Inhibition du transport des analogues nucléosidiques par l’inhibiteur de tyrosine kinase nilotinib

Mémoire

Josy Baldaheania Naud

Maîtrise en Biologie Cellulaire et Moléculaire

Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Josy Baldaheania Naud, 2013

ii

iii

RÉSUMÉ

Les analogues nucléosidiques sont des antimétabolites utilisés depuis longtemps dans le traitement de

plusieurs cancers. Due aux similarités de leurs structures chimiques à celles des nucléosides, ils sont

assimilés, métabolisés et incorporés à l’ADN comme les nucléosides. Pourtant, quelques remplacements

d’atomes dans leurs structures provoquent l’arrêt de la synthèse de l’ADN. Parmi les analogues

nucléosidiques les plus utilisés dans la clinique, on retrouve la cytarabine et la gemcitabine, le premier étant

important dans les traitements des cancers hématopoïétiques, tandis que le dernier est plus utilisé dans le

traitement des tumeurs solides. La cytarabine a été utilisée dans le traitement de la leucémie myéloïde

chronique (LMC) en combinaison avec l’interféron jusqu’en 2001, lorsqu’on a approuvé l’inhibiteur de kinase

imatinib comme première ligne de traitement pour cette maladie. L’imatinib se lie au site ATP de la protéine

BCR-ABL, qui provient d’une translocation entre deux gènes, et leur présence dans les cellules leucémiques

caractérise la Leucémie myéloïde chronique. Environ 80% des patients répondent très bien au traitement avec

l’imatinib, mais 20% développent de la résistance ou de l’intolérance après quelques années de traitement.

Pour ces patients, quelques thérapies alternatives sont à l’étude, comme par exemple, l’utilisation de la

cytarabine en combinaison avec l’imatinib. On a travaillé sur l’hypothèse que les inhibiteurs de kinase

interfèrent dans le transport des analogues nucléosidiques. Les objectifs de cette étude était de 1) mesurer

l’assimilation des analogues nucléosidiques en présence des inhibiteurs de kinases, 2) vérifier si ces derniers

ont un rôle dans le transport et la cytotoxicité des analogues nucléosidiques et 3) démontrer qu’une thérapie

utilisant ces deux médicaments de façon successive peut être plus efficace qu’un traitement qui les utilise

simultanément. Pour ce faire, on a mesuré l’assimilation des nucléosides et des analogues nucléosidiques en

utilisant la [3H] thymidine et la [3H] gemcitabine et on a utilisé la méthode d’effet de proximité pour vérifier

l’effet de l’inhibiteur de kinase nilotinib sur la cytotoxicité des cellules. Nos résultats ont montré que les

inhibiteurs de kinases bloquent l’assimilation des nucléosides et analogues nucléosidiques. Les inhibiteurs de

kinases utilisés dans le traitement de la LCM, l’imatinib et surtout le nilotinib, protègent les cellules de la

cytotoxicité de l’analogue nucléosidique gemcitabine lorsqu’on les utilise simultanément, mais ils peuvent

aussi augmenter la cytotoxicité de la gemcitabine après un traitement successif de l’analogue nucléosidique

suivi de l’inhibiteur de kinase nilotinib

iv

v

Table des matières

RÉSUMÉ ............................................................................................................................................................. iii

Table des matières .............................................................................................................................................. v

Table des figures ................................................................................................................................................ vii

Liste des tableaux .............................................................................................................................................. ix

AVANT-PROPOS ............................................................................................................................................... xi

Liste des abréviations et acronymes ................................................................................................................. xiii

Introduction ......................................................................................................................................................... 1

Chapitre 1 ............................................................................................................................................................ 1

1.1 Les analogues nucléosidiques .................................................................................................................. 1

1.2 Les transporteurs nucléosidiques ............................................................................................................. 2

1.3 Le cancer et les inhibiteurs de kinases ..................................................................................................... 3

1.4 La leucémie myéloïde chronique .............................................................................................................. 5

1.4.1 Traitement de la LMC ............................................................................................................................ 6

1.5 Les jonctions GAP .................................................................................................................................. 10

CHAPITRE 2 ..................................................................................................................................................... 13

2.1 Matériel et méthodes .............................................................................................................................. 13

2.1.1 Culture cellulaire .............................................................................................................................. 13

2.1.2 Test de l’entrée de la thymidine et de la gemcitabine radiomarquée au [3H] ................................... 13

2.1.3 Test d’effet de proximité .................................................................................................................. 13

2.1.4 Test MTT ......................................................................................................................................... 13

2.1.5 Immunofluorescence ....................................................................................................................... 14

CHAPITRE 3 ..................................................................................................................................................... 15

3.1 Résultats ................................................................................................................................................. 15

3.1.1 Inhibition de l’entrée de la [3H]thymidine par des inhibiteurs de kinases. ........................................ 15

3.1.2 Inhibition de l’assimilation de la [3H] gemcitabine par des inhibiteurs de kinases utilisés dans la

clinique. .................................................................................................................................................... 16

3.1.3 Inhibition de la [3H] thymidine par les inhibiteurs de kinase utilisés dans le traitement de la LMC. . 17

3.1.4 Inhibition de l’entrée de la [3H] thymidine dans les cellules K562 par l’imatinib et le nilotinib. ....... 18

3.1.5 Relation dose réponse du nilotinib versus l’imatinib sur des lignées cellulaires ovariennes ............ 20

3.1.6 Relation dose réponse du traitement simultané de la gemcitabine avec le nilotinib sur les cellules

ovariennes. ............................................................................................................................................... 21

3.1.7 Immunofluorescence de la connexine 43 ........................................................................................ 23

vi

3.1.8 Effet de proximité de la gemcitabine sur les cellules ovariennes ..................................................... 23

3.1.9 Augmentation de l’effet de proximité de la gemcitabine par le nilotinib sur la lignée ovarienne PA1.

.................................................................................................................................................................. 25

CHAPITRE 4 ..................................................................................................................................................... 29

4.1 Discussion et conclusion ............................................................................................................................. 29

4.1.1 Régulation de l’entrée de nucléosides ............................................................................................. 29

4.1.2 Traitement avec la gemcitabine suivi du nilotinib versus traitement simultané avec la cytarabine

avec le dasatinib. ...................................................................................................................................... 30

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................... 33

vii

Table des figures

Figure 1- Structure chimique de la gemcitabine. La gemcitabine est un analogue de la désoxycytidine que

diffère de cette dernière par le remplacement de deux atomes d’hydrogéne par deux atomes de fluor sur le

groupe sucre de la molécule. .............................................................................................................................. 1

Figure 2 - Structure chimique de la cytarabine. La cytarabine est un analogue de la désoxycytidine qui diffère

de cette dernière par la présence d'un groupe hydroxyle à la position 2 du groupe sucre de la molécule ......... 2

Figure 3 – Schéma de la translocation entre le gène ABL au chromosome 9 et le gène BCR au chromosome

22 qui donne origine au chromosome Ph+ où on trouve le gène BCR-ABL [20] ................................................. 5

Figure 4 – Shéma simplifié des quelques voies de signalisation activées dans les cellules BCR-ABL [20]........ 6

Figure 5 – Réduction de ≥ 3-log du transcrit BCR-ABL après le traitement avec l’Imatinib [5] ........................... 8

Figure 6 – Schéma du mécanisme d’action de l’Imatinib sur la protéine BCR-ABL [21] ..................................... 9

Figure 7 – Entrée du nucléoside [3H] thymidine dans les cellules ovariennes PA1 après 15 minutes

d’exposition aux differentes inhibiteurs de kinases à 10µM. ............................................................................. 16

Figure 8 - Entrée de la [³H] gemcitabine dans les cellules ovariennes PA1 après 15 minutes d’exposition aux

inhibiteurs de kinases en utilisation clinique. ..................................................................................................... 17

Figure 9 - Entrée de la [³H] thymidine dans les cellules ovariennes PA1 après 15 minutes d’exposition aux

inhibiteurs de kinases utilisés dans le traitement de la LMC à différentes concentrations. ............................... 18

Figure 10 - Entrée de la [³H] thymidine dans les cellules de la LMC K562 après 15 minutes d’exposition à

l’inhibiteur de kinase imatinib à différentes concentrations ............................................................................... 19

Figure 11 - Entrée de la [³H] thymidine dans les cellules de la LMC K562 après 15 minutes d’exposition à

l'inhibiteur de kinase nilotinib en différentes concentrations. ............................................................................. 19

Figure 12 - Viabilité des cellules ovariennes PA1 après traitement de 72 h aux inhibiteurs de kinases nilotinib

et Imatinib. ......................................................................................................................................................... 20

Figure 13 - Viabilité des cellules ovariennes Skov3 après traitement de 72 h aux inhibiteurs de kinases nilotinib

et Imatinib. ......................................................................................................................................................... 21

Figure 14 - Viabilité des les cellules ovariennes PA1 après traitement simultané de 72 h à la gemcitabine en

combinaison avec le nilotinib à 5 µM et à 1 µM ................................................................................................ 22

Figure 15 - Viabilité des cellules ovariennes Skov3 après traitement simultané de 72 h de la gemcitabine en

combinaison avec le nilotinib à 5 µM et à 1 µM ................................................................................................ 22

viii

Figure 16 - Immunofluorescence de la Cx43 sur les cellules d'osteosarcoma MG-63, les cellules de

glioblastoma SKI-1 et les cellules ovariennes PA1 ............................................................................................ 23

Figure 17 - Viabilité des cellules SKI-1 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la gemcitabine

pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios. ............................................................................ 24

Figure 18 - Viabilité des cellules ovariennes PA1 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la

gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios ........................................................ 24

Figure 19 - Viabilité des cellules ovariennes Skov3 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la

gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios ........................................................ 25

Figure 20 - Viabilité des cellules MG-63 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la gemcitabine

pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios ............................................................................. 26

Figure 21 - Viabilité des cellules PA1 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la Gemcitabine

pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios. ............................................................................ 26

Figure 22 - Viabilité des cellules Skov3 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la Gemcitabine

pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios ............................................................................. 27

ix

Liste des tableaux

Tableau 1 – Inhibiteurs de kinases approuvés par la Food and Drug Administration pour les traitements des

cancers [17] ......................................................................................................................................................... 4

Tableau 2 – Ratio des meilleures réponses hématologiques et cytogéniques du traitement avec l’imatinib

versus le traitement avec l’IFN-α [22] .................................................................................................................. 7

Tableau 3 – inhibiteurs de kinase utilisés dans les essais pour ce travail ......................................................... 15

x

xi

AVANT-PROPOS

Premièrement, je remercie mon directeur, Dr. Manuel Caruso, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et m’a offert l’opportunité de poursuivre mes études au Québec et d’avoir financé une partie de ma maîtrise.

J’aimerais également remercier mon co-directeur, Dr. Pedro Otávio de Campos-Lima, pour ces belles paroles d’espoir et d’encouragement et pour sa motivation contagieuse.

Je remercie aussi ma collègue Florence Pagé-Larivière, pour son support et son amitié dans les moments plus difficiles durant son temps passé au laboratoire. Je remercie également Bryan Simoneau, pour nos moments de discussion sur plusieurs questions des cours théoriques et sur mon cheminement durant la maîtrise.

Plus personnellement, je remercie profondément Jean-Philippe, mon amoureux, pour son encouragement, pour sa compréhension, sa patience et son amour tellement fort au point de combler presqu’à 100% l’absence de ma famille et de mes amis tant loin et pour m’avoir soutenue de toutes les formes pendant les deux ans de maîtrise. Ensuite, je remercie mes parents pour se faire présents, malgré la distance, à travers leurs paroles d’encouragements et leurs conseils et par leurs personnalités pleines de courage et d’espoir exemplaires. Vous êtes mon inspiration. Je remercie ma grand-mère pour ses prières quotidiennes pour moi, pour son amour et pour être le plus bel être humain (dans tout le sens) que j’ai connue.

Merci à mes beaux-parents, Lise et Christian, qui m’ont accueillie dans leur famille, pour avoir été si attentionnés vers moi depuis que je suis au Québec et pour leurs encouragements et prières.

En terminant, je remercie profondément Dr. Paula Jimenez pour sa disponibilité, son écoute, son amitié et son support moral et scientifique.

xii

xiii

Liste des abréviations et acronymes

ADN ............................................................................................................................Acide Désoxyribonucléique

ADP .................................................................................................................................Adénisone Diphosphate

AMP .......................................................................................................................... Adénosine Monophosphate

AN .............................................................................................................................. Analogues Nucléosidiques

Ara-C.................................................................................................................................................... Cytarabine

ARN...................................................................................................................................... Acide Ribonucléique

ARNm ............................................................................................................... Acide Ribonucléique messagère

ATP ................................................................................................................................ Adénosine Triphosphate

AZT...................................................................................................................................................... Zidovudine

CNT ....................................................................................................... Transporteur nucléosidique concentratif

Cx26. .............................................................................................................................................. Connexine 26

Cx43 ............................................................................................................................................... Connexine 43

DMSO .....................................................................................................................................Diméthyle sulfoxide

EGFR ........................................................................................ Récepteur de facteurs de croissance épidermal

ENT ......................................................................................................... Transporteur Nucléosidique équilibratif

FDA ...................................................................................................................... Food and Drug Administration

GIST................................................................................................................. Tumeur stromale gastro-intestinal

GTP………………………………………………………………………………………………..Guanidine triphosphate

GDP……………………………………………………………………………………………….Guanidine diphosphate

3H ………………………………………………………............……………………......………………..…………Tritium

IK............................................................................................................................................ Inhibiteur de kinase

IFN-α................................................................................................................................................Interféron alfa

JG.................................................................................................................................................... Jonction GAP

LCM ...................................................................................................................... Leucémie myéloïde chronique

MDR ...............................................................................................................................« Multi drug resistance »

MNGIE ...........................................................................Encéphalopathie neuro-gastro-intestinale mitochondrial

MTT ......................................................................... 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium bromide

NBMPR ...................................................................................................................... Nitrobenzylmercaptopurine

PDGF ......................................................................................................Facteur de croissance plaquette dérivé

Ph ………………………………………………………………………………………...... Chromosome Philadelphia

RR ……………………………......................................…………………………………… Ribonucleotide reductase

TN ………………………….....................................…………………………………… Transporteur nucléosidiques

xiv

1

Introduction

Chapitre 1

1.1 Les analogues nucléosidiques

Les nucléosides naturels sont les précurseurs des molécules essentielles pour la physiologie cellulaire, comme l’AMP, l’ADP, l’ATP, l’ADN et l’ARN. Les analogues nucléosidiques (AN) sont des agents chimiothérapeutiques importants dans plusieurs traitements anticancéreux et antiviraux. Leurs structures chimiques sont similaires à celles des nucléosides, en se différenciant de ces derniers par quelques ajouts ou remplacements des atomes ou groupes d’atomes. Due à ces fortes similarités structurales, les AN agissent comme antimétabolites et peuvent être assimilés et métabolisés facilement par les cellules comme le sont les nucléosides [1] (Figure 1 et 2).

À l’extérieur de la cellule, les AN sont dans une forme inactive. Une fois dans la cellule, ils sont phosphorylés par les nucléoside kinases en leurs formes monophosphatés et ensuite en leurs formes actives, diphosphates et triphosphates qui sont capables, par compétition avec les nucléosides, de s’incorporer aux nouveaux brins d’ADN ou d’ARN et provoquer la terminaison de la chaine d’élongation. Ils sont capables d’inhiber la synthèse de l’ADN ou d’interférer dans l’activité de certaines enzymes impliquées dans la synthèse des acides nucléiques, comme la ribonucleotide réductase (RR) et l’ADN polymérase [1-3].

Les AN sont classifiés selon leurs similarités aux nucléosides pyrimidiques et puriques. Parmi les analogues puriques importants utilisés dans la clinique, on retrouve la cladribine et la fludarabine [1]. La cladribine (2-CdA) est un analogue de la deoxyadénosine utilisé dans le traitement de la leucémie à tricholeucocytes. La fludarabine est un analogue de l’adénosine utilisé dans le traitement de certains lymphomes.

Parmi les AN pyrimidiques, il y a deux analogues de la deoxycytidine largement utilisés dans la clinique, la gemcitabine et la cytarabine. La gemcitabine se différencie de la deoxycytidine par le remplacement de deux atomes d’hydrogène par deux atomes de fluor sur le groupe sucre de la molécule (figure 1) [1].

Figure 1- Structure chimique de la gemcitabine. La gemcitabine est un analogue de la désoxycytidine que diffère de cette dernière par le remplacement de deux atomes d’hydrogéne par deux atomes de fluor sur le groupe sucre de la molécule.

2

La gemcitabine est utilisée dans les traitements contre les tumeurs solides, principalement ceux du pancréas, et en combinaison avec d’autres agents chimiothérapeutiques dans le traitement du cancer de l’ovaire, du poumon et du sein [1, 4]. Elle s’incorpore aux brins d’ARN et d’ADN en formation, et suite à son incorporation, un nucléoside s’ajoute à la molécule de gemcitabine et évite qu’elle soit reconnue dans le nouveau brin d’ADN. De cette façon, il échappe à la réparation de l'ADN par excision de pairs de bases et empêche aussi l’ADN polymérase de procéder. En sa forme diphosphate, la gemcitabine est aussi capable de diminuer la prolifération cellulaire à travers l’inhibition de la RR [1].

La cytarabine (Ara-C) est également un analogue de la deoxycytidine (figure 2) qui est spécialement utilisée dans le traitement de certains types de leucémies aigues et lymphomes. La cytarabine a déjà été utilisée dans le traitement standard de la LMC avant l’utilisation des inhibiteurs de kinase comme première ligne de traitement contre cette maladie [5]. Au même titre que la gemcitabine et les autres AN, l’Ara-C est phosphorylée dans ses formes actives diphosphate et triphophaste, s’incorpore à l’ADN et bloque l’ADN polymérase, ce qui a comme conséquence le blocage de la synthèse de l’ADN.

Figure 2 - Structure chimique de la cytarabine. La cytarabine est un analogue de la désoxycytidine qui diffère de cette dernière par la présence d'un groupe hydroxyle à la position 2 du groupe sucre de la molécule

1.2 Les transporteurs nucléosidiques

Due à leurs caractéristiques hydrophiles, les nucléosides, ainsi que les AN, entrent dans les cellules par des transporteurs spécifiques. Chez l’humain, les cellules peuvent co-exprimer plusieurs isoformes de transporteurs de nucléosides (TN) distribués de forme hétérogène sur les pôles apical et basolatéral de la cellule [6, 7]. Les TN se différencient entre eux par leurs dépendance au sodium, par la sélectivité à certains substrats et par la sensibilité à certains inhibiteurs [6].

Ils sont classifiés dans deux familles majeures : les transporteurs nucléosidiques concentratifs (CNT) et les transporteurs nucléosidiques équilibratifs (ENT). Les CNT font le transport des nucléosides contre un gradient de concentration, en dépendance au sodium (Na+), et seulement vers l’intérieur de la cellule. On retrouve trois types chez l’humain, CNT1, CNT2 et CNT3. Le CNT1 transporte principalement les nucléosides pyrimidiques,

3

mais aussi l’adénosine; le CNT2 fait le transport des analogues puriques et de l’uridine et le CNT3 transporte les deux groupes de nucléosides, pyrimidiques et puriques [8].

Quant aux ENT, on en retrouve quatre types principaux : ENT1, ENT2, ENT3 et ENT4. Ils sont également les plus abondants chez l’humain. Parmi ces quatre ENT, les deux premiers mentionnés, soit ENT1 et ENT2, sont les plus importants, dus à leurs capacités de faire le transport des nucléosides puriques et pyrimidiques. Tous ces transporteurs sont très sélectifs, mais montrent une faible affinité par rapport aux transporteurs concentratifs [9] et font le transport des nucléosides dans les deux sens, vers l’intérieur et vers extérieur de la cellule jusqu’à l’équilibre, à l’exception du transporteur ENT4, dont il a été récemment démontré que l’activité est couplé à Hydrogéne (H+) [7].

ENT1 est le plus abondant chez l’humain, on le trouve dans presque tous les tissus. Il se différencie des autres ENT par sa forte sensibilité au nitrobenzylmercaptopurine (NBMPR) de l’ordre du nanomolaire. ENT1 ainsi qu’ENT2 sont inhibés par le dipyridamole, un vasodilatateur qui les inhibe de façon non-spécifique [6, 8].

Les TN sont cliniquement importants parce qu’ils font aussi le transport des analogues nucléosidiques, des agents importants utilisés dans les traitements anticancéreux et antiviraux. Leurs expressions et fonctionnalité sont associées à la sensibilité aux traitements. ENT1 est celui qui fait le transport de la majorité des analogues nucléosidiques important cliniquement et est le mieux caractérisé en termes de structure et fonction [8]. Par contre, malgré son importance clinique, la régulation de ce transporteur est peu connue.

1.3 Le cancer et les inhibiteurs de kinases

Au niveau cellulaire, les processus biologiques qui contrôlent la croissance, la prolifération, la survie et la mort cellulaire, se font par des cascades de signalisations importantes. Ces cascades consistent en plusieurs transferts d’un groupe phosphate d’une molécule d’ATP à une protéine et ce, sur environ 518 protéines tyrosine-kinase chez l’humain. Ces protéines tyrosine-kinase sont des récepteurs de la membrane plasmique ou des protéines intracellulaires qui transmettent un signal reçu du milieu extracellulaire aux différentes cibles situés dans le cytoplasme ou le noyau [10]. Plusieurs dérégulations dans les fonctions de ces enzymes, tel que l’activation constitutive provoquée par des mutations qui favorisent la conformation active de la protéine ou amènent à sa surexpression, sont associée à des maladies immunologique, neurologique, métabolique, infectieuse et aussi à la cancérogenèse. C’est le cas de la protéine BCR-ABL (figure 2), responsable de LMC [10-12].

Il est à noter que le cas où une seule protéine oncogénique est responsable de la transformation d’une cellule en cellule cancéreuse est plutôt rare. En général, les cellules cancéreuses ont des contextes moléculaires particuliers qui proviennent de l’accumulation de plusieurs mutations à l’ADN. Due à ce profil singulier, le résultat d’un traitement avec les médicaments chimiothérapeutiques conventionnelles n’est pas prévisible et peut être très toxique. En effet, étant donné que ces médicaments ne sont pas capables de discriminer une cellule cancéreuse d’une cellule normale, les risques d’effets secondaires plus sérieux pour les patients sont augmentés et contribuent à la résistance [10, 12-14].

4

Par contre, l’utilisation des agents qui peuvent interférer de façon plus spécifique dans l’activité des protéines oncogéniques impliquées dans les cascades de signalisation impliqués dans la prolifération, la survie, et la migration des cellules cancéreuses montrent une très bonne opportunité pour comprendre les fondements moléculaires de certains types de cancer et améliorer la sensibilité aux traitements avec beaucoup moins de toxicité [10, 14].

Les agents utilisés pour la thérapie ciblée sont les anticorps monoclonaux, les siRNA et les inhibiteurs de kinases (IK). Ces derniers ont révolutionné plusieurs traitements de cancers dans les dernières décennies [10], et ce, par leur contribution à l’augmentation de la survie (de quelques mois) des patients atteints des cancer très agressifscomme le cancer du poumon, du sein, colorectal et du pancréas [15].

Dans le cas de dépendance oncogénique, spécialement, lorsqu’un IK a comme cible une protéine kinase mutée, les résultats ont été très encourageants dans le traitement de certains types de cancers [12]. Par exemple, les inhibiteurs utilisés contre la protéine BCR-ABL, le récepteur de facteurs de croissance épidermal (EGFR) et la protéine kinase C (PKC) ont été les premières protéines ciblées dans le développement de traitement en utilisant les IK [16]. L’imatinib a été le premier IK approuvé par l’agence fédérale américaine des produits alimentaires et médicamenteux (FDA) et son succès a montré que les IK sont une option thérapeutique efficace. Par la suite, plusieurs IK ont été approuvés favorisant l’utilisation de cette nouvelle classe de médicaments dans le traitement du cancer.

Tableau 1 – Inhibiteurs de kinases approuvés par la Food and Drug Administration pour les traitements des cancers [17]

Médicament Date de l’approbation

par la FDA Indication

Imatinib 2001 Leucémie myéloïde chronique

Tumeur stromal gastro-intestinal

Gefitinib 2003 Cancer du poumon à non petites cellules

Sorafenib 2005 Carcinome rénal

Carcinome hépatocellulaire

Erlotinib 2005 Cancer du pancréas

Sunitinib 2006

Carcinome rénal

Tumeurs stromal gastro-intestinale résistants à l’imatinib

Dasatinib 2006 Leucémie myéloïde chronique

Leucémie lymphoblastique aigue

Nilotinib 2007 Leucémie myéloïde chronique résistante à l’Imatinib

Lapatinib 2007 Cancer du sein HER2+

Pazopanib 2009 Carcinome rénal avancé

PLX4032 Sous révision Mélanome métastatique

5

Actuellement, il y a 9 inhibiteurs de kinases approuvés par la FDA [17] et un grand nombre de nouveaux IK sont en phase préclinique ou clinique.

1.4 La leucémie myéloïde chronique

La LMC est associée à la présence du chromosome Philadelphia (Ph+) dans les cellules souches hématopoïétiques de la lignée myéloïde et se caractérise par l’accumulation de ces cellules souches dans le sang et dans la moelle osseuse. Le chromosome Ph+ provient d’une translocation entre les chromosomes 9 et 22 (q34; q11) [18] causée par le remplacement du premier exon du gène de la protéine oncogénique Abelson (ABL) par des séquences du gène « Breakpoint cluster region » (BCR) (figure 3). La fusion de ces séquences donne la protéine chimérique Bcr-Abl, dont l’activité Abl devient constitutive [10, 16].

La protéine Abl est normalement impliquée dans le remodelage du squelette d’actine, l’adhésion, la motilité [19] et la régulation du cycle cellulaire à travers l’intégration de plusieurs signaux de sources extra et intracellulaires qui amènent la cellule vers la prolifération ou l’apoptose [20].

BCR est une protéine dont l’expression est présente dans tous les tissus. Elle a une activité serine/thréonine kinase dont les seuls substrats identifiés sont la Bap1 et BCR elle-même par autophosphorylation. Son rôle sur l’activation des résidus tyrosine est plus large, étant capable activer des protéines importantes tel que la petite GTPase Grb-2 qui active la voie de signalisation Ras. Elle possède aussi un domaine d’homologie à la pleckstrine (domaine PH) capable de stimuler l’exchange de la guanidine triphosphate (GTP) par la guanidine diphosphate (GDP) sur le facteur d’exchange de guanidine Rho qui active certains facteur de transcription. Par contre, le rôle de la protéine BCR tant que telle sur la pathogénicité de la LMC n’a pas été démontré [20].

Figure 3 – Schéma de la translocation entre le gène ABL au chromosome 9 et le gène BCR au chromosome 22 qui donne origine au chromosome Ph+ où on trouve le gène BCR-ABL [20]

Sa forme mutante, produit de cette translocation, soit la protéine de fusion Bcr-Abl, est présente chez 95% des patients diagnostiqués avec la LMC et entre 5 et 10% des patients diagnostiqués avec la leucémie aigüe. Elle

6

modifie la capacité des cellules souches hématopoïétiques d’adhérer à la matrice extracellulaire, recrute et active plusieurs voies de signalisation qui augmentent la prolifération de ces cellules de façon indépendante aux signaux de croissance, et en même temps, provoquent la résistance aux mécanismes d’apoptose par l’activation de la voie PI-3k/Akt et Jak-Stat [10, 16, 18, 20] (figure 4).

Figure 4 – Shéma simplifié des quelques voies de signalisation activées dans les cellules BCR-ABL [20]

La résistance à l’apoptose par la voie PI-3k/Akt se fait par l’activation de la protéine adaptatrice CRKL par Bcr-Abl. L’activation de CRKL amène à l’activation de la voie PI-3k/Akt, qui phosphoryle Bad, une molécule pro-apoptotique, qui devient inactive lors de sa phosphorylation [18, 20].

En plus de contribuer dans la signalisation anti-apoptotique, l’activation de la voie PI-3k/Akt augmente l’expression du facteur d’initiation de la traduction eIF4E dans les cellules de la LMC et cette surexpression peut être l’un des événements cellulaire qui contribue à l’évolution de la maladie en crise blastique, soit la phase où les patients ne répondent plus à aucun traitement. Par contre, les facteurs qui amènent à la phase blastique de la maladie sont probablement plusieurs et ne sont pas toujours bien déterminés. La surexpression d’eIF4E augmente la traduction des ARNm spécifiques, comme ceux de c-myc et de la cycline D1. La protéine c-myc et la cycline D1 régulées par mTOR sont requises pour la prolifération de cellules BCR-ABL dépendantes[18]. Donc, lorsque ces deux voies, PI-3k/Akt et mTOR sont constitutivement actives, il y a altération de la régulation de la machinerie de traduction de facteurs qui régulent la survie, la prolifération et la différentiation de cellules souches hématopoïétiques [18].

1.4.1 Traitement de la LMC

Avant 2001, le traitement standard contre la LMC était l’Interféron-alfa (IFN-α) en combinaison avec la cytarabine. Ce traitement a fait augmenter de façon significative la survie des patients par rapport aux traitements antérieurs. Par contre, les effets secondaires provoquaient de fortes intolérances et peu de gens avaient une réponse cytogénétique complète [21]. Depuis, les connaissances sur la biologie cellulaire et moléculaire de cette maladie ont permis le développent de plusieurs IK ayant comme cible la protéine Bcr-Abl.

7

En 2001, l’imatinib mesilate (STI 571, Gleevec® de Norvatis), a été le premier IK approuvé pour utilisation en clinique. Il a révolutionné le traitement de la LMC et est devenu la première ligne de traitement grâce à sa faible toxicité et ses réponses cliniques encourageantes [21].

Le suivi du traitement de la LMC est basé sur trois critères : les réponses hématologiques, cytogéniques et moléculaires (table 2). La réponse hématologique complète dépend de la normalisation du comptage des cellules du sang qui est déterminée par :

le nombre de cellules blanches dans le sang plus petit que 10 x 109 L-1;

le nombre de plaquettes étant moins que 450 x 109L-1;

absence de cellules immatures;

absence de splénomégalie [21].

La réponse cytogénique indique le pourcentage de cellules Ph+ en métaphase. Une réponse cytogénétique complète représente 0 % de cellules Ph+ en métaphase, tandis que la réponse cytogéniques partielle correspond à une variation de 1 à 34 % de ces cellules Ph+ en métaphase. L’examen pour la vérification de cellules Ph+ résiduels pendant le traitement est fait à chaque 6 mois. Lorsque les résultats ne sont pas constants, mais présentent des variations entre la réponse cytogénique complète et la réponse cytogénique partielle, on considère que le patient a une réponse cytogénique majeure, de 0 à 35 % de Ph+ (partielle + complète) [21, 22].

Les réponses hématologiques et cytogéniques complètes des patients traités avec l’imatinib, situées entre 95% et 74%, ont été supérieures aux réponses obtenues par le traitement standard antérieur avec l’IFN-α en combinaison avec des faibles doses de cytarabine, soit de 56 % pour la réponse hématologique complète et de 23 % pour la réponse cytogénique complète [22, 23].

Tableau 2 – Ratio des meilleures réponses hématologiques et cytogéniques du traitement avec l’imatinib versus le traitement avec l’IFN-α [22]

Réponse Traitement

Imatinib Interféron α plus cytarabine

Hématologique complète 95.3 (93.2 – 96.6) 55.5 (51.3 – 59.7)

Cytogénique majeur 85.2 (81.9 – 88.0) 22.1 (18.7 – 25.8)

Cytogénique complète 73.8 (69.9 – 77.4) 8.5 (6.3 – 11.1)

Cytogénique partiale 11.4 (8.9 – 14.3) 13.6 (10.8 – 16.7)

Toutefois, la réponse moléculaire qui consiste à quantifier le transcrit du gène BCR-ABL est une méthode de suivi du traitement de la LMC plus rigoureuse. Une réponse moléculaire majeure signifie une réduction de ≥ 3-log du transcrit et une réponse moléculaire complète est la non-détection du transcrit par RT-PCR [21] (figure

8

5). Le traitement avec l’Imatinib a atteint des réponses moléculaires majeures, résultats jamais observés avec le traitement antérieur [5].

Figure 5 – Réduction de ≥ 3-log du transcrit BCR-ABL après le traitement avec l’Imatinib [5]

Comme schématisé à la figure 5, l’imatinib se lie au site ATP de la protéine Bcr-Abl en conformation inactive. Il empêche ainsi l’activation du substrat et conséquemment, inhibe les voies de signalisation de Bcr-Abl, ce qui provoque la réduction de la prolifération des cellules Ph+ sans induction de l’apoptose [21].

9

Figure 6 – Schéma du mécanisme d’action de l’Imatinib sur la protéine BCR-ABL [21]

La sélectivité d’un inhibiteur vers une protéine donnée demeure le but principal dans le développement des IK. Par contre, la majorité d’entre eux, incluant l’imatinib, ont comme cible le site ATP de la protéine kinase, une région très conservée chez la plupart des kinases, expliquant pourquoi les IK peuvent avoir d’autres cibles que la protéine d’intérêt [24]. C’est ce qui a été observé avec l’imatinib. En plus de son action sur la protéine Bcr-Abl, il se lie aux récepteurs PDGF et KIT [16, 21]. Normalement, les ligands de ces récepteurs provoquent la dimérisation des récepteurs et l’autophosphorylation de leurs domaines tyrosine kinase qui activent les cascades de signalisation PI3K/Akt, Ras/MAPK et JAK/STAT [25]. Ces voies de signalisation contrôlent l’activation du cycle cellulaire, la prolifération et l’inhibition de l’apoptose.

Dans les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), les cellules cancéreuses ont des mutations de gain de fonction au niveau des récepteurs KIT qui les rendent constitutivement actifs. Une étude in vitro portant sur l’activité de l’imatinib dans des lignées cellulaires humaines de GIST a démontré qu’il se lie au site de phosphorylation du substrat, empêche son activation et par conséquence, inhibe la cascade de signalisation en aval [26]. Suite à ces résultats, une étude clinique a débuté avec des patients en condition de GIST métastatique ou avec des patients qui n’ont pas subi de chirurgie d’excision de leur tumeur. Parmi 15 % des patients atteint de GIST qui n’ont pas de mutations sur KIT, 5 à 7 % ont des mutations sur PDGFRα, également ciblé par l’Imatinib [25].

Pourtant, malgré les résultats positifs du traitement de la LMC avec l’imatinib, environ 20% des patients n’ont pas de réponse cytogénétique complète [27] et 25% des patients développent soit une intolérance aux effets secondaires ou une résistance au traitement due à des mutations du gène BCR-ABL qui réduisent l’affinité du site de fixation de l’ATP de la protéine pour l’Imatinib ou une l’amplification du gène [28, 29]. Ces résultats ont poussé le développement de nouveaux IK basés sur le modèle de l’imatinib, tel que le nilotinib (AMN-107) et le dasatinib (BMS-354825), plus puissants et efficaces contre certaines formes mutées de Bcr-Abl [27-29].

En 2007, le nilotinib a été approuvé pour le traitement de la LMC pour les patients qui présentaient une intolérance ou qui ne répondaient plus au traitement avec l’imatinib. En juin 2010, il a été approuvé pour le traitement des patients nouvellement diagnostiqués [30] et il est actuellement utilisé comme première ligne de

10

traitement de la LMC en phase chronique aux États-Unis et en Europe [23, 29]. La phase chronique de la LMC est caractérisée par l’augmentation des cellules blanches dans le sang et la présence de moins de 10% de cellules myéloïde immature dans la moelle osseuse.

Comme l’imatinib, le nilotinib se lie également au site de fixation de l’ATP de la protéine Bcr-Abl en conformation inactive (non phosphorylée), mais avec beaucoup plus d’affinité, ce qui permet la stabilisation de la conformation inactive de la protéine Bcr-Abl. De plus, contrairement à l’Imatinib, il induit l’apoptose, mais inhibe également l’autophosphorylation de PDGFR et de c-kit [29].

Il y a été démontré que le nilotinib est efficace sur 32 des 33 lignées cellulaires de la LMC Ph+ testées, la seule exception étant celles porteuse de la mutation T315I [29]. L’inhibition de la prolifération cellulaire du nilotinib sur des cellules sensibles à l’imatinib peut être de 43 à 60 fois plus forte et de 20 à 30 fois plus forte sur des cellules résistantes à l’imatinib in vitro. Comme c’est le cas pour l’imatinib, les mécanismes de résistance associés au traitement avec le nilotinib sont liés à l’expression du transporteur d’efflux « Multidrug Resistance » (MDR) et à la surexpression de Bcr-Abl [17, 29].

Dans une étude clinique de phase III [27], il a été montré que le traitement avec le nilotinib a donné presque le double de la réponse moléculaire majeure obtenue avec le traitement à l’imatinib et une meilleure réponse cytogénétique complète. Il est à noter que le critère principal de cette étude était le taux de la réponse moléculaire majeure (table 2), soit la diminution de 3-log dans la quantité d’ARNm de BCR-ABL.

Le dasatinib est l’autre IK approuvé pour le traitement de la LMC pour les patients intolérants, résistants ou en phase avancé de la maladie et pour les patients de la leucémie lymphoïde aigue en toutes les phases. Il inhibe BCR-ABL, c-kit, PDGFR et aussi toutes les protéines kinase de la famille Src. L’inhibition des protéines Src se fait probablement en raison de la conformation sur laquelle le dasatinib se lie à Bcr-Abl, soit la conformation active, ce qui diffère de l’Imatinib et du Nilotinib [31]. Il est environ 300 fois plus puissant que l’imatinib contre les cellules Bcr-Abl et la majorité des mutants. Par contre, les résultats des études cliniques de phase I et II ont montré que les meilleures réponses ont été obtenues chez les patients en phases avancées [32].

1.5 Les jonctions GAP

Les jonctions gap (JG) sont des canaux qui se forment entre les membranes plasmiques des cellules adjacentes et permettent la diffusion directe, mais sélective, de certains ions et métabolites entre elles. La diffusion sélective de petites molécules est responsable de la synchronisation électrique et métabolique des tissus. La synchronisation électrique, par exemple, est très importante pour les tissus excitables, comme dans la synchronisation de la contraction des cellules cardiaques et du rythme des battements cardiaques. Dans les tissus non-excitables, c’est plutôt la synchronisation métabolique qui est plus importante puisqu’à travers les JG, elle est responsable, entre autres, de la croissance embryogénique et la différenciation épithéliale[33].

Chez les invertébrés, les JG sont formées par des protéines de la famille des connexines (Cx). Ces protéines s’associent en hexamères pour former un hémi-canal, le connexon. Deux connexons de membranes plasmiques opposites forment une JG [33].

Il existe également des connexons à l’intérieur ou sur la membrane plasmique [34] de plusieurs types de cellules qui ont des fonctions différentes de celle de la diffusion de petites molécules entre les cellules. En

11

effet, certains connexons jouent un rôle dans la signalisation de survie et de mort cellulaire, dans l’expression de certains gènes et possiblement dans l’adhésion cellulaire, telle que la Cx43 dont le sous expression diminue l’expression de la N-cadherine à la surface des cellules [34].

Il y a plusieurs types de protéines Cx spécifiques pour différents types de tissues et cellules. Toutes ces Cx partagent des caractéristiques structurales communes, soit 4 domaines transmembranaires, deux domaines extracellulaires en boucles, un domaine intracellulaire en boucle ainsi que des régions C et N terminaux intracellulaires. Deux ou plusieurs types de Cx peuvent se retrouver dans la même cellule, comme c’est le cas des Cx43 et Cx26 qui sont co-exprimées dans plusieurs tissus, mais n’interagissent pas entre elles [33].

Des mutations dans les gènes qui codent les Cx sont associées à certains syndromes. Dans les cellules

cancéreuses, l’expression des Cx et la communication intercellulaire sont altérées. Il a été démontré que

dépendamment du type et du stade du cancer, les Cx peuvent agir soit comme suppresseur du cancer ou

peuvent favoriser le développent de métastases [33].

12

13

CHAPITRE 2

2.1 Matériel et méthodes

2.1.1 Culture cellulaire

Les lignées cellulaires d’ovaire, PA1 (ATCC CRL-1572) et Skov3 (ATCC HTB-77); du glioblastome, SKI-1 et de l’ostéosarcome, MG-63 ont été maintenues dans le milieu de culture DMEM (Invitrogen). Les cellules de la LMC, K562 (ATCC CCL-2430) ont été maintenues en milieu de culture RPMI 1640 (Invitrogen). Ces deux milieux de culture ont également été enrichis avec 10 % de sérum fœtal bovin (Thermo Scientific HyClone, Canada), 2 % de pénicilline/streptomycine (Invitrogen), la culture se faisait à 37ºC en présence de 5 % de CO2.

2.1.2 Test de l’entrée de la thymidine et de la gemcitabine radiomarquée au [3H]

Les cellules ovariennes PA1 ont été ensemencées en plaques de 24 puits à la densité de 4,2 x 103

cellules/puit et incubées pendant 24 h à 37ºC, 5% CO2. Quant aux cellules de la LMC, K562, des échantillons à la densité de 1,3 x 105cellules/mL ont été mis dans des tubes eppendorfs de 1,5 mL pour le test. Les cellules des deux lignées ont été lavées avec une solution tampon de sodium (20 mM Tris/HCl, 3 mM de K2HPO4, 1 mM de MgCl2 ·6H2O, 2 mM de CaCl2, 5mM de glucose et 130nM de NaCl, pH 7.4) [6] à la température ambiante. Ensuite, on a ajouté les inhibiteurs de kinases à la concentration de 10 µM dans la solution tampon et les cellules ont été incubées pendant 15 minutes à 37°C. Par la suite, les IK ont été enlevés et les cellules lavées avec la solution tampon avant l’ajout de la thymidine ou de la gemcitabine marquée au 3H à la concentration de 1 µM pour ensuite être incubées pendant 5 minutes à 37ºC. Les cellules ont été lavées 5 fois pour les cellules (PA1) et 3 fois pour les cellules (K562) avec de la thymidine ou de la gemcitabine à 10 µM dans la solution tampon à 4°C. Les cellules ont été lysées avec 600 µL de SDS à 10%. Le comptage de la radioactivité a été réalisé dans 3 mL de liquide de scintillation.

2.1.3 Test d’effet de proximité

Les cellules ont été ensemencées en plaques de 6 puits à la densité de 60 x 104cellules/puit pour les cellules PA1 et MG-63; 70 x 104 cellules/puit pour les SKI-1 et 90 x 104cellules/puit pour les Skov3. Le lendemain la gemcitabine à 3 µM a été ajoutée et l’incubation a été poursuivi pendant pour 24 h. Ensuite, les cellules traitées et non-traitées ont été comptées et ensemencées en proportion de 100%, 50%, 25%, 12,5% et 6,25% de cellules traitées dans une plaque de 24 puits à la densité de 60 x 104cellules/puit pour MG-63 et PA1; 40 x 104cellules/puit pour SKI-1 et 120 x 104 cellules par puit pour Skov3. Après 24 h, 1/10 des cellules ont été prélevées et transférées en six répliquâtes en plaque de 96 puits pour l’incubation de 72 h à 37°C. Pour le test d’effet de proximité avec le nilotinib à 5 µM et à 1 µM, ce dernier ainsi que les contrôles, le dipyridamole à 10 µM et le NBMPR à 1 µM, ont été ajoutés lors des passages en plaques de 24 et 96 puits.

2.1.4 Test MTT

Le test de prolifération cellulaire a été quantifié par la transformation du sel 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium bromide (MTT) en sel formazan par les cellules vivantes. 37,5 µL de MTT à la

14

concentration de 5 mg/mL a été déposé sur les cellules suite à une incubation à 37°C pour une durée de 4 h. Après ce temps, les puits ont été vidés de leur liquide et 100 µL de diméthyle sulfoxide (DMSO) a été déposé dans chaque puits pour dissoudre le sel formazan sous agitation pendant 10 min. La quantité de sel formazan dissous a été mesurée par spectrophotométrie à 595 nm.

2.1.5 Immunofluorescence

Des lamelles de verres ont été stérilisées par la chaleur d’une flamme et déposées dans une plaque 35 mm où les cellules ont été ensemencées et incubées à 37°C pendant 72 h. Par la suite, les cellules ont été fixées avec du paraphormaldéhyde à 4% à 4°C à la température ambiante pendant 20 minutes et perméabilisées par traitement avec du Triton-X à 0,2% pendant 5 min. Le blocage a été fait avec du lait en poudre à 5% pendant 45 min à 37°C avant l’incubation avec 500 µL de solution d’anticorps primaire contre la connexine-43 dilué au 1/800 dans du lait en poudre à 1% sous agitation pendant 45 min. Ensuite, un deuxième blocage a été fait avant l’hybridation avec la solution d’anticorps secondaire Alexa 594 dilué 1/1000 dans du lait en poudre à 1% et incubé sous agitation pendant 30 min à 37°C.

15

CHAPITRE 3

3.1 Résultats

3.1.1 Inhibition de l’entrée de la [3H]thymidine par des inhibiteurs de kinases.

Afin de reproduire les résultats obtenus par Huang et al.[6] sur l’inhibition de l’entrée des nucléosides dans la cellule, nous avons utilisé six inhibiteurs de kinases, dont trois sont utilisés en clinique et trois qui ne le sont pas :

Tableau 3 – inhibiteurs de kinase utilisés dans les essais pour ce travail

Non utilisés en clinique Utilisés en clinique

Inhibiteur de la voie NF-κB Gefinitib

Ly294002 Imatinib

Y-27632 Sunitinib

Le gefinitinib est un inhibiteur d’EGFR et est approuvé pour le traitement du cancer de poumon de type non à petites cellules pour les patients résistants au traitement standard avec le docetaxel ou le platinum [10]. L’imatinib, utilisé dans le traitement de la LMC et le sunitinib, qui a plusieurs cibles, est utilisé également dans le traitement du cancer du rein avancé [35].

Quant aux inhibiteurs non-utilisés en clinique, nous avons utilisé un inhibiteur de la voie NF-κB; le LY294002 qui inhibe la phosphorylation d’AKT dans la voie PI3K/AKT et le Y-27632 qui inhibe la protéine serine/thréonine kinase associé à Rho, P160Rock [36].

Les résultats de cette expérience (figure 7) ont montré que les cellules ont eu une très bonne assimilation de la [3H] thymidine en présence de notre contrôle négatif, le DMSO à 1%. Le dipyridamole à une concentration de 10 µM a été utilisé comme contrôle positif due à sa capacité de bloquer les transporteurs nucléosidiques équilibratifs sans être toxique pour les cellules [9, 37]. Le dipyridamole a bloqué à 100% l’entrée de la [3H] thymidine dans les cellules. Les inhibiteurs de kinases non utilisés dans la clinique ont montré une faible inhibition de l’entrée de la [3H] thymidine. Le blocage le plus efficace a été observé pour l’inhibiteur de la voie PI3/AKT, Ly294002, qui a bloqué jusqu’à 56% de l’entrée du nucléoside. L’inhibiteur de la voie NF-κB a inhibé à 20% l’entrée du nucléoside et l’inhibiteur Y-27632 n’a pas bloqué le transport de la thymidine radiomarquée. Les inhibiteurs de kinases utilisés en clinique ont bloqué plus fortement l’entrée de la [3H] thymidine. L’imatinib étant celui qui a eu l’effet le plus remarquable, en bloquant à 86% le transport du nucléoside. Les deux autres inhibiteurs ont bloqué plus faiblement le transport du nucléoside, le sunitinib à 61% et le gefitinib à environ 50%.

16

Figure 7 – Entrée du nucléoside [3H] thymidine dans les cellules ovariennes PA1 après 15 minutes d’exposition aux differentes inhibiteurs de kinases à 10µM.

Ces résultats montrent que les inhibiteurs de kinases bloquent l’entrée du nucléoside [3H] thymidine, mais que les inhibiteurs de kinases utilisés dans la clinique sont plus efficaces que ceux non utilisés en clinique.

3.1.2 Inhibition de l’assimilation de la [3H] gemcitabine par des inhibiteurs de

kinases utilisés dans la clinique.

Ensuite on a vérifié l’effet de 8 des 9 inhibiteurs de kinases actuellement utilisés en clinique sur l’entrée de l’analogue nucleosidique [3H] gemcitabine sur des cellules adhérentes. Puisque le principal transporteur de la gemcitaibne est l’ENT1, nous avons utilisés le NBMPR, un inhibiteur spécifique pour l’ENT1, comme deuxième contrôle à la concentration de 1 µM, lui aussi dilué dans du DMSO. Tous les inhibiteurs de kinases ont été utilisés à la concentration de 10 µM.

On a utilisé l’erlotinib, employé dans le traitement du cancer du pancreas, le gefinitib, un inhibiteur de PDGF utilisé dans le traitement du cancer du poumon non à petites cellules, deux inhibiteurs utilisés dans le traitement du cancer du rein, le sorafenib et le sunitinib, le lapatinib utilisé dans le traitment du cancer du sein et les trois inhibiteurs de kinase approuvés pour le traitement de la LMC.

Tous les inhibiteurs de kinases testés bloquent l’entrée de la gemcitabine dans les cellules PA1 de façon importante (figure 7). Parmi les inhibiteurs testés, avec un pourcentage de blocage de 41%, le lapatinib est celui qui bloque le moins l’entrée de la gemcitabine dans les cellules PA1. En ce qui concerne le sunitinib et le sorafenib, les deux utilisés dans le traitement du cancer du rein, bloquent respectivement 67% et 83%. Quant à l’erlotinib, avec 89% de blocage, est l’un des inhibiteurs qui a bloqué le plus fortement le transport de l’analoque nucléosidique. Pour le lapatinib, un pourcentage de 71% a été observé et finalement, pour les trois inhibiteurs de kinase utilisés dans le traitement de la LMC, le dasatinib, imatinib et nilotinib, respectivement 86%, 69% et de 96% de blocage de l’entrée de la Gemcitabine ont été observés (figure 8).

0

20

40

60

80

100

Entr

ée

de

la

[3 H

] th

ymid

ine

(%

)

Inhibiteurs de kinases

17

Figure 8 - Entrée de la [³H] gemcitabine dans les cellules ovariennes PA1 après 15 minutes d’exposition aux inhibiteurs de kinases en utilisation clinique.

Ainsi, les résultats ont demontré que 8 des 9 inhibiteurs de kinases d’utilisation clinique bloquent efficacement l’entrée de l’analogue nucléosidique gemcitabine et que le nilotinib bloque presqu’à 100% l’entrée de cet analogue nucleosidique à la concentration de 10 µM.

3.1.3 Inhibition de la [3H] thymidine par les inhibiteurs de kinase utilisés dans le

traitement de la LMC.

Compte tenu de leur efficacité à bloquer l’entrée de l’analogue nucléosidique et de leur l’importance clinique dans le traitement de LMC, une courbe dose-réponse avec le dasatinib, l’imatinib et le nilotinib a été realisée afin de vérifier jusqu’à quelle concentration ces inhibiteurs de kinase sont capables de bloquer l’entrée de nucleoside [3 H] thymidine dans la lignée cellulaire PA1(figure 9). Encore cette fois-ci, c’est le nilotinib qui a inhibé plus efficacement l’entrée de la [3H] thymidine pour toutes les concentrations et ce, en comparaison avec l’imatinib et le dasatinib. En effet, à 10 µM tous les trois inhibiteurs bloquent efficacement l’entrée du nucléoside dans les cellules. Le nilotinib a été le plus efficace avec un blocage de 99% tandis qu’à la même concentration, l’imatinib et le dasatinib ont bloqué l’entrée de la [3H] thymidine à 65% et 76% respectivement. Aux concentrations de 1 µM et 0,1 µM, les différences entre l’efficacité de l’imatinib et du dasatinib pour inhiber l’entrée de la [3H] thymidine par rapport à celui du nilotinib sont encore plus visibles. Par exemple, à 1 µM, l’imatinib bloque à 28% et le dasatinib à 29% le transport de la [3H] thymidine vers l’intérieur de la cellule, tandis qu’à cette même concentration le nilotinib bloque à 95%. À 0,1 µM, le nilotinib bloque le transport de la thymidine radiomarquée à 76%, soit presque que le même pourcentage que l’imatinib et le dasatinib à 10 µM. Cependant, à 0,1 µM l’imatinib et le dasatinib bloquent respectivement 17% et 4% (figure 8).

0

20

40

60

80

100

En

trée d

e l

a

[³H

] g

em

cit

ab

ine (

%)

[10 µM] Inhibiteurs de kinases

PA1

18

Figure 9 - Entrée de la [³H] thymidine dans les cellules ovariennes PA1 après 15 minutes d’exposition aux inhibiteurs de kinases utilisés dans le traitement de la LMC à différentes concentrations.

Ainsi, les résultats démontrent que le nilotinib bloque le transport de la [3H] thymidine beaucoup plus efficacement que les deux autres inhibiteurs de kinase utilisés dans le traitement de la LMC et ce, même à des concentrations cliniquement importantes, étant donné que la concentration plasmatique moyenne du nilotinib chez les patients qui prennent la dose standard de 400 mg/j est de 1.7 µM/L [38].

3.1.4 Inhibition de l’entrée de la [3H] thymidine dans les cellules K562 par

l’imatinib et le nilotinib.

Étant donné que l’imatinib et le nilotinib sont les deux inhibiteurs de kinases approuvés comme première ligne de traitement de la LMC, une courbe dose-réponse a été réalisée en utilisant cette fois-ci une lignée cellulaire de la LMC, la K562. Encore pour cette lignée cellulaire, les résultats ont indiqué que les deux inhibiteurs de kinases bloquent le transport de la [3H] thymidine, mais que le nilotinib est celui qui le bloque le plus efficacement. L’imatinib a bloqué l’entrée de la [3H] thymidine jusqu’à 50% à 1 µM et à 78% à 10 µM. À 0,1 µM, l’effet de l’imatinib plus faible avec une inhibition du transport du nucléoside de 16% (figure 10).

0

20

40

60

80

100

En

trée d

e l

a

[3H

] th

ym

idin

e (

%)

PA1

Imatinib Dasatinib Nilotinib

19

Figure 10 - Entrée de la [³H] thymidine dans les cellules de la LMC K562 après 15 minutes d’exposition à l’inhibiteur de kinase imatinib à différentes concentrations

Le nilotinib, toutefois, a toujours eu un effet plus fort sur le blocage de l’entrée de la [3H] thymidine, soit en bloquant à 97% à 10 µM, à 94% à 1 µM et à 76% à 0,1 µM le transport du nucléoside (figure 11).

Figure 11 - Entrée de la [³H] thymidine dans les cellules de la LMC K562 après 15 minutes d’exposition à l'inhibiteur de kinase nilotinib en différentes concentrations.

Ainsi, les résultats ont démontré que le nilotinib et l’imatinib bloquent l’entrée de la [3H] thymidine dans les cellules K562. Le Nilotinib étant celui qui bloque le plus fortement l’entrée du nucléoside à des concentrations obtenues en clinique.

0

20

40

60

80

100

Assim

ilati

on

de la

[³H

] th

ym

idin

e(%

)

K562

Imatinib

0

20

40

60

80

100

En

trée d

e l

a

[³H

] th

ym

idin

e(%

)

K562

Nilotinib Nilotinib

20

3.1.5 Relation dose réponse du nilotinib versus l’imatinib sur des lignées cellulaires

ovariennes

Le gemcitabine est utilisée dans le traitement du cancer de l’ovaire en combinaison avec d’autres agents chimiothérapeutiques [39]. L’imatinib a déjà été proposée pour le traitement du cancer de l’ovaire, mais les résultats cliniques n’étaient pas très encourageants [40, 41]. Alors, afin de vérifier la sensibilité aux inhibiteurs nilotinib et imatinib, un test de prolifération des cellules ovariennes PA1 et Skov3 a été réalisé un utilisant ces deux inhibiteurs de kinases à différentes concentrations (figure 12).

Les cellules PA1 ont montré une très forte sensibilité à la gemcitabine à 10 µM. À 30 µM, le nilotinib a été plus cytotoxique que la gemcitabine à 10 µM et l’imatinib a tué les cellules avec pratiquement la même efficacité que la gemcitabine à cette même concentration. Toutefois, à partir de 10 µM, l’imatinib semble avoir très peu d’effet sur la viabilité de ces cellules. Pourtant, le nilotinib, à cette même concentration, est un peu plus efficace que l’imatinib en tuant 60% des cellules PA1. Il est à noter que l’efficacité du nilotinib diminue à partir de la concentration de 3µM (figure 11).

Figure 12 - Viabilité des cellules ovariennes PA1 après traitement de 72 h aux inhibiteurs de kinases nilotinib et Imatinib.

Tout comme les cellules PA1, les cellules Skov3 ont montré une sensibilité à l’imatinib et au nilotinib à la concentration de 30 µM, mais moins que les cellules PA1 pour l’Imatinib (figure 12). À 10 µM, les cellules Skov3 sont moins sensibles au nilotinib que les cellules PA1, montrant respectivement 65% contre 39% de viabilité cellulaire. Toutefois, à partir de la concentration de 3 µM les deux lignées répondent de façon similaire aux deux inhibiteurs de kinase avec une très faible sensibilité (figure 13).

-20

0

20

40

60

80

100

Via

bilit

é (

%)

Inhibiteurs de kinase

PA1

Nilotinib Imatinib

21

Figure 13 - Viabilité des cellules ovariennes Skov3 après traitement de 72 h aux inhibiteurs de kinases nilotinib et Imatinib.

Ces résultats ont montré que les cellules ovariennes sont sensibles aux inhibiteurs de kinase imatinib et nilotinib et ce, à de très fortes concentrations. Il est à noter que les cellules PA1 sont montrées un peu plus sensibles au nilotinib que les cellules Skov3.

3.1.6 Relation dose réponse du traitement simultané de la gemcitabine avec le

nilotinib sur les cellules ovariennes.

Étant donné que le nilotinib a bloqué l’entrée du nucléoside thymidine et de l’analogue nucléosidique gemcitabine, nous avons émis l’hypothèse que le nilotinib pourrait avoir un effet sur la cytotoxicité de la gemcitabine lors d’un traitement en combinaison.

Une courbe dose-réponse sur les cellules PA1 et Skov3 a été réalisée en combinant la gemcitabine à différentes concentrations et le nilotinib à des concentrations de 1 µM et 5 µM. Comme contrôle, la gemcitabine a été utilisée seule ou en combinaison avec le dipyridamole à 10 µM. Également, le NBMPR à 1 µM a été utilisé comme second contrôle (figure 14).

Les cellules PA1 ont montré une très forte sensibilité à la gemcitabine avec 0% de viabilité cellulaire jusqu’à la concentration de 0,03 µM. Pourtant en présence du dipyridamole à 10 µM, les cellules sont protégées de la cytotoxicité de la gemcitabine et deviennent moins sensibles à cette dernière à partir de 1 µM. Lorsqu’on ajoute le nilotinib à 5 µM, les cellules deviennent moins sensibles à la gemcitabine à partir de 0,3 µM. À 1 µM, le nilotinib protège les cellules PA1 à peu près comme le NBMPR à 1 µM (figure 14).

0

20

40

60

80

100

Via

bilit

é (

%)

Inhibiteurs de kinase

Skov3

Nilotinib Imatinib

22

Figure 14 - Viabilité des les cellules ovariennes PA1 après traitement simultané de 72 h à la gemcitabine en combinaison avec le nilotinib à 5 µM et à 1 µM

La gemcitabine est moins cytotoxique pour les cellules Skov3 que pour les cellules PA1 (figure 15). En effet, à la concentration de 10 µM, on observe 11% de viabilité cellulaire dans la lignée Skov3 alors que 0% de viabilité cellulaire est observée dans la lignée PA1. Lorsque la gemcitabine à 10 µM et le dipyridamole sont utilisés en combinaison simultané, la viabilité des cellules Skov3 augmente de 11% à 58%. Si le nilotinib à 5 µM est utilisé à la place du dipyridamole, ce dernier protège les cellules Skov3 de la même manière que le dipyridamole, soit avec 65% de viabilité. Comme pour les cellules PA1, le nilotinib à 1 µM et le NBMPR à 1 µM protègent les cellules de façon semblable.

Figure 15 - Viabilité des cellules ovariennes Skov3 après traitement simultané de 72 h de la gemcitabine en combinaison avec le nilotinib à 5 µM et à 1 µM

23

Ainsi, ces résultats ont confirmé que le nilotinib protège les cellules ovariennes de la cytotoxicité de l’analogue nucléosidique gemcitabine, probablement par le blocage du transport de cet analogue nucléosidique vers l’intérieur des cellules PA1.

3.1.7 Immunofluorescence de la connexine 43

Les JG sont des canaux entre les cellules, formées par des protéines de la famille des Cx, qui permettent le passage passifde petites molécules. Récemment, il a été démontré que la gemcitabine est capable de diffuser d’une cellule par ces jonctions [4, 42]. Dans notre laboratoire, on a déjà démontré que les JGp formés par les connexines-43 (Cx43) permettent la diffusion de la gmcitabine, ce qui augmente la cytotoxicité de cette dernière [4]. Alors, dans le but de savoir si ces lignées ovariennes possèdent des JG, un essai d’immunofluorescence a été fait avec un anticorps dirigé contre la Cx43 (figure 16).

Les lignées MG-63 et SKI-1 ont été utilisés comme contrôle positif étant donné que Cottin et al.[4] ont démontré que ces deux lignées possèdent des JG fonctionnelles qui permettent le passage de la gemcitabine d’une cellule à l’autre, ce qui augmente sa cytotoxicité.

Les résultats d’immunofluorescence ont montré qu’il y a une forte concentration de la Cx 43 à l’intérieur de ces cellules, mais malgré cela, les jonctions situées en surface cellulaire sont hautement fonctionnelles pour la diffusion de la gemcitabine [4].

Figure 16 - Immunofluorescence de la Cx43 sur les cellules d'osteosarcoma MG-63, les cellules de glioblastoma SKI-1 et les cellules ovariennes PA1

Ces résultats ont aussi permis de constater que la Cx43 est présente dans les cellules ovariennes PA1 en quantité plus importante sur la membrane plasmique qu’à l’intérieur des cellules, en formant des plaques entre les cellules.

3.1.8 Effet de proximité de la gemcitabine sur les cellules ovariennes

24

Par la suite, afin de vérifier si la gemcitabine est capable de diffuser d’une cellule à l’autre sur les lignées ovariennes, un test d’effet de proximité a été réalisé.

À titre de contrôle, la lignée cellulaire SKI-1 a été utilisée (figure 17) puisque la diffusion de la gemcitabine dans cette lignée est tellement forte que lorsque l’on mélange 50% de cellules traitées aves 50% de cellules non-traitées, la viabilité cellulaire après 72h est 0%. Le mélange de 13% de cellules SKI-1 traitées avec 88% des cellules non-traitées a tué 68% des cellules.

Figure 17 - Viabilité des cellules SKI-1 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios.

La lignée ovarienne PA1 (figure 18) a montré un effet de proximité similaire à celui des cellules SKI-1 avec 0% de viabilité après 72h lorsqu’on mélange 50%-50% de cellules traitées avec des cellules non-traitées. À 13% de cellules traitées, la viabilité après 72h est de 32.

Figure 18 - Viabilité des cellules ovariennes PA1 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios

-20

0

20

40

60

80

100

0 100 50 25 12,5

Via

bilit

é (

%)

% cellules traitées

PA1

25

Les cellules Skov 3 (figure 19) n’ont presque pas d’effet de proximité, peut-être à cause de leur faible sensibilité à la gemcitabine. On avait encore 29% de cellules viables sur 100% des cellules traitées.

Figure 19 - Viabilité des cellules ovariennes Skov3 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios

Ainsi, ces résultats indiquent que les cellules ovariennes PA1 ont un fort effet de proximité de la gemcitabine.

3.1.9 Augmentation de l’effet de proximité de la gemcitabine par le nilotinib sur la

lignée ovarienne PA1.

Les expériences antérieures ont montré que le nilotinib bloque le transport de la gemcitabine par les transporteurs équilibratifs et qu’un traitement en utilisant simultanément cet analogue nucléosidique en combinaison avec le nilotinib rend les cellules ovariennes PA1 moins sensibles à la gemcitabine.

Suite à l’obtention de ces résultats, il paraissait possible qu’un traitement successif de la gemcitabine suivi du nilotinib pourrait augmenter l’effet de proximité sur les cellules PA1. Due au blocage des ENT par le nilotinib qui conséquemment empêche la sortie de la gemcitabine, cet inhibiteur de kinase pourrait augmenter la concentration de la gemcitabine dans les cellules, ce qui augmenterait par le fait même, la diffusion de la gemcitabine entre les cellules. Ainsi, un traitement successif pourrait rendre les cellules PA1 encore plus sensibles au traitement à la gemcitabine.

Afin de vérifier cette hypothèse, un test d’effet de proximité a été réalisé et le nilotinib aux concentrations de 5 µM et 1 µM a été ajouté suite à un traitement de 24 h à la gemcitabine. La même chose a été faite pour le contrôle négatif dipyridamole à la concentration de 10 µM.

Les cellules MG-63 ont été utilisés comme contrôle puisqu’elles diffusent très bien la gemcitabine par les JG [4]. Pourtant, ni le dipyridamole ni le nilotinib ne semblent avoir augmenté l’effet de proximité sur les cellules MG-63 (figure 20).

0

20

40

60

80

100

0 100 50 25 12,5

Via

bilit

é (

%)

% de cellules traitées

Skov3

26

Figure 20 - Viabilité des cellules MG-63 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios

Par contre, sur les cellules PA1, une augmentation de l’effet de proximité causée par le blocage des transporteurs nucléosidique équilibratif a été effectivement observée (figure 21). Encore une fois, on aperçoit toujours que les cellules PA1 ont un fort effet de proximité de la gemcitabine lorsque celle-ci est utilisée seule. La viabilité cellulaire est nulle lorsque 50% des cellules traitées sont mélangées à 50% des cellules non-traités, mais jusqu’à 25% de cellules traitées, le pourcentage des cellules viables commence à augmenter. Pourtant, avec ce même pourcentage de cellules traitées à la gemcitabine (soit 25%), suivi du traitement avec le nilotinib à 5 µM, la viabilité reste nulle.

Figure 21 - Viabilité des cellules PA1 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la Gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios.

-20

0

20

40

60

80

100

0 100 50 25 12,5 6,25

Via

bilit

é (

%)

% de cellules traitées

MG-63

Gemcitabine 3 µM + Dipyridamole 10 µM

+ Nilotinib 1 µM + Nilotinib 5 µM

-20

0

20

40

60

80

100

0 100 50 25 12,5 6,25

Via

bilit

é %

% de cellules traitées

PA1

Gemcitabine 3 µM GE + Dipyridamole 10 µM

GE + Nilotinib 1 µM GE + Nilotinib 5 µM

27

Contrairement aux cellules PA1, dont l’ajout du nilotinib après la gemcitabine augmente la cytotoxicité de cette dernière, la sensibilité des cellules Skov3 à cet analogue nucléosidique ne semblent pas être très affecté par l’ajout du nilotinib (figure 22). Au contraire, on observe que les cellules sont encore moins sensibles à la Gemcitabine jusqu’à 25% de cellules traitées. Pourtant, jusqu’à 12,5% il est possible d’observer que l’effet protecteur du nilotinib et du dypiridamole demeure, mais commence à diminuer, et à 6,26% de cellules traitées, le nilotinib à 5 µM n’a plus aucun effet de protection par rapport au traitement avec la gemcitabine seule. Par contre, cet effet de protection persiste avec le dipyridamole et le nilotinib à 1 µM.

Figure 22 - Viabilité des cellules Skov3 après 72 h de contact entre les cellules traitées à la Gemcitabine pendant 24 h et les cellules non-traitées en différents ratios

Ainsi, ces résultats ont confirmé l’hypothèse que lorsque les cellules PA1 sont capables de diffuser la gemcitabine, et qu’un traitement à la gemcitabine suivi du nilotinib tue plus de cellules non-traitées et donc augmente l’effet de proximité.

0

20

40

60

80

100

0 100 50 25 12,5 6,25

Via

bilit

é (

%)

% de cellules traitées

Skov3 Gemcitabine 3 µM GE + Dipyridamole 10 µM

GE + Nilotinib 1 µM GE + Nilotinib 5 µM

28

29

CHAPITRE 4

4.1 Discussion et conclusion

4.1.1 Régulation de l’entrée de nucléosides

La croissance cellulaire est soutenue par la quantité de nucléosides naturels disponibles dans le milieu extracellulaire. Ces nucléosides entrent dans la cellule où ils sont utilisés dans la construction des molécules essentielles à la physiologie cellulaire, comme les acides nucléiques ADN et ARN. Ils sont aussi importants dans la signalisation extracellulaire et dans les cascades de signalisations intracellulaires, comme l’adénosine et ses formes phosphatées, l’AMP, l’ADP et l’ATP, dont la dernière est aussi la plus importante molécule de stockage d’énergie cellulaire. En plus, ils ont aussi un rôle anti-mutagénique et agissent comme des antioxydants naturels, comme la guanosine et l’inosine qui protègent l’ADN de l’oxydation par la diminution de la production de ROS [43].

Due à leurs nombreux rôles physiologiques, la quantité de nucléosides à l’intérieur des cellules est hautement contrôlé par des enzymes impliquées dans la dégradation du surplus des nucléosides, par le type de transporteur (CNT ou ENT), par des sous-types (CNT1, CNT2…ENT1, ENT2…) exprimés dans certains tissus, par la localisation membranaire, par les concentrations de ces transporteurs et par la régulation de leurs l’activité qui est encore peu connue.

L’excès des nucléosides intra et extracellulaire provoque un déséquilibre biochimique qui déstabilise l’homoeostasie cellulaire et causant des graves conséquences métaboliques et physiologiques. L’encéphalopathie neuro-gastrointestinale mitochondrial (MNGIE) est une maladie métabolique causée par des mutations dans l’enzyme thymidine phosphorylase qui dégrade la thymidine et la désoxyuridine. En absence de l’activité de cette enzyme, ces deux nucléosides s’accumulent dans les cellules ce qui provoque un déséquilibre biochimique qui endommage l’ADN mitochondrial [7].

Mais dans certains cas, le niveau de nucléosides dépend de l’expression et de l’activité des TN. Par exemple, l’activation de certains facteurs de croissance des macrophages est associée à la surrégulation d’ENT1 qui permet l’entrée de la thymidine qui est ensuite incorporée à l’ADN. Lorsque ENT1 est bloqué pharmacologiquement, il y a diminution de l’incorporation de la thymidine à l’ADN et conséquemment diminution de la prolifération cellulaire [7]. Il a été déjà démontré chez la souris que le blocage de l’entrée de l’adénosine par de l’inhibition d’ENT1 par l’éthanol à une haute concentration (20% v/v), a comme conséquence l’altération de la signalisation purinergique des récepteurs A1 d’adénosine [44].

Toutefois, la façon dont les cellules régulent les transporteurs nucléosidiques est encore un sujet de discussion et de recherche. Récemment, Reyes et al. [45] ont démontré in vitro et in vivo que mENT1 ainsi que hENT1 sont phosphorylés sur plusieurs résidus de leur large boucle intracellulaire directement par la protéine kinase C (PKC) et la protéine kinase A (PKA). La phosphorylation est considérée comme un régulateur de la fonction des protéines et la phosphorylation d’un seul site est assez pour altérer la fonction d’une protéine. Pourtant, lorsqu’une protéine présente plusieurs sites de phosphorylation, la possibilité qu’elle soit régulée par la phosphorylation augmente et, généralement dans ce cas, la régulation se fait à travers

30

l’équilibre entre plusieurs kinases et phosphatases qui amènent au changement globale de la conformation [46].

Les résultats de Reyes et al.[45] ont montré qu’il y a une ample possibilité de recherche sur les protéines kinase impliquées de façon directe ou indirecte dans la régulation de l’activité des transporteurs nucléosidiques. Nos résultats, ainsi que ceux de Huang et al. [6], ont montré que plusieurs IK bloquent l’entrée des nucléosides et des AN dans des cellules de tumeurs solides et des cellules K562 de la LMC, où environ 80 à 90% des transporteurs sont du type ENT1[6].

Deux hypothèses sur le fonctionnement du blocage de l’entrée des nucléosides par les IK sont en débat, soit par l’implication de ces IK dans la phosphorylation des transporteurs ou par la liaison directe de l’IK au transporteur. Nos expériences du blocage de l’entrée de la [H+] thymidine prenaient 20 minutes, une marge de temps suffisant pour la phosphorylation, compte tenu que le temps de phosphorylation le plus long est celui des résidus de thréonine et serine, qui requièrent environ 10 minutes [46]. Par contre, Huang et al. [47] ont déjà démontré que certains IK bloquent ENT1 par compétition avec l’inhibiteur spécifique d’ENT1, le NBMPR.

Faits importants à citer, à l’exception des nucléosides naturels, la capacité des TN de faire le transport change selon les différentes molécules pharmacologiques. En plus du NBMPR, d’autres molécules bloquent directement ENT1, tel que le dipyridamole et l’AZT, qui est un substrat des transporteurs CNT1 et CNT3 mais qui peut être transporté par l’ENT2. Par contre, lors de son interaction avec ENT, l’AZT le bloque même s’il n’est pas un substrat des transporteurs équilibratifs [9].

Un autre facteur qui appuie l’idée de l’implication des IK dans l’activité des transporteurs nucléosidiques est le fait que malgré que les IK utilisés en clinique aient été développés initialement pour bloquer une voie de signalisation spécifique dérégulée, la majorité de ces substances ont en réalité plusieurs cibles impliquées dans plusieurs voies de signalisations [24]. Cette polyvalence s’explique par le fait que les IK sont conçus pour se lier au site de liaison de l’ATP de la protéine tyrosine kinase, une région hautement conservée. Pour cette raison, il est difficile de produire un inhibiteur hautement spécifique, ce qui fait que d’autres kinases sont aussi inhibées [24]. De plus, il a été déjà démontré que l’imatinib inhibe BCR-ABL, PDGFR α et β, c-Kit et plus faiblement VEGFR et c-Raf et même des substrats qui n’ont pas d’activité kinase tel, que l’oxydoréductase NQO2 [48]. Pour cette raison, il est possible que les IK puissent se lier à d’autres molécules, telles que les transporteurs d’analogues nucléosidiques.

4.1.2 Traitement avec la gemcitabine suivi du nilotinib versus traitement simultané

avec la cytarabine avec le dasatinib.

Les patients de la LMC traitées avec l’imatinib ont eu des résultats jamais vu antérieurement, comme des réponses moléculaires majeurs qui duraient environ plus de 5 ans pour 80% d’eux. Par contre, les 20% des patients restants ont toujours besoin de traitement plus fort, soit en augment la dose standard de l’Imatinib ou l’utilisation des thérapies alternatives pour atteindre de tels niveaux de réponse. Telles thérapies alternatives consistent en remplacement de l’imatinib par les inhibiteurs de deuxième génération ou la combinaison de médicaments. Parmi la combinaison de médicaments déjà testées, on trouve l’imatinib avec la cytarabine, dont les résultats obtenus in vitro ont montré un effet synergique, ce qui a poussé à une étude clinique. Cette

31

étude clinique a révélé qu’effectivement, les patients qui ont reçu un traitement combiné ont atteint de meilleures réponses moléculaires que ceux qui étaient sous le traitement de l’Imatinib seul[21].

Mais contrairement à ces études, nos résultats obtenus in vitro avec les cellules K562 de la LMC et les cellules PA1 du cancer de l’ovaire, suggèrent plutôt que la combinaison de l’imatinib ou le nilotinib avec les AN, lorsqu’ils sont utilisés simultanément, peut diminuer l’efficacité du traitement, due à leur blocage de l’entrée de l’analogue nucléosidiques à l’intérieur des cellules.

Il est connu que le nilotinib est 20 fois plus puissant pour les cellules résistantes à l’imatinib et 60 fois plus puissant pour les cellules sensibles à l’imatinib. Dans nos résultats, les deux inhibiteurs ont bloqué l’entrée de la [3H] thymidine et de la [3H] gemcitabine, mais aussi pour le blocage du transport de nucléoside, le nilotinib a eu une action beaucoup plus forte, en bloquant l’entrée de nucléoside presque à 100% même en concentration plus basse que celle utilisée dans la clinique.

Le nilotinib a été récemment approuvé comme premier ligne de traitement de la LMC [23] et il est trop tôt pour savoir si les patients peuvent développer la résistance ou l’intolérance au nilotinib à long terme. Toutefois, notre hypothèse est qu’un traitement alternatif possible en utilisant le nilotinib en combinaison avec un analogue nucléoside, tel que celui suggéré pour l’imatinib avec la cytarabine, serait encore plus désavantageux, étant donné que le nilotinib a un pouvoir de blocage des transporteurs nucléosidiques plus grand que l’imatinib et ce, dans un traitement simultané de ces deux médicaments.

Nous avons également montré que le traitement simultané de la gemcitabine avec le nilotinib diminue la cytotoxicité de la gemcitabine sur les cellules du cancer de l’ovaire. La gemcitabine est une des médicaments les plus utilisés dans le traitement de cancers récurrents de l’ovaire ou résistants au traitement standard qui utilise le cisplatine en combinaison avec le paclitaxel. Le principal transporteur de la gemcitabine est ENT1, mais dans les cellules de l’ovaire, on y retrouve aussi une forte concentration d’ENT2, ENT4 et de CNT3 [49].

Nous avons aussi démontré antérieurement que les cellules qui possèdent des JG fonctionnelles peuvent permettre la diffusion de l’AN gemcitabine d’une cellule à l’autre, ce qui permet son arrivée dans les cellules les plus éloignées des vaisseaux sanguins et conséquemment, augmente sa cytotoxicité dans le traitement des tumeurs solides [4]. Une façon d’augmenter encore plus la diffusion de la Gemcitabine dans les cellules serait d’éviter sa sortie par les transporteurs nucléosidiques équilibratifs. Étant donné que les IK bloquent les ENTs, ils bloquent en même temps l’entrée et la sortie d’AN des cellules.

En partant de ce point de vue, un traitement utilisant la gemcitabine et ensuite le nilotinib pourrait augmenter la diffusion et conséquemment la cytotoxicité de la première. Effectivement, nos résultats du test d’effet de proximité ont confirmé que la gemcitabine diffuse d’une cellule à l’autre, et ont montré que lorsqu’on ajoute le nilotinib après la gemcitabine, la cytotoxicité de cette dernière augmente par rapport au traitement à la gemcitabine toute seule.

Ces données sont importantes, considérant que l’un des mécanismes de résistance associés au traitement du cancer est la faible pénétration de certaines médicaments dans la tumeur, due à l’irrigation désordonnée, caractéristique des tumeurs solides. Dans le cas du cancer de l’ovaire, le traitement combinatoire avec la gemcitabine suivi du nilotinib pourrait être une bonne option de traitement contre ce type de cancer étant

32

donné que la gemcitabine est utilisée actuellement dans le traitement du cancer et que l’utilisation de l’imatinib a été déjà proposée, due à sa capacité de bloquer l’autophosphorylation de PDGFR [40, 41].

Dans le cas de la LMC, la diffusion d’un médicament d’une cellule à l’autre par les JG n’influence pas l’efficacité du traitement. Par contre, nos résultats suggèrent que l’administration simultanée de la cytarabine avec les IK (imatinib ou nilotinib) peuvent diminuer l’efficacité du traitement due au blocage de l’entrée de la cytarabine. Par contre, l’effet de blocage montré par l’imatinib et le nilotinib n’est pas observé pour le dasatinib, dont les blocages effectués à des concentrations utilisés cliniquement sont peu importantes et pour cette raison, un traitement combinatoire du dasatinib avec la cytarabine pourrait être plus intéressant.

En conclusion, les travaux présentés mettent en évidence les rôles des IK sur le blocage de l’entrée de nucléosides et des AN et la possibilité d’une nouvelle approche thérapeutique qui utiliserait la combinaison de ces deux médicaments.

33

BIBLIOGRAPHIE

1. Galmarini, C.M., Mackey, J.R.Dumontet, C., Nucleoside analogues: mechanisms of drug resistance and reversal strategies. Leukemia, 2001. 15(6): p. 875-90.

2. Galmarini, C.M., Mackey, J.R.Dumontet, C., Nucleoside analogues and nucleobases in cancer treatment. Lancet Oncol, 2002. 3(7): p. 415-24.

3. Veltkamp, S.A., Pluim, D., van Eijndhoven, M.A., Bolijn, M.J., Ong, F.H., Govindarajan, R., Unadkat, J.D., Beijnen, J.H.Schellens, J.H., New insights into the pharmacology and cytotoxicity of gemcitabine and 2',2'-difluorodeoxyuridine. Mol Cancer Ther, 2008. 7(8): p. 2415-25.

4. Cottin, S., Ghani, K., de Campos-Lima, P.O.Caruso, M., Gemcitabine intercellular diffusion mediated by gap junctions: new implications for cancer therapy. Mol Cancer, 2010. 9: p. 141.

5. Branford, S., Rudzki, Z., Harper, A., Grigg, A., Taylor, K., Durrant, S., Arthur, C., Browett, P., Schwarer, A.P., Ma, D., Seymour, J.F., Bradstock, K., Joske, D., Lynch, K., Gathmann, I.Hughes, T.P., Imatinib produces significantly superior molecular responses compared to interferon alfa plus cytarabine in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase. Leukemia, 2003. 17(12): p. 2401-9.

6. Huang, M., Wang, Y., Cogut, S.B., Mitchell, B.S.Graves, L.M., Inhibition of nucleoside transport by protein kinase inhibitors. J Pharmacol Exp Ther, 2003. 304(2): p. 753-60.

7. Molina-Arcas, M., Trigueros-Motos, L., Casado, F.J.Pastor-Anglada, M., Physiological and pharmacological roles of nucleoside transporter proteins. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2008. 27(6): p. 769-78.

8. Zhang, J., Visser, F., King, K.M., Baldwin, S.A., Young, J.D.Cass, C.E., The role of nucleoside transporters in cancer chemotherapy with nucleoside drugs. Cancer Metastasis Rev, 2007. 26(1): p. 85-110.

9. Pastor-Anglada, M., Cano-Soldado, P., Molina-Arcas, M., Lostao, M.P., Larrayoz, I., Martinez-Picado, J.Casado, F.J., Cell entry and export of nucleoside analogues. Virus Res, 2005. 107(2): p. 151-64.

10. Arora, A.Scholar, E.M., Role of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy. J Pharmacol Exp Ther, 2005. 315(3): p. 971-9.

11. Wong, S.Witte, O.N., The BCR-ABL story: bench to bedside and back. Annu Rev Immunol, 2004. 22: p. 247-306.

12. Zhang, J., Yang, P.L.Gray, N.S., Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature reviews Cancer, 2009. 9(1): p. 28-39.

13. Brozik, A., Hegedus, C., Erdei, Z., Hegedus, T., Ozvegy-Laczka, C., Szakacs, G.Sarkadi, B., Tyrosine kinase inhibitors as modulators of ATP binding cassette multidrug transporters: substrates, chemosensitizers or inducers of acquired multidrug resistance? Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2011. 7(5): p. 623-42.

14. Janne, P.A., Gray, N.Settleman, J., Factors underlying sensitivity of cancers to small-molecule kinase inhibitors. Nat Rev Drug Discov, 2009. 8(9): p. 709-23.

15. Knight, Z.A., Lin, H.Shokat, K.M., Targeting the cancer kinome through polypharmacology. Nat Rev Cancer, 2010. 10(2): p. 130-7.

16. Druker, B.J.Lydon, N.B., Lessons learned from the development of an abl tyrosine kinase inhibitor for chronic myelogenous leukemia. J Clin Invest, 2000. 105(1): p. 3-7.

17. Dar, A.C.Shokat, K.M., The evolution of protein kinase inhibitors from antagonists to agonists of cellular signaling. Annu Rev Biochem, 2011. 80: p. 769-95.

18. Perrotti, D., Turturro, F.Neviani, P., BCR/ABL, mRNA translation and apoptosis. Cell Death Differ, 2005. 12(6): p. 534-40.

19. Colicelli, J., ABL tyrosine kinases: evolution of function, regulation, and specificity. Sci Signal, 2010. 3(139): p. re6.

34

20. Deininger, M.W., Goldman, J.M.Melo, J.V., The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood, 2000. 96(10): p. 3343-56.

21. Deenik, W., Janssen, J.J., van der Holt, B., Verhoef, G.E., Smit, W.M., Kersten, M.J., Daenen, S.M., Verdonck, L.F., Ferrant, A., Schattenberg, A.V., Sonneveld, P., van Marwijk Kooy, M., Wittebol, S., Willemze, R., Wijermans, P.W., Beverloo, H.B., Lowenberg, B., Valk, P.J., Ossenkoppele, G.J.Cornelissen, J.J., Efficacy of escalated imatinib combined with cytarabine in newly diagnosed patients with chronic myeloid leukemia. Haematologica, 2010. 95(6): p. 914-21.

22. O'Brien, S.G., Guilhot, F., Larson, R.A., Gathmann, I., Baccarani, M., Cervantes, F., Cornelissen, J.J., Fischer, T., Hochhaus, A., Hughes, T., Lechner, K., Nielsen, J.L., Rousselot, P., Reiffers, J., Saglio, G., Shepherd, J., Simonsson, B., Gratwohl, A., Goldman, J.M., Kantarjian, H., Taylor, K., Verhoef, G., Bolton, A.E., Capdeville, R.Druker, B.J., Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med, 2003. 348(11): p. 994-1004.

23. Wei, G., Rafiyath, S.Liu, D., First-line treatment for chronic myeloid leukemia: dasatinib, nilotinib, or imatinib. J Hematol Oncol, 2010. 3: p. 47.

24. Broekman, F., Giovannetti, E.Peters, G.J., Tyrosine kinase inhibitors: Multi-targeted or single-targeted? World J Clin Oncol, 2011. 2(2): p. 80-93.

25. Maleddu, A., Pantaleo, M.A., Nannini, M.Biasco, G., The role of mutational analysis of KIT and PDGFRA in gastrointestinal stromal tumors in a clinical setting. J Transl Med, 2011. 9: p. 75.

26. Tuveson, D.A., Willis, N.A., Jacks, T., Griffin, J.D., Singer, S., Fletcher, C.D., Fletcher, J.A.Demetri, G.D., STI571 inactivation of the gastrointestinal stromal tumor c-KIT oncoprotein: biological and clinical implications. Oncogene, 2001. 20(36): p. 5054-8.

27. Saglio, G., Kim, D.W., Issaragrisil, S., le Coutre, P., Etienne, G., Lobo, C., Pasquini, R., Clark, R.E., Hochhaus, A., Hughes, T.P., Gallagher, N., Hoenekopp, A., Dong, M., Haque, A., Larson, R.A.Kantarjian, H.M., Nilotinib versus imatinib for newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med, 2010. 362(24): p. 2251-9.

28. Weisberg, E., Manley, P.W., Breitenstein, W., Bruggen, J., Cowan-Jacob, S.W., Ray, A., Huntly, B., Fabbro, D., Fendrich, G., Hall-Meyers, E., Kung, A.L., Mestan, J., Daley, G.Q., Callahan, L., Catley, L., Cavazza, C., Azam, M., Neuberg, D., Wright, R.D., Gilliland, D.G.Griffin, J.D., Characterization of AMN107, a selective inhibitor of native and mutant Bcr-Abl. Cancer Cell, 2005. 7(2): p. 129-41.

29. Garnock-Jones, K.P., Nilotinib: in the first-line treatment of newly diagnosed Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukaemia in chronic phase. Drugs, 2011. 71(12): p. 1579-90.

30. Doggrell, S.A.Christensen, A.M., Are there better Bcr-Abl kinase inhibitors for chronic myeloid leukaemia than imatinib? Evaluation of Saglio G, Kim D-W, Issaragrisil S, et al. Nilotinib versus imatinib for newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2010;362:2251-9, and Kantarjian H, Shah NP, Hochhaus A, et al. Dasatinib versus imatinib in newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2010;362:2260-70. Expert Opin Pharmacother, 2011. 12(1): p. 157-63.

31. Weisberg, E., Manley, P.W., Cowan-Jacob, S.W., Hochhaus, A.Griffin, J.D., Second generation inhibitors of BCR-ABL for the treatment of imatinib-resistant chronic myeloid leukaemia. Nat Rev Cancer, 2007. 7(5): p. 345-56.

32. O'Hare, T., Eide, C.A.Deininger, M.W., New Bcr-Abl inhibitors in chronic myeloid leukemia: keeping resistance in check. Expert Opin Investig Drugs, 2008. 17(6): p. 865-78.

33. Mroue, R.M., El-Sabban, M.E.Talhouk, R.S., Connexins and the gap in context. Integr Biol (Camb), 2011. 3(4): p. 255-66.

34. Hur, K.C., Shim, J.E.Johnson, R.G., A potential role for cx43-hemichannels in staurosporin-induced apoptosis. Cell Commun Adhes, 2003. 10(4-6): p. 271-7.

35. Tanji, N.Yokoyama, M., Treatment of metastatic renal cell carcinoma and renal pelvic cancer. Clin Exp Nephrol, 2011. 15(3): p. 331-8.

35

36. Ishizaki, T., Uehata, M., Tamechika, I., Keel, J., Nonomura, K., Maekawa, M.Narumiya, S., Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinases. Mol Pharmacol, 2000. 57(5): p. 976-83.

37. Paterson, A.R., Lau, E.Y., Dahlig, E.Cass, C.E., A common basis for inhibition of nucleoside transport by dipyridamole and nitrobenzylthioinosine? Mol Pharmacol, 1980. 18(1): p. 40-4.

38. Deininger, M.W., Nilotinib. Clin Cancer Res, 2008. 14(13): p. 4027-31. 39. Giuntoli, R.L., 2nd, Bristow, R.E., Diaz-Montes, T.P.Armstrong, D.K., Feasibility of intravenous

gemcitabine and an intraperitoneal platinum agent in the treatment of ovarian cancer. J Chemother, 2011. 23(3): p. 163-7.

40. Alberts, D.S., Liu, P.Y., Wilczynski, S.P., Jang, A., Moon, J., Ward, J.H., Beck, J.T., Clouser, M.Markman, M., Phase II trial of imatinib mesylate in recurrent, biomarker positive, ovarian cancer (Southwest Oncology Group Protocol S0211). Int J Gynecol Cancer, 2007. 17(4): p. 784-8.

41. Coleman, R.L., Broaddus, R.R., Bodurka, D.C., Wolf, J.K., Burke, T.W., Kavanagh, J.J., Levenback, C.F.Gershenson, D.M., Phase II trial of imatinib mesylate in patients with recurrent platinum- and taxane-resistant epithelial ovarian and primary peritoneal cancers. Gynecol Oncol, 2006. 101(1): p. 126-31.

42. Garcia-Rodriguez, L., Perez-Torras, S., Carrio, M., Cascante, A., Garcia-Ribas, I., Mazo, A.Fillat, C., Connexin-26 is a key factor mediating gemcitabine bystander effect. Mol Cancer Ther, 2011. 10(3): p. 505-17.

43. Rose, J.B.Coe, I.R., Physiology of nucleoside transporters: back to the future. Physiology (Bethesda), 2008. 23: p. 41-8.

44. Choi, D.S., Cascini, M.G., Mailliard, W., Young, H., Paredes, P., McMahon, T., Diamond, I., Bonci, A.Messing, R.O., The type 1 equilibrative nucleoside transporter regulates ethanol intoxication and preference. Nat Neurosci, 2004. 7(8): p. 855-61.

45. Reyes, G., Nivillac, N.M., Karim, M.Z., Desouza, L., Siu, K.W.Coe, I.R., The Equilibrative Nucleoside Transporter (ENT1) can be phosphorylated at multiple sites by PKC and PKA. Mol Membr Biol, 2011. 28(6): p. 412-26.

46. Salazar, C.Hofer, T., Multisite protein phosphorylation--from molecular mechanisms to kinetic models. FEBS J, 2009. 276(12): p. 3177-98.

47. Huang, M., Wang, Y., Collins, M., Gu, J.J., Mitchell, B.S.Graves, L.M., Inhibition of nucleoside transport by p38 MAPK inhibitors. J Biol Chem, 2002. 277(32): p. 28364-7.

48. Baker, S.J.Reddy, E.P., Targeted inhibition of kinases in cancer therapy. Mt Sinai J Med, 2010. 77(6): p. 573-86.

49. Bock, A.J., Dong, H.P., Trope, C.G., Staff, A.C., Risberg, B.Davidson, B., Nucleoside transporters are widely expressed in ovarian carcinoma effusions. Cancer Chemother Pharmacol, 2011.