BIOCHIMIE, 1974, 56, 161-170.

Inhibition par ]a N-dthylmaleimide des transports du et du phosphate dans les mitochondries.

R o g e r DEBISE et R o g e r D U R A N D .

Laboratoire de Biochimie , Universit~ de Clermont-Ferrand, Complexe Sc ient i f ique des Cdzeaux, 63170- Aubi~re.

(25-7-1973).

glutamate

Summary. - - We have studied the i nh ib i t o ry effect of NEM at the level of phospha te and g lu tamate t r a n s p o r t in r a t l iver and pig hea r t mi tochondr ia .

Two kinds of methods have been ut i l i sed : a k inet ic method (swelling of mi tochondr ia ) , a metabol ic method where g lu tamate oxida t ion can be considered as a r e su l t an t between t r anspor t and subs t ra te metabol i sm.

Fol lowing resul t s have been obta ined :

1. - - Phospha te and g lu tamate t ranspor t , es t imated by swell ing methods, are inh ib i ted by NEM in ra t l iver mi tochondr ia : 0.1 mM NEM, 15 seconds, resul ts in a 50 p. cent i nh ib i t i on of phospha te t ranspor t , whereas under the same cond!t ions g lu tamate t r anspo r t is affected by 15 p. cent. These resul t s are consis tent wi th a different local isa t ion of the two t r a n s p o r t systems in the in te rna l mi tochondr ia l membrane .

Pig h e a r t mi tochondr i a do not swell in 100 mM a m m o n i u m glutamate . 2. - - Phospha te t r anspo r t inh ib i t ion by NEM (rat l iver and pig hea r t mi tochondr ia )

is protected by substrate . Tha t is to say, phospha te decreases the inh ib i t i on by NEM when added to the p re ineuba t ion med ium 30 seconds before NEM. This <(protection ~) is more extensive in pig hea r t mi tochondr ia : 2 mM phospha te decreases NEM inh ib i t ion by 75 p. cent (NEM 0.2 mM, 45 seconds). In r a t l iver mi tochondr ia the fol lowing values are ob ta ined 10 mM phospha te decreases NEM inh ib i t i on by 50 p. cent (NEM 0.1 mM, 30 seconds).

In the case of g lu tamate t ranspor t , in r a t l iver mi tochondr ia , there is no protect ion by substrate .

3. - - Glu tamate oxidat ion, in ra t l iver mi toehondr ia , is inh ib i t ed by 0.1 mM NEM. The same resul t s are observed for coupled and uncoupled mi tochondr i a by C1CCP. In the coupled s tate g lu tamate and phospha te t r anspo r t are concerned, in the uncoupled state only g lu tamate t r a n s p o r t is concerned. Succinate oxidat ion is less inh ib i t ed by NEM. All the da ta are cons is tent wi th a s imul t aneous effect of NEM at different sites : the phos- phate and g lu tamate carr iers bu t also the electron t r ans fe r enzymes.

I N T R O D U C T I O N .

E n 1965 C h a p p e l l et Crof t s [1], e o n s i d e r a n t l ' i m p e r m 6 a b i l i t 6 r e l a t i v e de la m e m b r a n e i n t e r n e des m i t o c h o n d r i e s aux a n i o n s , p r o p o s a i e n t l ' ex i s - t e n c e de (< p e r m 6 a s e s )) p o u r c h a q u e s u b s t a n c e t r a n s p o r t 6 e . Cet te h y p o t h 6 s e s ' a p p u y a i t s u r des o b s e r v a t i o n s c o n c e r n a n t p r i n c i p a l e m e n t ]e gonf le- m e n t des m i t o c h o n d r i e s , el le s ' a p p l i q u a i t t o u t p a r - t i c u l i ~ r e m e n t au t r a n s p o r t du p h o s p h a t e m i n 6 r a l d o n t l ' e n t r 6 e s e r a i t a c c o m p a g n 6 e d ' u n 6 c h a n g e a v e c u n h y d r o x y l e .

Abr6via t ions : NEM : N-~thylmal6imide. p CMB : acide paraeh loromercur ibenzo iqne . CPDS : aeide 6,6'- d i th ionicot in ique . ASPM : N-(N-ac6tyl-4-sulfanoyl- ph6nyl) mal6imide. CICCP : Chlorocarbonylcyanide ph6nylhydrazone . EGTA : Rthyl6neglycol-bis (E-amino- 6thyl 6ther) N, N' t6trac6tate. Pi : phospha te inorga- n ique (ou minera l ) .

E n 1966 F o n y o et B e s s m a n [2] m o n t r a i e n t q u e des t h i o l s s o n t i m p l i q u 6 s d a n s le t r a n s p o r t de ce t a n i o n . F o n y o [3] 6 t a b l i s s a i t p e u a p r 6 s que l ' e n t r 6 e et la s o r t i e d u p h o s p h a t e d 6 p e n d e n t d u m 6 m e t r a n s p o r t e u r . On s a l t d e p u i s les t r a v a u x de Me i j e r et T a g e r [4] q u ' i l ex i s t e en f a i t d e u x t r a n s p o r t e u r s d u p h o s p h a t e d i s t i n g u a b l e s p a r l e u r s e n s i b i l i t 6 v i s -h-v is des r ~ a c t i f s th io l s . L ' i n h i b i t i o n d u t r a n s - p o r t d u p h o s p h a t e p a r l a NEM est c o n n u e d e p u i s les e x p 6 r i e n c e s de H a u g a a r d [5] en 1969.

S ix a u t r e s t r a n s p o r t e u r s d o n t c e l u i d u g l u t a m a t e d a n s les m i t o c h o n d r i e s de fo ie de r a t , s o n t m a i n - t e n a n t r e c o n n u s [6] . L ' i m p o r t a n c e des g r o u p e - m e n t s t h i o l s d u n s la m e m b r a n e i n t e r n e des m i t o - c h o n d r i e s [7] de m 6 m e que l e u r rS le m i s en l u m i 6 r e h p r o p o s d u t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e la is- s a i e n t s u p p o s e r q u ' i l s p o u r r a i e n t p a r t i c i p e r ac t i -

11

162 R. Debise et R. D u r a n d .

vement au t ranspor t du glutamate. Effectivement, conjo in tement h ceux de deux autres 6quipes [8, 9] nos r6sultats devaient mont re r que la NEM inh ibe le t ranspor t du glutamate dans les mito- chondr ies de foie de rat.

L'effet de la NEM sur les t ranspor ts du phos- phate et du glutamate renda i t donc possible une d i sc r imina t ion des deux t ranspor teurs au niveau de la membrane in te rne des mi tochondr ies . De plus cette Oude devait nous permettre de pr6ciser les propri6t6s du t ranspor t du phosphate dont l ' i nh ib i t ion par la NEM devait se r6v~ler << prot6- g6e >> par le substrat. Ce ph6nom~ne est analogue h celui observ~ par Kepes [10] h propos du trans- port du Lactose chez E. eoli off le m6thyl-3-D-thio- galactoside protege contre l ' i nh ib i t ion par le p,GMB.

MATERIEL ET METHODES.

ISOLEMENT ET CONTROLE DES SUSPENSIONS MITO-

CHONDRIALES.

Les mi tochondr ies de foie de rat sont isol6es 8 50~) g selon la technique de Weinbach [11] pH 7,4, en mil ieu saccharose 0,2,5 M, Tris 10 raM, h une temp6rature comprise entre 0°C et 4°C. Elles sont ensuite lav~es deux fois par centrifuga- t ion h 8 50'0 g. La suspension finale cont ient 40 mg de prot6ines par ml. La teneur en prot6ines est 6valu6e par la m6thode du << biuret rapide >> [12].

Les mi tochondr ies de coeur de porc sont isol~es 15 0,00 g par la technique de Crane et coll. I13~

16g~rement modifi6e. L 'extract ion a l ieu h pH 7,4 clans du saccharose 0~,25 M, Tris 10 mM, h une temp6rature comprise entre 0°C et 4°C. Elles sont lav~es deux fois puts remises en suspension h rai- son de 40 mg de prot~ines par Inl.

Le contr61e de l ' int~grit6 des mi tochondr ies est effectu6 par nIesure du ContrSle Respiratoire (RCR) ou de I 'ADP/O par polarographie avec un oxygraphe Gilson.

MEsuPm DE L ' E N T R E E DU PHOSPHATE MINERAL ET

DU GLUTAMATE.

L'entr6e de ces anions darts la matr ice mito- chondr ia le est suivie par photom6trie h 5.46 nm suivant la technique de ,Chappell et Crofts [14].

Les mi tochondr ies (4 mg de prot6ines) sont pr6- incub6es h pH 7,4 et h 25°C sous un volume de 0,5 ml. La composi t ion du mil ieu est la suivante : Saccharose 2.5,0 mM, Tris 40 raM, EGTA 1 raM. Les diff6rents produi ts sont ajout6s sous un faible volume (5 ~l ~ 10 i~I). La NEM est ensuite in t ro- duite, sa concent ra t ion finale var iant de 0,05 mM

h 0,4 raM. Au bout du temps d6sir~, toujours inf~- r ieur h 2 rain, de la cyst6ine en large exc~s (con- cent ra t ion finale 2 mM) fixe i r r~vers iblement la NEM n ' ayan t pas encore r~agi. Un aliquot (0,8 mg de prot~ines) est in t rodui t r ap idement dans la Inicrocuve du photom~tre contenant 1 ml de phos- phate d ' a m m o n i u m 100 mM ou de glutamate d'am- m o n i u m 1,O0 mM, h pH 7,4 et 25°C.

L 'appare i l utilis6 est un spectrophotonl~tre Unicam S P 800 (k : 546 nm) ou un photom~tre Eppendor f (filtre 546).

MESURE DE LA SORTIE DU PHOSPHATE MINERAL.

Les mi tochondr ies sont pr~incub~es comme pour la mesure de l 'entr~e du phosphate. La mi- crocuve du photom~tre cont ient 1 ml de mil ieu dont la composi t ion est : Saccharose 250 InM ; Tris 20 InM, KC1 15 raM, EGTA 1 raM, pH 7,4, tem- pera ture 25°C. Les mi tochondr ies sont alors intro- duties (0,8 rag) puts I 'ATP (1 raM) et le C1CCP (0,5 ~M).

E T U D E POLAROGtLAPHIQUE DE L ' E F F E T DE LA NEM SUR L'OXYDATION DU GLUTAMATE.

Les mi tochondr ies sont pr6incub6es comme dans les 2 cas pr6c6dents, sans inh ib i teur et en sa pr6sence. Le temps d 'act ion de la NEM est 6gale- ment contr616 par addi t ion finale de cyst6ine en exc~s. En fin d ' incuba t ion , 1,5 mg de prot~ines sont pr~lev6s et in t rodui ts dans la cellule de Foxy- graphe. Le volume final du mil ieu thermostat6 h 27°C est 2 ml, (Composit ion : glycylglycine 24 raM, Mg C12 9 nlM, KC1 60 raM, saccharose 85 mM, phosphate min6ra l 5 inM, substrat (gluta- mate ou succinate) 10 mM, pH 7,4. On mesure alors la consommat ion d'oxyg~ne A l 'Oat 3 obtenu par addi t ion de 4OJ0 nmoles d'ADP et h l'~tat d6coupl6 provoqu6 pa r l ' add i t ion de C1CCP 0,5 I,M (concent ra t ion finale).

ANIMAUX.

Les rats sont de souche Wistar.

RESULTATS EXPERIMENTAUX.

I - - I N H I B I T I O N DE L 'ENTREE ET DE LA SORTIE DU

PHOSPHATE MINI~RAL DANS LES MITOCHONDRIES DE

FOIE DE RAT ET DE C(EUR DE PORC.

- - Pr incipe de la m~thode utilis~e.

Entree du phosphate minSral : les mitochon- dries dans un mil ieu isotonique constitu~ par cer- ta ins sels d ' a n l m o n i u m gonflent passivement. L'ac- cumula t ion du sel dans la matr ice mi tochondr ia le est suivie d 'une entree massive d 'eau assurant lc

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

T r a n s p o r t du g l u t a m a t e et du p h o s p h a t e dans les m i t o c h o n d r i e s . 163

main t ien de la press ion osmotique in terne (figure 1 a).

La suspension 6tant t ravers6e par un faisceau monochromat ique peu absorb6 par les part icules, leur gonflement est accompagn6 d 'une augmenta- t ion de la lumi~re t ransmise (soit une d iminut ion de la densit6 optique). La manifes ta t ion opt ique

CICC.P/ATP) la s t imulat ion du t ranspor teur d6- pend de la vitesse de fonc t ionnement de l 'ATPase en absence d ' inhibi teur .

--- Rdsultats expdrimentaux.

Nos condi t ions exp6r imenta les sont telles que seul le t r anspor teur du phospha te catalysant un 6change phospha te min6ra l -hydroxyle [4] est

a)

Pi-

O H - ~

NN~

N~M I - P i -

~ ~ OH'~--H20

NH3* H t

E 1.4

0 6 1.2

1,0 • N~M =

c) Pi- Pi-

ADP 3~

c5 1.2

exL m.i. int.

Mersalyl

\o O

1ran

~ N E M

Mersaly!

d~

FIG. 1. - - Relations entre inhibition du transport du phosphate mineral et gon- flement des mitochondries.

a) et b) : gonflement des mitochondries dans le phosphate d'ammonium 100 mM, a) principe, b) enregistrements de la D.O. h 546 nm, sans inhibiteur (O), en pre- sence de NEM, en pr6sence de Mersalyl. c) et d) gonflement des mitochondries Ii6 h l 'inhibition de la sortie du phosphate et au fonctionnement de l'ATPase, c) prin- cipe, d) enregistrements obtenus darts les m~mes conditions qu'en b). I : transpor- teur du phosphate ; II : transloease des nucl6otides ; I I I : ATPase ; m.i. : mem- brane interne ; ext : espace extramito- chondrial ; int : matrice mitochondriale ; NEM : N-Ethylmal6imide ; Pi : phosphate min6ral.

du gonflement est en fait difficile /l in terpr6ter , elle est la r6sultante des var ia t ions simultan6es de plusieurs parambtres tels que la modif ica t ion de la taille et de la forme des par t icules , ou la lib6ra- l ion de prot6ines dans le mi l ieu alt6rant la diff6- rence d ' ind ice de r6fract ion entre ]es deux phases [14]. En pr6sence d 'un inh ib i teur du t ranspor t de l 'anion, la p6n6trat ion du sel est ra lent ie ainsi que le gonflement cor respondant .

Sort ie du phosphate min6ral : les d6couplants tels que le C1C~CP st imulent le fonc t ionnement de l 'ATPase localis6e sur la face matr ic ie l le de ]a membrane interne. Si on ajoute de I 'ATP, il est dans ces condi t ions aussit6t hydrolys6 avec lib6- ra t ion de phospha te min6ral. Toute inh ib i t ion du t ranspor teur du phospha te p rovoque son accumu- lat ion e t ] e gonflement passif des mi tochondr ie s (.figure 1 c).

Les deux techniques utilis6es sont appa remment sym6triques, un examen plus at tentif fait appa- ra i t re des diff6rences. L'6tude de l 'entr6e du phos- phate est r4alis6e dans le phosphate d ' a m m o n i u m 100 raM, cette forte concent ra t ion st imule le trans- por teur au m a x i m u m et toute inh ib i t ion du gonfle- ment est d i rec tement li6e h celle du t ranspor teur . Dans le cas de la sortie du phosphate (systbme

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

fonct ionnel . Les faibles concent ra t ions de NEM et les temps d ' incuba t ion courts adopt6s permet- tent de l imi ter l ' ac t ion de l ' i nh ib i t eur a un effet sur le t ranspor t p r o p r e m e n t dit et de min imise r les possibili t6s de r6actions secondai res avec d 'autres groupements chimiques.

La figure 2 compare les effets de la NEM sur ie t r anspor t du phospha te min6ral dans ]es mito- chondr ies de foie de rat (a) et (b) et de eoeur de po rc (c) et (d). Sur cette figure sont port6s les pourcentages d ' inh ib i t ion du t ranspor t du phos- phate dans les deux types de mi tochondr ies en fonct ion du temps d ' incuba t ion de la NEM, En (a) et en (c) l ' inh ib i t ion est mesur6e dans le phosphate d ' a m m o n iu m 100 raM, elle se t radui t par une dimi- nut ion de la vitesse et de l ' ampl i tude du gonfle- ment (figure 1) li6s h la p6n6trat ion du phosphate . Par contre en (b) et (d) (syst~me C1CGP/ATP) 1 ' inhibit ion est suivie pa r l ' augmenta t ion progres- sive du gonflement.

Nous constatons en ce qui concerne l 'entr6e du phosphate , pour les deux types de mi tochondr ies , que le m a x i m u m d ' inh ib i t ion obtenu est fonct ion de la concent ra t ion de l ' inhibi teur . La concentra- t ion 0,05 mM est darts les deux cas insuffisante pour inh iber compl~tement l 'entr6e du phosphate

164 R . D e b i s e e t R . D u r a n d .

p o u r un t e m p s i n f 6 r i e u r h 2 m i n u t e s d ' i n c u b a t i o n . On o b s e r v e d ' a u t r e p a r t que l ' a u g m e n t a t i o n de l ' i n h i b i t i o n n ' e s t pas l i n6a i r e si ce n ' e s t d a n s les 15 p r e m i b r e s s e c o n d e s . P o u r les c o n c e n t r a t i o n s

100 0.2mM • 100

/ I I I ' I I 0

1 2 temps~nn)

b)

I ' I I I I 1 temps(ran)

100 100

0.2mM I

~M ~ I 0.2ram

T- '~ / ~/ 0.05m M ~

d)

0 0 I I I I i = i , 1 2 1 2

temps(mn) temps(mn)

FIG. 2. - - Inhib i t ion par la NEM du transport du phosphate dans les mi toehondries de [oie de rat et de co~ur de porc.

Les essais a) et b) ont 6t6 r6alis6s sur des mitochon- dries de foie de rat, les essais c) et d) sur des mito- chondr~es de cceur de porc. Les mitochondries (4 mg de prot~ines) sont pr~ineub~es h 25°C sous un volume de 0,5 ml. Composition du milieu : saccbarose 250 raM, Tris 40 mM, EGTA 1 raM, pH 7,4. Le NEM (concentra- t ions finales : 0,05 raM, 0,1 mM et 0,2 mM) est ajout6e en dfibut d ' incubation. La cystfiine 1 mM finale, intro- duite au bout d 'un laps de temps var iant de 15 secondes h 2 minutes r6agit ins tan tan6ment avec la NEM libre res tante et met fin h son action. Un essai tSmoin ne contenant que ]a cyst$ine est rSalis$ conjointement . Dans les essais a) et c), 0,1 ml de milieu (0,8 mg de pro- tdines) sont pr~lev~s et portds dans la cuve du photo- m6tre contenant 1 ml de phosphate d ' ammonium 100 mM h 25°C, pH 7,4 ; le gonflement est suivi par enre- g ' s t rement de la d iminut ion de la densitd optique h 546 nm. Dans les essais b) et d) le mSme al iquot est prdlevb et in t rodui t rap idement dans la cuve de photo- m6tre contenant 1 ml de milieu h 25°C (saccharose 200 mM, KCL 15 mM, ATP 1 raM, C1CCP 0,5 ~tM, pH 7,4). La d iminut ion de la D.O. est enregistrde h 546 nm.

En abscisse sont portds les temps s6parant l ' addi t ion de la cystdine de celle de la NEM. En ordonnde sont por t , s les pourcentages d ' inhibi t ion calcul6s par rap- port au gonflement t6moin constitu~ par l 'essai ne contenant que la cystdine.

• Mitochondries de foie de rat (phosphate d 'ammo- n ium 100 raM). © Mitochondries de foie de rat (sys- t6me C1CCP/ATP). = Mitochondries de coeur de porc (phosphate d ' ammonium 100 mM). [] Mitochondrie de ceeur de porc (syst~me C1CCP/ATP).

0,0'5 mM et 0,1 mM en p a r t i c u l i e r , l ' e n t r 6 e du p h o s - p h a t e s e m b l e p lus i n h i b 6 e et p lu s r a p i d e m e n t d a n s les m i t o c h o n d r i e s de fo ie de rat .

P o u r u n e c o n c e n t r a t i o n de NEM d o n n 6 e (0,2 mM), la so r t i e du p h o s p h a t e d a n s les d e u x t y p e s de m i t o c h o n d r i e s est i n h i b ~e p r o g r e s s i v e - m e n t s u i v a n t le t e m p s d ' i n c u b a t i o n de ]a NISM (b) et (d). Alors que la NEM 0,2 mM r 6 a g i s s a n t p e n - d a n t 1 m i n u t e 30 s e c o n d e s i n h i b e t o t a l e m e n t Fen- t r6e du p h o s p h a t e d a n s les m i t o c h o n d r i e s de foie

100

/ ~ + P i 10 mM

i i i ! | | = i

1 temps(ran) 2

10C

"NEMO.2mM

2 / , , ? 1

t e m p s (ran)

100 100 NEM O,2mM NEM O.2mM

1 • t | i i ! i i 1

1 temps(ran) 2 temps(mn)l

FIG. 3. - - E[fet du phosphate minera l sur l ' inhibi t ion de son transport par la NEM darts les mi tochondries de foie de rat et de co~ur de porc.

a) et b) mitochondries de foie de rat, c) et d) mito- chondries de coeur de porc. Les condit ions exp6rimen- tales sont celles de la figure 2, le phosphate (sel de potassium) est in t rodui t 30 secondes avant la NEM. En ordonn6e sont port6s les pourcentages d ' inhibi t ion de l 'entr6e du phosphate mesur6e dans le phosphate d ' ammonium 100 m M : essais a) et e) et les pourcen- tages d ' inhib i t ion de sa sortie dans le systbme C1CCP/ ATP : essais b) et d). En abscisse est portb ]e temps d'action de la NEM. Les symboles utilis~s sont eeux de la figure 2.

de r a t (a) et de cceur de p o r c (c), l ' i n h i b i t i o n de la s o r t i e du p h o s p h a t e n ' e s t p a s t o t a l e d a n s ]es m 6 m e s c o n d i t i o n s . Le g o n f l e m e n t obse rv6 q u a n d les m i t o c h o n d r i e s s o n t i n c u b 6 e s en p r 6 s e n c e de Mersa ly l , ( r6ac t i f m o i n s p 6 n 6 t r a n t qui i n h i b e io ta-

BIOCHIMIE, 1974, 5 6 , n ° 1.

T r a n s p o r t d u g l u t a m a t e e t d u p h o s p h a t e d a n s les m i t o c h o n d r i e s 165

lement le t ranspor t du phosphate pour des concen- trat ions de l ' o rd re de 15 nnmles /mg de prot6ines), est toujours sup6rieur h eelui imputable h l 'ac t ion de la NEM dans ee syst~me.

Puisqu ' i l est admis que l ' inh ib i t ion du t ranspor t du phosphate par la NEM est due h sa r6act ion avec les groupements thiols du t ranspor teur nous avons voulu savoir dans qu'el le mesure il 6tait possible de contr61er sa r6activit6 en modif iant leur accessibilit6. Nous avons dans ce but fait var ie r les condi t ions d ' incnbat ion.

P r o t e c t i o n par le p h o s p h a t e minera l .

Les exp6riences de la figure 2 ont 6t6 r6p6t6es mats en ajoutant au mil ieu d ' incubat ion du phos-

eoeur de pore paraissent encore plus sensibles l ' addi t ion de phosphate que les pr6c6dentes. On voit en (c) que la p ro tec t ion est obtenue avec du phospha te 2 mM (au lieu de 10 mM) dans le sens de l 'entr6e. La concent ra t ion de NEM utilis6e dans ce cas est 0,2 mM contre 0,1 mM en (a). La protec- t ion est 6galement accentu6e dans le sens de la sort ie (d) au point de res t re indre de fa~on appr6- ciable le m a x i m u m d ' inh ib i t ion obtenu.

- - E[ fe t du malate .

Nons avons eherch6 si d 'autres compos6s pr6- sentaient la par t icular i t6 de modif ier l ' inh ib i t ion du t ranspor t du phosphate par la NEM. Les mito- ehondr ies ont 6t6 ineub6es en pr6senee de plu- sieurs dicarboxylates , acetoglutarate, aspartate,

lO0 a ) 1oo

N E M o.2 mM

.c

I temps(mn)

b)

N F M o , z m M

| i | | i i

temps( ran)

Fro. 4. - - Ef fe t du ntalate sur l 'inhibi- tion de la sortie du phosphate mineral par la NEM pour les mitoehondries de [oie de rat et de cceur de pore.

L'inhibition de la sortie du phosphate est ~tudi6e en pr6sence de malate 4 mM introduit 30 secondes avant la NEM. Figure 4 a : mitoehondries de foie de rat. Figure 4b : mitoehondries de eoeur de pore. Les conditions exp6rimentales sont eelles de la figure 2. Essais en pr6senee de malate (sel de potassium) 4 mM (&).

phate min6ral h une concent ra t ion n 'exc6dant pas 10 mM. Dans t o u s l e s cas la NEM 6tait in t rodui te 30 secondes apr6s et l ' inh ib i t ion du t ranspor t du phosphate mesur6e pour des temps de r6act ion croissants n 'exc6dant pas 2 minutes. Nous avons doubl6 chacun de nos essais pa r un t6inoin ne contenant pas de phosphate .

La figure 3 mont re les r6sultats obtenus pour les mi tochondr ie s de foie de rat (a) et (b) et de eoeur de po re (c) et (d). Il s 'en d6gage les constatat ions suivantes : la pr6sence de phosphate d iminue l ' inh ib i t ion de son t ranspor t par la NEM. Le ph6- nom6ne est surtout accentu6 pendan t la p remi6re minute, il a re~u le nom de pro tec t ion par le sub- strat. Si nous consid6rons les nf i tochondr ies de foie de rat nous voyons que la pro tec t ion est net- tement plus accentu6e dans le cas de la sort ie du phospha te (b) que dans celni de l 'entr6e (a). L ' inh ib i t ion de l 'entr6e du phosphate par la NEM 0,1 m M est prot6g6e par du phosphate 10 ram /t condi t ion que ]e temps d 'ac t ion de l ' i nh ib i t eur n 'exc6de pas 1 minute 30 secondes (a). Par contre, du phospha te 1 mM protbge 1 ' inhibit ion de sa sor- tie par de la NEM 0,2 mM m6me pour un temps plus long d ' incubat ion (b). Les mi tochondr ie s de

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malate. Un r6sultat posi t i f a 6t6 obtenu pour le malate.

La figure 4 o/z sont pr6sent6s des r6sultats se r appor t an t /l la sortie du phosphate mont re les modif icat ions de la r6activit6 de la NEM vis-/i-vis des thiols impliqu6s dans son transport . Le ma- late 4 mM est ajout6 au mi l ieu 30 secondes avant l ' inh ib i teur . On constate que ce d icarboxyla te a u n effet analogue /t celui du phosphate , il est 6gale- ment plus accentu6 dans le cas des mi tochondr ies de eoeur de po re (b).

II - - I N H I B I T I O N D U T R A N S P O R T D U G L U T A M A T E

D A N S L E S M I T O C H O N D R I E S DE F O I E D E R A T .

Les in i tochondr ies de co~ur de pore ne gonflent pas dans le glutamate d ' a m m o n iu m 100 mM, il n 'a done pas 6t6 possible d ' aborder l '6tude de son t ranspor t pa r eerie t echnique pour ce type de mi- tochondries .

Les mi tochondr ies de foie de rat par eontre, sont le si~ge d 'un gonflement impor tan t quand elles sont en suspension dans ee mil ieu (figure 5 B). L ' a m p l i t u d e et la rapidi t6 du ph6nombne sont cependant sensiblement inf6r ieures h celles mesu-

166 R . D e b i s e e t R . D u r a n d .

r6es d a n s le p h o s p h a t e d ' a m m o n i u m 100 mM p o u r u n e m 6 m e q u a n t i t 6 d e m i t o c h o n d r i e s ( f igure 5 A). D e p u i s les t r a v a u x de C h a p p e l l , le t r a n s p o r t des a n i o n s d a n s les m i t o c h o n d r i e s es t 6 tud i6 p a r la p l u p a r t des a u t e u r s en u t i l i s a n t des se ls d ' a m m o -

1.4

E ¢

C)

1.1

1 m n

Fro. 5. - - E / le t de la NEM sur le gon f l ement des mi tochondries de [oie de rat dans le phosphate d'am- m o n i u m 100 mM (A) el le g lu tamate d ' a m m o n i u m I00 mM (B).

Les condi t ions exp6r imenta les sont celles de la figure 2. Les trac6s A e t B repr6senten t la d i m i n u t i o n de ]a densit6 opt ique h 546 n m de la suspens ion quand les mi tochondr ies sont prSineub6es en presence de eys- t6ine 2 mM seulement . Les trac6s A' et B' sont ob tenus quand les mi tochondr ies sont pr6incub6es en pr6sence de NEM 0,1 mM p e n d a n t 1 minu te 30 seeondes avan t l ' add i t ion de la cyst6ine. A' : phospha te d ' a m m o n i u m 100 raM. B' : g lu tamate d ' a m m o n i u m 100 raM.

n i u m 10,0 mM en p r 6 s e n c e d ' u n i n h i b i t e u r de la c h a i n e r e s p i r a t o i r e ( R o t 6 n o n e ou A n t i m y c i n e ) . Des e s sa i s e f fec tu6s a v e c ou s a n s R o t 6 n o n e n ' o n t p a s p e r m i s de m c t t r e e n 6 v i d e n c e u n e m o d i f i c a t i o n s e n s i b l e d u g o n f l e m e n t .

Q u a n d les m i t o c h o n d r i e s de fo ie de r a t s o n t p r6 - i n c u b 6 e s en p r 6 s e n c e de NEM 0,1 mM p e n d a n t 1 m i n u t e 30 s e c o n d e s et que l ' o n m e s u r e e n s u i t e l e u r g o n f l e m e n t d a n s le g l u t a m a t e d ' a m m o n i u m 100 m M ce lu i -c i es t i n h i b 6 ( f igure 5 B') m a i s m o i n s s 6 v b r e m e n t que d a n s le p h o s p h a t e d ' a m m o n i u m 100 m M (f igure 5 A') .

Afin d e m i e u x p r 6 c i s e r le p h 6 n o m ~ n e n o u s a v o n s e f fec tu6 u n e 6 t u d e c o m p a r a t i v e de l ' i n h i b i t i o n d u t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e et de ce l le du t r a n s p o r t d u g l u t a m a t e p a r la NEM.

S u r la f igure 6 s o n t p o r t 6 s les p o u r e e n t a g e s d ' i n h i b i t i o n o b t e n u s d a n s l ' u n et l ' a u t r e m i l i e u e n f o n c t i o n d u t e m p s d ' a e t i o n de l ' i n h i b i t e u r . Q u a n d la NEM est 0,1 irrM le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e es t i n h i b 6 de 5,0 p. c e n t e n s e u l e m e n t 15 s e c o n d e s , le m a x i m u m a t t e i n t au b o u t de 2 m i n u t e s 6 r an t de l ' o r d r e de 90 p, c e n t a lo r s que ce lu i d u g l u t a m a t e ne l ' e s t que de 15 p. c e n t a v e c u n m a x i m u m d ' e n - v i r o n de 60 p. c e n t s e u l e m e n t . Cet te d i f f 6 r e n c e es t 6 g a l e m e n t v a l a b l e p o u r u n e a u t r e c o n c e n t r a t i o n de

lOO

0 . 1 m M

o I i I I i I I

I 2

temps ( m n )

Fro. 6. - - Inhib i t ion par la NEM du gon f lement des mi tochondries de foie de rat dans le phosphate d'am- m o n i u m 100 mM et le g lu tamate d ' a m m o n i u m 100 raM.

Les condi t ions exp6r imenta les sont les m~mes que pour la figure 2. Les mi toehondr ies sont pr6ineub6es en pr6sence de NEM 0,05 mM ou 0,1 mM pendan t n n temps va r i an t de 15 secondes h 2 minu te s puis le gonflement est 6tudi6 soit dans le phospha te d ' a m m o n i u m 100 mM ( e ) soit dans le g lu tamate d ' a m m o n i u m 100 mM (&).

~EM. L o r s q u e ce l le ci es t 0,05 mM il n ' e s t p a s pos - s i b l e d ' i n h i b e r le t r a n s p o r t d u g l u t a m a t e d e p lu s de 30 p. cen t .

Le t r a n s p o r t d u g l u t a m a t e 6 t a n t i n h i b 6 p a r la NEM c o m m e ce lu i d u p h o s p h a t e , l ' e x i s t e n c e d ' u n e p r o t e c t i o n p a r le s u b s t r a t 6 t a i t e n v i s a g e a b l e . La f igure 7 m o n t r e q u ' i l n ' e n es t r i e n .

Q u a n d les m i t o c h o n d r i e s s o n t i n c u b 6 e s e n p r6 - s e n c e de g l u t a m a t e 10 mM (sel de p o t a s s i u m ) , a jou t~ a v a n t la NEM 0,2 raM, n o u s c o n s t a t o n s q u e l ' i n h i b i t i o n es t a u g m e n t 6 e c o n t r a i r e m e n t h rou te a t t en t e . Cet te a u g m e n t a t i o n es t r e l a t i v e m e n t p e u i m p o r t a n t e si l ' o n se r6 f~re h la c o n c e n t r a t i o , n

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T r a n s p o r t d u g l u l a m a t e e l d u p h o s p h a t e d u n s l e s m i t o c h o n d r i e s . 167

de g l u t a m a t e u t i l i s6e (10 mM). La f igure 7 m o n t r e en o u t r e q u e s i le g l u t a m a t e de p o t a s s i u m est r e m - p l a c 6 p a r u n a u t r e se l de p o t a s s i u m (tel que KC1) h la m 6 m e c o n c e n t r a t i o n , l ' i n h i b i t i o n d u gonf le- m e n t est a u g m e n t 6 e d a n s les m 6 m e s p r o p o r t i o n s .

100

c- O

. D

e-

5O

0 I I I I 1 2 temps (mn)

Fro. 7. - - In[luenee du glutamate 10 mM sur l ' inhi- bition de son transport par la NEM 0,2 mM.

Les condi t ions exp6r imenta les sont les m6rnes que pr6c6demment, les mi tochondr ies sont pr6incub4es en pr6senee de NEM 0,2 mM puts le gonflement est mesu- r4 sur u n al iquot . • I nh ib i t i on du gonflement des mi toehondr ies de foie de ra t duns le g lu tamate d ' am- m o n i u m 100 mM pa r la NEM 0,2 mM. © Inh ib i t i on en pr6senee de g lu tamate 10 mM (sel de po tass ium) ajout6 30 secondes avan t la NEM. A Inh ib i t i on en pr6sence de KC1 10 mM ajout6 30 secondes avan t la NEM.

Ceci s u g g 6 r e que l ' e f f e t o b s e r v 6 s e r a i t i m p u t a b l e la p r 6 s e n c e d u p o t a s s i u m p l u t 6 t q u ' h ce l le du

g l u t a m a t e .

I I I - E F F E T D E L A N E M s u R L ' O X Y D A T I O N D U

G L U T A M A T E .

L e s r 6 s u l t a t s a c q u i s p a r la I n 6 t h o d e de gonf le- m e n t des m i t o c h o n d r i e s n 6 c e s s i t e n t 6 v i d e m m e n t p o u r 6 t re t o u t ~ f a i t p r o b a n t s u n e c o n f i r m a t i o n a p p o r t 6 e p a r d ' a u t r e s t e c h n i q u e s .

L ' o x y d a t i o n d u g l u t a m a t e m e s u r 6 ~t l ' 6 t a t 3 El6] p a r la m 6 t h o d e o x y g r a p h i q u e n 6 c e s s i t e le t r a n s - p o r t d u s u b s t r a t , du p h o s p h a t e et de I 'ADP. A l ' 6 t a t d 6 c o u p l 6 le t r a n s f e r t des 61ec t rons n 6 e e s s i t e u n i q u e m e n t I ' e n t r 6 e d u s u b s t r a t . Si la NEM i n h i b e le t r a n s p o r t du p h o s p h a t e et d u g l u t a m a t e o n d o l t o b s e r v e r u n e i n h i b i t i o n de l ' o x y d a t i o n ~ l ' 6 t a t d6coup l6 . E n r e v a n c h e si le t e m p s de r 6 a c t i o n de la NEM est ju s t e n 6 e e s s a i r e p o u r a f f e c t e r le t r a n s - p o r t d u p h o s p h a t e o n do l t o b s e r v e r u n e i n h i b i t i o n

l ' 6 t a t 3 et p a s d ' i n h i b i t i o n h l ' 6 t a t d6coup l6 .

L o r s de l ' o x y d a t i o n du s u c c i n a t e d a n s t o u s l e s cas seu le l ' o x y d a t i o n du s u b s t r a t h l ' 6 t a t 3 d e v r a i t 6 t re affeet6e. E n effet i l n ' a pus p u 6 t re d 6 m o n t r 6 que le t r a n s p o r t de ee s u b s t r a t 6 ta i t i n h i b 6 p a r la NEM.

N o u s a v o n s p r 6 i n c u b 6 les m i t o c h o n d r i e s e n p r6 - s e n e e de N,EM 0,1 mM p e n d a n t u n t e m p s v a r i a n t de 0 ~ 1 m i n u t e 15 s e e o n d e s p u i s la c o n s o m m a - t i o n d ' o x y g 6 n e a 6t6 m e s u r 6 e h l ' 6 t a t 3 e t h l ' 6 t a t d 6 c o u p l 6 en p r 6 s e n c e de g l u t a m a t e ou de s u c c i - na t e . La f igure 8 m o n t r e les r 6 s u l t a t s o b t e n u s au e o u r s d ' u n e e x p 6 r i e n c e . (Cet te e x p 6 r i e n e e a 6t6 r6p6 t6e s i x fois) .

150 ~ J ~ ' ~

4 "~I00

x ,o

c 5O

A

\

I I ! 11 l 1 ternps(mn)

Flo. 8. - - E f fe t de la NEM 0,1 mM sur les consomma- tions d'oxgg6ne, d l'~tat 3 et & l'dtat ddcouplG des mi tochondries de foie de rat mesurdes en presence de g lu tamate et de succinate.

Les mi toehondr ies de foie de r a t (6 mg de prot6ines) sont pr6incub6es h 25°C et h pH 7,4 sous un volume de 0,6 ml. La composi t ion du mi l ieu est la su ivante : Glycylglyeine 24 mM, MgCI2 9,6 raM, KC1 60 mM, Saccbarose 87 mM. La NEM 0,1 mM est a lors a jout6e pendan t un temps v a r i a n t de 0 h 1 minu te 15 seeondes au bout duquel ]a cyst6ine 2 mM finale est ajout6e. La eonsommat ion d'oxyg~ne est a lors mesur6e pa r oxy- graphic sur 1,5 mg de prot6ines mi tochondr ia les .

Volume final du miFeu 2 ml, concent ra t ions finales : ADP 0,2 mM, Phospha te 5 raM, Subs t ra t 10 raM, C1CCP 0,5 ~lxM.

En ordonn6e sont port4s les va leurs de la eonsom- mat ion d'oxyg6ne mesur6e it l '6 tat 3 ( e ) et h l '6 ta t d6coupl6 (O) pour chaque temps de r6aet ion de la NEM indiqu4 en abseisse.

A : Consommat ions d'oxyg~ne mesur6es en pr6senee de sueeinate.

B : Consommat ions d'oxyg6ne mesur6es en pr6senee de glutamate .

Q u a n d le s u b s t r a t es t le g l u t a m a t e n o u s c o n s t a - t o n s u n e n e t t e i n h i b i t i o n de la c o n s o m m a t i o n d ' o x y g b n e auss i b i e n ~ l ' 6 ta t 3 q u ' h l ' 6 t a t d6coup l6 , cec i p e n d a n t les 30 p r e m i 6 r e s e c o n d e s d ' a c t i o n de l ' i n h i b i t e u r . P e n d a n t les 15 s e c o n d e s s u i v a n t e s l ' i n h i b i t i o n d i m i n u e s i g n i f i c a t i v e m e n t , el le aug-

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168 R. Debise et R. Durand.

mente ensuite dans les deux eas. Contra i rement h ee que nous at tendions, m6me en pr6senee de sue- einate on note une inh ib i t ion h l'~tat d6eoupl£

DISCUSSION.

I N H I B I T I O N D U T R A N S J P O R T D U P H O S P H A T E E T P R O -

T ~ C T I O N P A R LE S U B S T R A T ,

Nos r6sultats conce rnan t l ' i nh ib i t ion du t rans- port du phosphate par la NEM sont en faveur d 'une localisat ion re la t ivement externe du trans- por teur du phosphate dans les deux types de mi- tochondries , celui-ci 6tent r ap idemen t touch6 par une faible concent ra t ion d ' inh ib i t eur (figure 2).

La protect ion par le phosphate est observ6e pour les deux types de mi tochondr ies mats elle est plus marqu6e dens le cas de mi tochondr ies de eoeur de pore, m~me pour une concent ra t ion de phosphate plus faible et une concent ra t ion de NEM plus 61ev~e (figure 3).

II est possible que la concent ra t ion en t ranspor- teur du phosphate soit plus 6levee dens les mito- chondr ies de c oeur h finalit6 essent iel lement 6ner- g~tique ou que celui-ci soit plus sensible au phos- phate.

L'effet protecteur est un ph~nom~ne relative- ment stable. Des r6sultats non ment ionn6s ici mont ren t que lorsque des mi tochondr i e s ont 6t6 pr6incub6es en presence de phosphate, il persiste m~me apr~s remise en suspension dens un mil ieu n ' en contenant pas.

La protect ion par le phosphate peut s 'expl iquer entre autres hypotheses, par une mobili t6 des fonc- t ions thiols du t r anspor teur dens la membrane in te rne des mi tochondr ies . Le phosphate p r o v o - querai t une or ienta t ion d e s thiols du c6t~ de la matr ice mi tochondr ia le les r endan t ainsi moins accessibles ~ la NE~. On comprend alors pourquoi l ' augmenta t ion du temps de r6act ion de la NEM suppr ime la p ro t ec t ion comme le mont ren t nos r6sultats. Ce changcment de posi t ion des thiols peut 6tre d u h une modif icat ion de la conformat ion de la prot6ine.

Un m~me effet vis-h-vis du t ranspor t du phos- phate a 6galement gtg observ~ avec d 'antres r6ac- tifs des groupements thiols : ASPM [17], CPDS [18, 19].

Ce ph~nom~ne de protec t ion a servi de p r inc ipe au rep6rage lnol6culaire du t ranspor teur du lac- tose chez E. Colt [20].

Si les mi tochondr ies sont pr6incub6es en pre- sence de malate 4 mM (figure 4) l ' i nh ib i t ion de la

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

sortie du phosphate par la NEM est diminu~e. Ce ph~nom~ne est peut-Stre une cons6quence de l'effet proteeteur exerc6 par le phosphate. L.a NEM n'affeete pas l '6change phosphate-dicarboxylates , on peut done envisager deux ~ventualit~s :

- - le malate favorise l 'entr6e du phosphate par un m~eanisme d'~ehange diffusion insensible h la NEM.

--- l 'entr~e du malate au cours de la pr6 incuba- t ion a provoqu~ une sortie de phosphate endog~ne suffisante pour prot~ger le t ranspor teur . Le ph6no- m~ne observ~ est p robab lement une rfisultante des deux interpr6tat ions .

I N H I B I T I O N D U T R A N S P O R T D U G L U T A M A T E D A N S

LES M I T O C H O N D R I I ~ S D E F O I E D E R A T .

Pour une m~ine concent ra t ion de NEM et un m6me temps d 'act ion, le gonflement des mi tochon- dries de foie de rat est plus inhib6 dens le phos- phate d ' a m m o n i u m 100 mM que dens le glutamate d ' ammon ium 100 mM (figure 6).

Ce r6sultat e s t e n faveur d 'une localisat ion diff6- rente des deux t ranspor teurs dens la membrane interne, celui du glutamate moins accessible, ~tant plus interne. Cette in te rpre ta t ion est renforc~e par le fait que le Mersalyl, r6actif qui diffuse real au travers de la membrane , inh ibe tota lement le t ranspor t du phosphate sans affeeter celui du glu- tanmte.

L ' inh ib i t ion du t ranspor t du glutamate dans les mi toehondr ies de foie de rat par la NEM a ~gale- ment 6t6 trouv6e par deux autres ~quipes [8, 9]. La Fuseine, un autre r6actif des fonet ions thiols inhibe aussi le t ranspor t du glutamate dans ee type de mi tochondr ies [8].

Tager a propos6 un m6eanis lne d ' i nh ib i t ion du t ranspor t du glutamate dans lequel la NEM forme- rai t un analogue s t ructural du substrat au niveau du site actif [9]. S'il en ~tait a insi on devrait ob- server une forte protec t ion exere6e par le gluta- mate eontre l ' i nh ib i t ion de son t ranspor t par la N£M or nos r6sultats mon t ren t qu' i l n ' en est r ien.

Quand les mi toehondr ies sont ineub6es en pr6- sence de glutamate 10 mM (sel de potassium), non seulement l ' i nh ib i t ion n 'est pas d iminu6e mats clle est renfore6e. Si l 'exp6rienee est r6p6tfie en pre- sence d 'un autre sel de potass ium A la m~me con- cent ra t ion le m~me ph6nom~ne apparalt . Ce r6sul- tat e s t e n faveur d 'une act ion exere6e par le potassium sur la r6aetivit6 des thiols impliqu6s dans le t ranspor t du glutamate, eeux ei 6tant plus aeeessibles que dans l 'exp6rienee t6moin r~alis6e dans un mil ieu n 'en eontenant pas.

T r a n s p o r t du g l u t a m a t e el du p h o s p h a t e dans les m i t o c h o n d r i e s . 169

INHIBITION DE L'OXYDATION DU GLUTAMATE.

Le t r a n s p o r t d u s u b s t r a t n ' e s t p a s le seu l fac- t e u r l i m i t a n t la r e s p i r a t i o n des m i t o c h o n d r i e s . T r a n s p o r t d u p h o s p h a t e , i n t 6 g r i t 6 des t r a n s p o r - t e u r s d ' 61ec t rons de la c h a i n e r e s p i r a t o i r e et t r a n s - l o c a t i o n des n u c l 6 o t i d e s s o n t ~ p r e n d r e en c o n s i - d 6 r a t i o n m a t s l ' o r d r e d a n s l e q u e l ces d i f f 6 r e n t s p a r a m ~ t r e s s o n t a f fec t6s n o u s es t i n c o n n u .

Les r 6 s u l t a t s o b t e n u s p a r l ' i n h i b i t i o n d u gonfle- m e n t des m i t o c h o n d r i e s l a i s s e n t s u p p o s e r que le t r a n s p o r t d u p h o s p h a t e est i n h i b 6 a v a n t ce lu i d u g l u t a m a t e d a n s les m i t o c h o n d r i e s de fo ie de ra t . D ' a u t r e s r 6 s u l t a t s m o n t r e n t que l ' i n h i b i t i o n des p h o s p h o r y l a t i o n s o x y d a t i v e s p a r la N,FAVl es t d u e e n p r e m i e r l i eu ~ l ' i n h i b i t i o n de la t r a n s l o c a t i o n des n u c l 6 o t i d e s ( 6 c h a n g e A T P / A D P ) a v a n t q u e la l i m i t a t i o n de l ' a p p o r t d u p h o s p h a t e (qui e n s e r a i t la cause ) n e so i t & i n e r i m i n e r [21].

Les t r a n s p o r t e u r s d ' 61ec t rons de la c h a i n e r e s p i - r a t o i r e s o n t s e n s i b l e s ~ la NEM [22] n Ia i s n o u s ne p o s s 6 d o n s m a l h e u r e u s e m e n t p a s d ' i n d i c a l i o n s suf- f i s an t e s p e r m e t t a n t d ' e s t i m e r l ' o r d r e d a n s l eque l i ls i n t e r v i e n n e n t n i d ' e s t i m e r q u a n t i t a t i v e l n e n t la p a r t qu i l e u r r e v i e n t d a n s la d i m i n u t i o n de la c o n - s o m m a t i o n d ' o x y g b n e o b s e r v 6 e .

Nos r 6 s u l t a t s m o n t r e n t que la NEM af fee te r a p t - d e m e n t la c o n s o m m a t i o n d ' o x y g b n e des m i t o c h o n - d r i e s de fo ie de r a t m e s u r 6 e e n p r 6 s e n c e de g lu ta- m a t e . L ' e f fe t o b s e r v 6 a u g m e n t e l i n 6 a i r e m e n t p e n - d a n t les 30 p r e m i b r e s s e c o n d e s auss i b i e n l ' 6 t a t 3 qu'h l ' 6 t a t d 6 c o u p l 6 off seu ls s o n t ~ m e t t r e en c a u s e le t r a n s p o r t d u g l u t a m a t e et le t r a n s f e r t des 61ec t rons .

Si n o u s c o n s i d 6 r o n s u n a u t r e s u b s t r a t c o m i n e le s u c e i n a t e d o n t le t r a n s p o r t n ' e s t p a s i n h i b 6 p a r la NEM, la c o n s o m m a t i o n d ' o x y g 6 n e es l 6 g a l e m e n t a f fec t6e h l ' 6 t a t d6coup l6 . U n p o i n t d ' i m p a c t de l ' i n h i b i t e u r p r i n c i p a l e m e n t l oca l i s6 au n i v e a u de la c h a i n e r e s p i r a t o i r e es t p r e s q u e c e r t a i n .

P o u r u n t e m p s d ' a c t i o n de l a NEM 0,1 m M sup6- r i e u r h 30 s e c o n d e s 1 ' i n h i b i t i o n de la c o n s o m m a - t i o n d ' o x y g ~ n e d i m i n u e . Ce p h b n o m ~ n e a 6t6 ob- s e rv6 au c o u r s de t o u t e s nos e x p 6 r i e n c e s s ans e x c e p t i o n .

L ' i n h i b i t i o n a u g m e n t e h n o u v e a u q u a n d le t e m p s d ' a c t i o n de la NEM est p r o l o n g 6 , cec i d a n s les d e u x cas et p o u r les d e u x s u b s t r a t s , p e u t 6 t re u n p e u p l u s e n p r 6 s e n c e de g lu t a ina t e .

Ce t y p e de m 6 t h o d e s n e p e r m e t p a s de n m n t r e r de f a c o n c e r t a i n e que le t r a n s p o r t d u g l u t a m a t e est i n h i b 6 p a r la NEM m a t s e l les n ' i n f i r m e n t p a s les r 6 s u l t a t s o b t e n u s p a r a i l l eu r s . I1 est p r o b a b l e

que de t o u s l e s f a c t e u r s d o n t d 6 p e n d la r e s p i r a - t i o n des m i t o c h o n d r i e s le t r a n s p o r t du g l u t a m a t e est le d e r n i e r t o u c h 6 p a r la NEM.

On c o n s t a t e en effe t que l ' o x y d a t i o n d u gluta- m a t e es t i n h i b 6 e de 50 p. c e n t h l ' 6 t a t d 6 c o u p l 6 (NEM 0,1 mM, 30 s e c o n d e s , f igu re 8). E n r e v a n c h e l ' i n h i b i t i o n d u t r a n s p o r t d u g l u t a m a t e m e s u r 6 e p a r la m 6 t h o d e de g o n f l e m e n t , p o u r u n e m 6 m e c o n c e n t r a t i o n de NE,M et u n m 6 m e t e m p s de r6ac - t i on , n ' e s t que de 25 p. c e n t ( f igure 6).

R ~ s u ~ .

L ' inh ib i t ion par la NEM des t r anspo r t s du phospha te et du g lu tamate au n iveau des mi toehondr ies de foie de r a t et de eoeur de porc a 6t6 6tudi6e.

Deux types de m6thodes ont 6t6 util is~es : m6thodes cin6t iques de gonflement, m6thode m6tabol ique off l ' oxyda t ion peut ~tre consid~r6e comme une r6sul tan te ent re le t r a n s p o r t des subs t ra t s p rop remen t di ts et leur m~tabol isme.

Les r~sul ta ts su ivants ont ~t~ obtenus :

1 - - Dans les mi toehondr ies de foie de r a t le t r ans - port du phospha te est inhib~ avan t celui du g lu tamate pa r la NEM. Les mi toehondr ies de eoeur de pore ne gonflent pas dans le g lu tamate d ' a m m o n i u m 100 mM ;

2 - - L ' i nh ib i t i on du t r anspo r t du phospha te pa r la NEM est d iminu~e quand du phospha te est in t rodu i t dans le mi l ieu de p rd ineuba t ion des mi toehondr ies avan t la NEM. Cette ¢ protection >) est plus impor t an t e et plus sensible h la concent ra t ion du phospha te dans les mi toehondr ies de eceur de pore.

Le glutamate , add i t ' onn6 dans le mi l ieu de pr6in- cubat ion des mi toehondr ies , n ' a pas d'effet sur l ' i nh i - b i t ion pa r la NEM du t r anspo r t du g lu tamate mesur6 dans le g lu tamate d ' a m m o n i u m 100 mM.

3 - - L 'oxyda t ion du g lu tamate dans les mi tochon- dries de foie de r a t est inhib6e h l '6 ta t 3 et h l '6tat d6eoupl6 obtenu pa r addi t ion de C1CCP. L'effet de la NEM semble se fa i re s imu l t an6men t h p lus ieurs sites : t r a n s p o r t du phosphate , du g lu tamate et t r ans f e r t des 61eetrons h l '6 ta t eoupl6, t r a n s p o r t du g lu tamate et t r ans f e r t des 61eetrons h l '6tat d6coupl&

BIBLIOGRAPHIE.

1. Chappell, J. B. & Crofts, A. R. (1965) Biochem. J., 95, 393-402.

2. Fonyo, A. a Bessman, S. P. (1966) Bioehem. Bio- phys. Res. Comm., 24, 61-66.

3. Fonyo, A. (1968) Biochem. Biophys. Res. Comm., 32, 624-628.

4. Metier, A. J., Groot, G. S. P. ¢, Tager, J. M. (1970) F.E.B.S. Letlers, 8, 41-44.

5. Haugaard, N., Lee, N. N., Kostrzewa, R., Horn, S. Haugaard, E. S. (1969) Biochim. Biophys. Acta,

172, 198-204. 6. Chappell , J. B. (1969) Brit. Med. Bull., 24, 150-156. 7. Sabadie-Pia loux, N. a Gautheron, D. (1971) Bio-

chim. Biophys. Acta, 234, 9-15. 8. Meyer, J., Brandol in , G. & Vignais, P. M. Sympo-

sium sur les mitochondries. Grenoble. 7, 8, 9 F6vrier 1973. Communica t ion .

9. Metier, A. J., Brouwer, A., Rei jngoud, D. J., Hock, J. B. a Tager, J. M. (1972) Bioehim. Biophys. Acta, 238, 421-429.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.

1 7 0 R . D e b i s e e t R . D u r a n d .

10. Kdp6s, A. (1960) Biochira. Biophys . Acta, 40, 70. 11. W e i n b a c h , E. C. (1961) Anal. Biochem., 2, 335-343. 12. Gorna l l , A. G., B a r d a w i l l , L. H. • David , M. M.

(1949) J. Biol. Chem., 177, 751-766. 13. Crane , F. L., Gleen, J. F. a Green, D. E. (1956) Bio-

chim. Biophys . Acta, 22, 475-487. 14. Chappe l l , J. B. ~ Crof t s , A. R. (1966) d a n s ¢ Rdgu-

lation of metabol ic process in m i t o c h o n d r i a ~> B. B. A. Library. Elsevier Publ i sh ing Company. Amsterdam. London. Vol. 7, p. 273-314.

15. Har r i s , E. J. a V a n D a m , K. (1968) Biochem. J., 106, 759-766.

16. Chance , B. ~ W i l l i a m s , G. R. (1956) Advances in Enzymology , 17, 65-134.

17. K l i n g e n b e r g , M., D u r a n d , R. a Guer in , B. EUR. J. Biochem. s o u s p resse .

18. A b o u - K h a l i l , S. Th6se 3 e Cycle L y o n 1973. 19. G a u t h e r o n , D. C. (1973) Biochimie, 55, 727-745. 20. Fox, C. F. ~ :Kennedy, E. P. (1965) Proc. Nat. Acad.

Sci. USA, 54, 891-899. 21. Mc Givan , J . D., Grebe, K. a K l i n g e n b e r g , M. (1971)

Biochem. Biophys. Res. Cola., 4'5, 1533-1541. 22. G u t m a n , M., M e r s m a n n , M., L u t h y , J. ~ S inger , T. P.

(1970) Biochemis try , 9, 2678-2687.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 1.