Introduction aux radicaux libres et espèces réactives de l’oxygène

Pr H Puy

OXYGENEespèces réactives de l'oxygène (ROS)

Il existe des micro-organismes pour lesquels l’oxygène est inutile, et même toxique: anaérobies.

L’oxygène est indispensable à la vie des êtres pluricellulaires (aérobies)

L’oxygène est nécessaire à au Tfert d’e- couplé aux phosphorylations oxydatives : source principale de leur énergie

L ’ANOXIE EST MORTELLE A COURT TERME

• Entraîne une chute de l’ATP cellulaire

• Les tissus résistent inégalement à l’anoxie : – Le cerveau est détruit en 3 minutes– Foie, rein et myocarde en qq heures– Muscle, peau et phanères, bcp plus tard.

CARACTERE TOXIQUE DE L ’OXYGENE

• Cependant, l’oxygène est toxique pour les organismes

• Son utilisation requiert des mécanismes protecteurs

• Le caractère toxique de l’oxygène participe à la pathogénie de nombreuses maladies

ROS: PRODUITS ACCIDENTELS

• Toutes les réactions impliquant O2 et des ions métalliques peuvent induire des «bavures»

• En particulier les flavoprotéines, et surtout les oxydases

Principales ROS

• ROS (Reactive Oxygen Species)

– Ion superoxyde (O2-.)

– Radical hydroxyle (OH.)– Ion hydroxyle (OH-), – Peroxyde d ’hydrogène (H2O2)

• Origines : chaînes respiratoires mais pas uniquement

Un radical libre (RL) est constitué par tout atome, groupe d’atomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe []

Le radical s’en trouve doté d’une réactivité particulière et peut ainsi réagir avec d’autres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin d’apparier son électron célibataire

Notion de radical libre et définitions I

L'oxygène moléculaire diatomique (O2) joue un rôle essentiel dans le métabolisme aérobie comme accepteur terminal d’électrons

O2 peut former des espèces partiellement réduites, les espèces oxygénées réactives [EOR] radicalaires ou non:

anion superoxyde (O2º-), peroxyde d'hydrogène (H2O2) et radical hydroxyle (HOº)

Les espèces oxygénées réactives sont des produits normaux du métabolisme. Leur production basale correspondrait à 3 % de la quantité totale d'oxygène consommé

Notion de radical libre et définitions II

Le stress oxydant est observé lorsque la production des espèces oxygénées réactives dépasse les capacités de défense des tissus

Il entraîne des altérations des composants cellulaires, dues aux réactions chimiques des espèces oxygénées réactives avec les lipides, les protéines et les acides nucléiques cellulaires

Notion de radical libre et définitions III

un "radical libre" (RL) est une espèce chimique - qui possède un électron non apparié ('célibataire') - qui a une existence indépendante ('libre')

nb:

1/ un RL est généralement écrit R.

2/ certains radicaux sont électriquement neutres tandis que d'autres sont chargés : il existe des radicaux

cationiques R.+ et des radicaux anioniques R.-

Radicaux libres (RL)

Espèce réactives de l'oxygène (ROS) et Radicaux libres oxygénés (RLO)

Formes réactives de l'oxygène (ROS) _______________________________________________________

Formes radicalaires (RLO) Formes non radicalaires _______________________________________________________

superoxyde O°- peroxyde d'hydrogène H2O2

hydroxyle OH° acid hypochloreux HOClperoxyle ROO° ozone O3

alkoxyle RO° oxygène singulet 1ghydroperoxyle HOO° peroxynitrite ONOO-

_______________________________________________________

O2 O.-2

H2O2 HOCl

OH. 1O2

NADPH Oxydaseet autres systèmes

SOD ou Spontanée en+H+ MPO

NADPH NADP - + H + Fe2+ / Cu2+

LES FORMES REACTIVES DE L’OXYGENE (FRO/ROS)

O.-2 anion superoxyde; H2O2 péroxyde d’hydrogène ou eau oxygénée; OH.radical hydroxyl; HOCl acide

hypochloreux; 1O2 oxygène singulet, SOD superoxyde dismutase, MPO myélopéroxydase

Les radicaux libres (RLO): atomes ou molécules ayant un électron non apparié ou célibataireLes dérivés non radicalaires

Métabolites réactifs de l’oxygène

Toute fuite d’électrons en présence d’O2 conduità la formation d’ERO (Espèces Réactives de l ’Oxygène)

O2 H2O2

Métaux

Quinones

SOD

Fenton

Oxydases

Monooxygénases h 1O2

UVA

O2-. OH .

NO. ONOO-NOS

Arg

Demi Vie de Différentes EORDemi Vie de Différentes EOR

EspEspèèces rces rééactivesactives Demi-vieDemi-vie (s)(s) Demi-vieDemi-vie (s)(s)

Hydroxyl radical (OH)Alcoxyl radical (RO)Singlet oxygen (1O2)Peroxynitrite anion (ONOO-)Peroxyl radical (ROO)Nitric oxide (NO)Hydrogen peroxide (H2O2)

Superoxide anion (O2-)

Hypochlorous acid (HOCl)

Hydroxyl radical (OH)Alcoxyl radical (RO)Singlet oxygen (1O2)Peroxynitrite anion (ONOO-)Peroxyl radical (ROO)Nitric oxide (NO)Hydrogen peroxide (H2O2)

Superoxide anion (O2-)

Hypochlorous acid (HOCl)

1010-9-9

1010-6-6

1010-5-5

0.05 – 1.00.05 – 1.077

1 - 101 - 10spontan. heures/jourspontan. heures/jour

(accelere par enzymes)(accelere par enzymes)

spontan. heures/jourspontan. heures/jour(SOD accel. 10(SOD accel. 10-6-6))

1010-9-9

1010-6-6

1010-5-5

0.05 – 1.00.05 – 1.077

1 - 101 - 10spontan. heures/jourspontan. heures/jour

(accelere par enzymes)(accelere par enzymes)

spontan. heures/jourspontan. heures/jour(SOD accel. 10(SOD accel. 10-6-6))

Conc.Conc. PhysiolPhysiol (mol/l)(mol/l)Conc.Conc. PhysiolPhysiol (mol/l)(mol/l)

1010-9-9

1010-9 -9 - 10- 10-7-7

1010-12 -12 - 10- 10-11-11

L’oxygène singulet : Il existe sous deux formes :

• l’oxygène noté 1Σ g+ où les deux électrons célibataires sont de spin opposé. Cette forme très instable se transforme en :

• 1Δg non radicalaire

Formes activées de l’oxygène

L’anion super oxyde (O2º-) :

Par capture d’un électron, l’oxygène triplet est réduit en anion superoxyde

O2 + 1e- O2 º-

Il est produit majoritairement par la chaîne mitochondriale, mais également par les oxydases

Formes activées de l’oxygène

Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) :

Par réduction divalente de l’oxygène:

O2 + 2e- + 2H+ H2O2 (oxydases)

Par dismutation de O2.- :

2 O2º- + 2H+ H2O2 + O2

Le radical hydroxyle (OH.) :

La coexistence de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène peut engendrer cette espèce oxygénée très réactive

Cette réaction est catalysée par des métaux de transition (comme Fe2+ et Cu+):

Réaction de Fenton 

H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OHº

Fe2+ est reconstitué par divers réducteurs dont l’anion superoxyde.

Fe3+ + O2- Fe2+ + O2

L’ensemble de ces réactions donne le bilan de Haber Weiss ou cycle de Haber Weiss.

H2O2 + O2º- O2 + OH- + OHº

L’acide hypochloreux (HOCl) :

Par l’action des myéloperoxydases, H2O2 donne naissance à HOCl au cours de la réaction suivante

H+ + Cl- + H2O2 HOCl + H2O

Pathologies inflammatoires: granulomatosesAbsence de MyeloperoxidaseAugmentation de la susceptibilite aux infections

Le monoxyde d’azote (NO) :

L-arginine + 2 NADPH + O2 L-citrulline + NOº + 2NADP+

La production concomitante de NOº et de superoxyde à un même site entraîne la formation du peroxynitrite (OONO-) qui est hautement cytotoxique

NOº + O2º- ONOO-

Synthèse des Voies de formation des EOR

Cyclo-oxygénases

Lipo-oxygénases

Echappement

chaîne respiratoire

Les multiples origines des ERO

•Physiologiques: respiration, hormones, cytokines, phagocytose

•Physiopathologiques: déficit en GSH, déficit enzymatique, maladie mitochondriale, inflammation

•Physique ou chimique: irradiation, xénobiotiques oxydants (médicaments, polluants)

•Autres stress: stress du réticulum, stress thermique, hypoxie,stress mécanique….

CERTAINES OXYDORÉDUCTASES UTILISENT L’O2 SANS PRODUCTION D’ÉNERGIE

• Les oxygénases fixent une molécule d’O2 sur les substrats

• Les oxydases oxydent les atomes d’hydrogène des substrats en H2O2

• Les hydroxylases fixent un OH sur une chaîne carbonée

Réactions de synthèse : hormones, neurotransmetteurs,….Réactions de dégradation : acides aminés aromatiques, cholestérol, hème, purines,….

Autres systèmes de productionAuto-oxydationCyclo-oxygénase et lipo-oxygénaseSystème de transport des électrons dans la

membrane nucléaireXanthine/xanthine oxydase

Hypoxanthine Guanine

Xanthine

Acide urique

Xanthineoxydase

O2

H2O2

O2.

Guanase

H2O

NH3

O2

H2O2

O2.

NAD+

NADH

NAD+

NADH

HN

NH NH

NH

O

O

O

Origine des EOR

Sources endogènes exogènes

peroxysome radiation, ultrasons

mitochondrie cigaretteautooxydation drogues

EOR

phagocytes chaleur oxyhemoglobine pesticides enzymes oxydantes infections detoxification hyperoxie,

exercice

pollution (NOx, O3)

Les mitochondries sont la principale source de production de radicaux libres

Exception pour le foie, où les microsomes sont les principaux producteurs

Mitochondries microsome peroxysome cytosol

45% 20% 30% 5%

Mitochondries microsome peroxysome cytosol

15% 45% 35% 5%

Chaîne respiratoire et production radicalaire au niveau mitochondrial

95%

3-5%

Tetraréduction

Monoréduction OH

Ion superoxyde

Peroxyde d ’hydrogène

Radicale hydroxyle

ROLES DES PEROXYSOMES

• Métabolisme des peroxydes, des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote

• Synthèse des plasmalogènes

-oxydation des acides gras

-oxydation des acides gras

• Métabolisme du glyoxylate

• Métabolisme des acides aminés (dégradation des isomères D des acides aminés, catabolisme de la L-lysine, dégradation des polyamines)

Oxydases peroxysomales

Glycolate oxydase, D-amino acide oxydase, urate oxydase…

Les peroxysomes utilisent une part importante de l’O2

Production majoritaire de l’ H2O2

Cytochrome P450 du réticulum endoplasmique

Réaction de mono-oxygenation:

A-H + O2 + NADPH,H+ A-OH + H2O + NADP+

Le réticulum endoplasmique est riche en cytochromes P450 impliqués dans les processus de détoxification.

P450FeIII P450 –FeIII-SH

2e- NADPHCytP450reductase

O2

P450-FeIII-SHO2

2-

P450-FeIII-SH + O2- et/ou H2O2P450-FeIII

SOH

Mécanisme génèse EROS

ROS ET DÉFENSE CONTRE LES MICRO-ORGANISMES

• Les globules blancs utilisent l’O2 pour tuer les bactéries qu’ils ont phagocytés

• Les monocytes et polynucléaires neutrophiles ont un mécanisme spécial pour créer des radicaux libres oxygénés

ROS et défenses anti-infectieuses

Comment se forment les RL, les RLO et les ROS ? (7)

Exemples de systèmes enzymatiques générateurs de ROS NADPH oxydase

P

Pp47

p67P

p40

Rac

GTP

gp91 p22Rap1A

Assemblage et activation de la NADPH oxydase des phagocytes d'après MH Paclet et F. Morel

PPP

p40

gp91p22

p47

PP

P

PP

p67

Rap1ARap1ARacGTP

activation

Complexe actif

NADPH + H+

NADP

O2

O2.-

H2O2 + Cl- HOCl + OHº

production O2º- , OH º

Activation des polynucleaires

NADPH + 2O2 2O2º- + NADP

+ + H +

La NADPH oxydase (FAD, cytochrome b)

H2O2

La myeloperoxydase

MEFAITS DES ROS

• Stimulées par les radiations ionisantes

• Mutations de l’ADN

• Peroxydation des lipides

• Altération des protéines

• Perturbent la transduction des signaux

• Modulent les gènes et les protéines de stress régulant la prolifération la différenciation cellulaire et l’apoptose

Les effets des ERO

•Effets physiologiques: croissance cellulaire, inflammation

•Effets toxiques: ADN, ARN, lipides, protéines

•Adaptation au stress oxydant: induction des gènes « anti-oxydants »répression des gènes « pro-oxydants »

Toxicité des ERO

•ADN: génotoxicité; 8-OH-Guanine, Mutagenèse, cancer

•ARN: oxydation et altération

•Lipides: peroxydation, toxicité des produits oxydés, signalisation, athérosclérose ?

•Protéines: oxydation des acides aminés (Cys, Met…) Nitrosylation (NO), Carbonylation dénaturation (protéines chaperon), agrégation, maladies dégénératives ?

•Glucides: glycation et dérivés Diabète

- Quelque exemples de dérivés d’oxydation des bases du DNA par les ROS.

Les cibles Moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS)

Les altérations du DNA peuvent induire des mutations ou la mort de la cellule

Exemples d’effets

des ROS sur les

lipides: exemple de la formation de l’isoprostane

Les cibles Moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS).

- Oxydation des lipides par les ROS

Les cibles Moléculaires des Radicaux libres (RL) et radicaux oxygénés (RLO),

espèces réactives de l'oxygène (ROS),

Aldéhydes dérivés d’acides gras polyinsaturés

Dérivés du cholestérol: oxystérols

- Exemples d’effets

des ROS sur les protéines:dérivés d’acides aminés

Les cibles moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS)

Les modifications des protéines peuvent induire des altérations fonctionnelles

Stress oxydant: adaptation et défense

•1ère ligne: molécules anti-oxydantes; GSH, Vit C, Vit E, biliverdine ….

•2ème ligne: induction ou répression des gènes Activités enzymatiques anti-oxydantes: GPx, Cat, SOD, Hox… Activités enzymatiques pro-oxydantes: CYP, oxydases… Réparation: ADN, protéines (Trx, Trx réductase, chaperon)

•Dernière ligne: apoptose

Adaptation cellulaire au stress oxydant

inductionde gènes

Répression de gènes

augmentation des enzymes

anti-oxydantes et de réparation

diminution des enzymes

productrices des espèces réactives

de l’oxygène

stressoxydant Adaptation

Toxicité: ADN,ARN Protéines Lipides

PROTECTIONS

Confinement en organelles

Protections non spécifiques

Protections spécifiques

CONFINEMENT EN ORGANELLES

• Mitochondrie

– COX, certaines oxydases

– Sensibilité de l’ADN mitochondrial

• Peroxysomes

– Contiennent de nombreuses oxydases

– Mais aussi catalases et peroxydases

Reparation des lipides oxydésExcision des bases oxydéesRéparation des protéines oxydées

En aval, non spécifique:les systèmes de réparation

PROTECTIONS NON SPECIFIQUES

• Certaines molécules naturelles se comportent comme des épurateurs de ROS (« scavengers»)

• Alcools et aldéhydes variés

• Glucose

• Acide urique, hème, bilirubine

• Bicarbonate

PROTECTIONS SPECIFIQUES

• L’évolution a sélectionné des mécanismes de protection qui ont permis l’aérobiose

• Vitamines antioxydantes

• Enzymes destructrices de ROS

• Le système Glutathion

VITAMINES ANTIOXYDANTES

• C’est une partie essentielle de leur rôle biologique

• Vitamines hydrophiles

– C’est l’acide ascorbique (vitamine C).

• Vitamines liposolubles

– vitamines A & E

• Vitamine E

Systèmes anti-oxydants non enzymatiques Systèmes anti-oxydants non enzymatiques (3)(3)

OCH3CH2(CH2CH2CHCH2)3H

R3

OH

R2

R1

CH3

Vitamine E

-tocophérol = R1, R2, R3 : CH3

-tocophérol = R1, R3 : CH3; R2 : H

-tocophérol = R1, R2 : CH3; R3 : H

-tocophérol = R1 : CH3; R2, R3 : H

- hydrosoluble- piégeur de radicaux superoxyde, hydroxyle, peroxyle- grande oxydabilité précautions lors du dosage

- carotène: anti-oxydant liposoluble, dosable dans plasma et lipoprotéines.

Systèmes anti-oxydants non enzymatiquesSystèmes anti-oxydants non enzymatiques

• Ubiquinol (coenzyme Q10) : anti-oxydant liposoluble

(particulièrement important dans la résistance des LDL à l’oxydation)

MeO

MeO

OH

(CH2-CH=C-CH2)10H

OH

CH3

H2O2

H2O + O2 H2O

O2.-

.OH

Superoxide

dismutases (Cu/Zn-Mn)

Catalase GSH-PeroxidaseGSH

GSSG

Fe2+ Fe3+

Première ligne de défense

Systèmes de Défense enzymatiques

ENZYMES PROTECTRICES DES ROS

• Superoxyde dismutases (SOD): Détruit l’ion

superoxyde O2.- en le métabolisant en H2O2 par une

réaction de dismutation :

2H+ + O2-. + O2

-. H2O2 + O2

• Trois isoenzymes :– SOD1 cytosolique CuZn-dépendante

– SOD2 Mitochondriale Mn-dépendante

– SOD3 extra-cellulaire CuZn-dépend.

• Peroxydases : RH + H2O2 --> ROH + H2O

Catalase

Ce sont des enzymes tétramériques, chaque unité portant une molécule d'hème et une molécule de NADPH

La réaction se fait en deux étapes:

Catalase-(Fe III) + H2O2 --------> O=Fe(IV)-E + H2

O=Fe(IV)-E + H2O2 --> Fe(III)-E + H2O

H2O2 2 H2O 2 ------------> O2 + 2 H2O

Les catalases sont présentes dans un grand nombre de tissus mais sont particulièrement abondantes dans le foie et les globules rouges

Elles sont localisées dans les peroxysomes et sont aussi impliquées dans la detoxification de

différents substrats

H2O2 + R’H2 R’ + 2H2OCat

– Le glutathion est un tripeptide (glycine, glutamate, cystéine)

– Dans toutes les cellules à des concentrations élevées

– Forme réduite: groupement –SH

– Forme oxydée: 2 tripeptides se lient de manière covalente (S-S, pont disulfure)

– 2 atomes d ’H libérés: H2O2 --> 2H20

LE SYSTEME GLUTATHION

Forme Réduite (GSH)

Le Glutathion: tripeptide formé à partir de glutamate, cysteine et glycine.

La forme réduite (GSH) maintien l’état réduit normal de la cellule.

LE SYSTEME GLUTATHION

Le produit de l’oxydation de la GSH conduit à un dimère lié par un pont disulfure: GS-SG.

L’enzyme glutathion reductase utilise le NADPH comme cofacteur pour réduire le GSSG en 2 GSH.

LE SYSTEME GLUTATHION

• Le Glutathion réduit H2O2 en deux étapes

• Glutathion peroxydase (GS Px Se ou glutathion-S-transférases non

sélénodépendantes) :

• H2O2 + 2GSH 2H2O + 1GSSG

• Il existe une Glutathion peroxydase cytosolique, une plasmatique, une gastrointestinale et un isoenzyme spécifique des

phospholipides oxydés: la HPGPx

• Glutathion réductase :

GS-SG + NADPH2 --> 2GSH + NADP+

Glutathion & Erythrocytes • GSH importance +++ en environnement oxygéné+fer => GR +++++

• RBCs matures n’ont pas de mitochondrie et sont dépendant de [NADPH] pour régénérer le GSH à partir du GSSG via la glutathion reductase.

• Plus de 10% du glucose consommé par les erythrocytes => voie des pentoses.

• Maintien des résidus cysteines de l’hémoglobine à l’état réduit.

• GSH essentiel pour la structure normale des RBC en gardant l’Hb sous forme Fe++

• Les GR à taux bas en GSH sont + hémolysables => Patients avec réduction GSH sont sujets à hémolyse accrue.

Système Thioredoxine /thioredoxine reductaseCofacteur: Acide lipoïque

Substratox

NADPH+H+ NADP+TrxR

Produitrex

Trx-S2Trx-(SH)2

Proteine-(SH)2 Proteine-S2

Thiorédoxine-SH GSHAcide Lipoique-SH...

Déhydro-lipoateGS-SGThiorédoxine oxydée…

EROS en pathologie: ORGANES CIBLES EROS en pathologie: ORGANES CIBLES

OO22--

HH22OO22

HOClHOClOOHH

intestinintestin

Coeur et Coeur et vaisseauxvaisseaux

Voies respiratoiresVoies respiratoires

Cerveau et Cerveau et nerfsnerfs

reinrein

NONO

PATHOLOGIES: CANCER• Les mutations sur l’ADN peuvent

activer des oncogènes

ou inactiver des antioncogènes

altérer des gènes de réparation de l’ADN et ceux du déclenchement de l’apoptose

ATHEROSCLEROSE• La peroxydation des lipides des lipoprotéines en

relation avec la formation des plaques d’athérome qui obstruent les vaisseaux sanguins

INFLAMMATIONL’apparition de ROS aggrave l ’inflammation

VIEILLISSEMENT• Altération de l ’ADN, des lipides et des protéines• Altération mitochondriale (ROS ++)• Athérosclérose, inflammation, Cancer• Théorie radicalaire somatique du vieillissement: les

ROS seraient responsables du vieillissement et des maladies qui lui sont associées

Certaines conditions physiopathologiques vont modifier les conditions de fonctionnement de ces

systèmes

Cas de l’ischémie reperfusion

I II III

e- e-

IV V ANT

Désynchronisation de la chaîne respiratoire durant l’ischémie reperfusion (1)

A l’ischémie: découplage avec excés e- et anoxie

I II III

O2º-

IV V ANT

Modifications de la chaîne respiratoire durant l’ischémie reperfusion (2)

O2

O2º-

A la reperfusion: apport massif O2 sur les e- accumulés

MnSOD

H2O2

CONCLUSIONS

les substances réductrices protègent les organismes aussi bien contre le vieillissement que contre l’athérosclérose et les effets des radiations ionisantes

vitamine C, carotènes, la vitamine E, Sélénium, Melatonine

Le désequilibre entre production et élimination des EOR survient durant: inflammation, ischemie/reperfusion, alterations du metabolisme, toxiques, polluants, etc.

Techniques d’exploration des systèmes anti-oxydants

1- Dosage des Isoprostanes  : La peroxydation de l’acide arachidonique , indépendante de l’action des

enzymes cyclooxygénase et lipooxygénase , conduit à la formation de dérivés de la famille des prostacyclines les Isoprostanes, dont la 8-epi PGF2 alpha.

2- Dosage des hydroperoxydes lipidiques :Aldéhydes stables comme le Malondialdéhyde (MDA) et les 4 hydroxyalkenals

comme le 4 HNE (4hydroxynonenal). 3- Dosage du glutathion :Stress oxydant rapport glutathion

réduit/glutathion oxydé4- Dosage des défenses: acide ascorbique, -tocophérol, -carotène,

ubiquinol, …

.

Techniques d’exploration de la peroxydation (2)

Total antioxydant status : mesure la capacité totale antioxydante du plasma à défaut de

mesurer chaque antioxydant individuellement.Marqueurs de la peroxydation des protéines: Protein adducts on protéines carbonylées. Marqueurs de la peroxydation des acides nucléiques: 8-0H-deoxyguanosine.Marqueurs de l’activation des PN: Dosage de la myeloperoxydase, de la Lactoferrine et de

l’elastase.Dosages d’enzymes anti oxydantes:la SODs, la Glutathion peroxydase selenium dept ou indept, la

catalase.