observés chez des souris

HMZ qui n'ont que 3 mois. Egalement chez ces mêmes souris, des zones de nécrose coaguiante

sont souvent présentes (figure 6), ainsi que de l'inflammation en plus grande quantité que chez

les souris TS.

1.2 Microscopie électronique

La caractérisation s'est poursuivie au niveau de l'ultrastructure des cellules hépatiques. Les observations en microscopie électronique ont été effectuées sur des souris TS et HMZ pour la

mutation. Les caractéristiques des hépatocytes se retrouvent chez les deux types de souris,

comme par exemple la présence de granules de glycogène, de nombreuses mitochondries ainsi

qu'un RER (réticulum endoplasmique rugueux) bien développé (figure 7). Aucune diff6rence

majeure n'est visible entre les cellules des souris TS et celles des souris HMZ. La présence de

desmosomes est même observée chez les HMZ, alors qu'il est connu que ces structures sont

associée aux FIS, et s'assemblent h l'aide des FIS et des MFs (Green et COU., 1987; Garrod,

1993).

A h d'examiner la distribution hépatique des différents filaments du cytosquelette. les patrons

d'expression des K8, KI8 et actine ont été observés par imm~~ofluorescence indirecte sur des

coupes congelées de foie de souris TS et HMZ. La K8 dans les cellules hépatiques des souris

TS se retrouve en plus grande concentration au niveau de la membrane plasmique, mais

s'exprime également dans le cytoplasme. tout comme la K18, sa partenaire habituelle pour

la formation de hlaments dans les hépatocytes (figure 8). Dans les cellules de souris HMZ, la

présence de la K8 n'est pas détectée, tel qu'attendu. La K18 par contre se retrouve dans les

Figure 6.

Colorations histologiques B l'hématoxyline-éosine (H&E) de coupes congel6es de foie de souris.

A. Foie de souris TS de 20 semaines. zone périportale.

B. Foie de souris HMZ de 20 semaines. comportant des pigments de lipofuscine (fléches).

C. Foie de souris HM2 de 20 semaines présentant une zone de nécrose coagulante (flèche).

Figure 7,

Ul trastnicture des cellules de foie de souris de type sauvage (A) et homozygotes (B) par microscopie electronique. Les flèches indiquent les complexes de jonction delimitant les canalicules biliaires, qui comprennent entre autres des desmosomes.

Figure 8.

Distribution comparative par imrnunofluorescence indirecte des K8 (ab), K18 (c,d) et actine (e,O dans des sections de foie de souris de 20 semaines TS (a,c.e) et HMZ (b.d.f).

Barre de mesure = 10 pm

cellules des ductules biliaires. du fait qu'elle peut s'associer à la K7 en absence de la K8 (figure

8). En œ qui conœme l'actine, le patron d'expression semble perturbé chez les souris HMZ pour des raisons encore imprécises. Le patron de I'actine chez les souris TS d6finit très bien le contour des membranes ainsi que les oinalicules biliaires. Par contre, chez les souris HM., k distribution de I'actine est perturbée et souligne une structure inembraaaire tds irrégulière (figure 8 ). Des analyses pdiiminaires ont éîé effectuées concemant le patron d'expression des MTs. A

premi&re vue, aucune diff6rence frappante n'est notée dans l'organisation de œ réseau entre les

hepatocytes des souris TS et HMZ

2. Hépatectomies partielles

Dans le but de determiner la capacité du foie B régdndrer sa masse perdue, tout en maintenant les fonctions m6taboliques nécessaires à la survie de l'animai, une sene d'hépatectomies partielles ont 6î.é effectuées sur les trois groupes de souns.

Les lobes restants des foies des souris hdpatectomisées sont observés sur une période de 3 j

après hépatectornie, car les expériences préliminaires ainsi que les données de la littérature ont mont& que la r6générescence la plus marquée se produit au cours des trois premiers jours suivant la chirurgie, et que pendant cette période le foie récupère la presque totalité (> 70 46) du volume enlevé lors de l'opération (Higgins et Anderson, 193 1).

La premi5re serie d'hépatectomies a porté sur des souris Qgks de 20 semaines, et la proportion

du foie enlev6 était de Z3. Le résultat le plus important de ces expériences est à l'effet que les souns KM2 sont incapables de survivre à ces opérations dans une proportion de 100% (tableau 2). En fait, elles succombent au cours des premihs heures suivant l'opération. Les souris TS, quant A elles, récupèrent nonnalement dans une proportion de 8096, dors que le pourcentage de survie des souris H I Z se situe entre les deux (56%).

Afin de vefi~er si la proportion du foie enlevd etait importante pour le phhotype des souris HMZ, des hépatectomies de 113 ont egalement 6t.é effectuées. Les résultats obtenus sont à l'effet que cette opération ne présente pas un stress assez grand, car 898 des souris HMZ survivent sans peine à ces Mpatectornies (tabIeau 2).

L'âge des souris semblait kgalement un facteur considérer, 6tant dome que le phénotype intestinal etait observe chez les souris HMZ à partir de 9 semaines (Baribault et coll., 1994),

mais dans une proportion beaucoup plus considerable chez les souris de plus de 20 semaines,

Tableau 2.

S w i e des souris TS, HTZ et H M 2 3 j après hbpatectomies partielles sous anesthesie au pentobarbitai

âge 1

20 semaines

10 semaines

génotype

TS

HTZ r

HMZ

TS

HMZ

-

hépatectomie 2/3

4/5 (80%)

Y9 (56%)

0/9 (0%)

8/10 (80%)

6/10 (60%)

hépatectomie 113

3n (100%)

-- 8/9 (89%)

selon les données du laboratoire d'accueil. Des hépatectomies ont donc étC effectuées sur

des souris ggées de 8 semaines. Comme le &montrent les résultats (tableau 2), les jeunes

souris HMZ survivent B I'opération dans une proportion bien plus importante que les souris

plus iigées, mais leur taux de survie demeure quand &me signincativement moins élevt que pour les souris TS. Donc, la sensibilit6 des souris HMZ à l'hépatectomie est progressive avec l'âge et dépend 6galement de la s6vérité de l'opération.

Un phénotype tout à fait inattendu s'est déclaré chez les souris HTZ suite aux hépatectornies. En effet, lorsque les foies des souris sont prélevés pour examen 3 j après I'h@atectomie, 67% des souris HTZ présentent un foie de couleur blanche conbrairement B la couleur rouge habituelle* De plus, la majorité des hépatocytes de ces souris sont remplis de vacuoles observables en

coloration HBrE (tableau 3, figure 9 B). L'analyse avec le colorant Rouge de Nile démontre que

ces vacuoles sont composées de lipides. Autrement dit, les souris W Z développent une stéatose suite à une hépatectomie partielle de 2/3. Malgré ce fait, le foie des souris HTZ récupère quand même le volume perdu lors de l'hépatectomie, de la même façon que celui des souris TS

(figure 9 A). De plus, il est à noter que le phénomène de stéatose est transitoire car les foies des souris affectées retrouvent une apparence normale lorsqu'ils profitent & 4 j de plus pour récup6rer.

3. Contenu comparatif en K8 et KlS chez les souris TS, HTZ et HMZ

Afin de determiner si le phénotype observ6 chez les souris HTZ pouvait ê t ~ causé par une

diminution de l'expression de la K8 chez ces souris, des analyses de type Western ont été

effectuées à partir de morceaux de foie congelés. Les niveaux de K8 et de K18 ont été

détermines chez les 3 groupes de souris, âgées de plus de 20 semaines. Les résultats montrent comme prévu que les souris HMZ n'expriment ni la K8 ni la K18 dans les extraits de foie (figure 10). Il est à noter qu'en immunofluorescence, la présence de la KI8 est détectée dans les cellules des ductules biliaires (figure 8), 03 eiie forme des nlaments avec la K7. Il est probable que la quantité de ces cellules n'est pas assez importante par rapport aux hbpatocytes pour que

I'expression de la K18 soit detectée en analyse Western dans un extrait de foie total. Les

niveaux de K8 sont en genéral assez équivalents entre les souris HTZ et TS, étant quelquefois un peu plus élevés chez les souris TS, dépendamment des individus étudiés. Pour la K18,

une légère augmentation est observée chez les souris TS par rapport aux souris HïZ .

Tableau 3. Nombre de souris de plus de 20 semaines présentant un foie gras après hépatectomies partielles de 2/3.

Figure 9.

A. Aspect des foies de souris TS (a,c) et HTZ (b,d) avant (a.b) et après (c,d) hépatectornies de 2M B. Coloration histologique (H&E, e ) et au Rouge de Nile (f) démontrant I'accumulation de Lipides

dans le foie des souris HTZ après hépatectornies de 2 3

homozygotes

0/9 (0 %)

L

type sauvage 1

O15 (O %)

-

hétérozygotes

6/9 (67 %)

Figure 10.

Détermination des niveaux de protbines de K8 (B) et de KI8 (C) dans des homogénats de foie de souris TS (2,5,8), HTZ (3,6,9) et HM2 (4,7,10) de 20 sem. A = gel coloré au Bleu de Coornassie pour montrer que la quantité de protéines deposées dans chaque puits est équivalente (30 pg). Le puits 1 représente les marqueurs de poids moléculaires.

4. Réponse des hépatocytes à 19isolement par la méthode de perfiision

Suite aux résultats obtenus avec les hépatectornies partielles, un autm essai a été utilisé pour ttudier la réponse des htpatocytes a un stress mécanique. La m6thode de pefiion sert à isoler les hépatocytes pour obtenir entre autres une culture primaire. Eue permet Cgaiement d'évaluer l'intégrité de ces cellules car elles doivent être en mesure de supporter la p~ss ion engendde par la circulation du tampon de pemision.

Les premières observations lors de ces expériences ont eté ii l'effet que le foie des souris HMZ réagit aès mal dès I'ttape de la pemision & l ' H e p B 10 &min. Le tissu devient gonflé et rigide, un peu comme si les cellules éclataient sous l'effet de la pression. Après la collaghse, les cellules secouées dans le milieu pour les recueiïlir ne tombent pas dans un nuage comme les cellules TS, mais plutôt par aggrégats. Dans ces conditions, la viabilité des Mpatocytes après la

perfusion se situe tout près de zéro, alors que le rendement de cellules recueillies se rapproche de celui obtenu pour les souris TS (résultats non montrés).

Diffdrentes variables ont été étudiées et ont permis de déterminer que la hgiiité des hépatocytes de souris HMS est véritablement liée a leur résistance niminuée à la pression de perfusion. Par exemple, un lavage avec un milieu contenant du calcium n'améiiore pas la viabilité des hépatocytes de souris HM2 après la perfusion. De la même façon, la concentration de la

collagénase a été diminuée afin de rejoindre la concentration optimale déterni.uk dans la

littérature (Klaunig et cou., 198 la), mais aucune amelioration n'a 6té observée dans la viabilité des cellules. Les deux seuls facteurs qui influencent la viabilité des hépatocytes de souris HMZ soumis à une perfusion, sont le débit de pemision ainsi que l'âge des souris. Un debit de lavage à l ' H e p diminué de moitié (SmVmin) par rapport au débit utilisé pour les souris TS (10 mllrnin) permet d'augmenter la viabilité des htpatocytes de souris HMZ de 20 semaines de O

42% (tableau 4). Lorsque les souris sont âgées de moins de 10 semaines, la viabilité se situe alors en moyenne à 6546, démontrant encore une fois l'importance du facteur âge dans le phénotype HMZ. (Ii est à noter que les souris TS perfusées à 5 d m i n se comportent exactement de la même manière que lors d'une perfusion 10 mVmin). Cependant, malgré le fait que la viabilité peut être améliorée pour les hépatocytes de souris HMZ en variant le deot de

perfusion et en prenant des souris plus jeunes, les valeurs obtenues pour les souris TS demeurent significativement plus élevées. Cette extrême hgiIité des hépatocytes de souris HMZ à la pression de la perfusion démontre un rôle pour la K8 dans le maintien de I'intégrit6 h6patocytaire.

Tableau 4.

Rendement et viabilité des hepatocytes de souris après pemision (Hepes 10 d m i n pour les souris TS et 5 ml/rnin pour les H T Z et les HMZ, et collagénase 5 mVmin pour toutes les souris).

type sauvage

hétérozygotes

homozygotes

10 semaines

20 semaines

.

rendement fceiides /foie)

10 semaines 4 5 10'

20 semaines 63 x 10' + 10 semaines 2,4 x 107

20 semaines t 2,4 x 107

viabilité (46) 1 nombre de souris

5. Culture primaire des hépatocytes

Suite aux résultats obtenus lors de la perfusion du foie et l'isolement des h6patocytes. il devenait

intéressant d'analyser le phénotype in vitro des cellules survivantes. L'objectif premier était

d'6tabli.r des conditions de culn~e~ pour tventuellement approfondir I'aualyse du phhotype

hépatique entraîn6 par l'absence de Kg, en étudiant diff6rents aspects in vitro. Cependant, la

mise en culture a permis d'observer d'autres phenotypes, notamment au niveau de l'effet de

I'absence de FIS sur les autres réseaux du cytosquelette (MFs et MTs).

Des etudes préliminaires ainsi que des d o ~ é e s tirées de la 1itthhu-e ont montré que le cuiiag&ne

de type I sous fome de gel représente la meilleure matrice pour la culture des hkpatocytes. Cette

matrice permet un attachement optimal des hépatocytes, ainsi que le maintien des fonctions

diff'renciées lorsque les ceIIdes sont mises en culture à haute densité (Ben-Ze'ev et coll.,

1988).

Le DMEM a 6té choisi comme milieu de base, après comparaisons avec le Ml99 et I'a-MEM (résultats non montrés), et egaiement en se basant sur la démonstration faite par differents

groupes selon laquelle le DMEM supportait mieux la croissance des hkpatocytes (Mitaka et

COU., 1991; Block et COU., 1996). Plusieurs 6lCments cités dans la littérature comme nécessains

pour la croissance et le maintien des fonctions diffihnciées, tels que décrits dans I'introduction

(pp. 20-2 l), sont ajoutés au milieu de base. Malgré la présence de tous ces déments, les

conditions de culture ne sont pas encore au point pour obtenir de belles cultures A long terme.

même au niveau des cellules de souris TS. Pour cette raison, les résultats qui suivent

s'appuient sur des observations effectuées B court terme, soit 3h et 24h après l'ensemencement

des hépatocytes.

5.1 Aspect morphologique

Tout d'abord, l'aspect morphologique des hepatocytes en culture isoles des 3 types de souris a

été observé par microscopie optique en contraste de phase. Ces analyses ont été effectuées sur des souris âgées de 20 semaines, étant donné que les phénotypes majeurs se rencontrent à

cet âge, tant au niveau de l'h6patectomie que de la perfusion. Comme les cellules de souris HTZ ressemblent énormément aux cellules de souris TS, il n'a pas eté jugé nécessaire de les inclure

ici. Par contre, des diffkrences frappantes ont tté observées entre les cellules des souris HMZ et

TS .

Remièrement, après 3 h d'attachement, les cellules de souris HMZ demeurent plus rondes et leur contour est moins bien d 6 f i que celui des hépatocytes de souris TS (figure 11). A œ

stade, de nombreux debris ceildaires sont présents dans le fond du plat. Les cellules de souris

TS quant à eues commencent ii s'&taler et ii s'assembler en travées, tout en présentant des

d i c u l e s biliaires. Ensuite à 24 h, I'observatim la plus marquante est encore au niveau de la

défiition de la membrane, qui est beaucoup plus floue chez les hCpafocytes de souris EMZ. L'arrangement des cellules est Cgalement diffCrent, la démarcation entre les cellules est

difficilement distinguée et il y a beaucoup de cellules mortes. Chez les souris TS, les hépatocytes en culture s'organisent en havées disposées de façon régulière, imitant la situation UI

vivo , et les cellules sont aisément distinguables l'une de l'autre. Les hépatocytes de souris

HMZ, par contre, semblent pousser de f w n désorganisée, sans être capables de former des

stnictures rkguli*res. Il y a toujours beaucoup plus de cellules mortes parmi les hépatocytes de

souris HMZ que parmi ceux de souris TS. Egalemen& leur temps de sunie en culture ne

depasse pas 48 h comparativementaux hdpatocytes de souris TS qui peuvent être maintenus au moins une semaine.

5.2 Contenu comparatif en protéines du cytosqueZette entre les cellules des souris TS et HM2

Les niveaux d'expression des protéines des autres éléments du cytosquelette (MFs et MTs) ont également et6 ddéterminés, d'examiner la possibilité d'une compensation par 1 'un ou l'autre de ces réseaux en absence de Fis chez les sourÏs HMZ. La comparaison a 6té effectuee entre les

niveaux de ces protéines in situ (homogénats de foie et htipatocytes frafchement isolés), par rapport à la situation in vitro (hepatocytes en culture depuis 3 h et 24 h). Ce qui résulte des

obsentations in situ en œ qui a trait, premihment, à 1 'actine, est à l'effet que son contenu est

plus abondant chez les souris TS dans les homogénats de foie. Par contre, dans les hépatocytes fraîchement isolds, son niveau est nettement plus Bev6 chez les souris HMZ (figure 12 A). Pour la tubuline, les résultats montrent un niveau augmenté chez les souris HMZ in situ . Les niveaux d'actine et de tubuline dans les hépatocytes in vitro sont beaucoup plus dlev& chez les souris

HMZ, autant après 3 h que 24 h de culture (figure 12 B ) .

5.3 Distribution des MTs et MFs en immunofluorescence

Suite B ces résultats, des analyses comparatives par microscopie confocale ont été effectuées sur

les hepatocytes, afin d'examiner I'effet de l'absence de FIS sur le patron de disvibution et

l'organisation fibrillaire des W s et des MFs.

Figure 1 1.

Aspect morphologique des hépatocytes de souris TS (a,c) et HMZ (b,d) de 20 semaines après 3h (a,b) et 24h (c,d) de culture sur collagène de type 1.

foie

I I

3 heures

hé patocyt es isolés

24 heures

Figure 12.

Détemllnation des quantités relatives d'ache et de tubuline par analyses de type Western chez des souris TS (a) et HMZ (b) dans le foie in situ (A) et des hépatocytes en culture sur collagène de type I depuis 3h et 24h (B).

Dans les h6patocytes de souris TS, l'actine est membranaire et délimite un contour régulier des cellules (figure 13). Après 3 h de culture, il y a très peu d'actine. tout amune les analyses de

type Western le démontrent (figure 12). et sa distribution est essentiellement membranaire. A

24 h, des canaiides biliaires sont obsewés et très bien définis. 11 semble y avoir plus d'actine après 3 h de culture dans les htpatocytes de souris HMZ que dans ceux des souris TS. Des aggrégats sont visibles au niveau de la membrane. et une coloration cytoplasmique est 6galement obsewée. Le patron d'actine dans les hépatocytes de souris HMZ montre bien que la

morphologie de ces hépatocytes en culture est ciifferente de celle des cellules normales. La plus grande diffhnce s'observe 24 h. alors que l'actine déhite le contour des cellules, qui dans

ce cas est très irrégulier contrairement aux cellules de souris TS, qui sont polygonales. Les

hépatocytes de souris HMZ sont plus etirés. moins bien &ai& et leur arrangement entre eux est très irrégulier, alors que leur noyau est plus gros, tel qu'observe @alement en contraste de phase (figure 1 1).

La tubdine est pratiquement absente ii 3 h dans les hépatocytes de souris TS, alors qu'elle se

retrouve en quantit6 très faible au niveau de la membrane plasmique (figure 14). Puis, sa distribution devient cytoplasmique, et de très beaux réseaux sont observés avec des amas

périnucléaires qui pourraient représenter le centre organisateur des micronibules (h4TOC). La

coloration pour la nibuline est très intense dans les hdpatocytes de souris HMZ a 3 h,

mmparativementà ce qui est retrouve dans les hdpatocytes de souris TS. Comme pour I'actine, un marquage cytoplasmique est aussi observé. A 24 h cependant, contrairement aux cellules de souris TS, la présence de MTOC n'est pas d e t e c e dans les hdpatmytes de souris FMZ, tandis

que l'intensité du signal est assez équivalente.

Le patron de distribution de la K8 est également présente dans cette section. dans le but de

montrer l'importance de son expression, auisi que par mesure de comparaison avec le patron des

MFs et des MTs. La K8 est observée dans toutes les cellules de souris TS (figure 15). Sa distribution est membranaire après 3 h, et devient plus cytoplasmique après 24 h. Bien entendu, la K8 est absente dans les h6patocytes de souris HMZ, tout comme la KI8 qui n'a même pas été observée attachée aux desmosomes. alors que sa présence avait et6 détectée à œ

niveau dans les corps embryonnaires d6ficients en K8 (Baribault et Oshima, 1991).

Figure 13.

Organisation fibrillaire des MFs (actine) dans des hépatocytes de souris TS (ac) et HMZ (b,d) de 20 semaines après 3h (a,b) et 24h (c.d) de culture sur collagène de type 1. La flèche pointe un canalicule biliaire.

Figure 14.

Organisation fibrillaire des MTs (tubuline) dans des hépatocytes de souris TS ( a s ) et KMZ (b,d) de 20 semaines après 3h (a.b) et 24h (c,d) de culture sur collagène de type 1. La flèche pointe un MTOC.

Figure 15.

Organisation fibrillaire des FIS de K8 dans des hépatocytes de souris TS (a,c) et KM2 (b.d) de 20 semaines après 3h (a,b) et 24h (c.d) de culture sur collagène de type 1.

DISCUSSION

L'intérêt pour les k6ratines s'est longtemps limité à leur utilisation comme marqueurs de la

différenciation cellulaire et de la transformation néoplasique (Osborn et coll., 19m; Lane et Alexander, 1990; Moll, 1994). Depuis quelques années, de nombreuses mutations au niveau de

k6ratines 6pidenniques, responsables de l'apparition de différentes maladies de la peau, ont été

identifiées, concentrant les efforts de recherche dans œ domaine (Vassar et coll., 1991;

Coulombe, 1993; Chan et coll., 1994, McLean et Lane, 1995). Un rôle de maintien de

l'intégrité cellulaire a 6té attribué à ces kératines. Les résultats présentés ici démontrent une

fonction semblable pour les kCratines de I'épithéiium simple au niveau du foie. En effet, des

souris déficientes en K8, protéine reprhtat ive de œ type de kératines, présentent des signes

de dégdnérescence précoce au niveau heptique, ainsi qu'une incapacité à récupérer d'une

hépatectorniepartielle de 2/3, et une résistance diminuée à une débit nonnal de perfusion utilisé

pour isoler les hépatocytes. Tous ces phénomènes peuvent être liés à une perte d'intégrité

hgpatocytaire due A l'absence de K8, donc de Rs, dans les hépatocytes.

Les résultats obtenus lorsque les cellules sont en situation normale, sans stress, indiquent un

rôle subtil des keratines dans le maintien de l'intégrité hepatocytaire. Par exemple, les

observations microscopiques en H&E montrent la présence de pigments de lipofuscine dans des

hepatocytes de souris HMZ d'environ 20 semaines, alors que ce phknomene se retrouve

gendralement chez des souris âgées de plus d'un an. 11 est ghralement admis que la lipofuscine est formée d'une accumulation de corps résiduels derivant d'organelles en voie de

peroxydation par des radicaux libres. Les deux processus suivants sern Ment importants dans

l'émergence de ces pigments: le premier concerne l'exposition des constituants cellulaires ii des

radicaux libres provenant de l'environnement ou formés intraceliulairement, alors que le second

implique la dggradation autophagique dans les lysosomes secondaires (Brunk et coll., 1992).

Comme les keratines semblent jouer un r61e dans l'autophagie (Blankson et coll., 1995). alors

l'absence de K8 impliquerait une perturbation ou un ralentissement du processus. Ceci augmenterait la période d'exposition du matériel à digérer aux composés oxydants, et

favoriserait ainsi la formation des pigments de lipofuscine.

Les zones de nécrose observées dans le foie des souris HMZ peuvent être attribuées il une perte

d'intégrité membranaire au niveau des hepatocytes, car il est connu qu'une membrane plasmique

endommagée induit une perte d'inegrité cellulaire, menant à la nécrose (Zimmerman, 1978).

Ces résultats confirment les premières données rapportées par le groupe ayant g 6 n M les souris

HMZ, qui avait remarqué 6galement de l'inflammation en plus grande quantité chez celles-ci par

rapport aux souris TS (Baribault et coll., 1994). Ces obsemations sont en accord avec Les

mesures des niveaux enques des enzymes aspartue arninotransf6mse (AST) et alanine aminotransf6me (ALTI, g6n6raiement considérés comme des marqueurs de neCrose hépatique.

Des taux plus élevés que la noxmaie sont en effet retrouvés dans la ci~~ulation des souris FVBN HMZ (Banbault et coll., 1994). De la même f q n , des souris transgéniques pour une protéine

m u e de K18 agissant comme un dominant-ndgatif' pnkmtent des zones de nécrose, de

l'inflammation et des taux élevés d'AST et d'ALT (Omary et coll., 1995). Ce phénomène de

nécrose a egalement 6té observe dans des souris transgdniques exprimant de façon ectopique la

K14 dans le foie (Albers et coll., 1995). L'expression de cette kératine epidermique induit la

perturbation des filaments de K8/K18 dans les hépatocytes, tout comme la p e n c e de la K18

mutante. Tout ceci demontre que les anomalies retrouvées dans les h6patocytes de souris KMZ sont vraiment causées par L'absence de As normaux.

Un autre phenotype observe chez les souris HMZ Concerne la masse moyenne du foie, qui est

aupentée de 20% par rapport aux souris TS (hranger et coll., soumis). Pour expliquer œ

phénotype, il est possible d'envisager un mecanisme de compensation. C'est-à-dire que le foie a

besoin de plus de cellules pour exercer le même travail qu'un foie normal. étant donné que les

cellules subissent une perte d'intégritk due à l'absence de K8. Cependant, il se pounait que la

masse des foies de souris HMZ soit plus élevée en raison d'une augmentation de la grosseur, et

non du nombre des cellules. En effet, tel que décrit dans les résultats, il est possible d'observer

en microscopie que les noyaux des hépatocytes de souris HMZ sont nettement plus gros que

ceux des souris WT. Des mesures plus précises, telles que la comparaison du volume des

hépatocytes par rapport ii la ploïdie, sont à envisager pour éclaircir ce ph6nomène.

Au niveau ultrastrucrural, aucune différence n'est observee entre les hdpatocytes de souris TS et

HMZ. Comme les desmosomes et les hémidesrnosornes représentent les seules structures

dlulaires connues interagissant directement avec les keratines de 1'6pithdium simple (Stappenbeck et Green, 1992; Stappenbeck et wll., 1994). l'absence de K8 dans les hépatocytes aurait pu induire une pemirbation au niveau de ces structures. Cependant, il est connu que les

FIS de K8K18 ne sont pas requis pour l'assemblage des desmosomes, ce qui peut expliquer

leur apparence normale en microscopie électronique (Oshima et coll., 1996). De plus, il a été

démontré que les KI8 et K19 peuvent s'associer aux desmosomes dans les corps embryonnaires

en suspension, en l'absence de K8 (Baribault et Oshima, 199 l), donc le même phhomène doit

se produire dans les hepatocytes de souris. Toutefois, il est possible que les keratines participent 2 la modulation de la fonction des desmosomes, qui contiennent entre autres des

Lcs données en immunofluorescence in situ présentées ici révèlent que l'absence de FIs dans les hépatocyfes entraîne une pemubation importante du réseau d'actine. Jusqu'ii maintenant le rôle de stabilisation de la membrane plasmique &ait surtout imputé B I'actine (Hia et Luna, 1994;

Kusumi et Sako. 1996). mais les résultais obtenus dans œ travail indiquent que les keratines sont également impliquées dans cette fonction, probablement par le biais d'interactions. directes ou indirectes, avec l'actine. Plusieurs travaux in vitro montrant la désorganisation des FIs par des agents perturbateurs spécifiques aux MFs sugghent des interactions entre ces deux réseaux

(Knapp et COU, 1983; Green et cou, 1987; Ohta et con., 1988), mais il est plus probable que ces

interactions se produisent par l'intermédiaire de protéines associees, que de façon directe entre MFs et FIS. Des données récentes concernant la plectine indiquent que cette protéine aurait le potentiel pour médier ces interactions. En effet, eile possède un domaine de liaison aux FIs et jusqu'h maintenant, il a été démontré qu'elle se lie aux FIS, ainsi qu'aux EJITs et B la myosine II, qui elle se lie B I'actine (Svitkina et coil., 1996). Des études en triple immunofluorescence (FIS, MF5 et plectine) avec reconstitution en 3 dimensions pourraient permettre de confumer ces

interactions de façon plus directe. L'analyse de la distribution des MTs dans les trépatocytes de

souris TS et HM2 deviendra un ajout indispensable afin de compléter ces travaux, lorsque les méthodes de fixation de la tubuline in situ seront mises au point dans le laboratoire d'accueil. Les donnees prébinaires à cet effet ne semblaient pas montrer de différence notable entre les souris TS et HMZ, mais se doivent d'être répétees, compte tenu entre autres des dsuitats

obtenus in vitro quant à la distribution des MTs dans les hépatocytes de souris HBKZ, ainsi que des observations concernant les niveau plus &levés de tubdine dans ces hépatocytes, aussi bien in situ qu'in vitro.

Alors qu'un rôle pour la K8 dans le maintien de ITintégrit6 structurale des hepatocytes est

suggére par les résultats discutt5s précédemment, cette fonction est ellement mise en évidence lorsqu'un stress est induit, par exemple suite à I'hepatectomie partielie, ou lors de l'isolement des hépatocytes. En effet, lorsque des souris HMZ de 20 semaines sont soumises à une hépatectornie de Z3, aucune ne survit plus de 6 h après I'opération. Les souris plus jeunes

démontrent un meilleur taux de survie mais tout de même infdrieur B cehi des souris TS, alors qu'une hépatectomie de 1B se montre très peu dérangeante peu importe le type de souris. L'int6grité membranaire entre encore en ligne de compte dans l'explication de ces phénotypes.

Avec l'âge, l'accumulation des agressions contre la membrane fait en sorte que d e c i &vient

trop endommagée pour répondre à un stress, comme l'augmentation brusque de pression sanguine dans les lobes restants du foie, suite à l'ablation des 2/3 du tissu. En microscopie électronique, il a été observé que des ~rythrocytes pénétraient dans le cytoplasme des

sanguine dans les lobes restants du foie, suite à l'ablation des 2n du tissu. En microsaipie

électronique, il a dté observe que des 6xythrocytes pénétraient dans le cytoplasme des

hdpafocytes de souxis HMZ après l'h6patectornie, démontrant de f q n claire la perte d'intégritd

membranaire de ces cellules (loranger et al ., soumis) .

L a sensibilil des souris B l'hépatectomie @elle augmente en fonction de l'âge et de la

proportion de foie enleve. II a été constaté de plus que l'utilisation du pentobarbital m n m e

anesthésiant était un fxteur aggravant dans Ia r6ponse des souris HMZ & l'h6patectomie. La

détoxification du pentobarbital s'effectue par les hépatocytes. Une surdose de cette drogue

causée par un mauvaise détoxification entrafne la mort par arrêt respiratoire, tout comme il est

observé chez les souris HhrlZ. La substitution du pentobarbital par I'ether permet aux souris

HMZ de survivre jusqu'à 45 h après l'h6patectomie (Loranger et coll., soumis). Ceci implique

pour la K8 la possibilité d'une fonction autre que mécanique, en accord avec d'autres btudes visant 2 démontrer son rôle dans le processus d'autophagie, son implication dans la résistance

aux drogues anticanctkuses et autres agents toxiques tels la grisduvine (Blankson et coll.. 1995; Bauman et d l . , 1994; Cadnn et coll., 1995).

Le phhotype de stéatose retrouvd chez les H"ï2 semblait particulihxnent intriguant au premier

abord, étant dome qu'ordinairement la présence d'un alkle de type sauvage est suffisante à

l'expression normale de la protéine. Les résultats des analyses de type Western ont permis de

constater que ce phdnotype n'est pas d(i à une diminution de moirie dans l'expression de la K8.

L'hypothèse que la présence du @ne neo dans le gène mute de la K8 exercerait un effet non

désir6 sur l'ADN au locus de la K8 a eté envisagée. Des h6patectornies sur des souris

transgeniques exprimant le gène neo ont eté effectuées, et de façon surprenante, ces souris ont développé une stéatose suite ii l'opération dans les mêmes proportions que les souris HTZ (Loranger et coll., soumis). Donc, le phhotype observe chez les souris H î Z peut être expliqué par la présence du gène neo dans le hansgène de la K8. Ceci ne donne pas d'indication supplémentaire quant au r61e de la K8, mais incite ii faire très attention dans I'interpr6tation de pathologies apparaissant chez des souris transgéniques portant le gène neo.

L'isolement des h+atocytes par la méthode de perfusion, qui au depart n'était qu'une 6tape en

vue d'obtenir des cellules en culture, a permis de mettre à nouveau en évidence la fragilité

particulière des hépatocytes de souris HMZ face à un stress. L'intégrité membranaire est encore mise en cause dans le ph6notype observé ici, étant dom6 que les hkpatocytes de souris HMZ ne

survivent pas à une pression de perfusion de 10 Wmin, alors que lasurvie est augmentéeà

42 % lorsque la pression est diminuée de moitie. Dans œ cas-ci comme pour I'hépatectomie, le

phénotype devient plus sévbre en faction de l'âge, suggérant une détérioration progressive de

l'intégrité hdpatocytaire. M m de v6ifier si la mort cellulaire lors de la perfusion est

v6ritab1ement w é e par I'éclaîement de la membrane, des &des de rnicfo~copie ttectronique sur les cellules de souris TS et HMZ observées avant et après la perfusion restent à compléter.

Cette fragilité à la pression de perfusion a 6galement eté notée pour les souris exprimant une KI8 mutante (Omary et coll., 1995). De plus, des expériences de microinjection sur des fibroblastes

de souris deficientes en vimentine (FI de type III) indiquent que ces cellules sont &galement plus

fragiles, suggerant un rôle g&neral pour les FIS au niveau du maintien de l'intégrité cellulaire (Goldrnan et coll., 1996). De la même f q n , cette fonction avait Cté envisagée dans le cas des

souris CS7BU6 HM2 dors que ces animaux meurent au 12ème jour embryonnaire, leur foie

étant incapable de supporter la croissance h6matopdietique üand6rée du sac vitellin aux cellules hépatiques ii œ stade (Baribault et coll., 1993).

Etant donné la fragilité des hépatocytes de souris HMZ, la mise en culture de ces cellules a exige une attention particulière dans la recherche des meilleures conditions pour assurer leur suMe in

viao. Cependant, malgré l'enrichissement du milieu de culture avec une grande quantité d'dléments cités dans la litrérature comme nécessaires pour la croissance et le maintien des

fonctions diff6rencih des hépaîocytes, il n'a pas étt5 possible de maintenir les hépatocytes de

souris HM2 au-delà de 48 h en culture, dors que les hépatocytes de souris TS survivaient

environ une semaine. Comme la majorite des études sur le maintien prolonge d'héptocytes en culture ont port6 jusqu'à maintenant sur des cellules de rats, il se peut que la culture

d'hepatocytes de souris à long terme nécessi te des éléments supplémentaires. À cet effet, des

travaux récents amorcés dans le laboratoire d'accueil montrent que l'ajout de DMSO dans le milieu après 24 h de culture augmente le temps de survie des hdpatocytes de souris HM2 jusqu'à une semaine, ce qui pourrait permettre éventuellement des etudes in vi@o Zî plus long teme.

L'observation des hépafocytes de souris en culhue à 3 h et 24 h permet tout de même de mettre

en lumière des phenotypes intéressants. Les résultats de morphologie combinés ceux obtenus

par irnmunofluore~cence des MFs et W s montrent que les hépatocytes de souris HMZ ne s'italent pas aussi rapidement dans le plat et présentent un arrangement irrégulier,

paaiculi&rernent notable au niveau de la membrane. Les résultats d'immunofluorescence en œ

qui a trait aux niveaux d'actine et de tubuline viennent également confi~rmer les analyses

Western, qui indiquent un niveau plus dev6 de ces protkines dans les hépatocyfes de souris

HMZ au cours des 24 premières heures de mise en culture. De même, dans le foie in siru, les

niveaux d'actine et de tubuline sont augment& chez les souris HMZ (I'aciine dans les

homogenats de foie de souris HM2 est diminuée, mais comme elle est nettement plus élevée dans les hépatocytes fmAchement isolés, il est probable qu'in vivo son epitope soit masqut5 par une ou des molécules associées. possiblement de nature lipidique. qui ne change pas son poids moléculaire). De plus, ii est noté que la distribution des Mïs et des MFs dans les h6ptocytes de

souris HMZ ressemble au patron d'expression de la K8, et œ particulièrement 3 h de culture.

Ceci suggère que les kératines sont necessaires B œ stade précoce de l'établissement de la da i re

d'hépatocytes, et que l'expression plus abondante de même que les différences dans la distribution cellulaire de l'ache et de la tubuline ne parviennent pas à compenser parfaitement

pour l'absence des As. Une thde a d'ailleurs déjà démontré un phénom&ne de compensation semblable, alors que la quantité de Mïs est augmentée dans les axones de cellules déficientes en

NF-L (Zhao, 1994).

Cette compensation par les autres éléments du cytosquelette, quoiqu'imparfaite, expliquerait pourquoi les hépatocytes de souris HMZ se portent relativement bien dans des conditions nomdes. De plus, ces résultats mettent en évidence le r61e essentiel des FIS dans le maintien de

l'intégrité tissulaire hépatique lorsque les h6patocytes sont soumis à un stress.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Tout comme pour les kkratines t5pidermiques. un rôle de maintien de l'intégrité cellulaire a été

démontre pour les k6dnes de l'dpithéiium simple. Cependant, en se basant sur les résultats

obtenus ici, les souris FVBM qui échappent au phénotype lethal se portent bien dans des

conditions idéales, c'est-&-dire sans stress. Le d e d'une kératine de l'épithélium simple comme

laK8 dans le maintien de l'intégrité h(opat0Cytaire est donc mis en &idence surtout lorsque les

cellules sont soumises il un stress comme ceux induits par I'hépatecfomie et la perfusion.

Plusieurs expériences sont à envisager pour la poursuite de ces travaux, dont les plus

importantes consisteraient à d 6 f d r la mécanistique de la protection des cellules contre le stress

par la K8. Par exemple, une voie explorer concerne les interactions de la K8 avec l'&ne

(toutes deux retrouvees majoritairement au niveau de la membrane plasmique), dtant d o ~ d les

résultats obtenus montrant la perturbation du patron d'actine, ainsi que l'augmentation de son

contenu dans les hépatocytes en absence de KS. De plus. il serait intéressant d'effectuer des

analyses de type Northern, afin de déterminer si le mt?canisme de compensation par les autres

réseaux du cytosquelette en l'absence de FIS résulte d'une régulation au niveau uan~criptionnel.

Les résultats présentés ici montrent surtout un r81e de la K8 dans la résistance au stress

mécanique. Cependant, ils n'expliquent pas les données obtenues concernant la susceptibilté

des hkpatocytes HMZ aux stress toxiques comme ceux induits par le pentobarbital et la

griseofluvine (Loranger et coll., soumis; Cadrin et coll., 1995), de même que les interactions

connues des K8/K18 avec plusieurs protéines impliquées dans la tmsduction de signaux

comme les protéines de la famille 14-3-3 (Liao et Omary, 1996). Dans ce dernier cas, il est

intéressant de noter que I'association des protéines 14-3-3 avec les K8K18 se produit avec la

forme soluble de celles-ci. L'hypothkse qui inclurait tous ces rhultats serait que les FIS

assemblés sous forme de filaments ont une fonction dans le maintien de l'intégrité structurale en

offrant une résistance au stress mécanique, alors que les autres fonctions. non mécaniques, impliqueraient la forme tétramérique, soluble, des FI S.

La portée significative de ces résultats s'aligne avec les dom- obtenues récemment pour les

kdratines 6pidermiques ainsi que pour la K18 dans le foie. La confirmation de la fonction des

kératines épidermiques dans le maintien de l'intégrité cellulaire est venue de découvertes de

mutations ponctuelles dans des keratines de la peau, à l'origine de maladies humaines comme

l'épidennolyse bulleuse de type simple. Les diffkrents mocikles animaux chez lesquels les FIS

de 1'6pithélium simple sont pemibés ou absents, (Omary et coll., 1995; Albers et c d . , 1995),

de l'épithélium simple sont pertubés ou absents, (Omary et coll., 1995; Albers et COL, 1995), tout comme les souris déficientes en K8 utilisées ici, présentent des signes d'hépatite légère (nécrose, inflammation, élévation des taux dALT et d'AST). Jusqu'B tout récemment, aucune

mutation de kératine & I'6pithélium simple n'avait pu être associée & une maladie humaine. Cependant, lors d'une ttude sur 28 patients atteints d'une forme cryptogénique de cirrhose du foie, une mutation dans la K18 a 6té identifiée chez 1 de ces individus (Ku et cou., 1997). Comme plusieurs patients présentent des formes idiopathiques de maladies hépatiqes, il devient

très intéressant de tester ces individus pour la présence de mutations dans la K8 ou la KI 8, qui viendraient clairement coaf i er l'importance & ces FIS dans le maintien de i'intégrité tissulaire hepatique.

Organisation Iobulaire du foie

La figure 16 présente les diff6rents lobes du foie, afin de nsualiser lesquels sont reW lors d'une h6patectomie partielle. Lorsque 1' hépatectomie est de 113, le lobe enlevt est le médian. Pour faire une hépatectomie de 2/3, le lobe latéral droit est alors prélevé en plus du médian.

Figure 16.

Diagramme montrant les différents lobes du foie: A = latéral droit, B = médian, C = latéral gauche, D= caudal. DB = ductule biliaire, VP = veine porte

Tiré de Elmore et Sirica, 1991

BIBLIOGRAPHIE

1. Albers, K. M., Davis, FE, Perrone, T.N., Lee, E.Y., Liu, Y., et Vore, M. 1995. Expression of an epidermal keratin protein in liver of bansgenie miee causes structural and functional abnormalities. J. Ce11 Biol. lm 157-169.

2. Asch, H. L., Mayhew, E, Lazo, R.O. et Asch, B.B. 1993. Lipids covalently bound to keratins of mouse mammary epithelial cells. Biochem. Mol. Biol. Intem. 291161-1169.

3. Baffet, G., Clement, B., Glaise, D., Guillouzo, A., et Guguen-Guillouzo, C. 1982. Hydrocortisone modulates the production of extracellular material and albumin in long-term cultures of rat hepatocytes with other Uver epithelial cells. Biochern. Biophvs. Res. Comm. 109507-512.

4. Baribault, H., Leroux-Nicollet, I., et Marceau, N. 19235. Differential respoasivness of eultured suekling and adult rat hepatocytes to growth-promoting factors: entry into S phase and mitosis. J. Ce11 Physiolog~ 122: 105 1 12.

5. Baribault, H., et Oshima, RG. 1991. Polarized and functional epithelia can form after the targeted inactivation of both mouse keratin 8 alleles. J. Cell Biol. 115: 1675- 1684

6. Baribault, H., Price, J., Miyai, K. et Oshima, RG. 1993. Mid-gestational lethality in mice lacking keratin 8. Genes Br Dev. 7:ll9l-l2O2.

7. Baribault, H., Penner, J., Iozzo, R.V., et Wilson-Heiner, M. 1994. Colorectal hyperplasia and inflammation in keratin 8-deficient FVB/N miee. Genes & Dev. 8: 3964-293. -

8. Barnes, D., et Sato, 0. 1980. Methods for growth of cultured cells in serum-free medium. And. Biochem. 102255-270,

9. Bauman, P. A., Dalton, W.S., Anderson, J.M., et Cress, A.E. 1994. Expression of cytokeratin confers multiple drug resistance. PNAS. 9153 11-53 14.

10.Ben-Ze'ev, A., Robinson, G.S., Bucher, N.L.R., et Farmer, S.R. 1988. Celi-ce11 and cell-matrix interactions differentially regulate the expression of hepatic and cytoskeletal genes in primary cultures of rat hepatocytes. PNAS. 852161- 2165.

11. Bissell, D. M., Arenson, D.M.. Maher, J.J., et Roll, F.J. 1987. Support of cultured hepatocytes by a laminin-rich gel. Am. Soc. Clin. Investi 79801-812.

12. Blankson, H., Holen, I., et Seglen, P.O. 1995. Disruption O€ the cytokeratin cytoskeleton and inhibition of hepatocytie autophagy by okadaic acid. Exp. Ce11 Res. 218522-530.

13. Blessing, M., Rtither, U. et Franke, W.W. 1993. Ectopie synthesis of epidermal cytokeratins in pancreatic islet cells of transgenic mice interferes with cytoskeletal order and insulin production. J. Ce11 Biol. 120:743-75.

14. Block, G. D., Locker, J., Bowen, W.C., Peterson, BE, Katpi, S.. Strom, S.C., Riley, T.. Howard. T.A., et hiIichalopouios, G.K. 1996. Population expansion, clonal growth, and speeific differentiation patterns in primary cultures of hepatocytes indueed by HGF/SF, EGF and TGFa in a chemicaliy detùied (HGM) medium. J. Ce11 Biol. 132: 1133- 1 149.

15. Bloemendal, H, et Pieper, ER 1989. Intermediate filaments: known structure, unknown function. Biochem. Biophys. Acta. 1007:24S253.

16. Boller, Ky Keder, K. Baribault, H., et Doetschman, T. 1987. Differential distribution of cytokeratins mer microinjection of anti-cytokeratin monoclonal antibodies. Eur. J. Ce11 Biol. 43:459-468.

17. Bucher, N. L R, et Swaffield, M.N. 1975. Regulation of hepatic regener ation in rats by synergistic action of insulin and glueagon. PNAS. 72: 1157-1 160.

18. Cadrin, M., Marceau, N., et Baribault, H. 1995. Griseofluvin hepatotoxicity-related effects in keratin 8-deficient WB/N mice. Mol. Biot. Cell. 6S:2171.

19. Capetanalci, Y ., Smith, S. et Heath, J.P. 1989. Overempression of the vimentin gene in transgenic mice inhibits normal lens ce11 differenciation. J. Ce11 Biol. 1W1653- 1664.

20. Capetanalci, Y., Kuisk, I., Rothblum, K. et Starnes, S. 1990. Mouse vimentin: structural relationship to €os, jun, CREB and tpr. Onco~ene. 5:645655.

21. Canno-Fonseca, M., et David-Ferreira, J.F. 1990. Interactions of intermediate filaments with ce11 structures. Electron. Microscop. Rev. 3: 1 15-141.

22. Caron, J. M. 1990. Induction of albumin gene transcription in hepatocytes by extracelular matrix proteins. Mol. Cell. Biol. 10: 1239-1243.

23. Chan, Y.-M., Anton-Lamprecht, I., Yu, Q.C., Jackel, A., Zabel, B., Ernst, J.-P., et Fuchs, E. 1994. A human keratin 14 mknockoutw: the absence of K14 leads to severe epidermolysis buIIosa simplex and a iunction for an intermediate filament protein. Genes & Dev. 82574-253'7.

24. Chou, C.-F., Smith, A.J., et Omary, M.B. 1992. Characterization and dynamics of O-linked glycosylation and phosphorylation of human keratins 8 and 18. Biol. Chem. 267:3901-3906.

25. Chou, C.-F., Riopel, C.L., Rott, L.S., et Omary, M.B. 1993. A significant soluble keratin fraction in "simplet1 epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J. Ce11 Sci. 105:433-444.

26. Chu, Y. W., Runyan, R.B., Oshima, RG., et Hendrix, M.J.C. 1993. Expression of complete keratin filaments in mouse L cells augments cell migration and invasion. PNAS- 90:42614265.

27. Colucci-Guyon, E., Portier, M.-M., Dunia, 1.. Paulin, D., Poumin, S. et Babinet, C. 1994. Mice Iacking vimentin develop and reproduce without an obvious pheno t y p e . Cell .79: 679-694.

28. Coulombe, P. A., Hutton. ME., Letai. A., Hebert, A., Palier, A.S., et Fuchs, E- 1991. Point mutations in human keratin 14 genes of epidermobsis bullosa s implex patients: genetic and funetional anaiysis. Cell. 66: 1301-13 1 1.

29. Coulombe, P. 19%. The cellular and moleculsr bioiogy of keratins: beginning a new era. Curr. Op. Ce11 Biol. 5 17-29,

30. Cete, F., Collard, J.-F. et Julien, J.-P. 1993. Progressive neuronopathy in transgenic mice expressing the hurnan neurofilement heavy gene: a mouse mode1 of amyotrophie Iateral sclerosis. Cell. 733146.

3 1. Czech, M. P. 1989. Signal transmission by the insulin-like growth factors. Cell. 59: 235-238.

32. Dale, B. A., Resland, R-B., Lmvis, S.P., Underwood, R. A., et Reckman, P. 1997. Transient expression of epidermal filaggrin in cultured cells causes collapse of intermediate filament networks with alteration of ceIl shape and nuclear integr ity. J. Invest. Dematol. 108: 179-lm.

33. Domenjoud, L., Jorcano, J.L., Breuer, B. et Alomo, A. 1988. Synthesis and fate of keratins 8 and 18 in nonepithelid cells transfected with cDNA. EXP. Ce11 Res. 179:352-361. -

34. Duval, M., Ma, X., Valet, J.P., et Vincent, M. 1995. Purification of developrnentally regulated avian 400-kDa intermediate filament assoeiated protein. Molecular interactions with intermediate filament proteins and other cy toskeleton components. Biochem. Cell Biol. 73:6S 1-657.

35. Elmore, L. W., et Sinca, A. 199 1. Phenotypic character ization of metaplastic intestinal glands and ductular hepatocytes in eholangioflbrotic lesions rapidly induced in the caudate Iiver lobe of rats treated with furan. Cm. Res. 515752-5759. -

36. Foisner, R., et Wiche, G. 1991. Intermediate filament-associated proteins. Curr. Op. CeII Biol. 3:75-81.

37. Foisner, R, R., Bohn, W., Mannweiler, IL, et Wiche, G. 1995. Distribution and ultrastructure of plectin arrays in subelones or fat glioma C6 ceils differ ing in inter mediate filament protein (virnentin) expression. J. Stnict. Biol. 1 15304-3 17. -

38. Fowier, S.D., et Greenspan, P. 1985. Application of Niie Red, a fluorescent hydrophobie probe, for the detection of neutrai lipid deposits in tissue section: Cornparison with 011 Red 0. J. Histochem. Cvtochem. 33(8):833-836.

39. Franke, W. W., Hergt, M. et Grund, C. 19W. Rearrengement of the vimentin cytoskeleton during adipose conversion: formation of an intermediate filament cage around lipid globules. Cell. 49: 13 1-141.

40. Galou, M., Colucci-Guyon, E., Ensergueix, D., Ridet, J.-L., Guimenez y Ribotta, M., Pxivat, A., Babinet, C. et Dupouey, P. 1996. Disrupted glial fibrillary acidic protein network in astrocytes from vimentin knockout mice. J. Cell Biol. 133:853-863.

41. Garrod, D. R 1993. Desrnosornes and hemidesrnosomes. Curr. Op. Ce11 Biol. 530- 40.

42. Godfroid E, Geuskens, M., Dupressoir, T., Parent, 1. et Szpirer, C. 1991. Cytokeratiis are exposed on the outer surf'ace of established human munmary carcinoma cells. J. Ce11 Science. 9959ç.607.

43. Goebel, H. H., et Bomemann, A. 1993. Desmin pathology in neuromuscular diseases. Virchows Arch. tW 127-135.

44. Green, K. J., Geiger, B., Jones, J.C.R, Talian, J.C., et Goldman, R.D. lm. The relatioashlp between inter mediate Naments and microf'ilaments before and during the formation of desrnosornes and adherens-type junctions in mouse epidermal keratinocytes. J. Ce11 Biol. 104 1389-1402.

45. Guidice, G. J., et Fuchs, E 1987. The transfection of epidermal keratin genes into f'ibroblssts and simple epithelial cells: evidence for inducing a type 1 by a type II gene. Cell. 48:453-463.

46. Hedberg, K. K., et Chen, L.B. 1986. Absence OP intermediate filaments in human adrenal cortex carcinoma-derived ce11 line- EXP. Ce11 Res. 163509-517.

47. Heid, H. W., Moll, R., et Franke, W.W. 1988. Patterns of expression of trichocytic and epithelial cytokeratins in mammalian tissues. Differentiation. 37: 137- 157.

48. Hembrough, T. A., Vasudevan, J., Allietta, M.M. et Glass II, W.F. 1995. A cytokeratin 8-like protein with piasminogen-binding activity is present on the external surfaces of hepatocytes, HepG2 cells and breast carcinoma ce11 lines. Ce11 Science. 108: 1071- 1082.

49. Higgins, G. M., et Anderson, RM. 1931. Experimental pathology of the Iiver. 1. Restoration of the liver of the white rat following partial surgieal removal. Arch. pathol. 12: 186-202.

50. Ktt, A. L., et Luna, E.J. 1994 Membrane interactions with the actin cytoskeleto n. Curr. Op. Cell. Biol. 6: 120-130.

51. Jackson, B. W., Grund, C., Schmid, E., Burki, K., Franke, W.W., et Illmensee, K. 1980. Formation of cytoskeletal elements during mouse embryogenesis. Differenciation. 17:161-179.

52. Janmey, P. A., Enteneuer, U., Traub, P., et Schliwa, M. 1991. Viscoelastic properties of vimentin compared with other filamentous biopolymer networks. J. Cell Biol. 113: 155- 160.

53. Johansson, S., Kjeilen, L., HWk, M., et Timpl, R 1981. Subdrate adhesion of rat hepatocytes: a cornparison of Iaminin and fibroneetin as attachment proteins. J. Ce11 BioL 90:260-264.

54. Johnson, G. S. 1980. Metabolism of NAD and NI-methylnicotinamide in gro- wing and gr owth arrested cells. Eur. J. Biochem. 1 12.635-641.

55. Kemler, R, Bruiet, P., Schnebelen, M.T., Gaillard, J., et Jacob, F. 1981. Reactivity of monocIona1 antibodies against intermediate filament proteins during embr yonic development. J. Embrvoi. Exp. Momhol. 644560.

56. Klaunig, J. E., GoldbIatt, P.J., Hinton, D.E., Lipsky, MM., Chacko, J., et Trump, B.F. 1981a Mouse liver cell culture. 1. Hepatocyte isolation. In Vitro. 17913-925.

5'7. Klaunig, J. E., Goldbiatt, P.J., Hintoa, D.E., Lipsky, M.M., et Trump, B.F. 1981b. Mouse liver ce11 culture. II. Primary culture. In Vitro. 17926-934.

58. Klymkowsky, M. W., Miller, RH., et Lane, B. 1983. Morpbology, behavior, and interaction of cultured epithelial cells alter the antibody-indueed disruption of keratin filament organization. J. Ce11 Biol. %:494-509.

59. Klymkowsky, M. 1995. Intermediate filaments: uew proteins, some answers, more questions. Curr. Oo. Ce11 Biol. 7:46-54.

60. Knapp, L. W., O'Guin, W.M. et Sawyer, RH. 1983. Drug-induced alterations of cytokeratin or ganization in cultured epithelial cells. Science. 219:Sûl-503.

61. Ku, N.-O., et Omary, M.B. 1994. Identification of the major physiologie phosphorylation site of human keratin 18: potential kinases and a role in filament reorganization. J. Ce11 Biol. 127: 161-171.

62. Ku, N.-O., Wright, T-L,, Terrault, N.A., Gish, R., et Omary, M.B. 1997. Mutation of human keratin 18 in association with cryptogenic cirrhosis. J. Clin. Invest. 99: 19-23.

63. Kukumi, A., et Sako, Y. 19%. Cell surface organization by the membrane skeleton. Curr. Op. CeIl Biol. 8566-574.

64. Kulesh, D. A., Cecena, G., Darmon, Y.M., Vasseur, M. et Oshima, RG. 1989. Posttranslational regulation of keratins: degradation of mouse and human keratins 8 and 18. Mol. Cell. BioI. 9: 1553-1565.

65. Lamas, E., Zindy, F-. Seunn, D., Guguen-Guillouzo, C., et Brechot, C. 1990. Expression of insulin-like growth factor II and receptors for insulin-like growth factor II, insulin-like growth factor I and insulin in isolated and cultured rat hepatoeytes. Hepatolo~v. 13936-940.

66. Lane, E. B., et Alexander, C.M. 1990. Use of keratin antibodies in tumor diagnos i S. Cancer Biol. 1: 165179.

67. Lane, E. B., Rugg, E.L., Navsaria, H., Leigh, LM., Heagerty, A.H.M., Ishida- Yamamoto, A., et Eady, R.A.J. 1992. A mutation in the eonserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356: 244-246,

68. Lane, E. B. 1994. Keratin diseases. Curr. min. Genet. Dev. 4412418.

69. Lazarides, E. 1980. Intermediate filaments es mechanical integrators of cellular s p ac e. Naîure. 283249-256-

70. Lazarides, E 1982. Intermediate filaments: A ehemically heterogeneous, developmentally regulated elass of proteins. AMU Rev. Biochem. 51:219-258.

71. Lee, M. JC, et Cleveland, D.W. 1994. Neurofilament function and dydunction: involment in uonal growth and neuronal disease. Curr. Op. Ce11 Biol. 6 3 - 40.

72. Li, H., Choudhary, SK, Milner, D.J., Kuisk. I.R. et Capetanalci, Y. 1994. Inhibition of desmin expression blocks myoblast fusion and interferes with the myogenic regulators MyoD and myogenin. J. Cell Biol. 124827-841.

73. Liao, J., Lowthert, LA., Ghon, N. et Omary, M.B. 1995. The 70-kDa Heat Shock Proteins Associate with Glandular Intermediate Filaments in an ATP- dependent Manner. J. Biol. Chem. 27Ck915-922.

74. Liem, R K. K 1993. Molecular biology of neuronal intermediate filaments. Cm. Op. Ce11 Biol. 5: 12-16.

75. Lin, Q., Balisdell, J., OKeefe, J., et Earp. H.S. 1984. Insulin inhibits the gtu&corticoid-mediated in=rease in hepatocyte EGF binding. J. Ce11 Phvsiol. 1 19:267-272.

76. Liotta, L A., Golcifarb. R.H., Brundage, R., Siegal, G.P., Teranova, V., et Gabnsa, S. 1981. Elfeet of plasminogen activator, plasmin and thrombin on glycoprotein and collagenous components of basement membrane. Cancer Res. 41:4629.

7 7 Loranger, A., Duclos, S., Grenier, A., Rice, J., Wilson-Heiner, M., Barïbault, H., et Marceau, N. Simple epithelium keratins are required for the maintenance of hepatocyte integrity, especially under stress conditions. soumis.

78. Lowe, J., et Stevens, A. 1993. Histologie, p.21. Editions Pradel, Pans et Editions Edisem, Saint-Hyacinthe, Québec. 378 p.

79. Lu, X., et Lane, E.B. 1990. Retrovirus-mediated transgenic keratin expression in cultured fibroblasts: speeifie domain funetions in keratin stabilization and filament formation. Ceil. 62581-6%.

80. Magin, T. M., Jorcano, J.L.. et Franke, W.W. 1983. Translational products of mRNAs coding for non-epider mal cytokeratins. EMBO J. 2: 1387-1392.

81. Magin, T. M., Jorcano. J.L., et Franke, W. W. 1986. Cytokeratin expression in simple epithelia. II. cDNA cloning and sequenee characteristics of bovine cytokeratin A (no.8). Differentiation. 30254-264.

82. M m , J. L. 1983. Organizing the cytoplasrn. Science. 222: 1109- 11 11.

û3. McDowell, E. M., et Trump, B.F. 1976. Histologie fixations suitable for diagnosis light and electronic microscopy. Arch. Pathol. Lab. Md. 100:- 414.

84. McGowan, J. A., Strain, A.J., et Bucher, N.L.R 1981. DNA synthesis in primar y cultures of adult rat hepatocytes in a detïned medium: effect of epidermal growth factor, insulin, glucagon and cyclic-AMP. J. Cell. Phvsiol. l m 3 5 5 363.

85. McGowan, J. A. 1986. Hepatocyte proliferation in culture. Daas: Research in hla ted and cultured hepatocytes, pp. 13-38. A. GuiIlouzo et C. Guguen- Guillouzo, eds. John Libbery Eurotext Ltée I INSERM, Paris.

86. McLean, W. H. I., et Lane, E.B. 1995. Intermediate filaments in disease. Curr. Op. Ceil Biol. 7: 11&125.

87. Miller, R K., Virkstrom, K.L. et Goldman, RD. 1991. Keratin incorporation fnto intermediate filament networks is a rapid process. J. Cell Biol. 113:843-855.

88. Miller, R K., Khuon, S. et Goldman, RD. 1993. Dynamics of keratin wernbly: exogenous type I keratin rapidly associates with type II keratin in vivo. Celi Biol. 122131-135.

89. Mitaka, T., Sattler, C.A., Sattler, G.L., Sargent, L.M., et Pitot, H.C. 1991. Multiple cell cycles occur in rat hepatocytes cultured in the presence of nicotinarnide and epidermal gr owth factor. Hemtolom. 13:21-30.

90. Moll, R., Franke, W.W., et Schiller, D.L. 1982. The eatalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumor s, and cultured cells. Cell. 3 1: 11-24.

91. Moll, R. 1994. Cytokeratins in the histological diagnosis of malignant tumors. Int. J. Biol. Markers. 9:63-69.

92. Mucenski, M. L., McLainJC., Kier, A.B., Swerdlow, S.H., Schreiner, C.M., Miller, T.A., Pietryga, D.W., Scott Jr, W.J., et Potter, S.S. 1991. A functional c-myb gene is required for normal rnurine fetal hernatopoiesis. Cell. 65677-689.

93. Novikoff, P. M., Cammer, M., Tao, L., Oda, H., Stockert, R.J., Wolkoff, A.W., et Satir, P. 19%. Tri-dimensional organization of rat hepatocyte cytoskeleton: relation to the asialoglycoprotein endocytosis pathway. J. Ce11 Sci. 109:21-32.

94. Ohta, M., Marceau, N., et French, S.W. 1988. Changes in the organization and antigenic determinants of intermediate filaments of rat hepatocytes after infusion of cytochalasin B in vivo. Am. J. Pathol. 133578-588.

95. h a r y , M. B., Baxter, G.T., Chou, C.-F., Riopel, C., et Lin, W.Y. 1992. PKCe- related kinase associates with and phosphorylates cytokeratin 8 and 18. Ce11 Biol. 117:5û3-593.

%. Osbom, M., et Weber, K. 1986. Intermediate Nament protein: a muitigene fa mily distinguishing major ceIl iineages. TIBS. lM69-472.

97. Osbom, M., Van Lessen, G., Weber, K, Kloppel, G., et Altmannaberger, M. 1986. Methods in laboratory investigation: Differential diagnosis of gastr ointestinal car cinomas by using monoclonal antibodies specMc for individual keratin polypeptides. Lab. Invest. 55497-504.

98. Oshima, R G., Howe, W.E., Klier, F.G., Adamson, ED., et Shevinsky, L.H. 1983. Intermediate filament protein synthesis in preimplantation murine embryos. Dev. Biol. 99:447-455.

99. Oshima, R G., Baxibault, K, et Caulin, C. 1996. Oncogenic reylation and function of keratins 8 and 18. Cancer and Metastasis Reviews- 15445-471.

lm. Paulin-Levasseur, M. 1992. Intermediate filament protcins: many unanswered questions, few unquestioned answers. Biochem. Ce11 BioI. 7Q842-848.

101. Reid, L. M. 1990. Stem eell biology, hormone/matrix synergies and liver differentiation. Curr. OP. Cell Biol. 2: 121-130.

102. Renton, K W., Deloria, L.B., et Mannering, GJ. 1978 Effects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylie aeid and a mouse interferon preparation on cytochrome P-450-dependent monooxygenase systems in cultures of primary mouse hepatocytes. Mol. Pharmacol. 14672-681.

103. R O O ~ . D. R, Cheng, C.K. Titterington, L., Meyers, C.A., Stanley, J.R., Steinert, P.M. et Yuspa, S.H. 1984. Synthetic peptides corresponding to keratin subunit e licit highly specitïc antibodies. L Biol. Chem. 259:8û37-80408040

104. Sania, A. J., fanini, S.R. et Evans, R.M. 1992. A functional role for vimentin intermediate filaments in the metabolism of lipoprotein-derived cholesterol Zn human SW-13 cells. J. Biol. Chem. 267: 19455-19463.

105. Seglen, P. O. 197'3. Preparation of rat liver cells. II. Effects of ions and chelators on tissue dispersion. EXP. Ce11 Res. 762130.

1M. Seglen, P. O. 1973. Preparation of ra t liver cells. III. Enzymatie requtre ments for tissue dispersion. Exp Ce11 Res. 82:391-398.

107. Sévier, N. 1994. Association des mitochondries avec les filaments intermédiaires dans les cellules hpithéliales PtK2 en culture. Mémoire de msuîse, Faculté de Médecine, Univemité Laval, Qu&ec, 67 p.

lûû. Shea, T. B., Beemann, M.L. et Fischer, 1. 1993. Transient requirement for vimentin in neuritogenesis: intracellular delivery of anti-vimentin antibodies and antisense oligonucleotides inhibit neurite initiation but not elongation of existïng neurites in neuroblastoma. J. Neurosci. Res. 3656-76.

109. Shyy, T.-T., Asch, B.B., et Asch, H.L. 1989. Concurrent coilapse of keratin filaments, aggregation of organelles, and inhibition of protein synthesis during the heat shock response In mammary epithelial cells. J. Cell Biol. 108: 1161-1169.

110. Sirnard, J. L., Cossette, L.J., Rong, P.M., Martinoli, M.G., Pelletier, O., et Vincent, M. 1992. Isolation of IFAPa-400 cDNAs: evidence for a transient cytostructural gene activity eommon to the precursor cells of the myogenic and the neurogenie cell lineages. Brain Res. Dev. Brain Res. 70173-180.

11 1- Skalli, O., et Goldman, RD. 1991. Recent insights into the assembly, dynarnics and function of intermediate filament networks. Celi Motil. C~kele ton. 19:67- 69.

112. Skalli, O., Jones, J-C., Gagescu, R., et Goldman, RD. 1994. IFAP 300 is common to desmosomes and hemidesmommes and is a possible linker of intermediate filaments to these junctions. 3. CeIl Biol. 125 159-170.

113. St-Hilaire, R J., et Jones, A.L. 1982. Epidermal growth factor: its biologic and metabolie effects with emphasis on the hepatocyte. He~atolopyl2:601613.

114. Stappenbeck, T. S., et GreenJCJ. 1992. The desmoplakin euboxyl terminus coaligns with and specifically disrupts inter mediate filament networ ks when expressed in cultured cells. J. Ce11 Biol. 116: 1197-1209.

115. Stappenbeck, T. S., Lamb, J.A., Corcoran, CM., et Green, K.J. 1994. Phosphorylation of the desmoplakin COOH terminus negatively tegulates its interaction with keratin intermediate filament networks. J. Biol. Chem. 269:29351-29354.

116. Steinert, P. M., Steven, A C . et Roop, D.R. 1985. The molecular biology of inter mediate filaments. Cell. 42141 1419.

117. Steinert, P. M., et Roop, D.R. 1988. Molecular and cellular biology of intermediate filaments. Annu- Rev. Biochem. 51593-625.

118. Sudhakaran, P. R, Stamataglou, S.C., et Hughes, RC. 1986. Modulation of protein synthesis and secretion by substratum in primary cultures of rat hepatocytes. E~P. Cell Res. 167:501516.

119. Sun, T. T., Eichner, R., Schenner, A., Cooper, D., Nelson, W.G., et Weiss, RA. 1984. Classification, expression, and possible mechanisms of evolution of mammalian epithelial keratins: a unifying model. Dans: The Cancer cells. V. W. Levine, Topp et Watson, editor. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 169- 176.

120. Svitkina, T. M., Verkhovsky, A.B., et Bonsy, G.G. 19%. Plectin sidearms mediate interaction of intermediate filaments with microtubules and other components of the eytoskeleton. J. Ce11 Biol. 135991-1007.

121. Traub, P., Perides, G., Schimmel, H., et Scherbarth, A. 1986. Interaction in vitro of nonepithelial intermediate filament proteins with total cellular lipids, ndividual phospholipids, and a phospholipid mixture. J. Biol. Chem. 26 1: 10558- 10568.

122. Traub, P., et Shoeman, RL. 1994. Intermediate filament proteins: cytoskeletal elements with a gene-regdatory function? Int Rev. Cvtol. 154: 101-103.

123. Vassar, R., Coulombe, P.A., Degenstein, L., Albers, K., et Fuchs, E. 1991. Mutant keratin expression in transgenfe mice causes marked abnormalities resembling a human genetic skin disease. CelI. 64365-380.

124. Vasseur, M., Duprey, P., Brulet, P., et Jacob, F. 1985. One gene and one pseudo gene for the cytokeratin endo A. PNAS. 82: 11511 159.

125. Venetianer. A., Schiller, D.L., Magin, T.M. et m e , W.W. 1983. Cessation of cytokerath expression in a rat hepatoma cell line lacking differentiated functions. Nature. 3057'0-733.

126. Virkstrom, K L., Borissy, G.G. et Goldman, RD. 1989. Dynarnic aspects of intermediate filament networks in BHK-21 cells. PNAS. 86549-553.

127. Weber-Benarous, A., Decaux, LE, Bennoun. M., Allemand, 1.. Briand, P., et Kahn, A. 1993. Retroviral infection of primary hepatocytes from normai mice and mice transgenic for SV40 l u g e T antigen. Exo. Ce11 Res. 20591-100.

128. Weinstein, D. E, Shelanski, UL., et Liem. RK.H. 1991. Suppression by antisense mRNA demonstrates a requirement for the glial fibrillary acidic protein in the formation of stable astrocytic processes in response to neurons. J. Cell Biol. 1 12: 1205-1213. -

129. Wiche, G.. Krepler. R, Artlieb, U., Pytela, R, et Denk, H. 19û3. Occurrence and imm unolocalization of plectin in tissues. J. Ce11 Biol. 9'7S87-W 1.

130. Wiche, G., Gromov, D., Donovan. A.. Castaibn, M.J., et Fuchs, E. 1993. Expression of plectin mutant cDNA in cultured cells indicates a role of COOH-terminal domain in inter mediate filament association. J. CeII BioI. l2l:607-6 19.

13 1. Williams. G. M., Bermudez E. et Scaramuzzino, D. 1978. Rat hepatocyte primary ce11 cultures. Improved dissociation and attachment techniques and the enhancement OC survival by culture medium. In Vitro. 13:809-817.

132. Xu. 2.. Cork, L., Griffin, J.. et Cleveland, D. 1993. Increased expression of neur ofilament NF-L produces morphological alterations that resemble the pathology of human motor neuron disease. Cell. 7323-33.

133. Yano, T., Tokui, T., Nishi, Y ., Nishizawa, K., Shibata, M., Kikuchi, K., Tsuiki,S., Yamauchi, T., et Inagaki, M. 1991. Phosphorylation of keratin inter mediate filaments by protein kinase C, by calmodulin-dependent kinase and by CAMP-dependent protein kinase. Eur. J. Biochem. 197:281-290.

134. Zhao. J.X., Ohnishi. A., Itakura, C., Mizutani. M., Yamamoto, T.. Hayashi, H., et Murai. Y. 1994. Greater number of microtubules per axon of unmyelinated Bbers of mutant quails deficient in neurofilaments: possible compensation for the absence of neurofilaments. Acta Neuropathologca 87: 332-336.

135. Zimmeman, H. J. 1978. Hepatotoxicity: the adverse effects of drugs and other chernicals on the liver. A. C. Crofts, editor, New York 597 p.

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