Impacts écologiques de la présence de quelques substances ...

Thèse de doctorat

Présentée

Par

Fida Ben Salem

Pour obtenir le grade de Docteur

A

L’Université de Pau et des Pays de l’Adour

Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur l'Environnement et les Matériaux

Equipe Environnement et Microbiologie

&

L’Université de Cathage

Faculté des Sciences de Bizerte

Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement

Spécialité

Biologie

Impacts écologiques de la présence de quelques substances prioritaires (pesticides

agricoles, hydrocarbures aromatiques polycycliques, polychlorobiphényles,

organo-métaux) dans un écosystème littoral anthropisé,

le complexe lac Ichkeul- lagune de Bizerte

Soutenue le : 22/07/2015

Devant la commission d'examen formée de :

Robert Duran : Professeur à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, Directeur de thèse

Ezzeddine Mahmoudi : Professeur à la Faculté des Sciences de Bizerte, Directeur de thèse

Mathilde Monperrus : Maître de conférences à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, Co-directrice

Olfa Ben Said : Docteur à la Faculté des Sciences de Bizerte, Co-directrice

Olivier Pringault : Directeur de Recherche à l’Institut de Recherche et Développement, Rapporteur

Sami Sayadi : Professeur au Centre de Biotechnologie de Sfax, Rapporteur

Catherine Gonzalez : Professeur à l’Ecole des mines d’Alès, Examinatrice

Imed Massoudi : Maître de conférences à l’Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir, Examinateur

A mes parents et mes frères

Merci pour votre soutien

Encouragement……

et compréhension…

AVANT – PROPOS

Le présent travail, a été mené au sein de l’Equipe Environnement et Microbiologie, dirigé par

Monsieur le Professeur Robert DURAN, et qui fait partie de l’Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur

l'Environnement et les Matériaux dirigé par Monsieur Olivier DONARD à l’Université de Pau et des Pays

de l’Adour.

Il est en cotutelle avec le Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Unité d’Ecologie

Côtière et Ecotoxicologie Marine à la Faculté des Sciences de Bizerte.

Une partie de chimie analytique a été réalisée au Laboratoire de Chimie Analytique Bio-inorganique

et Environnement (Anglet), qui fait partie aussi de l’Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur

l'Environnement et les Matériaux.

Ce projet a été effectué en partenariat socio-économique avec l’Agence Nationale de Protection de

l’Environnement de la Tunisie et le Commissariat Régional de Développement Agricole de Bizerte.

Remerciements

Ce travail est le fruit de nombreuses rencontres dans les équipes de recherches en France et en Tunisie que je

souhaite remercier ici pour toute l’aide, le soutien, les conseils qu’elles m’ont apportés ou tout simplement

pour leur bonne humeur et leur joie de vivre qui ont fait de ces quatre années, une aventure incroyable.

Je tiens à remercier Monsieur Olivier PRINGAULT et Monsieur Sami SAYADI d’avoir accepté

d’évaluer mon travail en tant que rapporteurs.

Un grand merci à Madame Catherine GONZALEZ et Monsieur Imed MASSOUDI d’avoir

accepté d’assisster à ma soutenance en tant que examinateurs.

Ma gratitude va en premier lieu à Monsieur Robert DURAN, Professeur à l’Université de Pau et

des Pays de l’Adour qui fut pour moi un directeur de thèse attentif et disponible malgré ses nombreuses

charges. Il a assuré la direction de cette thèse avec beaucoup de patience, il m’a suivie durant toutes les

étapes de mon travail, il n’a épargné ni son temps, ni ses compétences scientifiques. Je suis très heureuse de

pouvoir lui exprimer ici l’expression de ma profonde reconnaissance aussi pour ses qualités humaines au

laboratoire.

Je suis particulièrement reconnaissante à Madame Mathilde MONPERRUS, Maître de

conférences à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, pour son co-encadrement et d’avoir bien voulu

m’aider à réaliser la partie chimie de ma thèse qui a donné un plus à mon travail.

J'adresse mes plus sincères remerciements à Madame Patricia AISSA pour m’avoir accueillie au sein

du laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement et pour ses grandes qualités humaines.

Je tiens à remercier Monsieur Ezzeddine MAHMOUDI, Professeur à la Faculté des Sciences de

Bizerte pour son encadrement, ses conseils ont contribué au bon déroulement de cette thèse.

Mes remerciements les plus chaleureux iront à Madame Olfa BEN SAID, postdoctorale à la faculté

des Sciences de Bizerte, pour son co-encadrement, Sa disponibilité, ses conseils et son aide scientifique ont

grandement contribué à la réalisation de ces travaux, et à la collaboration entre les différents laboratoires de

recherches.

Un grand merci à Mr Olivier DONARD, ainsi que tous les membres de l’Institut Pluridisciplinaire de

Recherche sur l'Environnement et les Matériaux et à Madame Jacqueline PETITBON, ainsi que tous les

membres de l’Ecole Doctorale Sciences Exactes et leurs Applications de l’Université de Pau et des Pays de

l’Adour.

Il me tient à cœur de remercier mes chers parents Abed Esslem et Naima, mes frères Fedi et Med

Dhia et mon fiancé Adel ainsi que mes grands parents et toute ma grande famille pour l’aide et le soutien

qu’ils m’ont toujours témoignés.

Mes remerciements vont également à mes enseignants de la Faculté des Sciences de Bizerte, et tous

les membres de l’Unité d’Ecologie et Ecotoxicologie Côtière du Laboratoire de Biosurveillance de

l’Environnement, qu’il m’a été donné de rencontrer durant les années de ma thèse : Hamouda, Mohamed,

Naceur, Fehmi, Amor, Rahma, Soumaya, Amel, Ibtihel, Héla, Tkoua, Meriem, Ahmed, Badreddine, Jalila,

Abdelhafidh et mes amis Jihed et Marouen.

J’adresse mes remerciements aux membres de l’Equipe Environnement et Microbiologie (Pau) et ceux

du Laboratoire de Chimie Analytique Bio-inorganique et Environnement (Anglet) de l’Université de Pau et

des Pays de l’Adour : Habiba, Joana, Jean-Christophe, Christine, Claire, Anne, Hervé, Vanessa, Arantxa,

Mathilde, Fanny, Johanne, Fabien pour leurs encouragements.

Je remercie Mr Olivier GRUMBERGER et Mme Noëlle BRU pour leur aide.

Je tiens aussi à remercier Madame Nabiha MBAREK de l’Agence Nationale de Protection de

l’Environnement et Monsieur Taher KAABI du Commissariat Régional de Développement Agricole de

Bizerte pour leur aide.

Sommaire

INTRODUCTION GENERALE…………………………………………………………………………

CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE……………….……………………………………

I. CONTAMINATION DES ECOSYSTEMES AQUATIQUES PAR LES POLLUANTS

ORGANIQUES…………………………………………………………………………………..................

I.1. Polluants d’origine agricole : les pesticides……………………………………………………….…….

a. Ecosystème aquatique : Réceptacle des polluants agricoles………………………………….…….……..

b. Propriétés physico-chimique des pesticides………………………………………………….….………..

I.2. Polluant d’origine industrielle : HAP et PCB…………………………………………………………...

a. Contamination des écosystèmes par les HAP…………………………………………………………......

b. Contamination des écosystèmes par les PC………………………………………………………….........

I.3. Réglementation et normes……………………………………………………………………………….

II. BIOSURVEILLANCE DES ECOSYSTEMES AQUATIQUES…………………………………………

II.1. Importance du Benthos dans la biosurveillance des écosystèmes aquatiques…………………….........

a. Sédiment…………………………………………………………………………………………………..

b. Benthos………………………………………………………………………………………………........

c. Inter-relation : bactérie-nématode libres marins et chaine trophique dans le milieu marin…………........

II.2. Impacts des polluants sur les communautés benthiques……………………………………………….

II.3. La biodiversité bactérienne……………………………………………………………………………..

a. Techniques moléculaires en écologie microbienne……………………………………………………….

III. METHODE D’ANALYSE CHIMIQUE………………………………………………………………..

IV. PRESENTATION DE L’ECOSYSTEME ETUDIE : COMPLEXE LAC ICHKEUL-LAGUNE DE

BIZERTE…………………………………………………………………………………………………….

Références bibliographiques…………………………………………………………………………………

CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES…………………………..……………………………......

I. STRATEGIE D’ECHANTILLONNAGE....................................................................................................

II. PARAMETRES DESCRIPTEURS DES SITES D’ECHANTILLONNAGES………………………….

II.1. La salinité………………………………………………………………………………………….........

II.2. Le pH……………………………………………………………………………………………………

II.3. L’oxygène………………………………………………………………………………………….........

II.4. Les éléments nutritifs……………………………………………………………………………………

III. ANALYSES CHIMIQUES………………………………………………………………………......

III.1. Adaptation et validation de la méthode QuEChERS…………………………………………………..

III.1.1. Optimisation de l’extraction des HAP, PCB et OCP………………………………………............

III.1.2. Extraction et purification des HAP, PCB et OCP…………………………………………………….

III.1.3. Dosage des HAP, PCB et OCP……………………………………………………………………….

IV. ANALYSES MOLECULAIRES ………………………………………………………………...........

IV.1. Extraction de l’ADN génomique……………………………………………………………………….

IV.2. Amplification des gènes de l’ARNr 16S……………………………………………………………….

IV.3. Analyse TRFLP…………………………………………………………………………………….......

IV.4. Pyroséquençage…………………………………………………………………………………..........

V. ETUDE DE LA MEIOFAUNE…………………………………………………………….……….......

VI. TRAITEMENT STATISTIQUE DES DONNEES……………………………………………...........

VI.1. Analyses univariées…………………………………………………………………………………….

VI.2. Analyses multivariées………………………………………………………………………………….

Références Bibliographiques…………………………………………………………………………………

CHAPITRE III : STRATEGIE DE HIERARCHISATION DES POLLUANTS CHIMIQUES

D’INTERET A RECHERCHER DANS LE COMPLEXE LAC ICHKEUL-LAGUNE DE

BIZERTE………………………………………………………………………………………………….

Partie A : Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en Tunisie : cas du bassin agricole

du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte……………………………………………………………………

Introduction…………………………………………………………………………………………………

Références Bibliographiques…………………………………………………………………………………

I. Publication 1 : Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en grandes cultures dans le

bassin versant du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte (Tunisie)…………………………………………

Résumé……………………………………………………………………………………………………….

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Abstract………………………………………………………………………………………………………

Introduction…………………………………………………………………………………………………..

Matériels et Méthodes………………………………………………………………………………………

Site d'étude……………………………………………………………………………………………………

Stratégie d’échantillonnage…………………………………………………………………………………

Méthode de calcul global…………………………………………………………………………………….

Méthode de calcul par agriculteur……………………………………………………………………………

Résultats………………………………………………………………………………………………………

Utilisation des pesticides dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte………………………………….

Estimation des pesticides vendus……………………………………………………………………….........

Estimation des pesticides utilisés par les agriculteurs……………………………………………………….

Comparaison pesticides vendus et pesticides utilisés………………………………………………………...

Discussion……………………………………………………………………………………………………

Conclusion……………………………………………………………………………………………………

Remerciement………………………………………………………………………………………………...


Partie B : Validation et adaptation d’une méthode d’analyse chimique pour la détermination

simultanée des HAP, PCB et OCP dans le sédiment du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte par

GC-MS……………………………………………………………………………………………...............

Introduction…………………………………………………………………………………………………..

Références bibliographiques………………………………………………………………………………….

I. Publication 2 : Validation of an adapted quick, easy, cheap, effective, rugged and safe method for

the simultaneous analysis of heavy poly-aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and

organo-chlorine pesticides in sediment by Gas chromatography–mass spectrometry…………………

Abstract…………………………………………………………………………………………………….

1. Introduction……………………………………………………………………………………..…………

2. Experimental………………………………………………………………………………..……………

2.1. Reagents and chemicals…………………………………………………………………………………

2.2. Standard reference material and real samples…………………………………………………………...

2.3. QuEchERS extraction/purification procedure…………………………………………………………...

2.4. GC-MS Analysis…………………………………………………………………………………………

3. Results………………………………………………………………………………………………..…….

3.1. Adaptation of the QuEChERS method……………………………………………………………..……

3.2. Analytical performances…………………………………………………………………….…………..

3.3. Application to real samples……………………………...………………………………………………

4. Concluding remarks……………………………………..…………………………………………………

References………...…………………………………………………………………………………………..

II. Publication 3 : Organic contamination of sediments from Ichkeul Lake (protected area) and

Bizerta Lagoon (Anthropized ecosystem) watershed (Tunisia)…………………………………………..

Abstract……………………………………………………………………………………………………….

1. Introduction……………………………………………………………………………………..………….

2. Materials and methods……………………………………………………………………………………..

2.1. Study region and sampling........................................................................................................................

2.2. Physical and chemical parameters……………………………………………………………………….

2.3. Solvents and chemical standards…………………………...……………………………………………

2.4. Analytical methods……………………………………………………………………………………...

QuEchERS extraction/purification procedure………………………...……………………………………...

GC-MS Analysis……………………………………………...………………………………………………

2.5. Quality control…………………………………………………………………………………………...

3. Results and discussions…………………………………………………………………………………….

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)…………………………………………………………………..

Polychlorinated Biphenyls (PCBs)…………………………………………………………………………...

Organochlorine pesticides (OCPs)…………………………………………………………………………...

Butyltin………………………………………………………………………………………………………

Conclusion……………………………………………………………………………………………………

Acknowledgement……………………………………………………………………………………………

References…………………………………………………………………………………………………….

CHAPITRE IV : BIO-SURVEILLANCE DU COMPLEXE LAC ICHKEUL LAGUNE DE

BIZERTE : DIVERSITE MICROBIENNE ET DES NEMATODES LIBRES MARINS……………

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Partie A : Impacts écologiques de la présence des polluants organiques HAP et OCP sur les

communautés bactériennes et les nématodes libres marins du sédiment du complexe Lac Ichkeul-

Lagune de Bizerte…………………………………………………………………………………………

Introduction…………………………………………………………………………………………………..


I. Publication 4 : Bacterial Community Structure of the sediments from the complex Bizerta

Lagoon (Anthropized ecosystem)-Ichkeul lake (RAMSAR site) in Tunisia and pyrosequencing

analysis of four interesting sites……………………………………………………………………………

Abstract…………………………………………………………………………………………………….

1. Introduction……………………………………………………………………………………..………….

2. Materials and methods……………………………………………………………………………………..

2.1. Site description…………………………………………………………………………………………..

2.2. Sampling…………………………………………………………………………………………………

2.3. Physical-chemical analyses……………………………………………………………………………...

2.4. DNA extraction, PCR, T-RFLP analysis………………………………………………………………...

2.5. 454 Pyrosequencing……………………………………………………………………………………..

2.6. Statistical analysis………………………………………………………………………………………..

3. Results and discussions…………………………………………………………………………………….

3.1. Bacterial community structure…………………………………………….……………………………..

3.2. Bacterial community composition……………………………………………………………………….

3.2.1. Univariate indices……………………………………………………………………………………...

3.2.2. Multivariate indices……………………………………………………………………………………

4. Conclusion…………………………………………………………………………………………………

References................................................................................... ......................................................................

II. Publication 5 : Pesticides in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon Watershed in Tunisia: Use,

occurrence, and effects on bacteria and free-living marine nematodes…………………………………

Abstract………………………………………………………………………………………………………

Abbreviations list……………………………………………………………………………………………..

Introduction…………………………………………………………………………………………………...

Materials and methods………………………………………………………………………………………..

Site description and survey of pesticides use………………………………………………………………...

Sediment samples collection…………………………………………………………………………………

Physical and chemical parameters……………………………………………………………………………

Analytical methods…………………………………………………………………………………………...

QuEchERS extraction/purification procedure………………………………………………………………..

GC-MS Analysis……………………………………………………………………………………………..

Density of free-living marine nematodes…………………………………………………………………….

Bacterial community analysis………………………………………………………………………………...

Statistical analysis…………………………………………………………………………………………….

Results and discussion………………………………………………………………………………………..

Pesticide use………………………………………………………………………………………………….

Pesticides concentrations in sediment………………………………………………………………………..

Nematode abundances………………………………………………………………………………………..

Bacterial communities………………………………………………………………………………………..

Conclusion……………………………………………………………………………………………………

Acknowledgements…………………………………………………………………………………………..

References……………………………………………………………………………………………………

CHAPITRE V : CONCLUSIONS GENERALES & PERSPECTIVES………………………………...

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Liste des abréviations

PCB : Polychlorobiphényles

QuEChERS : Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe

HAP : Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques

ANPE : Agence Nationale de Protection de l’Environnement

UNESCO : Organisation des Nations unies pour l'éducation, la science et la culture

POC : Pesticides organochlorés

HCH : Hexachlorocyclohexanes

DDT : Dichlorodiphényltrichloroéthanes

MOC : Contaminants micro-organiques

Koc : coefficient de partage carbone organique/eau

LMW-HAP : HAP de faible poids moléculaires

HMW-HAP : HAP de haut poids moléculaires

Kow : coefficients de partage octanol/eau

POP : polluants organiques persistants

NOAA : Administration Océanique et Atmosphérique Nationale

TEL : threshold effects level

PEL : Prabable effect level

TRFLP : polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux

PCR : réaction en chaine par polymérase

ARN : Acide ribonucléique

ADN : Acide désoxyribonucléique

ARNr : Acide ribonucléique ribosomique

Pb : paire de base

HTS : high-throughput sequencing

OTU : Unités Opérationnelles Taxonomiques

ADNsb : Acide désoxyribonucléique simple brin

A, T, C, G : adénine, thymine, cytosine, guanine

ATP : Adénosine triphosphate

CRDA : Commissariat Régional de Développement Agricole de Bizerte

NPP : Nombre le plus probable

MES : matière en suspension

GC-MS : chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

H’ : indice de diversité de Shannon

R : richesse spécifique

SIMPER : similarity percentages

ANOSIM : analyse de similarités

CCA : Analyse des Correspondances Canonique

Liste des figures

Chapitre I : Synthèse bibliographique :

Fig1. Structure chimique de deux organochlorés dérivés du DDT

Fig 2. Mode de transfert des pesticides dans l’environnement

Fig 3. Devenir des pesticides et des contaminants micro-organiques (MOC) dans le milieu

aquatique (Warrena et al., 2003)

Fig 4. Structure chimique des 16 HAP prioritaires de la liste de l’Agence Américaine de

l’Environnement

Fig 5. Estimation de la consommation mondiale cumulée de PCB (légendes en tonnes)

(Breivik et al., 2002)

Fig 6. Réseau complexe de terriers de nématodes rapprochés dans le sédiment, vu à travers la

paroi latérale du verre de réservoir aquarium (Cullen, 1973).

Fig 7. Réseau trophique benthique (Leguerrier, 2005)

Fig 8. Carte de la position du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

Fig 9. Carte du réseau hydrographique (CRDA, 2007)

Fig 10. Carte des pentes de la région de Bizerte

Chapitre II : Matériels et méthodes :

Fig 11. Localisation des stations d’échantillonnage dans le lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

Publication 1 :

Fig 1. Carte d’occupation du sol de la région de Bizerte et localisation approximative des

terrains des agriculteurs questionnés

Fig 2. Pluviométrie du mois du septembre 2011 au mois d’Août 2012 avec l’horloge

d’utilisation des herbicides

Publication 2 :

Fig 1. Comparison of concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPsin the different

extraction experiments and in the certified reference materials SRM 1941b for PAHs (a) and

PCBs (b).

Publication 3:

Fig 1: Map of the Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon complex indicating the location of the

sampling sites (numbers)

Fig 2: Spatial distribution of total PAHs in superficial sediments of Ichkeul Lake-Bizerta

Lagoon complex in April 2012.

Fig 3a. Concentrations (ng.g-1

dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Ichkeul

Lake in April (ST1-ST8)

Fig 3b. Concentrations (ng.g-1

dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Bizerta

lagoon in April (ST9-ST20)

Fig 4. Spatial distribution of totals PCBs (ng.g-1

) in superficial sediments of complex Ichkeul

Lake-Bizerta Lagoon in April 2012.

Fig 5. Spatial distribution of totals OCPs (ng.g-1

) in superficial sediments of complex Ichkeul

Lake-Bizerta Lagoon in September 2011 and April 2012.

Fig 6a. Concentrations (ng.g-1

dry wt) of OCPs in sediment of different sites from Lake

Ichkeul in April (ST1-ST8)

Fig 6b. Concentrations (ng.g-1


Ichkeul-Bizerta lagoon in April (ST11-ST20)

Publication 4 :

Fig 1. Map of the complex Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon indicating the location of the

sampling stations

Fig 2. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial communities

structure from complex Ichkeul Lake - Bizerta Lagoon in two campaigns characterized by T-

RFLP fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides


from Ichkeul Lake in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP

fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides.


from Bizerta Lagoon in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP


Fig 5. Comparison of bacterial communities from the different sites of the Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared OTUs between

sites.The specific OTUs for each site are indicated. OTUs were determined at the species

level (97%).

Fig 6. Heat map for clustering abundance of OTUs in different sites with replicates.

Fig 7. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial community

composition from the complex Ichkeul lake - Bizerta lagoon in four sites in april based on

variables and characterized by OTUs and chemical analysis: PAHs and OCPs.

Publication 5 :

Fig 1. Aerial map of the complex and location of sampling sites (red circles)

Fig 2. Concentrations of organochlorine pesticides at the different sites (colors). The error bar

corresponds to the standard deviation (n=3).

Fig 3. Average densities of nematodes (individuals/10 cm2) in the different sites from the

complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. The error bar corresponds to the standard deviation.

Fig 4. Comparison of bacterial communities from the studied sites by heat map with

clustering analysis. The circles indicate the specific T-RFs for Site 1 (blue), Site 2 (yellow),

Site 3 (green) and Site 4 (red).


Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared T-RFs between sites.

The specific T-RFs for each site are indicated.

Chapitre V: Conclusions et perspectives:

Fig 1. L’inter-relation lac-lagune de point de vue écotoxicologique

Liste des planches


Planche 1. Photo de l’écluse de Tinja

Planche 2. Photo d’une vanne de l’écluse de Tinja

Chapitre II : Matériels et méthodes :

Planche 3. Photo de la benne Van Veen

Planche 4. Station située au niveau de l’oued Tinja du coté sud de l’écluse (site 1)

Planche 5 : Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site2)

Planche 6. Station située au centre du lac (site 4)

Planche 7. Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site 3)

Planche 8. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued (site 5)

Planche 9. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Sejnane (site 6)

Planche 10. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Douimiss (site 7)

Planche 11. Station localisée en face de la briqueterie (site 8)

Liste des tableaux


Tableau1. Seuil d’effet TEL (threshold effects level) de quelques HAP et Pesticides selon les

normes américaines déterminées par l’Administration Océanique et Atmosphérique Nationale

(NOAA). (NOAA, 1999)

Tableau 2. Production halieutique annuelle (kg) au niveau de la lagune de Bizerte (d’après la

Direction Générale de la Pêche et de l’Aquaculture Bizerte, 1999 ; Essid, 2001)

Publication 1 :

Tableau 1. La liste des matières actives utilisées dans le bassin versant lac Ichkeul-Lagune de

Bizerte

Tableau 2. Estimation des quantités des principales matières actives utilisées dans les zones

agricoles concernées après dire des agriculteurs.

Tableau 3. Les quantités des pesticides vendues par an au niveau des délégations concernées

(L : Litres, kg)

Tableau 4. Les propriétés physico-chimiques de certaines matières actives

Publication 2 :

Table 1. The different experiments performed for the adaptation of the QuEChERS extraction

Table 2. Retention time and target monitoring of the different compounds analyzed by GCMS

Table 3. Concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPs in the certified reference

materials SRM 1941b by the different experiments (see Table 1) and comparison with the

certified values(CV) (concentration ng.g-1

± SD standard deviation), na: not available, -: not

determined.

Table 4. Analytical performances of the QuEChERS method.na not avalaible, R2=linearity,

LOD=Limits of detection, LOQ=Limits of quantification, R%=Recoveries,

RSD=reproducibility.

Table 5. Concentrations of PAHs, PCBs and OCPs in sediment collected from Bizerta

Lagoon and Ichkeul Lake (concentrations ng g-1

± SD (n=3)).

Publication 3 :

Table 1. Physicochemical Parameters of water from the complex Ichkeul Lake-Bizerta

Lagoon

Table 2: Threshold effects level (TEL) (ng.g-1

dry wt) of OCPs from NOAA screening quick

references table

Table 3: Mean and range of detected concentrations of PAHs, PCBs and OCPs (ng.g-1

DW)

in September and April

Publication 4 :

Table 1: Means of univariate indices for OTUs assemblages from each site. N = Number of

OTUs; H' = Shannon-Wiener index; Margalef’s R= OTUs richness.

Publication 5 :

Table 1. Analytical performances of the QuEChERSmethod.R2, linearity; LOD, Limit of

detection; LOQ, Limits of quantification; R%, Recoveries; RSD, reproducibility.na, not

available,

Table 2. Estimated quantities of the main active compounds used in the agricultural areas of

the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex by farmers’ survey

Table 3. Concentrations (ngg-1

dry wt sediment) of OCPs in sediment from the four sites

studied in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. SD are indicated. LOD: limit of detection.

Table 4. Physical-chemical parameters at the sampling sites of the complex Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon

1

INTRODUCTION GENERALE

Le milieu aquatique est un compartiment environnemental très complexe, il est le siège d’un

grand nombre de réactions chimiques, physiques et biologiques. Plusieurs modèles ont été

construits pour essayer de simplifier et de comprendre le fonctionnement de ces écosystèmes

sensibles (Cerepnalkoski et al., 2012 ; Ciric et al., 2012 ; Tashkova et al., 2012).

L’introduction de contaminants provenant des activités anthropiques augmente rapidement.

Ceci complique la situation par une accumulation importante des xénobiotiques dans l’eau et

les sédiments (Ruiz-Fernandez et al., 2012). Les sources de pollutions sont de différentes

origines, industrielles, agricoles ou du trafic maritime… mais principalement anthropique.

Ainsi la contamination des milieux aquatiques par les pesticides, les hydrocarbures, les PCB

et les métaux est devenue un problème environnemental extrêmement important au cours de

ces dernières décennies (Li et al., 2014; Guo et al., 2014; Zhang et al., 2014; Wasswa et al.,

2011; Schoellhamer et al., 2007; Chang et al., 2006). A cause de leur biodisponibilité élevée

les xénobiotiques se retrouvent dans les différents types d’écosystèmes aquatiques : lagunes

(Acquavita et al., 2014 ; Pavoni et al., 2003), lacs (Zhi et al., 2015 ; Rasmussen et al., 2014),

rivières (Yu et al., 2014 ;Wang et al., 2015 ; Xia et al., 2015), mer (Yancheshmeh et al.,

2014 ; Ji et al., 2015), océan (Yunker et al., 2011 ; Aparicio-González et al., 2012). Dans ces

écosystèmes les polluants s’accumulent le long de la chaine trophique (Pérez-Ruzafa et al.,

2000 ; Verweij et al., 2004 ; Oliveira Ribeiro et al., 2005 ; Miranda et al., 2008). La

bioaccumulation et la bioamplification au niveau de la faune et la flore benthiques et

pélagiques ont été prouvées par plusieurs travaux (Jantunen et al., 2008 ; Pickard et Clarke,

2008 ; Daley et al., 2009 ; Norwood et al., 2013).

Les produits phytosanitaires sont une solution face aux menaces par les pestes (insectes,

champignons, mauvaises herbes…) en agriculture pour essayer de minimiser les pertes en

rendement de la production agricole. L’emploi de ces produits chimiques n’a cessé de croître

avec l’intensification des cultures (Lakshmi, 1993 ; Temme et Verburg, 2011). Ces produits

rejoignent le milieu aquatique par ruissellement menaçant son fonctionnement (Chang et al.,

2006, Wen et al., 1994). Les hydrocarbures aromatiques polycycliques proviennent

essentiellement du trafic maritime (déballastage) et des industries de raffinage. Ils sont

omniprésent dans les différentes matrices des écosystèmes aquatiques (Shu et al., 2000; Ben

Said et al., 2010; Opel et al., 2011).

2

Les polychlorobiphényles proviennent essentiellement des activités industrielles, ils sont

utilisés comme des stabilisateurs depuis 1929. L'accumulation de ces composés est

principalement liée à leurs fortes propriétés lipophiles et de la résistance à la dégradation

(Jaspers et al., 2006). La toxicité des PCB dépend du nombre et la localisation des atomes de

chlore sur la structure cyclique. Structurellement, deux classes de PCB sont distinguées,

coplanaires (non-ortho-substitué, par exemple 3,3,4,4,5-pentachlorobiphényle; PCB 126) et

non-coplanaires (ortho-substituté, par exemple 2,2,4,4,5,5-hexachlorobiphenyle; PCB153) et

ses congénères (Katarzynska et al., 2015).

La surveillance des milieux aquatiques est souvent réalisée par la mesure des paramètres

physico-chimiques, de polluants organiques et métalliques dans les différentes matrices

environnementales (sédiment, eau et matrices biologiques). L’impact environnemental est

évalué par l’étude des organismes vivant dans ce milieu. Le choix des méthodes analytiques

dépend de plusieurs critères : rentabilité, facile à manipulé et rapidité. Les méthodes

d’extraction classiques tel que la méthode soxhlet, par micro-ondes et par ultrasons, utilisées

pour doser les polluants organiques dans les matrices environnementales (Boer et Law, 2003;

Carvalho et al., 2008; Cueva-Mestanza et al., 2008), sont souvent coûteuses et nécessitent de

grands volumes de solvant d’extraction et beaucoup de temps. Une nouvelle méthode est

maintenant disponible, consomme beaucoup moins de solvant organique avec une extraction

des composés rapide, comme la méthode QuEChERS : quick, easy, cheap, effective, rugged,

and safe (Pinto et al., 2011 ; Satpathy et al., 2011). Mais cette méthode n’est pas encore

validée pour toutes les molécules ni pour toutes les matrices environnementales.

La biosurveillance des écosystèmes consiste à utiliser les organismes biologiques pour évaluer

l’impact de la pollution sur un milieu donnée. En général la biosurveillance est déterminée

soit par des bioindicateurs (qualitatif) ou des biomarqueurs (quantitatif). La bioindication est

basée sur la présence et/ou l’absence d’espèces au sein d’un écosystème. Cela nécessite de

connaître les paramètres écologiques influençant la répartition de ces espèces, ainsi que leur

sensibilité face aux polluants recherchés (Agnan, 2013). Un biomarqueur est une réponse

biologique pouvant être reliée à une exposition ou à des effets toxiques de contaminants

chimiques présents dans l’environnement cette activité peut être une quantité anormale

d’enzymes ou une altération biochimique, physiologiques ou comportementales (Kerambrun,

2011). Le benthos et plus précisément les bactéries et les nématodes libres marins hébergés

dans les sédiments jouent un rôle de bioindicateurs de la pollution (Moreno et al., 2011 ; Losi

et al., 2013). Les bioindicateurs sont définis comme étant des organismes biologiques utilisés

3

pour évaluer les conditions environnementales dans le milieu qu’ils habitent selon des

caractéristiques observées (abondance, biomasse, diversité, co-occurrence…) (Galloway et

al., 2004; Brown et al., 2001).

Les travaux de biosurveillance du complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte se sont intéressés

aux HAP dans la lagune de Bizerte (Mzoughi et al., 2002 ; Ben Said et al., 2010). Le lac

Ichkeul n’a jamais fait l’objet d’étude écotoxicologique en considérant les polluants

organiques. Aussi aucune étude ne s’est intéressée aux microorganismes au niveau du lac.

Ce travail de thèse s’intéresse précisément à l’ensemble du complexe hydrologique lac

Ichkeul-Lagune de Bizerte, à fin de répondre aux questions écologiques suivantes :

Recenser les pesticides les plus utilisés dans les zones agricoles entourant le complexe

lac Ichkeul-Lagune de Bizerte, par une enquête de terrain.

Investiguer la contamination chimique dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte

par les pesticides agricoles, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les

polychlorobiphényles et les organo-métaux.

Déterminer les impacts de la présence de ces contaminants dans le complexe sur les

communautés bactériennes et la densité des nématodes libres marins indigènes du

sédiment

Aider l’ANPE à maîtriser la gestion de l’écluse de Tinja en déterminant la relation

lac-lagune: Qui influence l’autre de point de vue écotoxicologique?

La nouveauté dans ce travail réside dans la combinaison des différentes approches mises en

œuvre : enquête, analyses chimiques et analyses biologiques. Ainsi que l’investigation

chimique et microbiologique du lac Ichkeul qui est une aire protégée et un site de l’UNESCO

qui n’a été jamais fait l’objet d’études. L’enquête sur les pesticides est aussi une première en

Tunisie où les données sur l’utilisation des pesticides en agriculture dans ce pays sont

inexistantes.

Notre travail sera articulé comme suit :

Le chapitre 1 « Synthèse bibliographique » sera consacré à une analyse sur l’état de

l’art de la problématique. Il présentera la contamination des écosystèmes aquatiques

par les polluants organiques (Pesticides agricoles, hydrocarbures aromatiques

polycycliques et polychlorobiphényles), ainsi la surveillance des écosystèmes

4

aquatiques par les méthodes d’analyses chimiques et par les organismes biologiques.

Enfin le site d’étude, le complexe lac Ichkeul-Lagune de Bizerte, sera présenté.

Le chapitre 2 «Matériels et méthodes » présentera les stratégies d’échantillonnage

ainsi que les démarches expérimentales suivies pour les différentes analyses des

échantillons.

Le chapitre 3 sera consacré à « Stratégie de hiérarchisation des polluants

chimiques d’intérêt à étudier dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte » ce

chapitre sera divisé en deux parties. La première partie sera réservée au premier

recensement des pesticides agricoles utilisés en grandes cultures dans le bassin

versant du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte (Tunisie) (Publication 1) et la deuxième

partie sera consacrée à la validation et adaptation d’une méthode d’analyse chimique

pour la détermination simultanée des HAP, PCB et OCP dans le sédiment du

complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte par GC-MS (Publication 2&3).

Le chapitre 4 sera consacré à la « Bio-surveillance du complexe lac Ichkeul lagune

de Bizerte : biodiversité microbienne et la densité des nématodes libres marins »

ce chapitre mettra l’accent sur les impacts écologiques de la présence des polluants

organiques HAP et OCP sur les communautés bactériennes et la densité des

nématodes libres marins du sédiment du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

(Publication 4 & 5).

Ce mémoire s’achève par une conclusion générale récapitulant nos principaux

résultats et présente des perspectives de recherche.

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10

CHAPITRE I :

SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE

11

CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Contamination des écosystèmes aquatiques par les polluants organiques

I.1. Polluants d’origine agricole : les pesticides

L'intensification de la production agricole, dans le monde, suite à l’explosion démographique

est accompagnée par des problèmes d'utilisation excessive et abusive de pesticides (Lakshmi,

1993 ; Temme et Verburg, 2011). Les pesticides appelés aussi produits phytosanitaires ou

produits phytopharmaceutiques sont des produits chimiques organiques ou minéraux

constitués d’un ou plusieurs substances actives et de composés supplémentaires tels que

diluant et adjuvant. Ils sont utilisés par les agriculteurs pour lutter contre les organismes

nuisibles aux cultures. Les pesticides sont classifiés selon plusieurs critères :

La nature de la cible:

les insecticides pour lutter contre les insectes, ils interviennent en les éliminant ou en

empêchant leur reproduction, différent type existent : les neurotoxiques, les

régulateurs de croissance et ceux agissant sur la respiration cellulaire.

les herbicides agissent contre les mauvaises herbes, ils possèdent différents modes

d’action, ils peuvent être des perturbateurs de la régulation d’une hormone, de la

photosynthèse ou encore des inhibiteurs de la division cellulaire, de la synthèse des

lipides, de cellulose ou des acides aminés.

les fongicides utilisés pour protéger les plantes contre les champignons, ils

interviennent soit en inhibant le système respiratoire ou la division cellulaire soit en

perturbant la biosynthèse des acides aminés, des protéines ou le métabolisme des

glucides.

Il y’a d’autres groupes moins utilisés que les trois grandes classes cités, comme les

rodonticides, les némanticides...

La nature chimique des substances actives :

Les pesticides organochlorés (POC) sont des composés organiques comportant au

moins un atome de chlore lié à un atome de carbone. Ce sont les premiers pesticides

12

organiques synthétiques utilisés en agriculture. Ils sont connus pour leur persistance

dans l’environnement et leur toxicité très élevée (Totten et al., 2004 ; Jiang et al.,

2009). Ils ont des demi-vie allant de 3à 20 ans (Lintellman et al., 2003). Les POC ont

un fort potentiel de bioaccumulation et de bioamplification dans les tissus biologiques

et peuvent même poser des risques pour les êtres humains par le biais de la chaîne

alimentaire (Guo et al., 2014).

Fig1. Structure chimique de deux organochlorés dérivés du DDT

Les pesticides organophosphorés (OP) sont des composés organiques comportant au

moins un atome de phosphore lié directement à un atome de carbone. Ils ont été

synthétisés pour remplacer les pesticides de 1ère

génération (les organochlorés) vu

leurs toxicité très élevée et leurs persistance dans l’environnement. Les pesticides

organophosphorés sont liquides, faiblement volatils, légèrement solubles dans l’eau et

possèdent des coefficients de partage huile-eau élevés (Who, 1986). Les OP ont une

toxicité à court terme contrairement aux pesticides organochlorés persistants. Les OP

ont cependant des toxicités aiguës supérieures à celles des pesticides chlorés, mais ils

vont être d'avantage dégradés et plus rapidement dans l'environnement. Leurs effets

toxicologiques sont pour la plupart due à l'inhibition de l'acétylcholinestérase dans le

système nerveux (Goh et al., 1990).

Les pesticides carbamates sont des composés organiques porteurs d'une

fonction esters substituée de l'acide carbamique ou d'un amide substitué. Les

carbamates sont également des inhibiteurs de cholinestérase avec un mécanisme

d'action similaire aux organophosphorés (Fukuto, 1990). Ils sont très biodégradables et

donc moins persistants dans l'environnement que les autres classes de pesticides (les

pyréthrinoïdes, organophosphorés et organochlorés). Ils sont dangereux pour

l'environnement et la santé humaine parce qu’ils sont des toxines du système nerveux

13

central et perturbateurs endocriniens fortes, affectant les humains et les animaux à

faible dose.

Une nouvelle classification selon les propriétés chimiques (Gevao et al., 2000) :

Pesticides non ioniques tel que les organochlorés, les organophosphorés, les

dinitroanilides et les carbanilates…

Pesticides ioniques cationiques basiques acides et autres…

Les pesticides améliorent les profits de l'agriculture par la diminution des pertes de récoltes

dues aux menaces phytosanitaires (insectes ravageurs, mauvaises herbes, champignons,

rongeurs…). Cependant, les pesticides, sont des poisons, peuvent mettre en danger la santé

humaine et des animaux (Fabro et Varca, 2012). En outre, les risques potentiels pour

l’Homme et la faune sont causés par des résidus de pesticides persistants, ainsi leur capacité à

s'accumuler dans la chaîne alimentaire pose une grande menace pour la santé humaine et

l'environnement mondial (Levitan, 2000; Fabro et Varca 2012). L’utilisation excessive de

certains pesticides a entrainé le développement de résistances des ravageurs. L’apparition de

ces résistances a conduit à la fabrication de nouvelles générations de pesticides, d’où un

nombre important de molécule et une grande diversité de matières actives utilisées.

a. Ecosystème aquatique : Réceptacle des polluants agricoles

Après l’application des pesticides sur les champs, et suite au phénomène d’érosion, les résidus

restant se retrouvent dans les eaux de ruissellement (Chang et al., 2006), selon différents

processus diffusion, désorption, dissolution (Lazartigues, 2010). Un écosystème aquatique,

marin ou d’eau douce, abrite des organismes vivants. Ces derniers interagissent entre eux et

aussi avec leur milieu. Les écosystèmes aquatiques sont formés d’une colonne d’eau abritant

les organismes pélagiques et d’une interface eau/sédiment abritant les organismes benthiques

(Lambshead et Schalk, 2001). Au niveau de la colonne d’eau les pesticides sont

biodisponibles (Guo et al., 2008 ; Phyu et al., 2006), ils se bioaccumulentdans les organismes

pélagiques (Galvao et al., 2012; Szlinder-Richert et al., 2008 ; Miranda et al., 2008). Aussi

ils s’adhérent aux particules sédimentaires en suspension dans l’eau (Warren et al., 2003) qui

vont ensuite sédimenter et se bioaccumuler dans les sédiments (Choi et al., 2014 ; Masiá et

al., 2013 ; Smalling et al., 2013 ; Wang et al., 2013 ; Zhao et al., 2009 ; Darko et al., 2008).

Plusieurs travaux ont déterminé la contamination des écosystèmes aquatiques par les

14

pesticides agricoles de part le monde. La concentration et le devenir des pesticides

organochlorés dans les sédiments de surface de l'estuaire des rivières Erh-jen et Lan-yang à

Taiwan ont été étudiés par Chang et Doong en 2006. Ces travaux ont montré une

contamination de ces écosystèmes par les hexachlorocyclohexanes (HCH) et les

Dichlorodiphényltrichloroéthanes (DDT) provenant des zones agricoles. Des concentrations

significativement élevées des pesticides ont été détectées dans les poissons d’élevage en mer

de Chine (Guo et al., 2008). Une contamination élevée a été déterminée chez des espèces de

bivalves marins collectés sur les côtes de Rio de Janeiro au Brazil (Galvao et al., 2012).

Malgré leur interdiction depuis les années 70, les pesticides organochlorés notamment le DDT

et leurs dérivés sont encore omniprésents dans les matrices environnementales (Guo et al.,

2008 ; Galvao et al., 2012). Ces derniers sont très connus pour leur toxicité élevée suite à

leurs bioconcentration, bioaccumulation et bioaugmentation le long de la chaine trophique des

écosystèmes aquatiques (Siriwong et al., 2009, Warrena et al., 2003).

Fig 2. Mode de transfert des pesticides dans l’environnement

La figure 3 montre le devenir des pesticides et des contaminants micro-organiques (MOC)

dans le milieu aquatique dés l’introduction des contaminants micro-organiques dans l’eau de

mer ils seront biodisponible pour le pélagos. Ensuite ils s’adhèrent au sédiment en suspension.

Enfin ils arrivent au fond et se diffusent dans le sédiment de fond (Warrena et al., 2003).

15

Fig 3. Devenir des pesticides et des contaminants micro-organiques (MOC) dans le

milieu aquatique (Warrena et al., 2003)

b. Propriétés physico-chimique des pesticides

Les pesticides sont considérés parmi les contaminants environnementaux les plus dangereux

en raison de leur tendance à la bioaccumulation, de leur persistance, de leur mobilité et de

leurs effets à long terme sur les organismes vivants (Nowell et al., 2014 ; Andreu et Picó,

2012). Le coefficient de partage carbone organique/eau et le temps de demi-vie des matières

actives des différents pesticides assurent leurs biodisponibilité (Worrall et Kolpin, 2004).

La demi-vie est le temps nécessaire pour qu’une matière active perde la moitié de son activité

pharmacologique ou physiologique. Le coefficient de partage carbone organique/eau (Koc)

nous renseigne sur l’aptitude de la molécule à être adsorbée ou désorbée sur la matière

organique : Les matières actives représentant un Koc élevé sont fortement adsorbées et

retenues à la surface du sol donc elles seront moins lessivées, donc elles ne seront transportées

dans le milieu aquatique que par érosion (Willis et al., 1983). Les molécules aux faibles Koc

vont être retrouvées avec les plus fortes concentrations dans la phase aqueuse du

ruissellement. (Klöppel et al., 1997 ; Klöppel et al., 1994 ; Southwick et al., 1997 ; Wauchope

et al., 1978 ; Wauchope et al. 2002). En arrivant dans les écosystèmes marins les pesticides

sont biodisponibles (Siriwong et al., 2009, Warrena et al., 2003). La biodisponibilité de ces

Source et transport de

MOCs

Ecotoxicologie et

biodisponibilité de MOCs

Occurrence de

MOC

Air

Eau Dégradationde

MOC Lumière

Bactéri

e

Réactifs

chimiques

Association de MOCs avec

le sédiment

Transport de MOC sur

le sédiment suspendu

Diffusion de MOC dans

le sédiment Influence de bioturbation

sur MOCs

Oligochètes

16

contaminants augmente suite à la biotransformation de ces molécules par les biofilms

microbiens (Widenfalk et al., 2008).

I.2. Polluant d’origine industrielle : HAP et PCB

a. Contamination des écosystèmes par les HAP

Les hydrocarbures peuvent être classés en trois familles :

les hydrocarbures saturés, qui ne possèdent pas de double ou de triple liaison ; ils

peuvent être linéaires (alcanes ou paraffines), ramifiés (isoparaffines) ou cycliques

(cycloalcanes, appelés aussi naphtènes).

les hydrocarbures insaturés, qui possèdent une ou plusieurs doubles liaisons (alcènes)

ou triple(s) liaisons (alcynes), les hydrocarbures (poly)insaturés, alcènes, sont

principalement d’origine biogénique, synthétisés par des organismes vivants.

Les hydrocarbures aromatiques, qui comportent un cycle aromatique (composés

monoaromatiques) ou plusieurs cycles aromatiques (composés polyaromatiques), une

description plus précise des hydrocarbures polyaromatiques sera présentée

ultérieurement.

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des composés benzéniques dont le

nombre des cycliques est variable. L’arrangement des anneaux de benzènes diffère aussi

d’une molécule à l’autre (Blumer, 1976). Ces deux critères permettent de distinguer des HAP

de faible poids moléculaire (LMW-HAP), dont la masse molaire est comprise entre 150 et 180

g mol-1

(moins de quatre cycles aromatiques), des HAP de haut poids moléculaire (HMW-

HAP) dont les masses molaires varient au delà de 200 à 280 g mol-1

(au moins quatre cycles

aromatiques) (Bouchez et al., 1996). Ces molécules sont ubiquistes dans l’environnement.

Deux sources d’HAP sont connues dans l’environnement soit pyrogéniques ou pétrogéniques.

Les sources pyrogéniques proviennent de la combustion de combustibles fossiles brute, de la

combustion incomplète de matière organique (par exemple le charbon, le pétrole, le bois). Les

sources pyrogènes comprennent aussi les opérations industrielles et des centrales électriques,

de l’utilisation de combustibles fossiles, la fusion, d’incinérateurs de déchets, gaz

d'échappement des véhicules à l'essence ou diesel, et d’incendies de forêt. La plupart des HAP

pyrogènes sont émis dans l'atmosphère sous forme de suies ou de gaz. Ils se retrouvent en

milieux marins suite aux retombées atmosphériques directe et aux ruissellements de surface

(Boonyatumanond et al., 2006). Les sources pétrogéniques sont le pétrole brut et les produits

pétroliers (le kérosène, l'essence, le carburant diesel, l'huile de lubrification, et de l'asphalte)

17

qui pénètrent dans l'environnement aquatique par les déversements direct d'hydrocarbures, ou

dans l’eau de ballast (Boonyatumanond et al., 2006) et les suitements naturels (Safronov et

al., 2014).

Les HAP ont des propriétés physico-chimiques qui les rendent persistants dans

l’environnement. A l’exception du naphtalène, leur solubilité dans l’eau est très faible.

Parallèlement, leurs coefficients de partage octanol/eau (Kow) sont relativement élevés,

témoignant d’un important potentiel de bioconcentration dans les organismes. Plusieurs

travaux ont prouvé la contamination des écosystèmes aquatiques par les HAP. Ils sont

présents dans les sédiments un peu partout dans le monde avec des teneurs plus ou moins

élevées. Ils ont été retrouvés dans les sédiments de Caleta Cordova, Patagonia en Argentina

(Isaac et al., 2013), de Sydney Harbour, en Nouvelle-Écosse (Smith et al., 2009) et du golfe

de Lion en France (Domine et al., 1994). Une étude analytique des HAP dans les sédiments

côtiers, de la mer Caspienne et des zones humides d’Anzali menée en 2010, a montré que les

concentrations de HAP totaux se situaient entre 212 et 9009 ng.g-1

ms (Yancheshmeh et al.,

2014). Les mêmes concentrations ont été reportées pour les sédiments du sud-ouest de la mer

de Barents (Boitsov et al., 2009). La variation des concentrations des HAP dans les sédiments

collectés de différents sites de Hamilton Harbour a été investiguée par Slater et al., (2008). Ils

ont montré la contamination élevée de plusieurs sites. En Tunisie plusieurs travaux ont montré

la contamination de la lagune de Bizerte par les HAP (Mzoughi et al., 2002 ; Trabelsi et

Driss, 2005 ; Ben Said et al., 2010).

18

Fig 4. Structures chimiques des 16 HAP prioritaires de la liste de l’Agence Américaine de

l’Environnement

b. Contamination des écosystèmes par les PCB

Les PCB sont des molécules exclusivement synthétiques. Ils sont formés essentiellement de

deux atomes de phényls. Ces contaminants proviennent essentiellement des rejets industriels

puisqu’ils sont présents dans les retardateurs de flammes. Ils ont été synthétisés la première

fois en 1881 (Schmidt et Schultz 1881), mais la production de ces composés a fortement

augmenté en 1960. Une enquête a été effectuée par Breivik et al. (2002) afin d’estimer les

quantités de PCB produites dans le monde, elle atteint un total d’environs 1,3 106 tonnes. La

distribution de la consommation de ces quantités dans les différents pays est présentée sur la

figure 4. Les PCB sont inertes chimiquement, très peu inflammables, très peu soluble dans

l’eau. Par contre, ils sont très solubles dans les solvants organiques. Ces propriétés physico-

chimiques leur donnent une résistance à l’oxydation et aux fortes températures, d’où leurs

utilisations intensive dans l’industrie. Ces mêmes propriétés qui les ont rendu très utiles dans

19

l’industrie, leur confère un effet néfaste sur l’environnement (Leaute, 2008). Les écosystèmes

aquatiques recevant des rejets industriels sont contaminés par les PCB à des degrés différents.

Les PCB ont été détectés dans l’eau, le sédiment et des espèces animales de la rivière Arrone

en Italie (Bazzanti et al., 1997) et la lagune de Terminos au Mexique (Carvalho et al., 2009)

ainsi que dans les sédiments de l’aire protégé le lake Qarun en Egypte et dans les sédiments et

les moules collectés de l’étroit des côtes de Istanbul en Turquie (Okay et al., 2009).

Fig 5: Estimation de la consommation mondiale cumulée de PCB (légendes en tonnes)

(Breivik et al., 2002)

I.3. Réglementation et normes

La littérature scientifique a montré que les résidus de pesticides et HAP peuvent affecter la

santé humaine. Les pesticides provoquent une toxicité neurologique aigue, un

dysfonctionnement des systèmes immunitaire, de reproduction et endocrinien. L’exposition

aux pesticides peut être la cause de développement de cancer. Les HAP sont mutagènes et

carcinogènes (Shabad, 1973). Ainsi la prise de conscience croissante du public concernant

l’utilisation des pesticides et la réglementation dans les années 1970 et 1980 ont donné lieu à

l'interdiction de nombreux pesticides traditionnels tels que le DDT et la plupart des

organochlorés. Ceci a conduit à la mise au point et l'homologation d’une nouvelle génération

moins persistante telle que les organophosphorés (Andreu et Picó, 2012).

20

Plusieurs organisations de santé et de protection de l'environnement, tels que le Centre

international de recherche sur le cancer et l'Agence de Protection Environnementale ont classé

presque tous les POC comme potentiellement cancérogènes pour l'homme (2B) et les PCB

comme cancérogène probable (2A) pour l'homme (IARC, 1991; USEPA, 1996 ; Çok et al.,

2012). Selon ces mêmes organisations, plusieurs HAP sont mutagènes, cancérogènes et ils ont

des propriétés de perturbation endocrinienne (IARC, 1983; USEPA, 1984; Çok et al., 2012).

La Convention de Stockholm sur les polluants organiques persistants (POP), qui est entrée en

vigueur en 2004, exigent l’élimination ou la réduction des rejets dans l'environnement de

plusieurs pesticides organochlorés, à savoir l'aldrine, le chlordane, DDT, dieldrine, endrine,

heptachlore, hexachlorobenzène, mirex, toxaphène, le chlordécone, l’hexachlorocyclohexane,

le lindane et le pentachlorobenzène. Certains de ces pesticides, comme le DDT, sont encore

permis pour certaines applications et sont donc encore en mesure de contaminer

l'environnement.

Plusieurs normes ont été élaborées par les centres de recherches en environnement. Parmi

celles-ci, les normes américaines NOAA (Administration Océanique et Atmosphérique

Nationale) en déterminant le niveau du seuil d’effet appelé TEL (threshold effects level), le

niveau d’effet probable PEL (Prabable effect level) et d’autres normes dans le sédiment marin

et d’eau douce, dans l’eau et le sol pour les HAP, pesticides et autres polluants (NOAA,

1999).

21

Tableau1. Seuil d’effet TEL (threshold effects level) de quelques HAP et Pesticides selon les

normes américaines déterminées par l’Administration Océanique et Atmosphérique Nationale

(NOAA). (NOAA, 1999)

TEL Sediment marin

(ng.g-1

ms)

Sediment d’eau douce

(ng.g-1

ms)

HAP:

Acenaphtène

Acenaphtylène

Anthracène

Benzo[a]pyrène

Benz[a]anthracène

Chrysène

Dibenz[a,h]anthracene

Fluoranthène

Fluorène

Naphtalène

Phénanthrène

Pyrène

Pesticides:

Chlordane

p,p DDD

p,p DDE

p,p DDT

DDT total

Dieldrin

Endrin

Lindane

6,71

5,87

46,85

88,1

74,83

107,77

6,22

112,82

34,57

86,68

152,66

2,26

1,22

2,07

1,19

3,89

0,715

0,32

31,9

31,7

57,1

111

21,17

41,9

53

4,5

3,54

1,42

6,98

2,85

2,67

0,94

22

II. Biosurveillance des écosystèmes aquatiques

II.1.Importance du Benthos dans la biosurveillance des écosystèmes aquatiques

a. Sédiment

Le sédiment est un dépôt de matériel meuble d’origine minérale ou biogène qui subit des

processus de diagenèse pour constituer une roche sédimentaire. Les particules solides de

sédiment dans les milieux côtiers sont constituées au moins de 1% de matière organique

provenant de la décomposition des organismes aquatiques (Azandegbe, 2010) et de l’apport

continental qui constitue la principale source d'énergie pour la vie dans la mer profonde

(Smith et al., 2008). L’élément majeur de la matière organique est le carbone organique total

(Leaute, 2008). Le sédiment est aussi le lieu où se déroulement plusieurs cycles

biogéochimiques comme ceux du carbone, de l’azote, du soufre et du phosphore. Les cycles

biogéochimiques du fer et du carbone organique sont fortement interdépendants, le fer est un

facteur clé dans le stockage à long terme du carbone organique (Lalonde et al., 2012). Des

considérations thermodynamiques et géochimiques indiquent que les cométabolismes

microbiens sont susceptibles de jouer un rôle crucial dans le cycle sédimentaire du carbone

organique (Prokopenko et al., 2013). Le rôle des flux de la matière organique dissoute

benthique dans les cycles océaniques de carbone et d'azote est important. Elle a un rôle dans

la préservation du carbone (Burdige et Komada, 2015). Le sédiment est soumis à des

mouvements de remise en suspension. La vitesse de la remise en suspension du sédiment

augmente en proportion directe avec la vitesse du vent, ceci est en relation avec les

paramètres des vagues (hauteur des vagues et densité de l'énergie des vagues). Avec la hausse

du vent de surface, une augmentation correspondante de la concentration et de la taille des

particules de la matière particulaire en suspension est observée dans la colonne d'eau (Zheng

et al., 2015).

b. Benthos

Le benthos désigne l’ensemble des organismes qui vivent dans le sédiment et à l’interface

eau-sédiment. On distingue le phytobenthos (végétaux benthiques) et le zoobenthos (animaux

benthiques). Ce dernier est subdivisé en trois groupes : le macrobenthos, visible à l’œil nu de

taille supérieure à 1 mm, le méiobenthos, de taille comprise entre 40 et 100 µm visible sous

loupe binoculaire et le microbenthos, de taille inferieure à 63 μm nécessitant la microscopie

23

pour leur visualisation. Le benthos joue un rôle dans la chaine trophique benthique et il a aussi

un rôle comme témoins des variations environnementales et des perturbations anthropiques

(Guidi-Guilvard et Dallot, 2014 ; Walters et al., 2014 ; Losi et al., 2013 ; Moreno et al.,

2011). Le benthos subit une variété de perturbations qui peuvent être occasionnelles, telles les

tempêtes benthiques, les flux de turbidité, les changements de locaux et l’abondance de

certaines espèces. Ces différents processus ont des répercussions importantes sur les

assemblages benthiques (Jumars et Wheatcroft, 1989).

Le microbenthos est représenté par les bactéries qui sont les organismes les plus anciens sur

Terre. Elles sont présentes dans pratiquement tous les environnements et sont abondants dans

tous les écosystèmes aquatiques. Les processus microbiens jouent un rôle primordial dans le

fonctionnement des écosystèmes. Les communautés bactériennes dépendent des facteurs

abiotiques tels que les nutriments et le carbone qui servent de ressources pour leur

métabolisme énergétique. De nombreuses réactions biogéochimiques se produisant dans les

sédiments marins sont catalysées par les communautés complexes de bactéries.

L’identification des microorganismes spécifiques à des transformations chimiques bien

déterminées a été un défi pour les microbiologistes, car les microorganismes manquent

généralement de détails morphologiques et sont donc beaucoup plus difficile à identifier que

les macro-organismes. Contrairement à leur gamme étroite de morphologies, les micro-

organismes sont génétiquement très diversifiés. Cette diversité génétique a été récemment

exploitée pour l'identification in situ des cellules microbiennes individuelles, et même de leurs

activités biochimiques. Ceci permet aux scientifiques d’utiliser des outils basés sur les acides

nucléiques tels que le clonage, le séquençage et l'hybridation permettant l’analyse de la

diversité, de la structure et des fonctions des communautés microbiennes (MacGregor et al.,

2003).

En écotoxicologie, l’évaluation de la qualité des milieux aquatiques se base sur des analyses

chimiques par dosage des contaminants, mettant en oeuvre des biomarqueurs ou des

bioindicateurs. Les bio-indicateurs sont des organismes biologiques animaux ou végétaux qui

donnent des indications sur la présence ou l’effet de xénobiotiques. L’effet des xénobiotiques,

direct ou indirect, peut être évalué par la disparition de certaines espèces sensibles ou, au

contraire, par la prolifération d’espèces résistantes (Fleeger et al., 2003). La meiofaune, en

général, et particulièrement les nématodes libres marins, sont des bioindicateurs. La

méiofaune, vivant à l’interface eau/sédiment et dans les premiers centimètres du sédiment,

regroupent différents taxons : les nématodes, les oligochètes, les polychètes, les copépodes et

24

d’autres. Les nématodes libres marins sont des vers ronds, pseudo-coelomates, insegmentés,

circulaires et recouverts d’une cuticule. Les nématodes représentent le taxon le plus diversifié

du règne Animal avec un intervalle estimé de 0,1 à 100 millions d’espèces (Meldal et al.,

2007). Ils sont utilisés comme bioindicateurs de la pollution. Parmi le benthos, les nématodes

libres marins témoignent les perturbations environnementales. Ils ont été utilisés comme des

bioindicateurs dans de nombreuses études écotoxicologiques, ce choix est dû à leurs

avantages par rapport aux autres taxons méiobenthique (Aissa, 1991) :

Les nématodes sont les métazoaires les plus abondants dans les sédiments marins, ils

représentent avec les formes parasites jusqu’à 95% du domaine benthique en substrats

meubles et ils sont qualifiés d’animaux ubiquistes

Ils possèdent des cycles vitaux particulièrement courts sans phases larvaires

planctonique

Leur taille minuscule ne nécessite pas de grandes enceintes

Les nématodes ont un rôle bioturbateur, ils sont les plus actifs, avec les ostracodes, parmi les

différents taxons méiobentiques. Ils creusent des galeries et brassent le sédiment favorisant

ainsi l’oxygénation des strates les plus profondes (Fig 6) (Cullen, 1973 ; Aissa 1991).

Fig 6. Réseau complexe de terriers de nématodes rapprochés dans le sédiment, vu à travers la

paroi latérale du verre de réservoir aquarium (Cullen, 1973).

Les nématodes ont aussi un rôle important dans la minéralisation de la matière organique.

Cette dernière joue un rôle crucial dans le cycle biogéochimique du carbone dans les

écosystèmes marins, fournissant ainsi la principale source de nourriture pour le benthos d'eau

profonde. Les sources de la matière organique sont différentes. Elle provient des détritus

exogène et les détritus endogène issue de la dégradation des organismes animaux ou végétaux

morts ou des excréta des animaux s’accumulant sur le fond (Aissa, 1991). La composition

25

chimique des particules organiques change lors de l'immersion à cause de leur colonisation et

la consommation par des bactéries hétérotrophes, de sorte que leur teneur en matière

organique labile est largement utilisé avant qu'ils n’atteignent le fond en haute mer. En

revanche, les particules de grande taille telles que les boulettes fécales, les phytodétritus et les

macro-agrégats ont un fort taux de sédimentation et atteignent le fond de la mer en subissant

seulement quelques petites modifications chimiques (Danovaro et al., 2000). Les

communautés microbiennes benthiques jouent le rôle le plus important dans la minéralisation

de la matière organique présente dans le sédiment (Jorgensen, 1982). Les nématodes libres

marins contribuent aussi dans le processus de décomposition de la matière organique, ceci a

été révélé par l’augmentation particulière de la densité nématologique à l’intérieur des feuilles

en décomposition (Odum et Heald, 1972).

c. Inter-relation : bactérie-nématode libres marins et chaine trophique dans le

milieu marin

Les communautés bactériennes et méiofaunistiques jouent un rôle essentiel dans la

reminéralisation de la matière organique (Odum et Heald, 1972 ; Jorgensen, 1982). Les inter-

relations trophiques benthiques sont plus complexes dans les zones côtières que dans les

océans ouverts (Graf, 1992). Ces communautés sont structurées par des relations de

compétition et de prédation. Les communautés benthiques dépendent de leur nourriture

essentiellement la matière organique particulaire, qui est principalement dérivé de couche

supérieure productive du phytoplancton (Cocito et al., 1990 ; Pape et al., 2013). Le

métabolisme de l'écosystème est intimement lié au flux du carbone et d'azote des producteurs

primaires aux consommateurs de niveaux trophiques supérieurs (Gillies et al., 2012 ; Pape et

al., 2013 ; McTigue et Dunton, 2014). Ce transfert trophique détermine la productivité des

écosystèmes en fonction de la structure et l'efficacité des réseaux trophiques. Ainsi les

bactéries essentiellement et les nématodes libres marins interviennent dans la minéralisation

de la matière organique (Jorgensen, 1982 ; Aissa, 1991 ; Pape et al., 2013). Les nématodes

libres marins bactériophages appartenant aux groupes trophiques microvores et déposivores se

nourrissent des bactéries benthiques (Moens et Vincx, 1997 ; Pape et al., 2013). Ainsi la

méiofaune en général et les nématodes libres marins en particulier assurent un lien entre le

microbenthos et le macrobenthos (Fig 7) (Moens et Vincx, 1997).

Selon Leguerrier, (2005) l’inclusion de la méiofaune et plus précisément les nématodes libres

marins dans le réseau trophique microbien se fait essentiellement via :

26

La prédation directe sur les bactéries dont elles peuvent stabiliser la croissance

La prédation sur les protozoaires l’excrétion de mucus qui peut être colonisé par des

micro-organismes consommé en retour

La bioturbation provoqué qui peut entre autre augmenter la profondeur de la couche

oxique

Les produits d’excrétion qui servent de nourriture aux micro-organismes, voir les

relations de symbioses entre méiofaune et microfaune.

Fig 7. Réseau trophique benthique (Leguerrier, 2005)

II.2. Impacts des polluants sur les communautés benthiques

Les communautés benthiques ne sont pas indifférentes à l’accumulation des polluants dans le

sédiment. La présence de ces polluants impacts la diversité du benthos tel que les

communautés bactériennes (Guo et al., 2015 ; Korlevic et al., 2015 ; Louati et al., 2013) et les

nématodes libres marins (Louati et al., 2013 ; Mahmoudi et al, 2005 ; Soltani et al., 2012)

ainsi les micoorganismes créent des gènes de résistances à ces polluants organiques et

interviennent dans leur biodégradation (Louati et al., 2011 ; Parellada et al., 2013 ; Wang et

al., 2015). La contamination des écosytèmes aquatique impact les communautés biologiques

ainsi elle provoque l’élimination des espèces sensibles la prolifération des espèces résistantes

27

et l’adaptation d’autres espèces qui diminue d’abondance au début de la contamination après

ils s’adaptent et reviennent à l’abondance normale (Duran et al., 2015 ; Louati et al., 2013 ;

Mahmoudi et al., 2005 ; Soltani et al., 2012).

II.3. La biodiversité bactérienne

L’écologie microbienne décrit la variabilité des microorganismes selon trois niveaux

(génétique, spécifique et écosystémique) intégrant les interactions entre les microorganismes

et les interactions entre microorganismes et leur environnement. La biodiversité alpha désigne

le nombre d'espèces dans un milieu donné. La biodiversité bêta, qui correspond au taux de

remplacement des espèces le long d'un gradient (par exemple climatique, spatial, d'altitude),

au sein d'une région donnée. La diversité gamma, qui correspond à la distribution spatiale des

espèces dans un écosystème. Les informations concernant la composition ou la distribution

taxonomique sont consignées sous forme de matrices croisant des échantillons et des taxons.

Selon le niveau d’inventaire réalisé, il peut s’agir de matrices de présence - absence

(composition) ou de matrices où figurent les abondances relatives (distribution taxonomique)

(Meisterhans, 2012). Le traitement des données de la matrice donne des indices de diversité.

Les indices permettent à l’écologiste d’interpréter et de comparer la diversité à différents

niveaux spatial et temporel. Selon Meisterhans (2012), les indices de Fisher (Fisher et al.,

1943) et de Margalef (Margalef, 1951) sont peu utilisés car basés seulement sur la richesse

taxonomique de la communauté (Krebs, 1998). Par contre, les indices de Simpson (Simpson,

1949) et de Shannon (Shannon et Weaver, 1963) sont les plus utilisés. Pour comparer les

échantillons deux à deux en calculant le pourcentage de ressemblance entre les communautés.

La comparaison des matrices de présence/absence de taxons dans les échantillons donne les

indices de Jaccard (Jaccard, 1912) ou de Sorensen (Sorensen, 1948). Alors que la

comparaison des matrices d’abondance relative des taxons présents dans les échantillons

comme l’indice de Bray-Curtis (Bray et Curtis, 1957) ou l’indice de Czekonowski

(Czekonowski, 1909).

L’interaction entre la biodiversité et le fonctionnement des écosystèmes en milieu marina

toujours attiré l’attention des scientifiques. Les indices de diversité permettent d’estimer les

effets sur l'écosystème à partir des caractéristiques structurelles des communautés fauniques

et leur fonctionnalité. Les modifications de la biodiversité induites par le changement

climatique et les activités anthropiques, permettent d’appréhender les relations

structure/fonction.

28

Les premières études qui ont considéré l’ARN ribosomal comme marqueur de l’évolution

bactérienne ont divisé le monde vivant en trois domaines : Eucarya, Bacteria et Archaea

(Woese et al., 1987, Woese et al., 1990). Les travaux de Zuckerand et Paulling (1965), ont

commencé l’étude de la biodiversité du monde bactérien et les techniques de phylogénie

moléculaire, après l’utilisation de méthodes classiques d’enrichissement et d’isolement. Ces

méthodes donnent des résultats partiels à cause de la faible cultivabilité des microbes (Ward

et al., 1990). Le concept d’écologie microbienne a commencé avec les travaux de Oslen et

al., (1986) ainsi que Pace et al., (1986). Parmi les techniques moléculaires pertinentes,

utilisées en écologie microbienne, toutes basées sur la réaction en chaine par polymérase

(PCR), les approches d’empreintes moléculaires comme le polymorphisme de longueur des

fragments de restriction terminaux (TRFLP) permettent la comparaison des structures des

communautés microbiennes, et le séquençage de nouvelle génération comme le

pyroséquençage et le MiSeq donnent un inventaire exhaustif des microorganismes présents.

a. Techniques moléculaires en écologie microbienne

Les développements récents des techniques moléculaires ont permis d'étudier la diversité et

l'activité des communautés bactériennes dans divers écosystèmes. Ces techniques sont basées

sur la détection d'acides nucléiques à l'intérieur des cellules vivantes ou après extraction

directement de l’échantillon. Plusieurs techniques empreintes digitales d’ADN, hybridation et

techniques analytiques basées sur la PCR peuvent être mises en œuvre. Les techniques

moléculaires ont été conçues pour contourner les limitations associées aux méthodes

microbiologiques traditionnelles. L'utilisation de méthodes moléculaires a grandement

contribué à une compréhension globale de la microbiologie des systèmes écologiques. Les

techniques moléculaires ont servi d'outils de surveillance pour suivre les changements et les

réponses des communautés bactériennes à un traitement donné. Ainsi, les corrélations entre la

composition de la communauté microbienne et la capacité de biodégradation ont pu être

déterminées (Abed, 2009). Les méthodes moléculaires ont permis un nouvel aperçu dans la

composition de la communauté microbienne et élargir les questions écologiques qui peuvent

désormais être abordées. Malgré les progrès, la diversité de la plupart des communautés

microbiennes sur Terre reste inexplorée (Neufled et al., 2006). Il est important d'estimer la

diversité microbienne avec précision afin de réaliser des analyses comparatives entre diversité

microbienne et les différents paramètres environnementaux. Les connaissances acquises par

les techniques moléculaires ont facilité la sélection de microorganismes appropriés pour la

29

conception de traitements de bioremédiation (Chaerun et al., 2004). Les avantages ainsi que

les inconvénients de chaque technique sont présentés ci-dessous (d’après Jung et Kang, 2014).

Empreintes moléculaires

Les techniques d’empreintes dans l’écologie microbienne permettent la séparation des espèces

en fonction de leur séquence d’ADN. Elles associent une identification moléculaire de la

microflore basée sur la séquence des gènes l’ARNr 16S. Les empreintes moléculaires

permettent de caractériser, sans mise en culture, la diversité d’une microflore, de comparer

des microflores semblables, d’en suivre la dynamique. Ainsi une communauté microbienne

est représentée par un profil où chaque pic correspond à une séquence et par extension à une «

espèce » de microorganisme, l’aire de chaque pic donnant une indication sur son abondance

relative. Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (TRFLP) est

un exemple de technique d’empreinte moléculaire accessible et relativement peu coûteuse

(Cao et al., 2013). Cette technique a été initiée par Liu et al. en 1997 puis s’est

considérablement développée au cours de la dernière décennie, elle est robuste et très utilisée

pour comparer les communautés microbiennes (Culman et al., 2008).

Ces techniques donnent une information rapide et globale sur la structure et l’évolution des

écosystèmes microbiens. L’inconvénient des techniques d’empreintes est qu’ils n’arrivent pas

à identifier les souches bactériennes à partir des séquences d’ADN déterminées.

Séquençage

Le séquençage Sanger, dit de première génération, produit quelques centaines de séquence

d’une longueur d’environ 1000 pb, les nouvelles générations de séquençage génèrent de 106

jusqu’à 109 séquences d’une taille allant de 100 à 700 pb (Scholz et al., 2012). Ces

techniques, désignées par les termes séquençage haut débit (HTS pour high-throughput

sequencing), constituent un ensemble de méthodes apparues à partir de 2005, permettant le

séquençage de centaines de milliers de fragments simultanément, à faible coût et en quelques

heures. Elles permettent de s’affranchir des étapes de constitution de banques génomiques.

Leur utilisation en écologie microbienne trouve de nombreuses applications. Les méthodes de

séquençage ont été utilisées pour détecter la diversité bactérienne et la structure de la

communauté dans les différentes matrices environnementales (Basak et al., 2015).La

technologie 454 trouve son application en écologie microbienne à travers le séquençage de

génomes bactériens, l’analyse de diversité de métagénomes sur la base de gènes de référence

30

ou l’analyse de gènes de fonction d’un métagénome. Elle permet d’identifier plusieurs

milliers d’OTU (Unités Opérationnelles Taxonomiques) au sein d’une population

microbienne complexe. L’avantage de la technique 454 par rapport aux autres techniques de

séquençage à haut débit est la taille des séquences (400 pb), plus longue et mieux adaptée à

l’identification des espèces et aux attentes en écologie microbienne (Claesson et al., 2010).

Aussi elle a l’avantage de séquencer en même temps, et en une seule lecture un certain

nombre d’échantillon par l’incorporation de la séquence barecode sur les amorces (Lu et al.,

2014). La première étape est l’obtention de fragments simple brin (sb) par fragmentation de

l’ADN génomique (ex : par nébulisation) ou PCR des gènes d’ARNr 16S (Theodorakopoulos,

2013). Deux adaptateurs (A et B) sont fixés par légation aux deux extrémités de ces

fragments. Ensuite, les fragments d’ADNsb sont mis en contact avec des microbilles qui

possèdent en surface des amorces complémentaires à un des adaptateurs et vont ainsi

permettre de fixer une molécule d’ADNsb à la fois. Les microbilles porteuses des brins

d’ADNsb sont mises en émulsion en présence des réactifs pour PCR. Chaque goutte

(microréacteur) englobe une microbille et donc une molécule d’ADN, ce qui permet une

amplification clonale de chaque fragment. L’étape suivante est la PCR en émulsion, qui

consiste à isoler les billes dans des bulles qui servent de microréacteurs. Ainsi, chaque bille

sera couverte par une amplification clonale d’un seul fragment à séquencer. Après la PCR,

des millions de séquences identiques recouvrent ainsi chaque bille. Après amplification, les

microgouttelettes (microréacteurs) sont dissociées, et les microbilles porteuses de l’ADN

simple brin largement amplifié sont transférées dans une plaque en fibre optique contenant 1,4

million de puits. Les puits possèdent un diamètre qui assure le dépôt d’une microbille par

puits. Avec ce système, 400 000 réactions de séquençage peuvent être réalisées en parallèle.

C’est au sein de chacun de ces puits que va se réaliser la réaction de pyroséquençage.

Contrairement à un séquençage de type Sanger, les types de nucléotides (A, T, C, G) seront

rajoutés de manière séquentielle et ce plusieurs fois de suite définissant ainsi le « flow cycle ».

Après chaque ajout d’un nucléotide, un traitement par une apyrase permet d’éliminer le

surplus, puis le nucléotide suivant est incorporé et ainsi de suite. La détermination de la

séquence repose sur la détection d’une émission de lumière résultant de l’incorporation d’un

ou plusieurs nucléotides lors de la polymérisation de l’ADN en utilisant le brin d’ADN fixé

sur la bille comme matrice. Le second adaptateur est utilisé pour initier cette polymérisation.

Si le nucléotide ajouté correspond à celui devant être intégré, il y a libération de

pyrophosphate inorganique. Celui-ci est alors utilisé par l’ATP sulphurylase pour produire de

31

l’ATP. La luciférase utilise cet ATP et la luciférine pour produire de l’oxyluciférine et de la

lumière.

La méthode 454 pyroséquençage est une technique très appliquée pour déterminé la diversité

et la structure de la communauté bactérienne on peut citer les travaux de Dong et al. (2014)

dans la mer de Chine orientale, l’étude de Lu et Lu (2014) dans la rivière Nanxijiang en chine.

Cette technique a réussit l’exploration du microbiota dans une variété d’échantillons

environnementaux comme le sol (Roesch et al., 2007), etles eaux usée (Ye et Zhang 2013).

Cette technique est maintenant de moins en moins utilisée, elle est remplacée par la technique

Illumina. La plate-forme Illumina MiSeq fournit Illumina séquençage à grande profondeur

pour un prix nettement inférieur par rapport à la technique 454 sequençing (Schmidt et al.,

2013).

III. Méthode d’analyse chimique

L’extraction est une étape très importante pour les analyses chimiques. Elle consiste à extraire

les molécules à analyser de la matrice. Lors de l’extraction de matrice solide, les composés

sont libérés de la matrice à l’aide d’un solvant et selon un mécanisme chimique et/ou

mécanique puis transférés dans le milieu d’extraction. Durant cette étape une perte éventuelle

d’une petite quantité de composés se produit. Les chimistes cherchent donc à mettre au point

des méthodes d’extraction plus fiables. La difficulté augmente avec le nombre de composés

ciblés et aussi la diversité des interactions analytes/matrice. Ainsi Le choix de la méthode est

basé surtout sur la fiabilité. Différentes méthodes d’extraction ont été développées comme

l’extraction soxhlet (Itoh et al., 2008), par micro-onde (Letellier et al., 1999 ; Bartolomé et

al., 2005 ; Itoh et al., 2008, Ramalhosa et al., 2012) et par ultrason (Banjoo et Nelson, 2005 ;

Navarro et al., 2009). Elles ont été appliquées sur différentes matrices telles que l’eau de

surface (Villaroel et al., 2014), le sol (Zhou et al., 2013), le sédiment (Bartolomé et al., 2005 ;

Itoh et al., 2008 ; Navarro et al., 2009 ; Hu et al., 2010), les végétaux, les fruits de mer

(Navarro et al., 2009), et pour un très grand nombre de composés organiques tels que les

pesticides (Hu et al., 2010. Navarro-Ortega et al., 2010), les HAP (Bartolomé et al., 2005 ;

Itoh et al., 2008, Hu et al., 2010 ; Navarro-Ortega et al., 2010), les PCB (Bartolomé et al.,

2005 ). Ces méthodes sont utilisées jusqu’à présent, néanmoins de nouvelles méthodes se

développent comme la méthode QuEChERS introduite par Anastassiades en 2003. Les

avantages de cette technique sont la fiabilité, la rapidité et le coût. Cette méthode vise la

fiabilité souhaitée pour un minimum de temps, d’effort et de coût. Elle vise à minimiser la

32

quantité de solvant organique utilisée et le temps nécessaire pour l’extraction. La méthode

QuEChERS a commencé à être appliquée principalement sur les fruits et les végétaux car

c’est une méthode rapide pour tester les aliments. Puis, cette méthode a été adaptée et

optimisée afin de l’appliquer à d’autres matrices (sédiment, sol, eau…).

IV. Présentation de l’écosystème étudié : Complexe Lac Ichkeul-Lagune

de Bizerte

L’extrême nord de la Tunisie, plus précisément la région de Bizerte, est caractérisé par deux

écosystèmes aquatiques, la lagune de Bizerte appelé couramment « elmetzawka » et le lac

Ichkeul ou « Gareat Ichkeul ». Ce dernier constitue, avec jbel Ichkeul et les marais, le parc

national Ichkeul. La superficie totale du bassin versant de la lagune de Bizerte est d’environ

380 km2 dont 150 km

2 de plan d’eau. La profondeur maximale de la lagune est située au

niveau du chenal de navigation et atteint 12 mètres. Le parc national de l'Ichkeul est formé du

lac Ichkeul qui couvre une superficie d’environ de 8 500 hectares, de marais d'une superficie

de 2 737 hectares et d'un massif montagneux culminant à 510 mètres d'altitude.

Le lac Ichkeul est un rare site au monde inscrit sur trois conventions internationales :

- Site Ramsar en 1980

- Réserve de la biosphère de l’UNESCO en 1977

- Site naturel du Patrimoine Mondiale de l’UNESCO en1979.

Il est aussi reconnu comme l’une des quatre principales zones humides du bassin occidental

de la méditerranée.

Fig 8. Carte de la position du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

33

La lagune de Bizerte est la troisième plus grande lagune en Tunisie, elle s’étend sur une

superficie de 150 km2

(Fig 8). La longueur de la lagune est d’environ 13 km et son largueur

est de l’ordre de 11 km. Ce plan d’eau semi fermé communique avec la mer Méditerranée via

un chenal et de l’autre coté elle est en relation avec le lac Ichkeul à travers l’oued Tinja (Fig

9). La lagune reçoit un amalgame de polluants provenant des sources situées au bord de cet

écosystème aquatique. Ce dernier est entouré par deux zones industrielles au niveau des villes

de Menzel Jemil et Menzel Bourguiba, des zones agricoles au sud ouest ainsi qu’au niveau de

Bizerte sud et Menzel Bourguiba, des zones urbaines qui sont de plus en plus populaire ce qui

évoque le problème des eaux usées. L’activité conchylicole est très développée au niveau de

la lagune, elle est aussi une source de pollution.

Le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte est caractérisé par une diversité biologique

considérable, il est connu par une grande production halieutique et aussi aquacole.

Le complexe est alimenté par plusieurs oueds (Fig 9).

Fig 9. Carte du réseau hydrographique (CRDA, 2007)

L’hydrologie du complexe est saisonnière :

- En hiver le lac Ichkeul est alimenté en eau douce par les oueds principalement :

Douimiss (15.106m

3/an), Sejnane (201.10

6m

3/an), Melah (47.10

6m

3/an), Ghezala

29.106m

3/an), Joumine 84.10

6m

3/an), et Tine 51.10

6m

3/an) (ANPE, 2005) d’où

34

une élévation du niveau d’eau, ce qui provoque un déversement en eau vers la

lagune de Bizerte à travers l’oued Tinja.

- En été l’évaporation intense entraine une baisse du niveau d’eau dans le lac et un

arrêt de l’alimentation du lac par les oueds d’où un passage de l’eau lagunaire vers

le lac Ichkeul toujours par l’oued Tinja (M’barek, 2001).

Mais l’apport d’eau continentale par les oueds vers le lac a chuté après la construction de

plusieurs barrages. Les conséquences ont été dramatiques sur la biocénose et le biotope. Pour

réduire les impacts négatifs de ces aménagements hydrauliques sur l’équilibre de

l’écosystème d’Ichkeul, afin de contrôler le niveau d’eau et le débit, l’écluse de Tinja a été

construite à l’embouchure de l’oued Tinja dans le lac Ichkeul (M’barek, 2001). L’ANPE est le

seul responsable de la gestion de l’écluse, la gestion de l’écluse de Tinja est dépendante de la

salinité de l’eau du lac.

Planche 1. Photo de l’écluse de Tinja

35

Planche 2. Photo d’une vanne de l’écluse de Tinja

Avant 2001 la gestion de l’écluse a été dépendante du climat selon les résultats d’un modèle

de prévision qui a été établit au cours de l’étude faite pour le sauvegarde du Parc National de

l’Ichkeul par l’ANPE (1993/1994). Pour cela l’écluse de Tinja est maintenue fermée à partir

du moment (Mars ou Avril) où la salinité moyenne et les niveaux de l’eau du lac sont égaux à

des valeurs critiques qui sont déterminées par le modèle de prévision. Après l’an 2001 il y

avait la mise en eau du barrage de Sidi Barrak. Ce denier permet le transfert d’une partie des

eaux mobilisées vers le barrage de Sedjnane (90Mm3). Une partie ces eaux pourrait être

directement lâchée, en cas de besoin vers l’Ichkeul (M’barek et Shimi, 2002). Dans ce cas

l’écluse sera maintenue ouverte de façon à améliorer le passage des organismes marins

(alevins et juvéniles) à travers l’oued Tinja.

Les résultats de la gestion de l’écluse de Tinja : Les vannes de l’écluse se ferment si les

conditions climatiques sont favorables, la salinité du lac diminue à plus de 19 g L-1

à la fin de

l’hiver (mars et avril) et le niveau de l’eau du lac devient supérieur à 100 cm, les périodes

d’ouverture et de fermeture de l’écluse sont gérées par l’ANPE avec l’aide de la CRDA de

Bizerte, ceci suivant les résultats du modèle de prévision qui permettent d’évaluer le

comportement du lac au cours des 12 mois de l’année en fonction de la salinité et du niveau

de l’eau du lac. Depuis Janvier 2011 l’écluse est en panne et reste ouverte depuis cette date.

La carte des pentes de la région montre que les pentes les plus faibles entourent le complexe

et en s’éloignant de ces deux écosystèmes la pente augmente. Ceci montre, que les deux

36

bassins versants se rencontrent, les eaux de ruissellement et celle des oueds se déversent dans

le lac et la lagune (Fig 10).

Fig 10. Carte des pentes de la région de Bizerte

La lagune de Bizerte connaît une intense activité halieutique très productive (INSTM, 1999 )

(Tableau 2).

Tableau 2: Production halieutique annuelle (kg) au niveau de la lagune de Bizerte (d’après la

Direction Générale de la Pêche et de l’Aquaculture Bizerte, 1999 ; Essid, 2001).

1989 1991 1993 1995 1997 1998

Aiguillette

Anguille

Bigeron

Calmar

Chien de mer

Crevette

Daurade

0

1860

7300

85

1000

4050

2400

0

2056

4879

0

2752

1210

670

828

1437

2684

40

60

386

1438

405

874

7936

1097

0

8640

2588

108

1914

9998

206

1931

1849

5216

293

2928

6280

124

4081

1095

4544

37

Loup

Marbré

Merlu

Muge doré

Pageot

Poulpe

Rascasse

Rouget rouge

Saupe

Seiche

Serre

Sole

Spars

Autres muges

Divers

Total

2860

17770

0

3000

250

1180

70

3100

3330

16090

0

685

8300

0

0

73330

735

17986

124

1486

244

260

0

696

2501

18066

913

650

2187

0

3774

61189

4158

8631

137

48

30

117

61

769

907

14530

553

3127

4482

3846

2834

51103

3976

3415

0

0

0

0

0

6218

228

15451

0

2085

6910

0

5996

65819

2373

8907

0

0

754

17

95

1524

3232

45031

0

1568

10253

2700

3359

101035

2000

19217

0

242

516

203

0

2014

3427

65915

0

2075

8460

347

4347

128108

La lagune de Bizerte souffre du phénomène d’eutrophisation, elle reçoit un amalgame de

polluants provenant de deux zones industrielles : cimenterie, El Fouledh (société Tunisienne

de Sidérurgie) et la STIR (Société Tunisienne des Industrie de Raffinage). Et d’origines

agricoles provenant des zones d’agricultures situées sur le bord de la lagune. La lagune est

aussi soumise à la menace de contamination par les hydrocarbures du trafic maritime intense

du port de Bizerte-Menzel Bourguiba soit pour le chargement et le déchargement de

marchandises ou pour la maintenance et réparation des navires. Malgré le grand nombre des

études écotoxicologiques faites sur la lagune de Bizerte aucune étude ne s’est intéressée aux

pesticides agricoles.

De même le lac Ichkeul n’a fait l’objet d’aucune étude, ni écotoxicologique (à part quelques

donnée sur les métaux) ni microbiologique malgré qu’il reçoit un mélange de polluants

provenant de zones agricoles et de zones urbaines non connectées au réseau d’assainissement.

Le lac reçoit également des hydrocarbures de la lagune de Bizerte à travers oued Tinja. Le lac

constitue donc un site multicontaminé par les pesticides, les métaux et les hydrocarbures.

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52

CHAPITRE II :

MATERIELS ET METHODES

53

CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES

I. STRATEGIE D’ECHANTILLONNAGE :

Notre stratégie d’échantillonnage consiste à considérer deux campagnes de

prélèvements d’eau et de sédiment au niveau du complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte. La

première compagne a été effectuée en septembre 2011 fin de la période sèche et la deuxième

en avril 2012 fin de la période pluvieuse.

Vingt sites ont été prospectés, huit dans le lac Ichkeul et onze dans la lagune de Bizerte ; une

station dans la mer Méditerranée a été considérée comme témoin par rapport à tous le

complexe (Fig 11). La plupart des sites sont situés aux embouchures des oueds qui alimentent

les deux écosystèmes aquatiques. Deux points témoins aux centres du lac et de la lagune, les

sites 4 et 20 sont considérés comme témoins. Les stations du lac ont été choisies par l’ANPE

en fonction des conditions de drainage et des paramètres écologiques au niveau de cet

écosystème. Elles correspondent aux différentes embouchures des oueds alimentant le lac

Ichkeul et une seule station du centre du lac le site 8 afin d’estimer l’effet du ruissellement

direct à partir des zones d’agricultures. Au niveau de la lagune, le site 9 permet d’estimer

l’effet du trafic maritime au niveau du canal. Les stations 18 et 19, proposées par l’ANPE,

permettent d’estimer l’effet de la pollution provenant des stations mytilicoles.

54

Fig 11: Localisation des stations d’échantillonnage dans le lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

Le prélèvement de sédiment a été effectué grâce à une benne Van Veen en triplicats, soit 120

échantillons au total. Des boites stériles ont été remplies pour l’étude microbiologique (NPP

et l’étude moléculaire), des boites en verre pour les analyses chimiques, des boites en

plastiques pour l’étude méiofaunistique.

Le prélèvement d’eau a été effectué par remplissage des bouteilles en polystyrène pour le

dosage de chlorophylle a et des éléments nutritifs.

Planche 3. Photo de la benne Van Veen

55

Planche 4. Station située au niveau de l’oued Tinja du coté sud de l’écluse (site 1)

Planche 5. Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site2)

56

Planche 6. Station située au centre du lac (site 4)

Planche 7. Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site 3)

Planche 8: Station située au niveau de l’embouchure de l’oued (site 5)

57

Planche 9. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Sejnane (site 6)

Planche 10. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Douimiss (site 7)

Planche 11. Station localisée en face de la briqueterie (site 8).

58

II. PARAMETRES DESCRIPTEURS DES SITE D’ECHANTILLONNAGE

Plusieurs paramètres abiotiques ont été mesurés, pour avoir une idée complète des

écosystèmes étudiés, tels que les paramètres hydrologiques de routine qui ont été mesurés sur

place : la température, le pH, la salinité et l’oxygène dissous ont été mesurés à l’aide d’un

multi paramètre de type WTW Multi-197i.

1. La salinité

La salinité représente la quantité de sels dissous dans l’eau. C’est un paramètre déterminant au

niveau des écosystèmes aquatiques en particulier le lac Ichkeul puisqu’elle varie énormément

entre les saisons. Elle dépend de l’hydrologie, principalement des apports en eaux douces des

oueds du bassin versant et des précipitations. Mais, elle dépend aussi des échanges avec la

lagune de Bizerte et de l’intensité de l’évaporation, notamment en été. Les apports d’eaux

douces diluent les eaux du lac induisant ainsi une diminution de la salinité surtout après

lessivage des sels par un flux sortant vers la lagune de Bizerte (ANPE, 2007). Au printemps

et en été, la diminution des apports en eaux douces et des précipitations, et l’intensification de

l’évaporation, induisent une augmentation de la salinité.

2. Le pH

Le pH de l’eau de mer varie généralement entre 7,5 et 8,4, pour une moyenne de l’ordre de

8,2. Elle est légèrement basique. Le pH des eaux du lac varie généralement entre 7.6 pendant

la période d’ouverture de l’écluse et 8.53 durant la période de fermeture de l’écluse (Ben

M’barek, 2001).

3. L’oxygène dissous

L’oxygène dissous est un paramètre important des écosystèmes aquatiques. L’oxygène

gouverne la majorité des processus biologiques, c’est un excellent indicateur de la qualité de

l'eau (Ramade, 1982).

4. Les éléments nutritifs

Les éléments nutritifs ont été aussi analysés dans les échantillons d’eau prélevés, le nitrate et

le nitrite ont été déterminés selon Wood et al. (1967), l’ammonium a été analysé selon la

procédure d’Aminot and Chaussepied (1983), le phosphate a été déterminé selon le protocole

de Murphy et Riley (1962). Concernant la chlorophylle a (Chl a), les échantillons d’eau de

mer ont été filtrés par filtre Whatman GF/F puis les concentrations des pigments ont été

59

déterminés selon la méthode standard spectrophotométrique de Parsons et al. (1984), après

l’extraction effectuée avec 10 mL d’acétone 90% pendant toute une nuit à l’obscurité. Le

carbone organique a été déterminé selon la procédure d’Espitalie et al. (1986). La matière en

suspension a été déterminée selon la méthode de Baretta-Beakker et al. (1992). La MES a été

mesurée au laboratoire après filtration d’un litre d’eau sur des filtres Whatman millipores

(0,45μm). Les filtres utilisés ont été pesés avant et après filtration, la différence des pesées

indique la quantité de matières en suspension relative au volume d’eau filtrée.

III. Analyses chimiques

III.1. Adaptation et validation de la méthode QuEChERS

La méthode QuEChERS a été adaptée par la réalisation de plusieurs tests de type de solvant

utilisé, la méthode d’agitation et la masse de sédiment utilisée à fin de déterminer la meilleure

méthode pour extraire les composés organiques HAP, PCB et OCP. Après cette méthode a été

validée avec le GC-MS.

III.1.1. Optimisation de l’extraction des HAP, PCB et OCP

Les conditions d'extraction selon la méthode QuEChERS ont été optimisées pour l'analyse

simultanée des HAP, PCB et OCP. La méthode d’extraction QuEChERS classique en utilisant

l'acétonitrile a été comparée à une méthode modifiée en utilisant des mixtures de solvants:

hexane-acétone (HA) et le dichlorométhane-acétone (DA). La méthode d'extraction a été

optimisée en comparant l'agitation manuelle aux ultrasons et deux masses de sédiment ont été

testées.

III.1.2. Extraction et purification des HAP, PCB et OCP

Le sédiment a été broyé dans un mortier, puis un aliquot de 5 g de sédiment a été pesé dans un

tube en polypropylène (50 ml). Ensuite, 4 ml d'eau ultra-pure a été ajouté, le tube a été agité à

la main et des standards internes (le naphtalène d8, le phénanthrène d10, pérylène d12, PCB

209, atrazine d5) ont été introduits. Ensuite 20 ml de solvant d'extraction ont été ajoutés et le

tube a été agité vigoureusement à la main pendant 1 minute. Après le mélange de sels de

tampon citrate est ajouté et le tube a été agité vigoureusement : manuellement pendant 5min

puis par agitation aux ultrasons pendant 15 min. Enfin, le tube a été centrifugé pendant 3 min

à 2500 rpm et 10 ml du surnageant ont été transférés dans un autre tube en polypropylène (15

ml), ce tube contient déjà 900 mg de MgSO4 et 150 mg de PSA. Le tube a été agité

60

vigoureusement à la main pendant 30 s et on le centrifuge pendant 3 min à 2500 rpm. Les

extraits ont été ensuite séchés sous un léger courant d'argon en utilisant un système de

concentration de l'évaporateur Turbovap LV. Le résidu séché a été re-dissous avec 1 mL

d'acétonitrile maintenu à -20°C jusqu'à l'analyse.

III.1.3. Dosage des HAP, PCB et OCP

Le sédiment des échantillons conservés pour les analyses chimiques a été lyophilisé et broyé

puis l’extraction et la purification ont été effectuées selon le protocole décrit en 3.1.2. Les

analyses ont été effectuées à l'aide de la Chromatographie en phase gazeuse Agilent 7890A

couplé à un spectromètre de masse Agilent 5975C avec une source d'ionisation par impact

électronique (El). Le système GC-MS a été équipé d'une colonne Agilent DB5-MS UI. La

température de la source d'ions et la température de quadrupôle ont tous les deux été maintenu

à 230 ° C et 150 ° C, respectivement. Un volume de 1 µL de l'extrait concentré de

l'échantillon a été injecté en mode sans division pulsé à une température d'entrée de 280 ° C.

IV. ANALYSES MOLECULAIRES

IV.1. Extraction de l’ADN génomique

L'ADN génomique de 250 mg d'échantillon de sédiment congelé a été extrait en utilisant un

kit d’extraction d'ADN UltraClean du sol (mobio Laboratories, CA) en suivant le protocole du

fabricant avec des modifications mineures, comme décrit précédemment par (Precigou et al.,

2001).

IV.2. Amplification des gènes de l’ARNr 16S

Les gènes de l'ARNr 16S ont été amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique extraits des

sédiments avec les amorces bactériennes universelles marquées par des fluorochromes 63F :

5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3' et 1387R 5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3'

(Marchesi et al, 1998). Le mélange d'amplification par PCR contenait : 12,5 µl Ampli Taq or

360 Master Mix (Applied Biosystems), 0,25 pM de chaque amorce (20 pM), 0,5 µl des

extraits d'ADN dilués 10x ont été ajoutés aux réactions de PCR. Le volume final de a été

ajusté à 25 µl avec de l'eau distillée. La réaction de PCR a été réalisée dans un thermocycleur

de PTC200 (MJ Research), dans les conditions suivantes : 95°C pendant 10 min, 35 cycles de

61

95°C pendant 45 secondes, 58°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 min, avec une étape

d'extension finale à 72°C pendant 10 min.

Les produits de PCR ont alors été visualisés par électrophorèse en gel d’agarose puis purifiés

en utilisant un kit de purification d'ADN sur gel (Takara, Japon) en suivant le protocole du

fabricant.

IV.3. Analyse TRFLP

Les produits de PCR purifiés (100 ng) ont été digérés avec quatre unités d'enzyme AluI

(Takara, Japon) pendant 3 heures à 37°C puis les fragments générés ont été séparés par

électrophorèse capillaire. En bref, environ 50 ng de l'ADN digéré à partir de chaque

échantillon a été mélangé avec 8,75 µl de formamide désionisée et 0,25 µl de Rox500

(Applied Biosystems ; marqueur de taille moléculaire), puis dénaturé à 94°C pendant 2 min et

refroidi immédiatement dans la glace avant l'électrophorèse capillaire. Après une étape

d'injection de 10s, l'électrophorèse a été réalisée pendant 30 min en appliquant une tension

de 15 KV.

IV.4. Pyroséquençage

Le séquençage 454 a été réalisé par la société Mr DNA, selon la méthode de Scott et al.,()

puis le traitement des données par le logiciel Mothur a été effectué à fin de nettoyer les

séquences et calculer la matrice. Au début l’extraction des séquences et la génération de 3

files fasta, qual et flow, ensuite la séparation des flowgrams en fonction des barcodes et

primers a été réalisée, les séquences des barcodes et des primers ont été enlevées et filtrées.

L’alignement selon la référence Silva, nécessaire pour rechercher les chimères et les

contaminants, a été effectué. Puis une préclusterisation a été réalisée pour éliminer les erreurs

de séquençage. Les chimères ont été recherchées et supprimées. Après, la classification et la

suppression des contaminants ont été réalisées. L’alignement a été re-calculé pour le calcul de

la matrice de distance. Enfin le calcul de la matrice de distance a été réalisé.

V. ETUDE DE LA MEIOFAUNE

La méiofaune a été extraite par la méthode de lévigation-tamisage (Vitiello et Dinet, 1979),

colorés au rose Bengale et comptés après 24 heures sous la loupe binoculaire pour le calcul

des densités moyennes des nématodes libres marins.

62

VI. TRAITEMENT STATISTIQUE DES DONNEES

Des traitements statistiques des résultats obtenus dans les différentes analyses chimiques,

microbiologiques et nématologiques ont été effectués.

VI.1. Analyses univariées

Des indices d’analyses univariées ont été considérés : La diversité (indice de diversité de

Shannon, H’), la richesse spécifique (R). Ces indices ont été calculés pour chaque site.

VI.2. Analyses multivariées

Les analyses multivariées ont été effectuées avec le logiciel PRIMER (Clarke et Gorley,

2001). Le coefficient de similarité de Bray-Curtis (Bray et Curtis, 1957) a été utilisé pour

construire la matrice de similarité entre les différents sites. Le test d’analyse de similarités

(ANOSIM) (Clarke, 1993) a été employé pour mettre en évidence l’existence d’éventuelles

différences significatives entre les communautés microbiennes des différents sites. La

procédure SIMPER (similarity percentages) a été utilisée pour déterminer la contribution de

chaque souche (ou OTU) à la dissimilarité de Bray-Curtis moyenne entre les sites. Les

analyses multivariées des données ont été réalisées par le logiciel MVSP v3.12d software

(Kovach Computing Service, Anglesey Wales). Le croisement des résultats des analyses

chimiques et microbilogique dans l’Analyse des Correspondances Canonique (CCA) a permis

de voir l’impact des HAP et des POC présents dans les différents sites sur les communautés

bactériennes. Le logiciel R a été aussi utilisé pour les analyses multivariées tels que le

diagramme de veen, le heat map et les réseaux à fin d’analyser les communautés

microbiennes des différents sites ainsi que les relations entres les souches.

63


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65

CHAPITRE III : STRATEGIE DE

HIERARCHISATION DES POLLUANTS

CHIMIQUES D’INTERET A RECHERCHER

DANS LE COMPLEXE LAC ICHKEUL-LAGUNE

DE BIZERTE

66

CHAPITRE III : STRATEGIE DE HIERARCHISATION DES POLLUANTS

CHIMIQUES D’INTERET A RECHERCHER DANS LE COMPLEXE LAC

ICHKEUL-LAGUNE DE BIZERTE

Partie A : Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en Tunisie : cas du

bassin agricole du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

Introduction

La présence des polluants organiques les HAP, les PCB et les pesticides dans les écosystèmes

aquatiques est préoccupante. Plusieurs études se sont intéressées à ces contaminants à travers

le monde avec pour objectifs de mettre en évidence leur présence dans la mer, les lagunes, les

lacs et les oueds et de déterminer leur quantité dans différentes matrices environnementales

(eau, sédiment et organismes biologiques) (Ke et al., 2002 ; Verweij et al., 2004 ;Wendt-

Rasch et al., 2004 ; Fernando et al., 2009 ; Berg et al., 2011 ; Engraff et al., 2011 ; Szlinder-

Richert et al., 2014). En Tunisie, depuis quelques années des études sont menées, mais elles

se sont surtout intéressé aux HAP dans les sédiment de Sfax (Louati et al., 2001 ; Zaghden et

al., 2007) et les sédiments de la lagune de Bizerte (Ben Said et al., 2010). Une seule étude

s’est intéressée aux PCB dans les sédiments de la baie de Monastir (Nouira et al., 2013).

Concernant les pesticides, une seule étude a déterminé les concentrations des pesticides

organochlorés chez des poissons collectés dans la lagune de Bizerte (Ben Ameur et al., 2013).

La détection de la contamination par les HAP et les PCB est facilitée car ces contaminants

représentent un nombre limité de molécules (e.i. 16 HAP préconisés par l’agence américaine

de protection de l’environnement) alors que pour les pesticides le nombre de matières actives

est très élevé. En effet, le problème de résistance des plantes exige de changer le pesticide

d’une période à une autre afin que de garder l’effet biocide. Afin de définir les molécules de

pesticides à rechercher dans le complexe lac Ichkeul-Lagune de Bizerte, une enquête a été

67

effectuée auprès des agriculteurs, des revendeurs et le commissariat régional de

développement agricole de Bizerte, dans le bassin versant du complexe. Le résultat de

l’enquête permet d’avoir une idée claire des pesticides problématiques qu’il faut analyser dans

le sédiment du complexe.


Ben Ameur W, Trabelsi S, El Megdiche Y, Ben Hassine S, Barhoumi B, Hammami B,

Eljarrat E, Barceló D, Driss MR, 2013. Concentration of polychlorinated biphenyls and

organochlorine pesticides in mullet (Mugil cephalus) and sea bass (Dicentrarchus labrax)

from Bizerte Lagoon (Northern Tunisia). Chemosphere, 90: 2372-2380.

Ben Said O, Goñi-Urriza M, El Bour M, Aissa P, Duran R, 2010.Bacterial Community


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Engraff M, Solere C, Smith KEC, Mayer P, Dahllöf I, 2011. Aquatic toxicity of PAHs

and PAH mixtures at saturation to benthic amphipods: Linking toxic effects to chemical

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Carvalho FP, Villeneuve JP, Cattini C, Rendón J, Mota de Oliveira J, 2009. Pesticide

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Verweij F, Booij K, Satumalay K, van der Molen N, van der Oost R, 2004. Assessment of

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69

I. Publication 1 :

A soumettre dans le journal Cahiers Agricultures

Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en grandes

cultures dans le bassin versant du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

(Tunisie)

First survey of agricultural pesticides used for crops in Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon watershed (Tunisia)

Fida Ben Salema,b

*, Olfa Ben Saida, Patricia Aissa

a, Robert Duran

b & Olivier Grunberger

c

a Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Faculté des Sciences de Bizerte, 7021,

Zarzouna, Tunisie.

b Equipe Environnement et Microbiologie – UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS- Université

de Pau et des Pays de l'Adour - France.

c IRD, UMR-LISAH (IRD-INRA-SupAgro), Bat 24, 2 place Viala, F-34060, Montpellier

cedex 01, France

*Corresponding author present address:


UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS

Université de Pau et des Pays de l'Adour - France.

Tel: +216 72 400 121 Fax: + 216 72 590 566

Email: [email protected]

mailto:[email protected]

70

Résumé

L’objectif de cette étude consiste à recenser les pesticides utilisés au niveau du bassin agricole

entourant le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte. Ce complexe est un bassin versant à

majorité de grandes cultures (blé, orge, fourrage…). Le recensement auprès des agriculteurs et

des revendeurs de produits phytosanitaires montre que les matières actives les plus utilisées

sont l’iodosulfurone (2014 kg), le mésosulfurone (1218 kg), le 2,4D (4618 kg), le glyphosate

(2886kg) et le fénoxaprop (5300 kg) comme matières actives des herbicides ; le tébuconazole

(9260 kg) et l’époxiconazole (17168 kg) comme fongicide ; et la deltaméthrine (341 kg),

matières active d’insecticides. Les herbicides sont utilisés deux fois par an (pré et post

émergence), le traitement par les fongicides se fait suite aux attaques de rouille, les

insecticides sont appliqués contre les insectes tel les pucerons par exemple. Les pourcentages

des matières actives utilisées ont été déterminés permettant d’établir un classement selon les

paramètres physico-chimiques de chaque principe actif (solubilité, DT50 et KOC). Ensuite,

une estimation théorique de la quantité de chaque matière active a été déterminée. Les grandes

cultures du bassin agricole du lac Ichkeul et de la lagune de Bizerte sont d’importantes

utilisatrices d’herbicides, fongicides et insecticides alors que les cultures maraîchères utilisent

de grandes quantités d’insecticides et d’herbicides.

Mots clés: recensement, pesticide, rive sud de la Méditerranée, quantifier, complexe lac

Ichkeul-lagune de Bizerte.

71

Abstract :

The objective of this study is to identify the pesticides used in the agricultural watershed

surrounding the complex Ichkeul Lake-Bizerta lagoon. The complex is a watershed majority

of field crops (wheat, barley, feed ...). The survey of farmers and dealers of pesticides shows

that the most commonly used active ingredients are iodosulfuron (2014 kg), mesosulfuron

(1218 kg), 2.4D (4618 kg), glyphosate (2886kg) and fenoxaprop (5300 kg) as herbicidal

active ingredient; tebuconazole (9260 kg) and epoxiconazole (17168 kg) as a fungicide; and

deltamethrin (341 kg), as insecticide. Herbicides are used twice a year (pre- and post-

emergence), treatment with fungicides is a result of rust attacks, insecticides are applied

against insects such as aphids, for example. The percentages of active ingredient were

determined to establish a ranking according to the physicochemical parameters of each active

ingredient (solubility, DT50 and KOC). Next, a theoretical estimation of the amount of each

active ingredient was determined. Crops agricultural basin of Ichkeul Lake and Bizerta lagoon

are important users of herbicides, fungicides and insecticides while vegetable crops use large

amounts of insecticides and herbicides.

Keywords: survey, pesticide, southern shore of the Mediterranean, quantify, Ichkeul Lake-

Bizerta lagoon.

72

Introduction

L'intensification de la production agricole à travers le monde s'accompagne souvent d’une

utilisation excessive et abusive de pesticides (Grovermann et al., 2013; Schreinemachers et

Tipraqsa, 2012). La production de céréales, source millénaire de la nutrition humaine ne

cesse de s’amplifier en liaison avec la croissance démographique et le développement. Selon

la FAO (2009) la production totale annuelle de céréales devra augmenter d'environ 3 milliards

de tonnes pour répondre à la demande mondiale d'ici 2050. L'utilisation de pesticides

(herbicides, fongicides, insecticides…) permet la sécurisation des rendements en diminuant

les pertes des cultures par les mauvaises herbes, les moisissures et les insectes (Fabro et

Varca, 2012). Cependant leur usage peut entraîner la présence de résidus toxiques dans les

produits de consommation, la biosphère et l’environnement. Les pesticides se retrouvent dans

les flux hydriques car ils peuvent se dissoudre facilement. Ils peuvent rejoindre les milieux

aquatiques par ruissellement ou infiltration et se retrouvent alors liés aux matières en

suspension dans l’eau et le sédiment (Rodrigues et al., 2013). Sur le pourtour méditerranéen,

l’utilisation des pesticides dans les bassins versants agricoles s'est intensifiée ces dernières

décennies. Les pesticides utilisés se sont diversifiés afin de répondre aux problèmes de

résistances. La prise en compte des risques sanitaires et écologiques liés à l’utilisation des

pesticides est un enjeu important mais pourrait affecter la production alimentaire (Carvalho,

2006). En Tunisie, à l’exception des retombées du protocole de Stockholm sur les pesticides

périmés (Dasgupta et al., 2010), très peu d'information publique est disponible sur l’utilisation

des pesticides. Une estimation par le "Pesticide Action Network" a évalué les quantités de

pesticides importés en Tunisie à 3985 tonnes de pesticides en 2004 et 3632 tonnes en 2005.

L’agriculture tunisienne est donc utilisatrice de produits phytosanitaires, mais son contexte ne

privilégie pas une vision claire des quantités utilisées, ni une estimation de leur impact sur

73

l’environnement et la santé humaine, malgré que la grande culture est une source de

contamination ailleurs : en Italie (Screpanti et al., 2005) et en Turquie (Uludag et al., 2007).

Le système de la lagune de Bizerte et du lac d'Ichkeul est un site d’étude privilégié.

Premièrement, le lac Ichkeul est un des rares sites au monde inscrits sur trois conventions

internationales (Ben M’barek, 2002). Deuxièmement, le lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

reçoivent une quantité inconnue de polluants provenant de leur bassin versant, zones agricoles

principalement cultivées en céréaliculture. Ces deux écosystèmes communiquent entre eux à

travers l’oued Tinja. L’exploitation du complexe présente des enjeux importants en termes de

services écosystémiques comme la préservation de la biodiversité, la fourniture de produits de

la pêche et de l'aquaculture pour la consommation humaine. Le complexe est sous l’influence

de grandes superficies agricoles, majoritairement spécialisées en grandes cultures (céréales et

fourrage) utilisatrices de pesticides (Stevenson et Battarbee, 1991) (Fig 1). L’utilisation des

pesticides dépend de l’exploitant agricole dans le contexte de sa filière de production qui

comprend les fournisseurs de produits et de semences, les cahiers de charges, la

réglementation, etc… L’agriculteur vise le niveau optimal de traitements pesticides du point

de vue de son appréciation des risques.

Malgré plusieurs études éco-toxicologiques sur la lagune de Bizerte (Ben Said et al., 2010) et

quelques données sur la pollution métallique du lac Ichkeul (Ben M’barek, 2002) aussi sur

plusieurs écosystèmes aquatiques du sud de la méditerranée aucune étude n’a été entreprise

pour estimer les apports en pesticides agricoles dans ce complexe ni dans tous le sud de la

méditerranée. Les objectifs de cette étude consistent donc à définir, pour le bassin versant du

complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte, les pratiques agricoles afin de recenser les pesticides

les plus utilisés et d’en estimer leurs quantités. La collecte des pratiques agricoles dans les

zones entourant les deux plans d’eau, nous a permis de comparer avec les pratiques agricoles

74

aux autres pays et de mettre en évidence quelques molécules problématiques susceptible de se

retrouver dans les eaux et le sédiment du complexe.

Matériels et Méthodes

Site d'étude

Le terrain d’étude appartient à deux étages bioclimatiques. L’étage méditerranéen humide

sous étage inférieur à hiver doux et l’étage méditerranéen subhumide à hiver doux. La

pluviométrie annuelle moyenne de la région varie de 450 à 650 mm par an. Le complexe lac

et lagune est alimenté par plusieurs oueds. L’apport d’eau douce du bassin versant du lac

Ichkeul est de 0,15 m3/km

2 de superficie alors qu’il est de 0,06 m

3/km

2, la lagune est donc

plus faible et plus plat ainsi elle reçoive moins de ruissellement (ANPE, 2005). Le lac Ichkeul

est le point terminal d’un important réseau hydrographique drainant un bassin versant d’une

surface d'environ 2080 km2 (Ben Garali et al., 2009). Les pentes les plus faibles entourent le

complexe. En s’éloignant de ces écosystèmes la pente augmente, l’eau de drainage et des

oueds se déversent finalement dans le lac et la lagune (CRDA, 2007). La salinité du lac

dépend de l’hydrologie du complexe cependant elle est de l’ordre de 4 gL-1

en hiver (eau

douce) et elle passe à 35 gL-1

en été à cause de l’évaporation et de l’influence de l’eau marine

provenant de la lagune. Une base de données, établie par le Commissariat Régional de

Développement Agricole CRDA, permet de mieux comprendre les caractéristiques des deux

bassins versants. L’analyse de l’occupation du sol dans ce bassin versant montrent que les

grandes cultures (Céréales et fourrage) occupent les plus grandes superficies agricoles

(Céréales 77620 ha et fourrage 46470 ha). L’arboriculture fruitière (18465 ha), située dans les

parties hautes, est plus marginalement tout comme les zones maraichères et légumineuses

(5230 et 11770 ha respectivement).

75

Stratégie d’échantillonnage

Le contact avec les agriculteurs est pris à travers le commissariat régional de développement

agricole (CRDA) et leurs représentants au niveau des délégations appelées les cellules

territoriales de vulgarisation (CTV). Les données ont été collectées aussi auprès des

revendeurs des produits phytosanitaires et enfin chez les agriculteurs. Les CTV visités sont

celles qui appartiennent aux bassins versants du lac Ichkeul et de la lagune de Bizerte. Les

revendeurs des pesticides dans la région de Bizerte sont constitués par un seul grand

fournisseur de produits phytosanitaires situé à Mateur qui vend ses produits aux agriculteurs

qui ont des terrains aux alentours du lac Ichkeul et des revendeurs situé à Bizerte ville, la

clientèle de ces revendeurs sont plutôt les agriculteurs qui ont des terrains aux alentours de la

lagune de Bizerte. Lors des visites, les questions portaient sur la nature et les quantités de

pesticides vendues. Chaque agriculteur enquêté exploite des terrains qui appartiennent tous

aux bassins versants du lac et de la lagune. Un échantillon représentatif de la population

globale d'exploitations comportant environ 100 individus a été interrogé (Fig 1).

76

Fig .1 Carte d’occupation du sol de la région de Bizerte et localisation approximative des

terrains des agriculteurs questionnés

Une liste des agriculteurs a été fournit par la CRDA puis le choix a été établit par rapport à

l’emplacement des terrains le plus proche du lac et de la lagune et des oueds qui alimentent le

complexe. L'entretien est semi directif. Il débute à propos des problèmes auxquels font face

les agriculteurs de façon générale, puis sur les pesticides utilisés comme traitement aux

maladies et aux mauvaises herbes dans les cultures céréalières et fourragères. Le discours a

toujours été amical. Trois informations minimales sont déterminées (type de culture,

pesticides utilisés, superficie du champ cultivé) (Voir questionnaire en annexe 1).

Grandes cultures

Forêts

Arboriculture fruitière

Cultures maraîchères

Implantation d’olives

77

Entre Avril 2011 et Mars 2012, 100 agriculteurs, 4 ingénieurs des (CTV) et des ingénieurs de

l’office des terres domaniales (OTD) ont été questionnés. L’OTD est propriétaire de 4102 ha,

situé dans les délégations de Mateur et Ghezella, dont 3524 ha sont des grandes cultures. La

pluviométrie durant cette saison a été mesurée, elle est d’une moyenne de 600 mm entre

Septembre 2011 et Mars 2012. Une démarche logique a été adoptée pour calculer les quantités

globales des matières actives utilisées dans les bassins versant du lac et de la lagune.

Méthode de calcul global

Des pourcentages d’utilisation des matières actives correspondant aux pesticides (nom

commercial) ont été déterminés en divisant le nombre d’agriculteurs qui utilisent cette matière

active sur le nombre total d’agriculteurs enquêtés (* 100). Après un classement établit selon

les paramètres physico-chimiques de chaque principe actif une estimation de la quantité de

chaque matière active, utilisée dans le bassin agricole entourant le complexe lac Ichkeul-

lagune de Bizerte, a été déterminée. Cette quantité (Qsubstance) est le produitdes surfaces

cultivées (ha) par le pourcentage d'utilisation du pesticide (%) par le dosage de la matière

active dans le pesticide.

Méthode de calcul par agriculteur

Pour chaque agriculteur, le pourcentage des superficies consacrées pour les grandes cultures a

été déterminé. Ensuite, les quantités des pesticides utilisés ont été calculées en multipliant la

surface par le dosage des herbicides les plus utilisés par cet agriculteur.

Résultats

Utilisation des pesticides dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte

D’après les agriculteurs et les ingénieurs du CRDA les grandes cultures (céréalières et

fourrages) occupent le plus grand pourcentage des superficies des champs cultivés au niveau

des délégations concernés. Elles sont de grandes utilisatrices d’herbicides, de fongicides et

d’insecticides (Tableau 1).

78

Tableau 1. La liste des matières actives utilisées dans le bassin versant lac Ichkeul-Lagune de

Bizerte

Type de pesticides Matières actives Noms commercials

Herbicides

Fongicides

Insecticides

Iodosulfuron

Fénoxaprop

Mésosulfuron

2,4D

Glyphosate

Diclofop

Tribenuron

Tébuconazole

Epoxiconazole

Flusilazole

Cyproconazole

Dimoxystrobine

azoxystrobine

Deltaméthrine

Puma, Amilcar

Puma

Amilcar

Sansac, Factor, Dialene super, Mustang

Kalach

Ilexan super, Dopler,

Granstar

Horizon

Opus, Ogam, Soprano, RexDuo, Spike

Punch

Amistar, Altosuper

Swing gold

Amistar

Decis

Les herbicides sont utilisés pour détruire les mauvaises herbes afin de supprimer la

compétition interspécifiques sur l’espace entre d’une part le blé, l’orge et le fourrage et

d’autre part les mauvaises herbes. Les traitements se font généralement deux fois par an, en

automne (octobre) et au printemps (mars). Les fongicides sont utilisés deux fois par an

comme traitement préventif. Ils sont aussi utilisés comme traitement curatif de la "rouille" à

chaque fois qu’il y est la maladie. La rouille est une maladie très répandue causée par les

moisissures. Les insecticides sont utilisés à chaque fois qu’il y’a une maladie. Au total au

mois deux applications d’herbicides, deux pulvérisations de fongicides et une application

d’insecticide (Fig 2).

79

Pluviométrie

Sep Oct Nov Déc Janv Fév Mars Avr Mai Juin Juil Août

Fig.2 Pluviométrie du mois du septembre 2011 au mois d’Août 2012 avec l’horloge

d’utilisation des herbicides

Les pesticides utilisés sont pulvérisés par avion pour les grandes superficies agricoles et par

tracteurs sur les petites superficies. Il faut noter que les agriculteurs indiquent toujours utiliser

le dosage consigné par les revendeurs qui est celui indiqué dans les catalogues et sur les

bouteilles de pesticides. Il est donc impossible d’établir la variété des doses par ce biais. Dans

l’entretien, il est difficile dans la discussion d’aller au delà de cette indication très générale,

alors que ce posent des problèmes d’estimation des volumes, lors de la dilution du produit, et

de quantité par surface, lors de l’épandage, ces deux paramètres induisant une forte

imprécision sur la quantité réellement répandue. Des agriculteurs indiquent qu’il y avait des

échecs et des résistances, qui sont des occasions où ils demandent l’aide technique surtout des

ingénieurs de CRDA et parfois des revendeurs et font des traitements supplémentaires. Les

quantités de substances actives appliquées dans le bassin versant sont estimées à 44,7 t/an

(Tableau 2). Ces valeurs correspondre approximativement à 0,5% des importations de

pesticides en Tunisie. Il s’agit de substances actives herbicides (17,9t), de fongicides (26,4t)

et d’insecticides (0,4t kg).

Herbicides Herbicides

Fongicides

80

Tableau 2. Estimation des quantités des principales matières actives utilisées dans les zones

agricoles concernées après dire des agriculteurs.

Matière active (nom

commercial)

Superficie

des cultures

céréalières

et

fourragères

traités

Dosage du

pesticide

Quantité de

matière

active

Nombre

d’applicatio

n minimal

par an

Quantité de

matière

active utilisée

Quantité de

matière

active

vendue

Unité Ha

traités

L ha-1

ou g ha-1

g L-1

ou

g kg-1

Kg Kg

Iodosulfuron(Puma)

Iodosulfuron(Amilcar)

Iodosulfuron (Total)

41410

61480

1 L/ha

330 g/Ha

8 g/L

30 g/Kg

2

662

1352

2014

192

1013

1205

Fénoxaprop (Puma) 41410 1 L/HA 64 g/L 2 5300 1536

2,4D 8016 0,8 L/ha 360 g/L 2 4618 2400

Mésosulfuron(Amilcar) 61480 330 g/Ha 30 g/Kg 2 1218 1013

Glyphosate 8016 1 L/Ha 360 g/L 2 4772 2160

Tébuconazole (Horizon) 18520 1L/Ha 250 g/L 2 9260 3750

Epoxiconazole (Opus)

Epoxiconazole (Rex Duo)

Epoxiconazole (Soprano)

Epoxiconazole (Ogam)

Epoxiconazole (Total)

18520

21136

25082

18520

0,8 L/Ha

0,5 L/Ha

1L/Ha

0,7L/Ha

125 g/L

187 g/L

125 g/L

125 g/L

2

3704

3952

6270

3242

17168

2340

2280

1950

780

7350

Deltaméthrine (Decis) 91049 0,25L/Ha 15 g/L 1 341 300

Estimation des pesticides vendus

Les visites effectuées au fournisseur et aux revendeurs ont permis de déterminer la nature et

les quantités de pesticides vendus dans la zone d’étude (Tableaux 2&3). Les quantités de

matières actives vendues durant l’année 2012 ont été calculées en se basant sur le pourcentage

de matière active présent dans les pesticides. Le bilan montre une consommation de 28 t/an de

substances actives. Les plus grandes quantités vendues sont celles de l’iodosulfurone

(1205kg), le mésosulfurone (1013kg), le 2,4D (2400kg), le glyphosate (2160kg), et le

fénoxaprop (1536kg) comme matières actives herbicides ; le tébuconazole (3750kg) et

l’époxiconazole (7350kg) comme fongicide et la deltaméthrine (300kg) matières active des

insecticides.

81

Tableau 3: Les quantités des pesticides vendues par an au niveau des délégations concernées

(L : Litres, kg)

Types de

pesticides

Nom

commercial

Ventes

annuelles

produits

Principes actifs Kg

Herbicides Puma

24000 L

Fénoxaprop 6.4% 1536

Iodosulfuron 0.8% 192

Méfenpyr 2.4% 576

Amilcar 135000 L Mésosulfuron0.75% 1013

Iodosulfuron0.75% 1013

Méfenpyr 2.25% 3087

Glyphosate 6000 L Glyphosate36% 2160

Mustang

8000 L

2,4D 30%

Florasulam 0.6%

2400

36

Total 12013

Fongicides Soprano

Ogam

15000 L

6000 L

Epoxiconazole 13%

Epoxiconazole 13%

Krésoxim 13%

1950

780

780

Rex Duo 12000L Epoxiconazole19% 2280

Thiophanate 31% 3720

Horizon 15000 L Tébuconazole 25% 3750

Opus 18000 L Epoxiconazole 13% 2340

Total 15600

Insecticides Decis 3000 L Deltaméthrine 10%

300

Grand Total 27913

82

Estimation des pesticides utilisés par les agriculteurs

L’enquête de terrain couvre une surface de 113390 hectares de grandes cultures (céréales et

fourrages). Le bilan montre que les quantités de pesticides utilisées au niveau du bassin

versant de la lagune de Bizerte et du lac Ichkeul, pour les grandes cultures céréalières et

fourragères, sont de 17,9t de matières actives d’herbicides, 26,4t de matières actives de

fongicides et de 0,4t de matières actives d’insecticides, soit au total 44,7t de matières actives

pour 113390 hectares de grandes cultures. Ainsi les agriculteurs utiliseraient 0,4 kg de matière

active par hectare par an au minimal.

Comparaison pesticides vendus et pesticides utilisés

Les différences entre les quantités de matières actives déclarées être vendues par les

revendeurs et celles déclarées être utilisées par les agriculteurs ne sont pas très importantes

pour la plupart des substances. Ainsi les matières actives telles que l’iodosulfurone

(1205/2014kg), mésosulfurone (1013/1218kg), 2,4D (2400/4618kg), glyphosate

(2160/4772kg) et la deltaméthrine (341/300kg) semblent bien déterminées par l’enquête

auprès des agriculteurs. En revanche, des différences en faveurs des quantités utilisées

apparaissent plus importantes pour le fénoxaprop (1536/5300kg), l’époxiconazole

(7350/17168kg), le tébuconazole (3750/9260kg) laissant penser que les agriculteurs ont

d’autres fournisseurs de produits phytosanitaires à part le fournisseur au niveau du

gouvernorat de Bizerte, dont on peut citer le CRDA qui intervient dans des cas de résistance

surtout à fournir une nouvelle matière active.

Les résultats de ce recensement indiquent qu’actuellement les formules commerciales

Amilcar et Puma sont les deux herbicides les plus employés en alternances à fin d’éviter les

problèmes de résistance, bien que deux des trois principes actifs soient identiques dans les

deux produits. Le glyphosate et les autres herbicides sont minoritaires en volumes répandus

mais peuvent représenter des quantités de substances actives non négligeables du fait des

83

concentrations. Amilcar et Puma semblent particulièrement conseillés par les revendeurs,

surtout que les couts de traitement ne sont pas comparables. Les statistiques sur l’exploitation

indiquent que 38% des agriculteurs utilisent deux fongicides de mêmes matières actives

l’époxiconazole et le tébuconazole (Opus, Ogam, Soprano, RexDuo, Spike, horizon), 62%

utilisent une gamme très variée.

Discussion

Le potentiel de transfert des produits phytosanitaires et la possibilité de détection des matières

actives peuvent être évalués à partir de quelques propriétés physico-chimiques (tableau 4) qui

caractérisent chaque substance active tel que le coefficient de partage carbone organique/eau,

la solubilité et le temps de demi-vie (Worrall et Kolpin, 2004). Le coefficient de partage

carbone organique/eau donne une indication sur l’aptitude de la molécule à être adsorbée ou

désorbée sur la matière organique : Les pesticides fortement adsorbés sont en principe retenus

à la surface du sol (moins lessivables). Dans ce cas, les quantités de pesticides ruisselées vont

dépendre des quantités de sédiments érodés et transportés (McDowell et al., 1981 ;Willis et

al., 1983). Les molécules aux faibles Koc vont être retrouvées avec les plus fortes

concentrations dans la phase aqueuse du ruissellement. (Dabrowski et al., 2002 ; Klöppel et

al., 1997 ; Klöppel et al. 1994 ; Southwick et al., 1997 ; Wauchope et al., 1978 ; Wauchope et

al., 2002). La demi-vie est le temps mis par une substance pour perdre la moitié de son

activité biocide.

84

Tableau 4. Les propriétés physico-chimiques de certaines matières actives

http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/fr/index.htm, Stuart et al., 2012 ; Passeportet al., 2013

Matière active Koc Solubilité

dans l'eau

DT50

ML g-1

mg l-1

Jours

Herbicides

Fénoxaprop

Iodosulfuron

Méfenpyr

Mésosulfuron

Glyphosate

2,4D

Fongicides

Epoxiconazole

Tébuconazole

Insecticides

Deltaméthrine

9490

97.7

634

3

1435

88.4

1073

769

10240000

0.9

25000

20

483

10500

23180

7.1

36

0.0002

1

181

135

48

12

29

119.8

365

65

Les différentes matières actives utilisées dans le bassin versant étudié (Tableau 1) sont

utilisées actuellement dans les pays européens. D’après les résultats du tableau 2, Les

pesticides les plus utilisés au niveau du bassin agricole de la lagune de Bizerte et lac Ichkeul

sont en majorité des herbicides et des fongicides. Les agriculteurs utilisent 0,4 kg de matière

active par hectare. Cette quantité est faible par rapport à 3-4 kg de matière active par hectare

utilisée en France et aux états unis (Schreinemachers et Tipraqsa, 2012) ainsi que 13 kg de

matière active par hectare utilisées en Thaïlande sur des bassins versants de cultures

d’exportations (Grovermann et al., 2013). Plus proche, une étude du ministère de l’agriculture

français (Agreste, 2014) indique que pour la campagne agricole 2011, Les blés reçoivent un

http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/fr/index.htm

85

nombre moyen de traitement proche de 2 par an aussi bien en herbicides qu’en fongicides

alors que les traitements insecticides se font en moyenne de 0,25 a 0,5 fois par an, ceci

confirme nos résultats.

Schreinemachers et Tipraqsa, (2012) indiquent qu’une intensification de la production

agricole de 1% impliquerait une augmentation de l’utilisation des pesticides de 1,8%. Les

auteurs indiquent également que la diminution de l'utilisation d'insecticides serait compensée

par une augmentation de l’utilisation d’herbicides et de fongicides, ce qui semble être le cas

en Tunisie. Selon Schreinemachers et Tipraqsa, 2012, l'utilisation de pesticides par hectare de

terres cultivées dépend des revenus des pays. L’utilisation de 0,2 kg de matière active par

hectare place la Tunisie dans l’intervalle des pays à faible revenu, beaucoup plus faible que 13

kg de substances actives par hectare utilisés en Thaïlande (Schreinemachers et Tipraqsa,

2012). Du point de vue des molécules utilisées, ce premier recensement, réalisé dans le bassin

versant du lac Ichkeul et de la lagune de Bizerte, montre une utilisation de fongicides,

d’herbicides et d’insecticides de « nouvelle génération ». Ces pesticides ont remplacé les

pesticides d’ancienne génération, les pesticides organochlorés, très persistants dans

l’environnement et encore présents aujourd’hui dans les sédiments de la lagune de Bizerte et

probablement présents dans les sédiments d’Ichkeul. Ces molécules sont autorisées pour

utilisation en France.

Les herbicides actuels peuvent causer de nouvelles perturbations écologiques dans le

complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte. Ainsi, le Glyphosate et le 2,4D sont retrouvées dans

plus de 20% des eaux superficielles françaises, il est donc probable que ces molécules se

retrouvent dans les sédiments du lac d’Ichkeul et de la Lagune de Bizerte avec leurs

métabolites, tout particulièrement acide aminométhylphosphonique (AMPA) (dont la

solubilité et les temps de demi-vie sont supérieurs à la molécule mère et qui a été retrouvé

dans près de 50% des eaux de surfaces françaises).

86

En ce qui concerne les fongicides, le tebuconazole présente un motif de préoccupation dans

la mesure où son temps de demi-vie est élevé (dans certains cas jusqu'à 620 jours) et que sa

mobilité en crue est avérée (Tahgavi et al, 2010). Même si sa toxicité animale est faible, un

impact sur les populations bactériennes est toujours possible affectant ainsi le bon

fonctionnement de l’écosystème.

Conclusion

Le recensement auprès des agriculteurs du bassin agricole du complexe lac Ichkeul-lagune de

Bizerte, à majorité de grandes cultures, montre une utilisation massive de fongicides,

d’herbicides et d’insecticides. Toutefois, il est nécessaire de s’assurer de leurs présences par

les dosages dans les différentes matrices environnementales et de comprendre leurs effets et

leurs devenirs. Afin de compléter nos connaissances sur l’utilisation des pesticides dans le

complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte, une enquête recensant les pesticides utilisés dans les

cultures maraichères et de légumineuses est nécessaire. Enfin, les teneurs des principales

substances utilisées dans le bassin versant doivent faire l’objet d’une surveillance,

particulièrement pendant les épisodes de ruissellements afin de limiter les effets sur

l’environnement.

Remerciement

Nous remercions vivement Mr Taher Kaabi, ingénieur principal au Commissariat Régionale

de Développement Agricole (CRDA) de Bizerte, pour son aide logistique et pédagogique.

Annexe 1 :

Questionnaire d'enquête auprès des agriculteurs :

Est-ce qu’il y’a un problème d’insecte ou de champignon ces dernières années ?

Comment vous éliminez les mauvaises herbes ?

Quels sont les pesticides que vous utilisés?

Est-ce que vous alternez le choix des pesticides chaque année?

87

Combien de fois vous pulvérisez vos champs et pendant qu’elle période de l’année?

Qu’elle est la quantité de pesticide que vous utilisez ?

Pratique d’utilisation des pesticides :

Comment vous pulvérisez les champs par les pesticides par avion avec des tracteurs ?


Agreste (2014) http://www.agreste.agriculture.gouv.fr/IMG/pdf/dossier21_protection.pdf

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90

CHAPITRE III : STRATEGIE DE HIERARCHISATION DES POLLUANTS

CHIMIQUES D’INTERET A ETUDIER DANS LE COMPLEXE LAC ICHKEUL-

LAGUNE DE BIZERTE

Partie B : Validation et adaptation d’une méthode d’analyse chimique pour la

détermination simultanée des HAP, PCB et OCP dans le sédiment du complexe Lac

Ichkeul-Lagune de Bizerte par GC-MS

Introduction

La surveillance des écosystèmes aquatiques se base en premier lieu sur les analyses chimiques

des polluants dans les différentes matrices. Une fois la liste des molécules de HAP, PCB et

pesticides à rechercher est établie, la détermination de leurs teneurs peut être envisagée. Ces

polluants provenant de différentes activités humaines rejoignent les milieux aquatiques marins

et, en fin de compte, se retrouvent accumulés dans les sédiments. Le choix de la méthode

d’analyse chimique est basé sur l’obligation du dosage simultané de trois types de polluants

afin de minimiser le temps d’analyse, surtout en considérant le grand nombre d’échantillons à

analyser. La méthode choisie doit offrir la fiabilité souhaitée en un minimum de temps, avec

un moindre effort et un coût réduit. Traditionnellement, la technique standard a été

l'extraction soxlhet avec des solvants non polaires (Boer et Law, 2003), mais en raison de

plusieurs inconvénients, d'autres techniques alternatives ont été développées telles que

l’extraction par micro-ondes (Carvalho et al., 2008 ; Cueva-Mestanza et al., 2008 ; Itoh et al.,

2008 ; Moreno et al., 2006 ; Bartolomé et al., 2005). La micro-onde génère un champ

électrique alternatif qui permet aux molécules polaires de tourner sur elles mêmes. Une autre

alternative est l’extraction par ultrasons (Errekatxo et al., 2008 ; Vagi et al., 2007) c'est-à-dire

l’extraction des composés organiques de la matrice par les vibrations mécaniques générées

par les ondes sonores. Les techniques micro-onde et ultrason sont moins coûteuses, plus

rapide et plus effectives que l'extraction soxhlet (Liu et al., 2013). Toutes ces techniques ont

91

été largement utilisés pour plusieurs extractions à partir de différentes matrices

environnementales comme les sols, l’eau, les sédiments, les tissus biologiques. Mais, ces

techniques ne sont pas toujours faciles à utiliser et à adapter pour les applications de routine.

Les inconvénients des méthodes classiques sont l’utilisation de grands volumes de solvant

d’extraction et des durées d’incubations très longues. Ceci a amené les chercheurs à

rechercher des méthodes qui réduisent le volume de solvants d’extraction et le temps

nécessaire pour réaliser cette étape.

La méthode QuEChERS est une nouvelle approche appelée ainsi « Quick, Easy, Cheap,

Effective, Rugged, and Safe ». Cette méthode combine les étapes d'extraction et de

purification (Pinto et al., 2011 ; Satpathy et al., 2011). Les avantages de cette nouvelle

méthode par rapport aux méthodes classiques sont la diminution du temps nécessaire pour

accomplir l’extraction et la purification. Ainsi le volume de solvant utilisé pour l’extraction

est réduit.

La méthode QuEChERS a été adaptée et validée pour l’analyse simultanée des HAP, PCB et

OCP dans le sédiment du complexe lac Ichkeul-Lagune de Bizerte. Puis l’analyse chimique

de 50 molécules organiques (16 HAP, 12 PCB et 22 pesticides organochlorés (POC)) a été

réalisée pour les sédiments collectés à 20 différents sites du complexe et à deux campagnes de

prélèvement.

92


Bartolomé L, Cortazar E, Raposo JC, Usobiaga A, Zuloaga O, Etxebarria N, Fernández LA,

2005. Simultaneous microwave-assisted extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons,

polychlorinated biphenyls, phthalate esters and nonylphenols in sediments. Journal of

Chromatography A, 1068: 229-236.

de Boer J, Law RJ, 2003. Developments in the use of chromatographic techniques in marine


hydrocarbons. Journal of Chromatography A, 1000: 223-251.

Carvalho PN, Rodrigues PNR, Alves F, Evangelista R, Basto MCP, Vasconcelos MTSD,

2008. An expeditious method for the determination of organochlorine pesticides residues in

estuarine sediments usingmicrowave assisted pre-extraction and automated headspace solid-

phase microextraction coupled to gas chromatography–mass spectrometry. Talanta,

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Cueva-Mestanza R, Sosa-Ferrera Z, Torres-Padrón ME, Santana-Rodríguez JJ, 2008.



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assisted extraction followed by solid-phase extraction treatment for polycyclic aromatic

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of multi-residues of pesticides in fruits and vegetables by microwave-assisted extraction

(MAE)–dispersive solid-phase extraction (d-SPE)–retention time locked (RTL)–gas

93

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Vagi MC, Petsas AS, Kostopoulou MN, Karamanoli MK, Lekkas TD, 2007.

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Water Quality/9th CEST conference), 210: 146-156.

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coupled with solid phase microextraction for the determination of organochlorine pesticides in

soil samples. Analytica Chimica Acta, 571: 51-57.

94

I. Publication 2 :

Submitted to: Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology

Validation of an adapted quick, easy, cheap, effective, rugged and safe method for the

simultaneous analysis of poly-aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and

organo-chlorine pesticides in sediment by Gas chromatography–mass spectrometry

Fida Ben Salem1,2

, Olfa Ben Said1,2

, Robert Duran2, Mathilde Monperrus

3

1Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Faculté des Sciences de Bizerte,

Université de Carthage, Tunisie.

2Equipe Environnement et Microbiologie – IPREM UMR 5254 CNRS – Université de Pau et

des Pays de l’Adour, France

3Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR 5254

CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

Corresponding author: Mathilde Monperrus, UFR Sciences et Techniques de la Côte Basque

Allée du Parc Montaury - 64600 Anglet – France, [email protected], Fax :

+33(0)5 59 57 44 09,

95

Abstract:

A quick, easy, cheap, effective, rugged and safe (QuEChERS) method has been adapted and

validated for the simultaneous analysis of poly-aromatic hydrocarbons (PAHs),

polychlorinated biphenyls (PCBs) and organo-chlorine pesticides (OCPs) in sediment

samples. The sample preparation method was adapted by modifying the solvent and the

extraction technique, and then optimized to the sediment amount. The performances were

evaluated in terms of accuracy, linearity and limits of detection and validated by the analysis

of a reference marine sediment material (SRM 1941b). Satisfactory recoveries were obtained

for the simultaneous analysis of PAHs, PCBs and OCPs, with the mixture dichloromethane-

acetone as solvent for extraction combined with an ultrasonic agitation. Correlation

coefficients obtained R2>0.95 for all compounds show that the method is linear over the range

assayed (0-1000 ng g-1

) and low quantification limits were obtained from 0.02 to 9.6 ng g-1

,

0.11 to 1.15 ng g-1

and 0.01 to 8.1 ng g-1

for PAHs, PCBs and OCPs, respectively. The

obtained concentrations for the SRM 1941b are in good agreement with the certified values

with recoveries ranging from 60% to 103% for PAHs, from 76 to 131% for PCBs and from 81

to 137% for OCPs. The repeatability was acceptable for all the compounds with RSD% lower

than 15%. The validated method was applied to the analysis of sediments from Bizerte area

(Tunisia) showing the presence of PAHs in the Bizerta lagoon while OCPs were the major

compounds found in the Ichkeul Lake.

Keywords: QuEChERS extraction, sediment, poly-aromatic hydrocarbons, polychlorinated

biphenyls, organo-chlorine pesticides.

96

1. Introduction

The analysis of organic compounds in sediment is very complex because they are strongly

bound to sediment organic matter and requires optimization and validation of rapid, robust

and sensitive analytical procedures. The main critical step in the analytical procedure for

sediment analysis is the extraction which needs suitable solvent and extraction technique to

obtain corrected recoveries for the analytes of interest. Many extraction techniques used for

the analysis of organic compounds were developed. Traditionally, the standard technique has

been the Soxlhet extraction with non-polar solvents (de Boer and Law 2003). But this

technique present several drawbacks such as long extraction time and large volume of solvent,

alternative techniques were developed including microwave-assisted extraction (Bartolomé et

al. 2005; Moreno et al. 2006; Carvalho et al. 2008; Cueva-Mestanza et al. 2008; Itoh et al.

2008) and ultrasonic-assisted extraction (Vagi et al. 2007; Errekatxo et al. 2008). Moreover,

the extraction step is generally followed by a clean-up step to remove any interfering

substances, which involves a time consuming solid phase extraction. All these techniques

have been used extensively for extractions on several environmental matrices such as soils,

sediments, biological tissues but they are not always easy to use and suitable for routine

applications. Recently, novel approaches, combining the extraction and the purification steps,

were developed and called QuEChERS method for ‘‘Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged

and Safe’’ method (Anastassiades et al. 2003; Pinto et al. 2011). These methods involve

extraction with acetonitrile partitioned from the aqueous matrix using anhydrous MgSO4 and

NaCl followed by a dispersive-SPE cleanup with MgSO4 and primary secondary amine

(PSA).The sample handling requirements of such methods are friendlier and the time required

to accomplish an extraction/clean up is significantly shorter. QuEChERS provides high

recoveries with simple analytical steps, low solvent consumption and could be applied to any

kind of solid matrices (mineral or organic) and appropriate to very volatile compounds

97

(Rouvière et al. 2012). Mainly applied for pesticides in food matrices (Lehotay et al. 2010;

Cieslik et al. 2011; Lee et al. 2011; Wilkowska and Biziuk 2011; Wang et al. 2012), the

application of QuEChERS methods to other organic pollutants is limited. QuEChERS method

was successfully applied for determining PAHs (Ramalhosa et al. 2009) and PCBs (Norli et

al. 2011) in fish, pharmaceuticals and hormones in sewage sludge (Peysson and Vulliet 2013)

and soil (Bragança et al. 2012). QuEChERS method was also validated for trihalomethanes

(chloroform, bromodichloromethane, dibromochloromethane and bromoform) and BTEX

(benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes) in soil samples (Anastassiades et al. 2003).

Recently, Peysson and Vulliet (2013) applied the QuEChERS method for the determination of

136 pharmaceutical compounds and hormones in sewage sludge (Peysson and Vulliet 2013).

The objective of the present study was the adaptation and the validation of QuEChERS

method for the simultaneous analysis of PAHs, PCBs and OCPs in sediment by GC-MS

2. Experimental

2.1. Reagents and chemicals

PCB standard solutions, either as compound mix, containing PCB 18, 28, 31, 44, 52, 101,

138, 118, 153, 149, 180, 194 and single compound solution of PCB 209 were purchased from

Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). The 16 priority PAHs (Naphthalene,

Acenaphthylene, Acenaphthene, Fluorene, Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Pyrene,

Benzo[a] anthracene, Chrysene, Benzo[b] fluoranthene, Benzo[k] fluoranthene, Benzo[a]

pyrene, Indeno[1,2,3-cd] pyrene, Dibenzo[a,h] anthracene, Benzo[ghi] perylene), as well as

three deuterated internal standards naphthalene-d8, phenanthrene-d10 and perylene-d12 were

supplied as pure reference materials (purity: 99.5%) also from Sigma Aldrich. OCPs standard

solutions of HCB, aldrin, dieldrin, heptachlor, heptachlor epoxide isomer B, endrin, endrin

aldéhyde, α and β endosulfan, endosulfan sulfate, 4,4'-DDE, 4,4'-DDD, 4,4'-DDT, α and β

98

chlordane, α and β nonachlor and an internal standards atrazine-d5 were purchased from

Sigma Aldrich. All standard stock solutions were prepared in acetonitrile and stored at-20°C.

Organic solvents (hexane, acetone, acetonitrile, and dichloromethane) were of analytical

grade and were supplied by Sigma Aldrich. The QuEChERS extract tubes were obtained from

Agilent Technologies (Massy, France) and contained the citrate buffer salt mixture (4g of

MgSO4, 1g of NaCl, 0.5g disodium citrate sesquihydrate and 1 g of trisodium citrate

dehydrate). Dispersive SPE tubes (containing 900 mg of MgSO4 and 150 mg of primary

secondary amine exchange PSA) were obtained from Agilent Technologies (Massy, France).

2.2. Standard reference material and real samples

Marine sediment standard reference material (SRM 1941b) was obtained from the National

Institute of Standards & Technology (Gaithersburg, MD, USA), Value for Total Organic

Carbon in SRM 1941b is 2.99±0.24 g/100g Mass fraction. Real sediment samples used for

application were collected from the lagoon of Bizerta and the Ichkeul Lake (Tunisia). The

sediments were placed in glass bottles and were kept frozen at -20°C. Samples were freeze

dried in a ZirBus Vaco2 lyophilier and stored at 4°C before analysis.

2.3. QuEchERS extraction/purification procedure

The QuEChERS method normalized and validated by Yang et al. (2010) for the analysis of

pesticides in soil was adapted and validated for the simultaneous analysis of PAHs, PCBs and

OCPs. An aliquot of 5g of sediment was weighed into a polypropylene tube (50 mL capacity).

Then, 4 mL ultrapure water was added, the tube was manually shaken and internal standards

(naphthalene d8, phenanthrene d10, perylene d12, PCB 209, Atrazine d5) were introduced. 20

mL of extraction solvent were then added and the tube was shaken vigorously by hand for 1

min. Afterwards, the citrate buffer salt mixture was added and the tube was shaken vigorously

either manually (5min) or by ultrasonic agitation (15min). Finally, the tube was centrifuged

99

for 3 min at 2500 rpm and 10 mL of the supernatant were transferred into another

polypropylene tube (15 mL capacity) already containing 900 mg of MgSO4 and 150 mg PSA.

The tube was shaken vigorously by hand for 30 s and centrifuged for 3 min at 2500 rpm. The

extracts were then dried under a gentle argon stream using a Turbovap LV Concentration

Evaporator system. The dried residue was re-dissolved with 1 mL acetonitrile and kept at

−20°C until analysis. The conventional QuEChERS extraction conditions using acetonitrile

was compared with modified methods using tow mixture of solvents: hexane-acetone (HA)

(50:50 v:v) and dichloromethane-acetone (DA) (50:50 v:v). Although extraction methods

were adapted with comparison of manual or ultrasonic agitation and two amounts of sediment

used for extraction were tested (Table 1). Two replicates were considered for each experiment

with two injections. An internal standard correction was used for the quantification of the

analytes.

Table 1. The different experiments performed for the adaptation of the QuEChERS extraction

2.4. GC-MS Analysis

The analyses were performed by using a gas chromatograph (Agilent 7890A) coupled to a

mass spectrometer with an electron impact ionization source (EI) Agilent 5975C. The GC–

MS system was equipped with an Agilent DB5-MS UI column. The ion source temperature

Experiment name Extraction solvent Extraction technique Amount of

sediment (g)

Experiment 1

Experiment 2

Experiment3

Experiment4

Experiment5

Acetonitrile

1:1 hexane:acetone

1:1 dichloromethane:acetone

1:1dichloromethane:acetone

1:1dichloromethane:acetone

manual agitation

manual agitation

manual agitation

Ultrasonic agitation

Ultrasonic agitation

2

2

2

2

5

100

and the quadrupole temperature were both kept at 230°C and 150°C, respectively. A sample

volume of 1 μL of the concentrated extract was injected in pulsed splitless mode at an inlet

temperature of 280°C. Retention time and target monitoring of the different compounds

analyzed by GCMS are summarized in Table 2.

Table 2. Retention time and target monitoring of the different compounds analyzed by GCMS

Compounds Retention Time Target ion m/z Qualifier ion m/z

PAHs

Naphthalene

Acenaphthylene

Acenaphthene

Fluorene

Phenanthrene d10

Phenanthrene

Anthracene

Fluoranthene

Pyrene

Benzo[a]anthracene

Chrysene

Benzo[b]fluoranthene

Benzo[k]fluoranthene

Benzo[a]pyrene

Perylene-d12

Indeno[1,2,3-cd]pyrene

Dibenzo[a,h]anthracene

Benzo[ghi]perylene

PCBs

PCB 18

PCB 31

PCB 28

PCB 52

PCB 44

PCB101

PCB 149

PCB 118

PCB 153

PCB 138

PCB 180

PCB 194

PCB 209

Pesticides

Hexachlorobenzene

Atrazine d5

α Endosulfan

Dieldrin

β Endosulfan

Heptachlor

Heptachlor Epoxide Isomer B

Endrin

Endrin aldéhyde

Aldrin

4,4'-DDE

4,4'-DDD

6.54

10.25

10.83

12.84

18.54

18.83

18.25

26.98

28.51

37.90

38.15

45.60

45.68

47.31

48.00

54.42

54.74

55.72

18.50

21.22

21.38

23.53

24.78

28.92

32.55

32.68

34.04

35.63

39.57

44.88

48.60

16.36

17.00

29.20

30.50

32.52

22.13

26.54

30.44

33.58

24.23

30.85

33.37

128

152

153

166

188

178

178

202

202

228

228

252

252

252

264

276

276

276

186

256

186

220

292

326

360

326

360

360

394

430

498

284

220

241

79

195

100

81

81

67

66

246

235

129

153

154

165

189

179

179

203

203

226

226

253

253

253

260

277

277

277

256

186

256

292

220

254

362

328

362

290

396

428

214

286

205

39

81

241

272

353

263

345

263

318

237

101

4,4'-DDT

α chlordane

β chlordane

cis-Nonachlor

trans-Nonachlor

35.55

28.20

29.13

29.44

33.21

235

373

373

407

409

235

375

375

409

407

3. Results

3.1. Adaptation of the QuEChERS method

The results obtained with the different tested extraction methods are presented in Table 3.

Table 3. Concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPs in the certified reference

materials SRM 1941b by the different experiments (see Table 1) and comparison with the

certified values (CV) (concentration ng.g-1

± SD standard deviation), na: not available, -: not

determined.

Compounds CV Exp1 Exp2 Exp3 Exp4 Exp5

PAHs

Naphthalene

Acenaphthylene

Acenaphthene

Fluorene

Phenanthrene

Anthracene

Fluoranthene

Pyrene

Benzo[a]anthracene

Chrysene



Benzo[a]pyrene


Dibenzo[a,h]anthracene

Benzo[ghi]perylene

PCBs

PCB 18

PCB 28

848±95

53.3±6.4

38.4±5.2

85±15

406±44

184±18

651±50

581±39

335±25

291±31

453±21

225±18

358±17

341±57

53±10

307±45

2.39±0.29

4.52±0.57

824.0±38.9

50.9±2.7

24.0±2.4

52.1±6.6

287.1±21.8

151.3±8.4

541.8±6.6

532.4±36.1

332.1±62.3

325.2±35.1

417.0±43.9

191.4±14.0

219.9±31.7

255.6±28.7

65.6±5.4

256.0±60.0

0.86±0.15

1.32±0.04

398.5±26.5

52.9±2.9

12.0±4.3

29.4±11.3

182.5±84.1

78.6±1.3

482.0±20.3

414.1±17.2

194.3±13.7

215.4±0.2

347.5±24.2

179.3±20.6

191.8±0.6

154.9±5.4

75.1±6.5

191.6±17.0

1.42±0.16

3.04±0.86

161.5±152.0

53.7±5.6

5.8±0.9

18.4±0.2

174.0±23.3

75.9±7.1

482.0±38.1

414.4±28.7

374.7±14.1

273.5±14.9

467.6±21.9

224.2±24.3

201.2±42.3

156.5±22.8

65.2±10.8

203.1±30.4

1.04±0.14

2.83±0.66

310.8±7.7

47.8±3.4

12.7±2.8

27.5±3.4

243.6±13.1

141.9±3.3

602.5±88.0

517.8±81.7

332.3±68.7

280.8±34.1

394.6±61.2

201.1±38.2

204.5±38.0

258.4±21.7

66.3±7.2

312.8±20.2

1.61±0.10

2.64±0.35

335.6±64.5

40.1±3.5

11.2±1.7

19.5±2.4

243.7±11.8

114.2±6.2

580.0±20.1

473.3±13.1

337.2±32.3

239.3±13.5

410.6±28.1

221.6±9.8

244.6±9.3

222.7±15.5

53.5±2.5

315.6±17.2

2.01±0.21

3.45±0.22

102

PCB 31

PCB 44

PCB 52

PCB101

PCB 118

PCB 138

PCB 149

PCB 153

PCB 180

Pesticides

Hexachlorobenzene

2,4'-DDE

4,4'-DDE

4,4'-DDD

4,4'-DDT

α chlordane

β chlordane

cis-Nonachlor

trans-Nonachlor

3.18±0.41

3.85±0.2

5.25±0.28

5.11±0.34

4.23±0.19

3.6±0.28

4.35±0.26

5.47±0.32

3.24±0.51

5.83±0.38

0.38±0.12

3.22±0.28

4.66±0.46

1.12±0.42

0.85±0.11

0.5±0.09

0.38±0.05

0.44±0.07

1.44±0.15

1.73±0.24

2.11±0.25

2.34±0.19

3.08±0.25

2.64±0.23

1.94±0.18

3.28±0.10

2.33±0.29

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2.03±0.26

2.99±0.54

2.87±0.49

3.29±0.48

4.74±0.72

3.45±0.10

3.42±0.49

5.17±0.87

3.75±0.66

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2.22±0.15

3.33±0.51

3.79±1.06

3.52±0.29

5.01±0.49

4.16±0.11

3.35±0.25

5.3±0.2

3.54±0.36

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2.77±0.46

3.34±0.09

4.12±0.28

4.16±0.20

5.47±0.22

5.07±0.14

3.98±0.07

6.32±0.14

3.87±0.15

-

-

-

-

-

-

-

-

-

3.27±0.30

3.80±0.35

4.54±0.29

4.25±0.38

3.91±0.36

4.17±0.42

4.57±0.70

4.90±0.72

4.23±0.46

4.72±0.31

0.70±0.13

3.18±0.37

3.94±0.43

1.44±0.04

0.73±0.07

0.69±0.08

0.41±0.04

0.45±0.05

The analysis of the certified reference sediment showed that ACN (acetonitrile) was the best

solvent for PAHs extraction and the mixture DA (dichloromethane/acetone) was better than

the HA (hexane/acetone) mixture (Figure 1a). The best extraction efficiencies for most PCBs

were obtained with the DA and HA solvent mixtures (Figure 1b) whereas lower recoveries

were obtained using ACN. Thus, the DA mixture was found to be the best solvent for the

simultaneous extraction of PAHs and PCBs. Pesticides were not analyzed during these

experiments but previous reports showed that dichloromethane was the best solvent for the

simultaneous extraction of PAHs, PCBs and pesticides (Thompson et al. 2002) as well as for

OCPs in soil (Norli et al. 2011). The mixture DA was thus chosen for the simultaneous

extraction of PAHs, PCBs and OCPs.

The comparison of the techniques used for extraction showed that the ultrasonic agitation

improved extraction efficiencies compared to manual agitation for PAHs and PCBs (Figures

103

1a and 1b). This result is consistent with previous works that showed highest recoveries when

sediment samples were extracted by ultrasonication (Pinto et al. 2011). It was also shown that

the time of ultrasonication had no statistically significant effect on the extraction efficiency

(Anastassiades et al. 2003), thus 15 minutes of ultrasonication was applied in this study.

Regarding the mass of sample used for the analysis, when increasing the amount of sediment

from 2 to 5 g for the extraction (experiments 4 and 5) no significant difference was observed

for both PAHs and PCBs (Figures 1a and 1b). Therefore, it was decided to use a mass of 5 g

to avoid problems with the limits of detection when working with real samples.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

CV

Exp 1

Exp 2

Exp 3

Exp 4

Exp 5

104

Fig1. Comparison of concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPsin the different

extraction experiments and in the certified reference materials SRM 1941b for PAHs (a) and

PCBs (b).

3.2. Analytical performances

Analytical performances of the adapted method were evaluated in terms of linearity (R2),

detection and quantification limits (LOD, LOQ), recovery (R%) and repeatability (RSD%).

Results are presented in Table 4. The linearity was verified using standard solutions in the

range of 0-1000 ng g-1

. Good correlation coefficients (R2>0.95) were obtained for all

compounds except for Endrin, demonstrating that the method is linear over the range assayed.

The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were determined by considering a

signal value 3 and 10 times respectively that of background noise obtained for blank samples.

The LOQ values are below 10 ng g-1

, 2 ng g-1

and 2.5 ng g-1

for PAHs, PCBs and OCPs

(except for Endrin), respectively. These low LOQs allow application of the QuEChERS

0

1

2

3

4

5

6

7

PCB18 PCB28 PCB31 PCB44 PCB52 PCB101 PCB118 PCB138 PCB149 PCB153 PCB180

CV

Exp 1

Exp 2

Exp 3

Exp 4

Exp 5

105

method followed by GC-MS to monitor simultaneously these compounds in environmental

studies.

Table 4. Analytical performances of the QuEChERS method.na not avalaible, R2=linearity,

LOD=Limits of detection, LOQ=Limits of quantification, R%=Recoveries,

RSD=reproducibility.

Compounds R2 LOD (ng.g

-1) LOQ (ng.g

-1) R (%) RSD (%)

Naphthalene 0.999 0.01 0.03 40 19

Acenaphthylene 0.999 0.02 0.05 75 9

Acenaphthene 0.992 0.01 0.02 29 16

Fluorene 0.999 0.06 0.15 23 13

Phenanthrene 0.999 0.18 0.31 60 5

Anthracene 0.999 0.04 0.10 62 5

Fluoranthene 0.999 0.07 0.12 89 3

Pyrene 0.999 0.09 0.22 81 3

Benz[a]anthracene 0.998 0.38 0.85 101 10

Chrysene 0.999 0.47 1.19 82 6

Benzo[b]fluoranthene 0.998 0.60 1.16 91 7

Benzo[k]fluoranthene 0.996 0.54 1.17 98 4

Benzo[a]pyrene 0.998 0.95 1.34 68 4

Indeno[1,2,3-cd]pyrene 0.996 0.95 1.40 65 7

Dibenz[a,h]anthracene 0.997 3.85 9.64 101 5

Benzo[ghi]perylene 0.996 0.52 1.60 103 5

PCB18 0.989 0.04 0.11 84 10

PCB28 0.984 0.11 0.29 76 6

PCB31 0.984 0.09 0.24 103 9

PCB44 0.974 0.06 0.18 99 9

PCB52 0.985 0.01 0.02 87 6

PCB101 0.980 0.07 0.18 83 9

PCB118 0.978 0.09 0.20 92 9

PCB138 0.962 0.42 1.15 116 10

PCB149 0.978 0.20 0.52 105 15

PCB153 0.957 0.05 0.13 90 15

PCB180 0.959 0.12 0.34 131 11

106

Hexachlorobenzene 0.993 0.01 0.05 81 7

2,4'-DDE 0.988 0.14 0.45 na 18

4,4'-DDE 0.971 0.03 0.11 99 12

4,4'-DDD 0.954 0.27 0.90 85 11

4,4'-DDT 0.954 0.38 1.27 129 3

α chlordane 0.999 0.00 0.01 86 10

β chlordane 0.985 0.00 0.01 137 12

cis-Nonachlor 0.996 0.00 0.01 108 9

trans-Nonachlor 0.999 0.00 0.01 102 12

The accuracy of the whole adapted method was evaluated by determining the recoveries

obtained for the certified reference sediment. The obtained data with the adapted method

showed acceptable recoveries ranging from 60% to 103 % for heavier PAHs with values of

relative standard deviation lower than 10%. For the light PAHs, the recoveries ranged from

23% to 75% with higher RSD% (9-19%). As expected, the values for PAHs were higher

according to the molecular weight. Lower recoveries and lower repeatability for lighter

molecular weight can be attributed to loss, mainly by evaporation during the sample

preparation. Recoveries ranging from 76% to 131% for PCBs and from 81% to 137% for

pesticides with RSD% lower than 15% for both compounds families were obtained.

Our results are almost in the same range of recoveries than those obtained in precious studies

for heavy PAHs (Concha-Grana et al. 2010; Thompson et al. 2002), but better and more

reproducible than those obtained for PCBs (53-149%) and pesticides (71-420%) using a

microwave extraction and dichloromethane as solvent extraction with the same materiel

reference 1941b (Wang et al. 2012). Moreover, it is more efficient than the method used by

Brondi et al. (2011) for pesticides (48-115%) using a QuEChERS method with MeCN as

extraction solvent and without ultrasonic agitation.

107

3.3. Application to real samples

The adapted method was applied to the analysis of real sediments samples from the hydro-

system complex of the Bizerta Lagoon /Ichkeul Lake (Tunisia) constituting 2 different

ecosystems. The results (Table 5) showed that Bizerta Lagoon sediments contained high

PAHs levels with concentrations ranging from 6 to 2605ng g-1

whereas the Ichkeul Lake

sediments exhibited a low PAHs contents (from 3 to 202 ng g-1

). Concentrations of PAHs

from Bizerta Lagoon were similar to those observed previously in sediment from the same

ecosystem (Ben Said et al. 2010; Mzoughi et al. 2005). The sediments from Ichkeul Lake

exhibited higher concentrations of pesticides (from 1.06 to 862 ng g-1

) than those from the

Bizerte Lagoon (from 0.56 to 24 ng g-1

). High concentrations were specially observed for

Dieldrin and Endrin.

For both ecosystems no contamination by PCBs was observed with concentrations ranging

from 0.15 to 1.88 ng g-1

. These results confirmed our assumption on the sources of

contamination since the area of Bizerta Lagoon is subject to contamination by two industrial

zones while the Ichkeul Lake is surrounded by a vast agricultural area. Further analysis of

sediments using this rapid and efficient developed method would help to determine precisely

the dispersion and the reactivity of these contaminants in the Bizerte area.

Table 5. Concentrations of PAHs, PCBs and OCPs in sediment collected from Bizerta Lagoon

and Ichkeul Lake (concentrations ng g-1

± SD (n=3)).

Compounds Bizerta lagoon Ichkeul lake

Naphthalene

Acenaphthylene

Acenaphthene

Fluorene

Phenanthrene

Anthracene

Fluoranthene

Pyrene

Benz[a]anthracene

3169±437

121±30

399±131

298±5

1882 ±566

323 ±87

1658 ±262

1790 ±244

951 ±662

103±8

2.41±1.89

5±1

5.1±0.2

29.1±7.4

5.03±0.56

13 ±5

21 ±6

6.1±0.1

108

Chrysene



Benzo[a]pyrene



Benzo[ghi]perylene

PCB 18

PCB 28

PCB 31

PCB 44

PCB 52

PCB101

PCB 138

PCB 118

PCB 153

PCB 149

PCB 180

PCB 194

αEndosulfan

Dieldrin

β Endosulfan

Heptachlor


Endrin

Endrin aldéhyde

Aldrin

4,4'-DDE

4,4'-DDD

4,4'-DDT

791 ±478

1827 ±340

674 ±11

1215 ±189

2605 ±836

607 ±41

1290 ±105

0.244 ±0.137

0.195±0.004

0.215 ±0.025

0.175 ±0.050

0.948 ±0.063

0.206 ±0.023

0.223 ±0.024

<LOQ

0.387±0.027

0.234 ±0.020

0.314 ±0.031

1.396 ±0.097

4±1

20 ±2

2.1 ±0.2

0.8 ±0.1

10±6

24 ±2

3.05±0.03

<LOQ

0.8 ±0.2

0.56±0.02

<LOQ

7.3±0.6

11.4±3.5

3.4±0.1

8.6±0.3

202 ±24

7 ±5

15 ±11

0.247 ±0.139

0.251 ±0.001

0.372 ±0.018

0.422 ±0.055

1.093 ±0.021

0.296 ±0.014

0.268 ±0.032

<LOQ

0.223±0.058

0.152 ±0.026

0.374 ±0.079

1.880 ±0.115

107.3±0.2

744 ±36

<LOD

1.06±0.01

13 ±2

862 ±59

3.0 ±0.1

1.12±0.03

1.5 ±0.2

1.5 ±0.7

<LOQ

4. Concluding remarks

The simultaneous extraction of PAHs, PCBs and OCPs in sediment was successfully

validated using a QuEChERS method combining a dichloromethane-acetone extraction with

ultrasonic agitation. This method was found to be accurate and reproducible for the analytes

of interest and sufficiently sensitive for the analysis of real sediment samples in the ng g-1

range. The simplicity, the rapidity and the low cost of the QuEChERS extraction are

advantages for using this method in environmental studies as demonstrated by the analysis of

PAHs, PCBs and OCPs contents in sediments in two ecosystems.

109

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109

II. Publication 3 :

To be submitted to: Marine Pollution Bulletin

Organic contamination of sediments from Ichkeul Lake (protected area) and Bizerta

Lagoon (Anthropized ecosystem) watershed (Tunisia)

Fida Ben Salema,b,c*

, Olfa Ben Saida,b

, Ezzeddine Mahmoudia, Robert Duran

b,

Mathilde Monperrusc

(a) Laboratory of Environment Biomonitoring, Faculty of Sciences of Bizerte, 7021,

Zarzouna, Tunisia – University of Carthage

(b) Equipe Environnement et Microbiologie – MELODY group - UMR CNRS IPREM

5254- IBEAS- Université de Pau et des Pays de l'Adour - France.

(c) Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR

5254 CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France





Tel: +216 72 400 121 Fax: + 216 72 590 566



110

Abstract

Determination of organochlorine pesticides (OCPs), Polycyclic Aromatic Hydrocarbons

(PAHs), Polychlorinated biphenyls (PCBs) and butyltin (BuSn) was conducted in sediments

from Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon watershed (Tunisia). A total of 59 compounds (16 PAHs,

12 PCBs, 22 OCPs and 9 BuSn) were monitored in forty surface sediment samples collected

during two campaigns. High concentrations of total PAHs were recorded ranging from 122 to

19600 ng.g-1

. Some OCPs such as Endrin, Dieldrin and Lindane (Hexachlorocyclohexane:

HCH) presented high concentration levels ranging from 28 to 2021 ng.g-1

. The concentration

of total PCBs was between 0.6 and 9.6 ng.g-1

indicating that there was contamination by PCBs

low than the internationals norms. Regarding butyltin there was contamination except for the

stations subject to maritime traffic, located in the path of vessels entering the channel of

Bizerta arriving to the port of Menzel Bourguiba and Ichkel lake. This study is the first

attempt to investigate organic contamination in Ichkeul Lake, which is a RAMSAR site and

UNESCO World Heritage site. Also pesticides are newly sought in environmental matrix and

the first in sediment in Tunisia.

Keywords: organochlorine pesticide, polycyclic aromatic hydrocarbon, polychlorinated

biphenyl, butyltin, UNESCO World Heritage site, aquatic ecosystem.

Highlights :

Bizerta lagoon is contaminated essentially by PAHs in sites submitted to maritime

traffic

Ichkeul lake is contaminated essentially by pesticides from the vast agriculture areas

There is no contamination by PCBs in the complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon

111

1. Introduction

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), organochlorine pesticides (OCPs), polychlorinated

biphenyls (PCBs) are classes of persistent organic pollutants (POPs). PAHs may originate

from incomplete combustion of organic matter, biosynthesized by some plants and fungi,

exploitation, transformation and combustion of fuel, tanker ballast washings, tanker accidents

and oil exploration and production (Biache et al., 2014). Commercial production of PCBs

began in 1929 and increased dramatically as their use as inter alia dielectric fluids in

capacitors and transformers, became more widespread. PCBs play a major part in the

contamination of the environment, because of their high physical-chemical stability. OCPs

were excessively used in agriculture to control pests (Gonzalez et al., 2005). These

contaminants enter into the environment from numerous sources, including river run-off,

atmospheric precipitation, industry, households and all types of transportation (Wen et al.,

1994; Chang et al., 2006). POPs have been detected in various environmental matrixes and

biota (Chang et al., 2006; Schoellhamer et al., 2007; Wasswa et al., 2011; Lin et al., 2012;

Figueiredo et al., 2014; Szlinder-Richert et al., 2014; Li et al., 2015). They were detected in

rivers (Yang et al., 2014; Yu et al., 2014; Jürgens et al., 2015), marine water (Brondi et al.,

2011; Miège et al., 2012; Yadav et al., 2015) and sediments (Li etal., 2015; Ma et al., 2015).

Aquatic ecosystem receives these pollutants from agricultural and industrial activities

(Sharma et al., 2014). Several studies have shed light on the presence of industrial pollutants

like PAH, metals, PCB called priority substances (Wenzel et al., 2006; Deycard et al., 2014),

in environment (Shu et al., 2000; Vane et al., 2007; Ben Said et al., 2010; Opel et al., 2011)

and their impacts on different trophic levels (Carro et al., 2014; Yohannes et al., 2014).

While, pesticides are newly sought. Although environmental concentrations are highest near

the sources, the presence of contaminants in places distant from primary sources indicates that

POPs are persistent in the environment and they can be transported at long distances (Pozo et

112

al., 2014). Pollutants from different origins reach the end in the sediment known as the

principal reservoir of environmental contaminants (Birch and Davey, 1995). Many of these

compounds are toxic to aquatic life and potentially harmful to humans (Tolosa et al., 2005;

Sharma et al., 2014). Coastal lagoons and lakes are generally ecosystems stressed by the

impact of large cities, industrial activities and intensive agriculture. Rivers and estuaries can

serve as important sources of metal and organic contaminants to coastal marine environments

(Pozo et al., 2014; Yang et al., 2014). Bottom sediments are considered as important elements

of aquatic ecosystems, the binding of organic Pollutants compounds with sediments is very

complex, which requires laborious analytical procedures for their analysis. In Tunisia, during

the past decades researchers have taken the determination of PAHs (Ben said et al., 2010;

Mzoughi et al., 2002; Trabelsi and Driss, 2005) and organotin (Mzoughi et al., 2005) in the

sediment of Bizerta Lagoon, but only one study was performed for the determination of PCB

contamination in surface sediments at Monastir Bay (Nouira et al., 2013). Even throughout

Tunisia, there is no study reported for the determination of pesticides in sediments but

pesticides were investigated in other biological matrixes such as human milk, from Bizerta

and various Tunisia places (Ben Hassine et al., 2012; Ennaceur et al., 2008), in mullet and sea

bass (Ben Ameur et al., 2013). Pollutants from agricultural activities may impact the health of

aquatic organisms and subsequently local and migratory birds. But, surprisingly the Ichkeul

Lake, it is an important stopover point for hundreds of thousands of migrating birds each year

(Stevenson, 1991), has never been investigated regarding organic contamination.

The current study aimed to investigate the occurrence and distribution patterns of OCPs,

PAHs, PCBs and BuSn compounds in sediment of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex

(Tunisia). A QuEChERS extraction method was applied with Gas chromatography–mass

spectrometry (GC-MS) for the determination of these pollutants. Sediment composition and

113

contaminant profiles from different sites of each ecosystem and the entire complex were

comparedin order to evaluate the organic contamination and the potential sources.

2. Materials and Methods

2.1. Study region and sampling

Ichkeul Lake –Bizerta Lagoon complex is located at the Northern region of Tunisia. The Tinja

River connects the Lake to the Lagoon and several rivers feed the hydrosystem complex (Fig.

1). The complex has been exploited for fishing activities since several centuries and the

lagoon also for mussel farming since 1964. Bizerta Lagoon is open to the Mediterranean Sea

by a channel. The area of Bizerta Lagoon is approximately128 km2 and it is subjected to

contamination from two industrial zones, oil refinery, cement plant... (Ben Said et al., 2010;

Mzoughi et al., 2010; Trabelsi et al., 2012) and agricultural lands located on the Bizerta

Lagoons’ edge. The Ichkeul Lake is a protected area covering 90 km2; it is an important

stopover point for hundreds of thousands of migrating birds each year (Stevenson, 1991). The

area is a Biosphere reserve, a Ramsar site, and a UNESCO World Heritage Site (Kraïem and

Ben Hamza, 2000; Ramdani et al., 2001; Ben M’barek and Slim-Shimi, 2002). The

hydrology of the complex is seasonal. During winter, Ichkeul Lake is fed by fresh water from

the rivers increasing the water level. Then large volume of water is spilled to the Bizerta

Lagoon through the Tinja River. During the summer, the water level in the Ichkeul Lake is

low due to high evaporation and because it is no longer supplied by rivers. Hence, water from

Bizerta Lagoon enters to the Ichkeul Lake through the Tinja River. Thus, the Ichkeul Lake is

connected to the Mediterranean Sea and formerly had a seasonal salinity regime, freshwater

increasing with winters’ rainfall and decreasing in summer. The Ichkeul Lake receives

principally agricultural inputs as it is surrounded by a vast agricultural area(Stevenson and

Battarbee, 1991).

114

A total of 40 surface sediments samples were collected from 20 coastal sites of the complex

Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon, during two campaigns in September 2011 and April 2012, by

using a Van Veen grab. Sites were chosen as the mouths of the various rivers that feed the

complex, sites next to industrial and two sites centers of the lake and the lagoon. The position

sites of the samples are presented in Fig. 1. The sediments were placed in glass bottles and

were kept frozen at -20°C. Before analysis samples were freeze dried in a ZirBus Vaco2

lyophiliser.

Fig 1: Map of the Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon complex indicating the location of the

sampling sites (numbers)

115

2.2. Physical and chemical parameters

Water column temperature, pH, dissolved oxygen, salinity were determined in the field with a

handheld multi-parameter system WTW Multi-197i (Table 1). Nitrite and nitrate were

analyzed following the procedure of Wood et al. (1967). Ammonia was determined according

to Aminot and Chaussepied (1983). Phosphate levels were determined as described in Murphy

and Riley (1962). For chlorophyll a (Chla), seawater samples were filtered through Whatman

GF/F filters. Pigment concentrations were determined using the standard spectrophotometric

method (Parsons et al. 1984), following extraction with 10 mL 90% acetone overnight at 4°C

in the dark. Carbon organic contents were determined according to Espitalie et al. (1986).

Table 1. Physicochemical Parameters of water from the complex Ichkeul Lake-Bizerta

Lagoon

ST/HAPs T°C pH

Salinity

(PSU)

Conductivity (ms cm-1)

dissolved oxygen

(mg l-1)

Nitrite

(µM)

Nitrate

(µM)

Phosphore

(µM)

Ammonium

(µM)

Chla

(µg L-1)

Suspended material (mg)

Organic carbon

(mg g-1)

September ST1 Sep 21.8 7.52 39.1 58.9 7.4 0.07 11.30 0.05 5.47 0.27 0.01 3.15

ST2 Sep 22.6 7.71 39.7 59.5 10 0.64 6.19 0.30 14.88 0.40 0.04 3.02

ST3 Sep 23.2 7.89 37.0 55.9 8.4 0.19 5.34 5.73 12.52 0.13 0.02 3.02

ST4 Sep 23.3 8.06 37.3 56.2 9.6 0.00 18.26 0.12 6.05 0.27 0.02 2.90

ST5 Sep 23.4 8.05 35.4 53.8 8.2 0.82 1.91 2.69 16.05 0.94 0.02 2.94

ST6 Sep 23.5 8.04 36.4 55.1 8.8 0.03 6.07 0.37 4.29 0.67 0.01 3.76

ST7 Sep 23.2 8.15 35.4 53.7 8.7 0.06 21.47 0.69 1.94 0.80 0.01 3.06

ST8 Sep 23.6 8.08 36.1 54.6 9.5 0.13 18.22 0.44 11.94 1.47 0.02 3.14

ST10 Sep 24.1 7.33 37 56.1 6.3 0.51 0.59 0.51 19.00 0.16 0.03 3.55

ST11 Sep 24.6 7.72 36.4 55.4 5.4 0.84 9.52 0.05 15.47 0.27 0.03 3.51

ST12 Sep 23.9 7.77 36.5 55.3 5.5 0.34 17.22 0.37 11.35 0.14 0.03 4.34

ST13 Sep 24.3 7.66 36.4 55.4 5.9 0.69 7.02 0.62 18.41 0.35 0.03 2.12

ST14 Sep 24.5 7.70 37.4 56.5 6 0.03 17.82 0.65 6.64 0.95 0.04 4.12

ST15 Sep 24.3 7.67 36.7 55.5 5.6 0.52 7.83 0.62 13.70 0.73 0.06 2.90

ST16 Sep 24.4 7.76 36.8 55.9 5.9 0.88 13.48 1.51 36.64 0.49 0.04 3.41

ST17 Sep 24.5 7.79 34.9 53.4 6.1 0.64 3.37 1.08 16.64 0.67 0.04 5.08

ST18 Sep 24.6 7.74 37.4 56.6 6.1 0.49 5.20 0.98 21.94 0.53 0.03 5.72

ST19 Sep 24.4 7.84 37.7 57.0 6.2 0.56 15.88 0.15 13.11 0.84 0.03 7.24

April ST1 Apr 22.8 8.24 2.4 4.6 9.6 0.09 1.73 0.02 7.32 0.45 0.04

ST2 Apr 22.5 8.24 2.5 4.9 11 0.53 6.09 0.09 11.09 0.68 0.06

ST3 Apr 23.8 8.32 2.6 5.0 9.2 0.09 2.41 0.74 13.98 0.41 0.05

ST4 Apr 23.6 8.32 2.6 5.0 10.8 0.07 1.76 0.16 9.83 0.52 0.04

ST5 Apr 23.2 8.32 2.6 5.01 9 0.57 7.22 1.26 14.54 2.06 0.03

ST6 Apr 23.4 8.32 2.4 4.7 9.7 0.0 3 1.28 0.17 6.87 1.50 0.04

ST7 Apr 23.1 8.31 2.3 4.4 9.3 0.09 3.65 0.41 10.85 1.75 0.04

ST8 Apr 22.9 8.27 2.6 5.0 10.7 0.15 1.97 0.27 3.94 3.98 0.06

ST9 Apr 23.4 8.18 32.2 49.3 8.5 0.41 3.71 0.36 11.64 1.73 0.02

ST10 Apr 23.2 8.21 32.4 45.6 8.5 0.46 2.91 0.32 13.91 0.39 0.02

116

ST11 Apr 23.5 8.34 24.5 40.2 8.4 0.32 4.78 0.63 18.79 0.57 0.02

ST12 Apr 22.9 8.33 30 46.3 8.7 0.50 5.99 0.54 10.19 0.36 0.03

ST13 Apr 23.1 8.34 27 42.6 8.6 0.57 8.21 1.46 8.37 0.49 0.02

ST14 Apr 23.2 8.34 28.8 45.1 8.4 0.71 11.43 1.22 16.22 0.74 0.04

ST15 Apr 23.7 8.37 28.5 43.5 8.6 0.01 0.97 1.64 11.07 1.44 0.03

ST16 Apr 23.6 8.39 28.6 45.1 8.5 0.60 5.81 0.32 7.88 0.96 0.05

ST17 Apr 23.7 8.42 29 45.3 8.7 0.74 6.91 1.72 11.54 0.91 0.03

ST18 Apr 23.2 8.46 28.4 45.1 8.5 0.50 3.72 0.50 16.02 0.65 0.02

ST19 Apr 23.6 8.45 29.1 45.6 8.6 0.53 4.23 0.36 8.74 1.97 0.04

ST20 Apr 23.5 8.40 29.2 45.7 8.2 0.46 5.98 0.16 8.34 0.76 0.01

2.3. Solvents and chemical standards

Organic solvents (hexane, acetone, acetonitrile, and dichloromethane) were of analytical

grade and were supplied by Sigma Aldrich. Buffer salt mixture was obtained from Agilent.

Deionized water used in the experiment was obtained from a Milli-Q water Ultrapure Water

Purification Systems (France).

PCB standard solutions, either as compound mix, containing PCB-18, 28, 31, 70, 52, 101,

138, 118, 153, 149, 180, 194 and singles compounds solutions of PCB 209 and PCB 30 were

purchased from Sigma Aldrich. The 16 priority PAHs, as well as two perdeuterated internal

standards phenanthrene-D10 and perylene-D12 were supplied as pure reference materials

(purity: 99.5%) also from Sigma Aldrich. OCPs standard solutions of HCB, aldrin, dieldrin,

heptachlor, heptachlor epoxide isomer B, endrin, endrinaldehyde, α and β endosulfan,

endosulfan sulfate, 4,4'-DDE, 4,4'-DDD, 4,4'-DDT, α and β chlordane, α and β nonachlor and

an internal standards atrazine-D5 were purchased from Sigma Aldrich. Standard solutions

were prepared in acetonitrile.

2.4. Analytical methods

The samples were analyzed according to an adapted QuEChERS method for the simultaneous

analysis of OCPs, PAHs and PCBs in sediment by gas chromatography–mass spectrometry.

BuSn were analysed according to methods validated by Moreno et al., 2006.

117

QuEchERS extraction/purification procedure

The samples were analyzed according to an adapted QuEChERS method for the analysis of

OCPs, PAHs and PCBs in sediment by gas chromatography–mass spectrometry. The

QuEChERS method validated by Yang et al. (2010) for the analysis of pesticides in soil was

adapted for the analysis of OCPs, PAHs and PCBs in sediment samples. Briefly, an aliquot of

5 g of sediment was weighed into a polypropylene tube (50 mL capacity). Then, 4 mL

ultrapure water was added, the tube was manually shaken and the internals standards (atrazine

d5, PCB 30, phenanthrene-D10 and perylene-D12) were introduced. Then, 20 mL of

extraction solvent (dichloromethane-acetone (50:50 v:v)) were added and the tube was shaken

vigorously by hand for 1 min. Then, a citrate buffer salt mixture (4 g MgSO4, 1 g NaCl, 0.5 g

disodium citrate sesquihydrate and 1 g of trisodium citrate dehydrate) was added and the tube

was shaken vigorously manually (5 min). Finally, the tube was centrifuged for 3 min at 2500

rpm and 10 mL of the supernatant were transferred into another polypropylene tube (15 mL

capacity) already containing 900 mg of MgSO4 and 150 mg PSA. The tube was shaken

vigorously by hand for 30 s and centrifuged for 3 min at 2500 rpm. The extracts were then

dried under a gentle argon stream using a Turbovap LV Concentration Evaporator system.

The dried residue was re-dissolved with 1 mL acetonitrile and kept at −20°C until analysis.

GC-MS Analysis


mass spectrometer (Agilent 5975C) with an electron impact ionization source (EI). The GC–

MS system was equipped with an Agilent DB5-MS UI column. The carrier gas was helium

used at 1 mL min−1

flow rate. The ion source temperature and the quadrupole temperatures

were kept at 230°C and 150°C, respectively. A sample volume of 1 μL of the extracts was

injected in pulsed splitless mode at an inlet temperature of 280°C. The column temperature

118

was programmed as follows: the initial oven temperature was set at 80°C for 1 min, increased

to 160°C at 10°C/min (hold 5 min), then ramped at 3°C/min to 300°C (hold 2min). The MS

interface temperature was maintained at 300°C. The quantification was carried out in the

selected ion monitoring mode (SIM) selecting two characteristics fragments ions for each

compound. Two replicates were performed for each sample with two injections. An internal

standard correction was used for the quantification of the analytes.

2.5.Quality control

The accuracy of the method was evaluated by the recoveries obtained for the certified

reference sediment. The obtained data show acceptable recoveries ranging from 60% to 103%

for PAHs, from 76 to 131% for PCBs and from 81 to 137% for pesticides.

3. Results and discussions

The physical and chemical parameters observed in the sampling stations are summarized in

Table 1.Water temperature at all sampled sites exhibited comparable temporal fluctuation

from 21.8 to 24.6 °C in September and from 22.5 to 23.7 °C in April (Table 1). In dry season,

salinity varied from 34.9 to 37.7 PSU in Bizerta Lagoon and from 34.4 to 39.7 PSU in Ichkeul

Lake. In rainy season salinity varied from 31.2 to 34.4 PSU in Bizerta Lagoon and from 2.3 to

2.6 PSU in Ichkeul Lake. The drop in salinity at the Ichkeul Lake from 35 to 2.5 PSU is due

to the contribution of continental water from dams and rivers. In Bizerta Lagoon the channel

and marine stations 9, 10 are submitted to the marine influence with higher salinities.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

All PAH target compounds were detectable in sediment samples collected from the complex

Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. Bizerta Lagoon was much more contaminated with PAHs than

Ichkeul Lake for two campaigns September and April. In September 2011, stations 10, 18 and

119

19 were the most contaminated at Bizerta Lagoon. Stations 9 and 12 were the most affected in

April (Fig.2). The site 10 located in the Mediterranean Sea near oil refining industry and sites

18 near the industrial area were contaminated by PAHs, as previously reported (Ben Said et

al., 2010). It is not surprising to found high PAHs levels in the sites 9 and 12 since they are

located at the channel of the Bizerta Lagoon, strongly impacted by maritime traffic of Menzel

Bourguiba harbor. The results are comparable to those reported previously (Mzoughi et al.,

2005; Ben Said et al., 2010). site 17 at Bizerta Lagoon was the less contaminated in April and

in September. This site is always subjected to water flow with permanent water renewal

eliminating all type of contaminant (Harzallah, 2003). For the Ichkeul Lake, sites 6 and 1

were the most contaminated in September. In April, stations 5, 1 and 2 were the most affected

by PAHs. Whatever the season, station 7 was the less affected with PAHs in September and

April. Site 1 was the most contaminated with PAHs at both seasons because there are fishing

boats installed and it is located near the Tinja River, which brings PAHs-contaminated waters

from Bizerta Lagoon (Fig 2). These results indicate that contamination by PAHs in the lagoon

and lake mainly due to accumulation of PAH in sediment from the maritime traffic. Seasonal

variation showed that contamination by PAHs was stronger in rainy season (April) than in dry

season (September) for the two ecosystems studied. These results were consistent with those

obtained by Mzoughi et al. (2005, 2002). Comparison with threshold published by the

National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) showed that the PAHs contents

in sites 6, 9, 10, 12, 18 exceeded the threshold effects level (TEL), site 12 exceeding the

probable effects level (PEL) (Table 2).

120

Fig 2: Spatial distribution of total PAHs in sediments of Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon

complex in April 2012. Gray rectangle: concentrations of total PAHs in April; black

rectangle: concentrations of total PAHs in September.

Table 2. Threshold effects level (TEL) (ng.g-1

dry wt) of OCPs from NOAA screening quick

references table

Compounds Marine sediment Freshwater sediment

Lindane

Chlordane

p,p DDD

p,p DDE

p,p DDT

DDT total

Dieldrin

Endrin

Heptachlor Epoxide

0.32

2.26

1.22

2.07

1.19

3.89

0.715

-

-

0.94

4.5

3.54

1.42

-

6.98

2.85

2.67

0.6

121

Fig 3a: Concentrations (ng.g-1

dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Ichkeul

Lake in April (ST1-ST8)

Fig 3b: Concentrations (ng.g-1

dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Bizerta

lagoon in April (ST9-ST20)

0

100

200

300

400

500

600

700

ST1

ST2

ST3

ST4

ST5

ST6

ST7

ST8

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

3500,00

Nap

hth

alen

e

Ace

nap

hth

ylen

e

Ace

nap

hth

ene

Flu

ore

ne

Ph

enan

thre

ne

An

thra

cen

e

Flu

ora

nth

ene

Pyr

ene

Ben

z[a]

anth

race

ne

Ch

ryse

ne

Ben

zo[b

]flu

ora

nth

ene

Ben

zo[k

]flu

ora

nth

ene

Ben

zo[a

]pyr

ene

Ind

eno

[1,2

,3-c

d]p

yren

e

Dib

enz[

a,h

]an

thra

cen

e

Ben

zo[g

hi]

per

ylen

e

ST11

ST12

ST13

ST14

ST15

ST16

ST17

ST18

ST19

ST20

122

Polychlorinated Biphenyls (PCBs)

Concentrations of PCBs detected in the sediment of Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex

were relatively low. This result is comparable to the range of concentrations of PCBs detected

in sediment from Monastir Bay in Tunisia (1.1 and 9.3ng.g-1

) (Nouira et al., 2013). However,

the contents detected in the tissues of fishs Mugilcephalus and Dicentrarchuslabrax from

Bizerta Lagoon were higher in the range of 1.43-156 ng.g-1

wt (Ben Ameur et al., 2013),

probably due to biomagnification. There was not a clear spatial and seasonal variation

between the Ichkeul Lake and the Bizerta Lagoon as reported previously (Nouira et al., 2013),

except for site 9 at Bizerta Lagoon which was more contaminated than the other sites in April,

and for site 5 at Ichkeul Lake in September. The complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon was

not affected by PCBs. PCBs contents exceeding neither the threshold set by NOAA nor the

Interim sediment quality guidelines (ISQGs) for total PCBs, which is determined at 21.5

μg·kg-1

dw for marine sediment and at 34.1 μg.kg-1

dw for freshwater sediment. The probable

effect levels (PELs) for total PCBs being 189 μg.kg-1

for marine sediment and 277 μg.kg-1

for

freshwater sediment.

123

Fig 4: Spatial distribution of totals PCBs (ng.g-1

) in sediments of complex Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon in April 2012. Light blue rectangle: concentrations of totals PCBsin April;

Light blue rectangle: concentrations of totals PCBs in April; dark blue rectangle:

concentrations of totals PCBs in September

Organochlorine pesticides (OCPs)

Pesticides were detectable in sediment from all prospected sites of the complex. These

concentrations were in the same range of those detected in the tissues of fishes Mugilcephalus

and Dicentrarchuslabrax in Bizerta Lagoon from 1.25 to 227 ng.g-1

dry wt (Ben Ameur et al.,

2013). Lindan (HCH), Dieldrin and Endrin are the most represented in the sediments of

Ichkeul Lake. Sites 2, 8 and 1 were the most contaminated. The maximum concentration of

endrin was recorded at site 2 and the minimal at site 6. Regarding Dieldrin, the highest

concentrations were observed at sites 8, 2 and 1. The lowest concentration was detected at the

site 6. Lindan (HCH) was detected in all sites with comparable concentrations. The maximum

124

dose was detected in site 8 and the minimum at site 6. Endosulfan has been detected in the

sediments of different sites with maximum at sites 8 and 2. Heptachlor, Aldrin,

Hexachlorobenzene (HCB), dichlorodiphenyltrichloroethane (DDTs), chlordane and

nonachlor were detected in the different sites, but at very low concentrations. A maximum

total concentration of up to 2021 ng.g-1

dry wt OCPs was detected in the sediments from sites

8. Interestingly site 2 is located near agricultural areas (4102 hectares) of the office of public

lands. Site 8 was the only site chosen because it is not located in the mouth of a river in order

to estimate the effect of direct runoff from agricultural areas. According to the results, it is

likely that direct runoff had a greater effect in the transport of pesticides that rivers flow. This

observation may be explained by a dilution effect in rivers. The OCPs were detected at low

levels in all sites of Bizerta Lagoon. The OCPs contents exceeded the threshold of the

standards published by NOAA (Table 2) in almost all sites in the lake and lagoon.

125

Fig 5: Spatial distribution of totals OCPs (ng.g-1

) in sediments of complex Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon in September 2011 and April 2012.

Fig 6a: Concentrations (ng.g-1


Ichkeul in April (ST1-ST8)

Fig 6b: Concentrations (ng.g-1


Ichkeul-Bizerta lagoon in April (ST11-ST20)

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0 A

lph

a B

HC

Bet

a B

HC

Gam

ma

BH

C

Del

ta B

HC

HC

B

End

osu

lfan

I

End

osu

lfan

II

Die

ldri

n

Hep

tach

lor

Hep

tach

lor

Epo

xid

e …

End

rin

End

rin

ald

éhyd

e

Ald

rin

2,4

' DD

E

4,4

'-D

DE

2,4

'-D

DD

4,4

'-D

DD

4,4

'-D

DT

ST1

ST2

ST3

ST4

ST5

ST6

ST7

ST8

ST9

ST12

ST15 ST18

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

Alp

ha

BH

C

Bet

a B

HC

G

amm

a B

HC

D

elta

BH

C

HC

B

End

osu

lfan

I

End

osu

lfan

II

Die

ldri

n

Hep

tach

lor

Hep

tach

lor

Epo

xid

e …

End

rin

End

rin

ald

éhyd

e

Ald

rin

2,4

' DD

E

4,4

'-D

DE

2,4

'-D

DD

4,4

'-D

DD

4,4

'-D

DT

ST9

ST10

ST11

ST12

ST13

ST14

ST15

ST16

ST17

ST18

ST19

126

Butyltin:

Concentrations of butyltin detected in the sediments of the lake/lagoon complex were

relatively low compared to norms. The spatial distribution of the BuSn in the sediment of the

complex shows that the sites subjected to the action of martime traffic are most contaminated

but the contents are substandard. The lake is more contaminated than the lagoon by BuSn

because the water column is deeper in the lagoon.

Conclusion

The Ichkeul Lake was found with high levels of OCPs contents. The OCPs input is probably

coming from the agricultural areas located at the edge of this aquatic ecosystem. Bizerta

Lagoon was found with high levels of PAHs contents, which are probably coming from the

maritime traffic. The PCBs content levels were found low indicating that there was not a real

127

contamination by these compounds. The hydrological characteristics of the complex Ichkeul

Lake-Bizerta Lagoon, such as seasonal variation of flow rates, may influence the spatial and

temporal distribution of persistent organic pollutants in sediments. It is thus important to

survey the impact of human activities on the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon hydrologic

complex in order to protect this area with high ecosystemic value.

Table 3. Mean and range of detected concentrations of PAHs, PCBs and OCPs (ng.g-1

DW) in

September and April

Complex Lake-Lagoon Ichkeul Lake Bizerta Lagoon

Mean Range Mean Range Mean Range

PAHs :

Naphtalene

Acenaphtylene

Acenaphtene

Fluorene

Phenanthrene

Anthracene

Fluoranthene

Pyrene

Benz[a]anthracene

Chrysene



Benzo[a]pyrene



Benzo[ghi]perylene

PCBs :

PCB 18

PCB 28

PCB 31

PCB 44

PCB 52

PCB101

PCB 138

PCB 118

PCB 153

PCB 149

PCB 180

PCB 194

OCPs :

α HCH

β HCH

γ HCH

δ HCH

HCB

αEndosulfan

βEndosulfan

Dieldrin

Heptachlor

HeptaEpox Isomer B

Endrin

326

11

37

31

111

22

116

115

99

67

145

64

106

178

37

112

0.150

0.186

0.208

0.432

0.114

0.176

<LOD

0.180

0.253

0.189

0.241

1.716

3.8

81

0.4

20.5

0.5

15.8

2.6

111

2.3

8.9

141

7-3169

1-121

5-62

3-399

4-298

2-1882

2-1658

4-1790

2-1253

2-791

4-1825

3-675

3-1215

4-2604

3-607

8-1290

0.042-0.362

0.117-0.337

0.104-0.471

0.080-1.280

0.013-0.583

0.071-0.434

<LOD

0.019-0.788

0.045-1.641

0.004-1.220

0.044-1.180

0.633-9.639

1.2-7.9

1-235

0.1-0.8

6-45.8

0.0-6.8

1.2-114

1.4-6.2

2-772

0.3-5.3

1.4-74.5

17-922

200

3

19

25

49

9

54

52

31

28

56

21

43

83

12

41

0.163

0.111

0.235

0.422

0.118

0.240

<LOD

0.170

0.118

0.096

0.159

2.790

4.1

85

0.4

21.7

0.8

28.9

2.6

209

2.5

6.3

248

7-512

1-9

7-62

3-172

11-188

2-37

9-389

7-339

3-281

6-155

10-251

3-134

9-210

17-602

3-29

11-166

0.055-0.482

0.130-0.337

0.104-0.471

0.080-1.280

0.013-0.452

0.086-0.309

<LOD

0.089-0.327

0.062-0.333

0.023-0.233

0.044-0.403

0.707-9.639

1.2-7.9

1-235

0.2-0.8

7.2-45.8

0.1-6.8

2.1-114

1.6-4.5

5-772

1.1-3.5

1.6-12.8

19-922

418

17

49

36

156

31

161

161

149

95

209

95

152

247

55

164

0.161

0.164

0.194

0.439

0.111

0.153

<LOD

0.185

0.349

0.256

0.301

1.228

3.6

78

0.3

19.7

0.3

6.3

2 .6

39

2.1

10.7

46

45-3169

1-121

5-62

5-399

4-298

5-1882

2-1658

4-1790

2-1253

2-791

4-1825

3-675

3-1215

4-2604

5-607

8-1290

0.042-0.362

0.117-0.204

0.105-0.359

0.114-1.111

0.017-0.583

0.071-0.434

<LOD

0.019-0.788

0.045-1.641

0.004-1.220

0.095-1.180

0.633-3.030

1.3-7.7

1.5-205

0.1-0.6

6-37.9

0.0-6.8

1.2-22,6

1.4-6.2

2-140

0.3-5.3

1.4-74.5

17-63

128

Aldrin

2,4' DDE

4,4'-DDE

2,4'-DDD

4,4'-DDD

4,4'-DDT

0.5

0.1

1.3

0.9

0.9

2.2

0.1-1.4

0.0-1.3

0.7-4.9

0.1-4

0.3-4.9

0.0-3.2

0.5

0.1

1.4

0.8

0.9

<LOD

0.2-1.1

0.0-0.9

0.8-4.9

0.1-3

0.6-1.5

<LOD

0.4

0.1

1.3

0.9

1

0.2

0.1-1.4

0.0-1.3

0.7-4.4

0.2-4

0.3-4.9

0.0-3.2

Acknowledgement

The authors would like to thank Mme Nabiha M’barek (National Agency of Environment

Protection Tunisia) and Mr Taher Kaabi (Commissariat Regional Commission for

Agricultural Development of Bizerta) for their logistic contribution. We acknowledge the

Regional Platform forEnvironmental Microbiology PREMICE supported by the Aquitaine

Regional Government Council (France) and the urban community of Pau-Pyrénées (France).

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134

CHAPITRE IV : BIO-SURVEILLANCE DU

COMPLEXE LAC ICHKEUL LAGUNE DE

BIZERTE : DIVERSITE MICROBIENNE ET DES

NEMATODES LIBRES MARINS

135

CHAPITRE IV : BIO-SURVEILLANCE DU COMPLEXE LAC ICHKEUL LAGUNE

DE BIZERTE : BIODIVERSITE MICROBIENNE ET DES NEMATODES LIBRES

MARINS

Partie A : Impacts écologiques de la présence des polluants organiques HAP et OCP sur

les communautés bactériennes et les nématodes libres marins du sédiment du complexe

Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

Introduction

Les analyses chimiques montrent que la lagune de Bizerte est contaminée par les HAP et le

lac Ichkeul est polluée par les OCP. Des sites de pollutions multiples HAP et OCP ont été

retrouvés dans le lac et la lagune. Dans certaines stations, les teneurs dans les sédiments

dépassent les normes. Il est maintenant indispensable d’étudier l’impact de la présence de ces

polluants sur les organismes biologique. La bio-surveillance est le suivi de la qualité de

l’écosystème aquatique à travers les communautés biologiques qui l’abritent. L’écologie de

ces communautés, leurs interactions avec les autres communautés et avec leur milieu peut

changer suite à la présence de polluants (Eadie et al., 1982 ; Xu et al., 2014). Les

communautés benthiques qui habitent le sédiment sont très diversifiées (Holmes et al., 2008).

Le choix des microorganismes et des nématodes libres marins est essentiellement lié à leurs

rôles de bioindicateurs (Moreno et al., 2011), mais surtout basé sur leurs capacités de

bioremédiation (Isaac et al., 2013). L’étude de ces communautés permet de déterminer les

espèces résistantes, possibles solutions pour la mise en place de procédés de bioremédiation.

136


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137

I. Publication 4:

To be submitted to: Microbes and Environments

Bacterial Community Structure of the sediments from the complex Bizerta Lagoon

(Anthropized ecosystem)-Ichkeul lake (RAMSAR site) in Tunisia and pyrosequencing

analysis of four interesting sites

Fida Ben Salema,b,c,e

, Olfa Ben Saida,b,e

, Ezzeddine Mahmoudia, NoëlleBru

d,e,

Mathilde Monperrusc,e

, Robert Duranb,e

aLaboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Faculté des Sciences de Bizerte, Tunisie.

bEquipe Environnement et Microbiologie – MELODY group - IPREM UMR 5254 CNRS –

Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

cLaboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR 5254

CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

dLaboratoire de Mathématiques et de leurs Applications, PAU UMR CNRS 5142 –Université

de Pau et des Pays de l’Adour, France

eFédération de recherche MIRA,Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

138

Abstract:

To investigate how the pollution affects the bacterial community structure and composition in

sediments, chemical and molecular approaches were combined to survey twenty stations

around the Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon complex.Terminal restriction fragment length

polymorphism (T-RFLP) analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes revealed that each site

was characterized by a specific bacterial community structure. The combination of this data

with those of chemical analysis showed a correlation between the bacterial fingerprint and the

pollutant content, principally with pesticides in Ichkeul Lake and PAHs in Bizerta Lagoon.

The 16S rRNA gene pyrosequencing of bacterial communities for four sitesresulted in 17661

sequences and 858 operation taxonomic units (OTUs). The taxonomic analysis of the

pyrosequencing data grouped the sequences into 44 different phyla. In general, Proteobacteria

were the most dominant phyla with predominance of Gammaproteobacteria,

Alphaproteobacteria and Deltaproteobacteria within the sediments. Besides Proteobacteria,

there are a number of sequences affiliated to the following major phyla detected in all four

sites: Chloroflexi, Bacteroidetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Actinobacteria,

Gemmatimonadetes, Firmicutes, Cyanobacteria, Spirochaetes, Acidobacteria. The bacterial

communities of the four sites shared 211 common OTUs. The Lake Ichkeul was characterized

by 219 specific OTUs and the Bizerta lagoon by 235 OTUs.

139

1. Introduction:

Lagoons and lakes are crucial environments for nature preservation. These ecosystems

are highly productive and need careful monitoring because they are very vulnerable. Their

status may change rapidly in response to natural- and human-driven events. Sediments are

complex habitats densely colonized bydiverse microorganisms. In sediments microbial

communities are involved in the decomposition of organic matter (Schultz and Urban, 2008).

Microorganisms play a key role in carbon, nitrogen and phosphorus cycling (Andrews et al,

2011) as well as in determining the fate of pollutants (Zhang et al., 2008). Polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs) and organochlorine pesticides

(OCPs) (Kjellerup et al., 2014) are persistent organic pollutants (POPs).These contaminants

are ubiquitous in aquatic ecosystems (Doong et al., 2008; Wang et al., 2011; Assem et al.,

2013; Galvaoet al., 2014; Mwanamoki et al., 2014). They are mainly from industrial sources,

agricultural and maritime traffic (Chang et al., 2006; Wen et al., 1994). They meet the sea

aquatic environments through spray drift, accidental offsite movement in herbicide rainfall

events, or through transport in surface runoff from agricultural areas (Shultz, 2001; Botta et

al., 2009). Recent developments in molecular techniques have provided an outstanding

opportunity to investigate in situ diversity and activity of bacterial communities in various

ecosystems. These techniques are based on the detection of nucleic acids within living cells or

after extraction directly from field material. The rapid development of molecular methods

allowed to obtain more detailed information on microbial diversity and dynamics in marine

sediments (Thiyagarajan et al., 2010). High-throughput sequencing (HTS) technologies are

highly efficient tools for identifying the entire phylogenetic profile of microbial communities

140

without prior culturing of organisms or knowledge of the species present. These HTS

technologies are useful for biomonitoring aquatic ecosystem.

During the past decades several projects have studied the PAHs in the sediment of Bizerta

lagoon and their impact on the benthic microorganisms and organisms (Ben said et al., 2010;

Mzoughiet al., 2002; Trabelsi and Driss, 2005). But pesticides and PCBs were neglected in

these studies. The current study aims to characterize the bacterial communities from the

sediments of the complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. The bacterial communities were

analysed at the taxonomic level using molecular methods such as T-RFLP and 454-

pyrosequencing targeting 16S rRNA genes. The effect of organic contaminants such as PAHs,

PCBs, OCPs on the bacterial assemblages were determined.

2. Materiels and Methods

2.1. Site description

The lake Ichkeul is a Biosphere reserve, a Ramsar site, and a World Heritage Site (Kraïem

and Ben Hamza, 2000; Ramdani et al., 2001a; Ben M’barek and Slim-Shimi, 2002). It is

internationally important for its wintering water fowl (Carp, 1980; Scott, 1980; Hollis, 1986);

it is an important stopover point for hundreds of thousands of migrating birds each year.

Because surrounded by a vast agricultural area the Ichkeul Lake receives agricultural

pollutant (Stevenson and Battarbee, 1991). Such pollutants may impact the health of aquatic

organisms and subsequently local and migratory birds. The lake is a freshwater ecosystem

(average salinity 4 PSU) in winter when the rivers are in flood and turns in a saline ecosystem

(average salinity 35 PSU) in summer because of evaporation and the inflow of seawater.

Ichkeul Lake - Bizerta lagoon watershed is located in the Northern of Tunisia, these aquatic

ecosystems are connected by Tinja river and Bizerta Lagoon is open to the Mediterranean

Seaby a channel. These two water bodies are also fed by several rivers. The area of Bizerta

Lagoon is approximately 128 km2. The complex receives contamination from two industrial

141

zones (Ben Said et al., 2010; Mzoughi et al., 2010; Trabelsi et al., 2012) and agricultural areas

located on the edge of the lagoon.

2.2. Sampling

Sediment samples were obtained from 20 coastal sites of the complex Ichkeul Lake - Bizerta

Lagoon (Fig. 1). 13 sites were chosen as the mouths of the various rivers that feed the

complex and 4 sites next to industrial or agricultural area and two sites centers of the lake and

the lagoon and one site in Mediterranean Sea.The sampling was performed during two

campaigns in September 2011 and April 2012. Three replicates were collected for each site.

Fig 1. Map of the complex Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon indicating the location of the

sampling stations

2.3. Physical-chemical analyses

142

Water column temperature, pH, dissolved oxygen and salinity were determined in the field

with a handheld multi-parameter system (WTW Multi-197i). Nitrite and nitrate were analyzed

following the procedure of Wood et al. (1967). Ammonia was determined according to

Aminot and Chaussepied (1983). Phosphate levels were determined as described in Murphy

and Riley (1962). For chlorophyll a (Chla), water samples were filtered through Whatman



in the dark. Suspended material was analysed according to (Baretta-Beakker et al. 1992).

Carbon organic was determined according to Espitalie et al. (1986).

2.4. DNA extraction, PCR, T-RFLPanalysis

The total genomic DNAs, 250 mg of the frozen sediment sample, were extracted using an

UltraClean soil DNA isolation Kit (MoBio Laboratories, CA) by following the

manufacturer’s protocol with minor modifications as previously described by (Precigou et al.,

2001). The 16S rRNAgenes were PCR amplified from the genomic DNA with the bacterial

universal fluorescent-labeled primers 63F: 5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ and

1387R 5’ GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’ (Marchesi et al., 1998).

The PCR amplification mixture contained: 12.5 µl AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Applied

Biosystems), 0.25 µl of each primer (20 µM), 0.5 µl of the DNA extracts and dilluated 10×

were added to the PCR reactions.A final volume of 25 μL was adjusted with distilled water.

Thermal cycling was carried out, in a PTC200 thermocycler (MJ Research), under the

following conditions: 95°C for 10 min, 35 cycles of 95°C for 45 seconds, 58°C for 45

seconds, 72°C for 1 min, with a final extension step at 72°C for 10 min. PCR products were

then purified using a DNA purification kit (MoBio Laboratories, CA). Purified PCR products

were digested with four units of enzyme AluI (Takara, Japan).

143

One µl of the digested DNA from each sample was mixed with 8.75 μL of deionized

formamide and 0.25 μL of Rox 500 (Applied Biosystems). T-RF profiles were analyzed with

Gene Scan Software version 3.1 (Applied Biosystem), after an injection step of 10 s,

electrophoresis was carried out for up to 30 min applying a voltage of 15 KV. Only profiles

with a more than 1% of the total fluorescence were fluorescence units were used for the

analysis. T-RFLP profiles were compared by canonical correspondence analysis (CCA) using

MVSP software (multivariate statistical package 3.12d, Kovach Computing Services, 1985–

2001, UK). This test is based on the linear correlation between community data (abundance of

each T-RF) and environmental parameters in the sediments. Linear regression analysis

between some T-RFs, and chemical data was performed in order to avoid over interpretation

of the correlation.

2.5. 454 Pyrosequencing

454 pyrosequencing of 12 samples was made: 4 sites among the 20 were selected according to

the environmental parameters ST12 most contaminated by PAHs, ST8 most contaminated by

OCPs, ST5 with multiple contamination by PAHs and pesticides and ST17 station, the less

contaminated of the entire complex. Three replicates for each site have been analysed at

MRDNA (MR DNA, Shallowater, TX). The HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen,

Valencia, CA) was used for PCR amplification as follows: 94°C for 3 minutes, 28 cycles of

94°C for 30 seconds, 53°C for 40 seconds and 72°C for 1 minute. Finally, an elongation step

at 72°C for 5 minutes was performed. The different PCR products were mixed in equal

concentrations and purified using AgencourtAmpure beads (Agencourt Bioscience

Corporation, MA, USA). The Roche 454 FLX titanium was used for sequencing, following

the manufacturer’s guidelines. The sequencing data were processed using a proprietary

analysis pipeline (www.mrdnalab.com, MR DNA, Shallowater, TX). After depletion of

barcodes and primers in sequences, those showing a low quality score, i.e. sequences < 200

144

bp with ambiguous base calls or with homopolymer runs exceeding 6 bp, were removed.

Sequences were then denoised and chimeras removed. Operational taxonomic units were

defined after removal of singleton sequences, clustering at 3% divergence (97% similarity)

(Dowd et al. 2008a; Dowd et al. 2011; Dowd et al. 2008b; Edgar 2010). OTUs were then

taxonomically classified using BLASTn against a curated GreenGenes database (DeSantis et

al. 2006). A cut-off similarity of 97% was applied for species, 95% for genera and 90% for

families’ assignation. In order to minimise the variability of libraries size and the

pyrosequencing errors, sequences representing less than 0.1% were not considered.

2.6. Statistical analysis

Canonical Correspondence Analysis (CCA) crossing bacterial community structure (relative

abundances of T-RFs) with chemicals data (concentrations of PAHs and pesticides) of each

site were performed with MVSP v3.22 software (Kovach Computing Service, Anglesey

Wales).

Univariate indices of pyrosequencing results were calculated for each site, including total

strains abundance, diversity (Shannon-Wiener index H’) and strains richness (R) using the

PRIMER v5.0 (Plymouth Routines in Multivariate Ecological Research) software package.

One-way analysis of variance (ANOVA) was used to test for overall differences of these

indices between controls and treatments and the Tukey HSD multiple comparisons test was

used in pairwise comparisons. Significant difference was assumed when p<0.05. Similarity

percentages (SIMPER) were used to determine the contribution of individual OTUs towards

the dissimilarity between sites. Statistical analysis of bacterial community structure (relative

abundances of OTUs) were performed by R i386 3.1.0 to obtained heat map, venn diagram,

networks (gplot).

3. Results and discussions

145

3.1. Bacterial community structure

Crossing TRFLP and chemical data showed a clear separation of bacterial communities of the

two ecosystems lake and lagoon irrespective of the season (Fig.2). This observation may be

explained by the effect of the large salinity difference between the ecosystems. The CCA

analysis shows also that the bacterial communities of the lake are under the influence of

pesticides while those of the lagoon by PAHs (Fig.2). Our results confirm those of Ben said et

al., (2010) indicated by the impact of PAH on bacteria community structure in sediment of

Bizerta lagoon. Considering the lake, the bacterial communities were more influenced by

PAHs in September than in April (Fig.3). This is related to the hydrology of the ecosystem:

during the dry season there has entrance of the lagoon water contaminated by PAHs to the

lake. For the lagoon pollution by PAHs and pesticides is most pronounced in April until

September (Fig.4).

146


structure from complex Ichkeul Lake - Bizerta Lagoon in two campaigns characterized by T-

RFLP fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides


from Ichkeul Lake in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP


147


from Bizerta Lagoon in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP


3.2.Bacterial community composition

454 pyrosequencing was used to determine the identity of the microorganisms of four sites:

Site 17 the less contaminated, site 12 the most contaminated in PAHs, site 8 the most

contaminated in pesticides and site 5 with mixture PAHs and pesticides. Three replicates from

each site were considered. The taxonomic analysis of the pyrosequencing data reveled 17661

148

sequencesand 858 OTUs, which were grouped into 44 different phyla. In general,

Proteobacteria were the most dominant phyla with predominance of Gammaproteobacteria,

Alphaproteobacteria and Deltaproteobacteria within the sediments. Besides Proteobacteria,

there are a number of sequences affiliated to the following major phyla detected in all four

stations: Chloroflexi, Bacteroidetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Actinobacteria,

Gemmatimonadetes, Firmicutes, Cyanobacteria, Spirochaetes, Acidobacteria.

3.2.1. Univariate indices

Results from the one-way ANOVA illustrate significant differences in most univariate indices

between bacterial communities from stations 5,8,12 and 17 (Table 1). The number of OTUs

and OTUs richness (R) are comparable at the sites of the lagoon and those of the lake.

Regarding each ecosystem, these indexes were lower in the most contaminated (sites 12 and

8), which are retains highest contents of PAHs and OCPs respectively. Shannon index (H’)

was significantly higher in site contaminated by PAHs (12).

Table 1: Means of univariate indices for OTUs assemblages from each site. N = Number of

species; H' = Shannon-Wiener index; Margalef’s R= species richness.

Samples N R H’

ST5

ST8

ST12

ST17

150

146

149

150

41

40

39

40

3.331

3.348

3.515

3.209

3.2.1. Multivariate indices

SIMPER results showed that the highest value of average dissimilarity was recorded between

sites from the lake and sites from the lagoon (50%), between sites from the same ecosystem

(average dissimilarity30%). A total of 858 OTUs and 17661 sequences were recorded in all

sites. The Veen diagram (Fig 5) showed that the most OTUs (211 OTUs) were shared by the

149

four sites, this result indicat an ecological continuum between the lake and the lagoon that are

closely linked via the Tinja River, 68 OTUs are commun between sites from the lake and 64

between sites from the lagoon, 97 strains characterise the control site (ST17), 85 for ST5 with

multiple contamination (PAHs and pesticides) 74 for site 12 contaminated by PAHs and 66

for site 8 contaminated by pesticides. That observation show that the control site is the most

diversify. Venn Diagram of the abundance of bacteria (Fig 5) shows that 97 bacterial strains

characterize the site 17, they are only present in this site, 85 in the site 5, 74 in the site 12 and

66 in the site 8. Site 17 is the most diverse, it has the highest shannon index (H’). This may be

due to the fact that this site is the less contaminated of the complex. The sites of the lagoon

(12 and 17) have 64 common bacterial strains. The sites of the lake have 68 common bacterial

strains. The common bacterial strains between all the sites are among 211.

Fig 5: Comparison of bacterial communities from the different sites of the Ichkeul Lake-

150

Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared OTUs between

sites.The specific OTUs for each site are indicated. OTUs were determined at the species

level (97%)

Simper and the heat map (Fig 6) clusteringshowed that the site 17 was dominated

byacidithiobacillus spp. (11%), nannocystineae spp. (3%), anaerolineaceae spp. (3%) and

actibacter spp. (2%). Site 12 was dominated by acidithiobacillus spp. (6%), actibacter spp.

(5%), nannocystineae spp. (4%), robiginitalea spp. (3%) and anaerolineaceae spp. (3%).

The site 8 from the lake was dominated bysinobacteraceae spp. (6.36%), nannocystineae

spp. (5.19%) and anaerolineaceae spp. (5.03%). Finally station 5 was dominated by

anaerolineaceae spp. (7.12%), sinobacteraceae spp. (3.69%) and nannocystineae spp.

(3.74%). Significant differences between sites resulted mainly from changes in the

abundances of the dominant strains. Lowest abundance of acidithiobacillus spp. and highest

number of actibacter spp. and robiginitalea spp. were responsible for 31.58% of average

dissimilarity between site 17 and site 12 from the lagoon caused by the contamination of site

12 by PAHs compared to site control ST17 so acidithiobacillus spp. is a strain sensitive to

PAHs, acidithiobacillus are extremely acidophilic, chemolithotrophic, sulfur-oxidizing

proteobacteria that have distinct advantages in improving leaching efficiency of metal

sulfides (Wang et al., 2014). Acidithiobacillus spp. is a strain present in ecosystems

contaminated by metals (Nguyen and Lee, 2015; Nguyen et al., 2015). Actibacter spp. is a

strain resistant to PAHs, this strain was present in ecosystems contaminated by PAHs

(Rubin-Blum et al., 2014), which confirms our results since the site 12 is contaminated by

PAHs. The abundance of sinobacteraceae spp., and nannocystineae spp. is higher and the

abundance of anaerolineaceae spp. is lowest causing 34.42% of significant difference

between sites 5 and 8 from the lake caused by contamination of site 8 by pesticides, so

sinobacteraceae spp. and nannocystineae spp. are bacterial strains resistant to pesticides and

151

anaerolineaceae spp. are sensitive to this type of compounds. The difference between the

Ecosystems Lake and Lagoon caused essentially by variation of salinity levels influence

bacteria community: highest abundance of acidithiobacillus spp. and actibacter spp. and

lowest abundance of anaerolineaceae spp. were responsible for 53.38% of average

dissimilarity between site 5 and site 17. Highest abundance of anaerolineaceae spp.

Andactibacter spp. and lowest number of acidithiobacillus spp. were responsible for 53.18%

of average dissimilarity between site 5 and site 12. Sites 8 and 12 are different at 52.44%

because lowest abundance of sinobacteraceae spp. and anaerolineaceae spp. and increasing

of actibacter spp. and acidithiobacillus spp. highest abundance of acidithiobacillus spp. was

responsible for 51.30% of average dissimilarity between site 8 and site 17.

152

Fig 6. Heat map for clustering abundance of OTUs in different sites with replicates.

The Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial community

composition from the complex Ichkeul Lake - Bizerta Lagoon in four sites 5,8,12 and 17 in

April based on variables characterized by OTUs and chemical analysis: PAHs and OCPs

shows that the replicates of each site are very close sometimes they overlap (Fig. 7). There is

also a clear separation between OTUs from Ichkeul Lake and those of the lagoon. Arrows

153

environmental parameters in this case PAHs and OCPs are opposite which the impact of this

parameters are anti-correlated.

Fig 7. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial community

composition from the complex Ichkeul lake - Bizerta lagoon in four sites in april based on

variables and characterized by OTUs and chemical analysis: PAHs and OCPs.

4. Conclusion

The determination of microbial community composition in sediment of the complex Ichleul

Lake-Bizerta Lagoon indicated that the bacterial communities from thelake were impacted by

pesticides and those of the lagoon by PAHs. In the Ichkeul Lake the bacterial communities

were more impacted by PAHs in September than in April. Such observation may be explained

by the hydrology of the ecosystem since during the dry season there has entrance of the

154

lagoon water contaminated by PAHs to the lake. The Shanon index H’ indicated that the

Bizreta Lagoon showed more bacterial diversity than the Ichkeul Lake.

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II. Publication 5:

158

Published in: ESPR

Pesticides in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon Watershed in Tunisia: Use, occurrence, and

effects on bacteria and free-living marine nematodes

Fida Ben Salem1,2,3*

, Olfa Ben Said1, Patricia Aissa

1, Ezzeddine Mahmoudi

1, Mathilde

Monperrus3, Olivier Grunberger

4 & Robert Duran

2

(a) Laboratory of Environment Biomonitoring, Faculty of Sciences of Bizerta, 7021,

Zarzouna, University of Carthage –Tunisia

(b) Equipe Environnement et Microbiologie – MELODY group - UMR CNRS IPREM

5254- IBEAS- Université de Pau et des Pays de l'Adour - France.

(c) Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR

5254 CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour - France

(d) IRD, UMR-LISAH (IRD-INRA-SupAgro), Bat 24, 2 place Viala, F-34060, Montpellier

cedex 01, France,





Tel: +216 72 400 121 Fax: + 216 72 590 566



159

Abstract

This study aimed to identify the most commonly used agricultural pesticides around Ichkeul

Lake-Bizerta Lagoon watershed. First survey of pesticides use on agricultural watershed was

performed with farmers, Regional Commissioner for Agricultural Development and pesticides

dealers. Then, sediment contamination by pesticides and response of benthic communities

(bacteria and free-living marine nematode) were investigated. The analysis of 22 active

organochlorine pesticides in sediments was performed according to QuEChERS method,

biodiversity of indigenous bacterial community sediment was determined by T-RFLP and

free-living marine nematodes were counted. The results of the field survey showed that

iodosulfuron, mesosulfuron, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4 D), glyphosate and

fenoxaprops were the most used herbicides, tebuconazol and epoxiconazol the most used

fungicides and deltamethrin the most used insecticide. Sixteen organochlorine pesticides

compounds among the 22 examined were detected in sediments up to 2ppmin Ichkeul Lake,

endrin, dieldrin and hexachlorocyclohexane being the most detected molecules. The most

pesticide-contaminated site in the lake, presented the higher density of nematode but when

considering all sites no clear correlation with OCPs content could be established. The

bacterial community structure in the most contaminated site in the lake was characterized by

the T-RFs 97, 146, 258, 285 and 335 while the most contaminated site in the lagoon was

characterized by the T-RFs54, 263, 315, 403 and 428. Interestingly, T-RFs 38 and 143 were

found in the most contaminated sites of both lake and lagoon ecosystems indicating that they

were resistant to OCPs and able to cope with environmental fluctuation of salinity. In

contrast, the T-RFs 63, 100, 118 and 381 in the lake and the T-RFs 40, 60, 80, 158, 300, 321

and 357 in the lagoon were sensitive to OCPs. This study highlighted that the intensive use of

pesticides in agriculture, through transfer toaquaticecosystem, may disturb the benthic

ecosystem functioning of the protected area. The free-living marine nematodes and bacterial

160

communities represent useful proxy to follow the ecosystem health and its capacity of

resilience.

Keywords: organochlorine pesticides, survey, bacterial community structure, T-RFLP,

bacterial diversity, sediment, resistant, sensitive.

161

Abbreviations list

OCPs: organochlorine pesticides

QuEChERS: Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe

T-RFLP: Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

bp: base pair

ppm : part per million

DDT: Dichlorodiphenyltrichloroethanes

Koc: carbon partition coefficient organic/water

rRNA: ribosomal Ribonucleic acid

CRDA: Regional Commission for Agricultural Development

CTV: territorial extension cells

Chla: chlorophyll a

HCHs: hexachlorocyclohexanes: lindane

HCB: hexachlorobenzene

GC–MS: Gas chromatography–mass spectrometry

DNA: deoxyribonucleic acid

PCR: Polymerase chain reaction

HEX: 5-Hexa-chloro-fluorescein

TET: Tetrachloro-fluorescein

T-RFs: Terminal Restriction Fragment

PAH: Polycyclic aromatic hydrocarbon

162

Introduction

Pesticides have been of great benefit inagriculture by decreasing the adverse effect of plant

pathogens on crops.Farmers have always used botanical and inorganic chemicals to protect

crops against pests. From the discovery of DDT toxic effect against insects in 1939,

organochlorine pesticides have been largely used for pest control through the 1960s (Boland

et al. 2004). After the adverse impact of organochlorine pesticides on human and animal

health as well as on the environment was reported in 1962 (Boland et al. 2004), the

organophosphate pesticides, which are not persistent in the environment, were used (Boland

et al. 2004). Since the 1990s, governments and international agencies have introduced

guidelines to reduce the use of pesticides (Boland et al.2004). But pesticides are still an

environmental issue of concern because of their persistence. Pesticides and their metabolites

are toxic, with capacity to bio-accumulate in food chain threatening environment and human

health (Fabro and Varca 2012). The intensification of the agricultural production around the

world associated with problems of overuse and misuse of pesticides have increased the

interest on environmental effect of pesticides. Pesticides have been detected in different

environmental matrices, such as surfaces water (De Gerónimo et al. 2014; Palma et al. 2014),

sediments (Guo et al. 2014; Li et al. 2014), fish tissue (Yohannes et al. 2014; Zhang et al.

2014) and mussels (Boonyatumanond et al. 2002; Khaled et al. 2004; Carro et al. 2014;

Herceg-Romanić et al. 2014). Particularly, pesticide contamination of aquatic ecosystems has

emerged as an important environmental issue in the last few decades. After application on

land, pesticides enter aquatic environment by effluent discharge, agricultural runoff,

atmospheric deposition, and air/water exchange (Macdonald et al. 2005; Botta et al. 2009).

Thus, pesticides are major concern in freshwater and coastal ecosystems (Kuranchie-Mensah

et al. 2012; YurtkuranandSaygı 2013). Donald et al. (1999) estimated that, in a given year,

37,000 to 500,000 wetlands in Saskatchewan (Canada) may be contaminated by herbicides

163

atlevels exceeding the limits. A large variety of pesticide compounds are released in the

environment because farmers alternate the choice of pesticide compounds year by year in

order to avoid the problem of resistance of fungi, weeds and insects to pesticides (Roush

1989). Little information is currently available on use and presence of pesticides in Southern

Mediterranean countries because of the lack of statistical data related to pesticide uses and the

high costs for analytical environmental survey.

Potential transfer of pesticides and the possible presence of the active ingredients can be

evaluated from several physical-chemical properties that characterize each active substance

such as carbon partition coefficient organic/water (Koc), solubility and half-life (Worrall and

Kolpin 2004). The partition coefficient organic carbon/water gives an indication of the

adsorbtion/desorbtionability of compound into organic matter. The strongly adsorbed

pesticides are retained at surface. In this case, quantities of lixiviated pesticides will depend

on the quantity of eroded and transported sediment (McDowell et al. 1981; Willis et al. 1983).

Compounds with low Koc will be left with the highest concentrations in aqueous phase of

runoff (Klöppel et al. 1997; Dabrowski et al. 2002; Wauchope et al. 2002).

Impact of pesticides in aquatic ecosystems has been largely studied (for review see Lew et al.

2009). Microcosm experiments involving molecular biology approaches revealed significant

shifts in bacterial community composition after pesticides treatments (Widenfalk et al. 2008).

It was demonstrated that periphyton bacterial communities from the most contaminated site

were more resistant to pesticide (Vercraene-Eairmal et al. 2010). Biofilm organization appears

to increaseability of some bacterial strains to biodegrade pesticides since the highest

pesticides degradation was obtained with biofilm (Tien et al. 2013). Similarly, in situ studies

involving pyrosequencing of bacterial 16S rRNA genes analyses revealed notable

modifications in bacterial community composition. Abundance of Gammaproteobacteria and

Verrucomicrobia members decreased downstream the pesticide input while particularly,

164

members related to Acidobacteria, Chloroflexi, Deltaproteobacteria and Firmicutes were

found in higher relative abundance (Marti and Balcazar 2014). Impact of pesticides has also

been demonstrated on free-living marine nematode assemblages. Several studies on the

impact of pesticides on a free-living marine nematode community were performed in

microcosm experiments showing controversial effects (Boufahja et al. 2011; Soltani et al.

2012). The total nematode abundance, diversity (Shannon-Wiener index H’) and species

richness were reduced in all treatments compared to control (Soltani et al. 2012) while the

abundance of nematodes in all pesticide concentrations significantly exceeded those in the

control (Boufahja et al. 2011). The species of free-living marine nematode: Pselionema sp.,

Prochromadorella neapolitana, Spiriniager lachiand, Daptonema trabeculosum, were found

sensitive to permethrin, while the species: Trichotheristus mirabilis, Xyala striata,

Araeolaimus bioculatus, Calomicrolaimus honestus, Oncholaimus campylocercoides and

Theristus pertenuis, were found resistant and proliferated (Boufahja et al. 2011; Soltani et al.

2012).

In the present study we performed for the first time in Tunisia a survey of pesticides used by

farmers to identify the pesticides most used in watershed of complex Ichkeul Lake-Bizerta

Lagoon. Then, concentrations of pesticides in sediment from this complex were determined.

Finally, influence of these pesticides on microbial community structure and free-living

nematodes was investigated.

165

Materials and methods

Site description and survey of pesticides use

The complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon (latitude37°07'–37°12'N, longitude: 9°36'–9°45'E

(lake)/latitude: 37°8'–37°14'N, longitude: 9°46'–9°56'E (lagoon)) is located in South of

Mediterranean Sea in the North of Tunisia. The Tinja River connects the lake to the lagoon

and several rivers feed the hydrosystem complex (Fig1). The complex is home to a variety of

fishing and aquaculture activities since several centuries. The Bizerta Lagoon is open to the

Mediterranean Sea by an artificial channel. The area of Bizerta Lagoon is approximately128

km2 and it is subjected to contamination from industrial zones including oil refinery, cement

and steel plants (Ben Said et al. 2010; Mzoughi et al. 2010; Trabelsi et al. 2012), agricultural

areas located on the Bizerta Lagoons’ edge and domestic wastes released by the neighbouring

towns; 400 000 inhabitants are recorded in the Bizerta district and 400 industrial units are

present around the lagoon (ANPE, 1989). Ichkeul Lake is a protected area by Ramsar

Convention (1980), classified biosphere reserve by UNESCO (1977) and natural World

Heritage Site by UNESCO. It is an important stopover point for hundreds of thousands of

migrating birds each year (Carp, 1980). The watershed of Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon

complex is surrounded by vast agricultural areas.

Survey of pesticides use strategy was firstly to collect data from the agency responsible for

agriculture in Bizerta region (Regional Commission for Agricultural Development, CRDA)

and their representatives in delegations called cells territorial extension (CTV). Then, dealers

of pesticides were questioned and finally farmers were interviewed. Representative samples

of the general population of farms with about 100 personswereinterviewed; they were

distributed in agricultural watershed around Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex (Fig1).

The information collected was: i) type of crop, ii) pesticides used and iii) field superficies. A

classification of the active substances was established according to their physical-chemical

166

parameters. Based on the content of active ingredient in the commercial formula, we have

followed a logical approach to calculate the total quantities of active ingredients: Percentages

of use of the active ingredients were determined by dividing the number of farmers using this

active ingredient on the total number of surveyed farmers (*100). After ranking established

according to the physical-chemical characteristics of each active ingredient, the amount of

each active ingredient was estimated. This amount (Qsubstance) is product of the cultivated

area (ha) by the percentage of use of pesticide (%) by the assay of the active ingredient in the

pesticide.

Sediment samples collection

Surface sediments samples were collectedin4 coastal sites of IchkeulLake-BizertaLagoon

complex. The sampling sites were located at the mouths of three rivers: Site 1 (37°10'31.

57"N / 9°38'17.09"E) in the Ichkeul Lake selected to determine the contribution of rivers in

pesticides level in the lake; Sites 3 (37°11’25.02”N / 9°47’16.26”E) and Site 4

(37°11’58.06”N / 9°55’72.01”E) in the Bizerta Lagoon to determine the contribution of rivers

in pesticides level in the lagoon; and Site 2 (37°10'27.66"N / 9°42'30.85"E) in Ichkeul Lake

close to agricultural area to determine the direct runoff impact in the lake; (Fig1). Sampling

was performed in April 2012in triplicate at each site. Sediment was collected with a Van

Veen grab. For bacterial analysis sediments were placed incryotubes, frozen quickly and

stored at -80°C until use.The sediments used for chemical analysis were placed in glass

bottles and were kept frozen at -20°C. Before analysis samples were freeze dried in a ZirBus

Vaco2 lyophiliser. Sediment for free-living marine nematode counting wasfixed in 4%

formalin.

167

Fig 1. Aerial map of the complex and location of sampling sites (red circles)

Physical and chemical parameters

Water column temperature, pH, dissolved oxygen and salinity were determined in the field

with a handheld multi-parameter system (WTW Multi-197i). Nitrite and nitrate were analyzed

following the procedure of Wood et al. (1967). Ammonia was determined according to

Aminot and Chaussepied (1983). Phosphate levels were determined as described in Murphy

and Riley (1962). For chlorophyll a (Chla), water samples were filtered through Whatman



in the dark. Suspended material was analysed according to (Baretta-Beakker et al. 1992).

Carbon organic was determined according to Espitalie et al. (1986).

168

Analytical methods

Concentrations of 22 organochlorine pesticides (OCPs), including lindane

(hexachlorocyclohexanes=HCHs), endosulfanes, dieldrin, endrin, aldrin, heptachlores,

dichlorodiphenyltrichloroethanes (DDTs), nonachlores, chlordanes, in sediment from the

different sites were determined. The samples were analyzed according to an adapted

QuEChERS method for the analysis of pesticides in sediment by gas chromatography–mass

spectrometry. Analytical performances of the QuEChERS method are presented in Table 1.

Table 1. Analytical performances of the QuEChERSmethod.R2, linearity; LOD, Limit of

detection; LOQ, Limits of quantification; R%, Recoveries; RSD, reproducibility.na, not

available,

Compounds R2 LOD (ngg

-1) LOQ (ngg

-1) R (%) RSD (%)

Hexachlorobenzene 0.993 0.01 0.05 81 7

2,4'-DDE 0.988 0.14 0.45 na 18

4,4'-DDE 0.971 0.03 0.11 99 12

4,4'-DDD 0.954 0.27 0.90 85 11

4,4'-DDT 0.954 0.38 1.27 129 3

α chlordane 0.999 0.00 0.01 86 10

β chlordane 0.985 0.00 0.01 137 12

cis-Nonachlor 0.996 0.00 0.01 108 9

trans-Nonachlor 0.999 0.00 0.01 102 12

169

QuEchERS extraction/purification procedure

The QuEChERS method validated by Yang et al. (2010) for the analysis of pesticides in soil

was adapted for the analysis of OCPs in sediment samples. Briefly, an aliquot of 5g of

sediment was weighed into a polypropylene tube (50 mL capacity).Then, 4 mL ultrapure

water was added, the tube was manually shaken and the internal standard (atrazine d5) was

introduced. Then, 20 mL of extraction solvent (dichloromethane-acetone (50:50 v:v)) were

added and the tube was shaken vigorously by hand for 1 min. Then, a citrate buffer salt

mixture (4g MgSO4, 1g NaCl, 0.5g disodium citrate sesquihydrate and 1 g of trisodium citrate

dehydrate) was added and the tube was shaken vigorously manually (5min). Finally, the tube

was centrifuged for 3 min at 2500 rpm and 10 mL of the supernatant were transferred into

another polypropylene tube (15 mL capacity) already containing 900 mg of MgSO4 and 150

mg PSA. The tube was shaken vigorously by hand for 30 s and centrifuged for 3 min at 2500

rpm. The extracts were then dried under a gentle argon stream using a Turbovap LV

Concentration Evaporator system. The dried residue was re-dissolved with 1 mL acetonitrile

and kept at −20°C until analysis.

GC-MS Analysis


mass spectrometer (Agilent 5975C) with an electron impact ionization source (EI). The GC–

MS system was equipped with an Agilent DB5-MS UI column. The carrier gas was helium

used at 1 mL min−1

flow rate. The ion source temperature and the quadrupole temperatures

were kept at 230°C and 150°C, respectively. A sample volume of 1 μL of the extracts was

injected in pulsed splitless mode at an inlet temperature of 280°C. The column temperature

was programmed as follows: the initial oven temperature was set at 80°C for 1 min, increased

to 160°C at 10°C/min (hold 5 min), then ramped at 3°C/min to 300°C (hold 2min). The MS

170

interface temperature was maintained at 300°C. The quantification was carried out in the

selected ion monitoring mode (SIM) selecting two characteristics fragments ions for each

compound. Two replicates were performed for each sample with two injections. An internal

standard correction was used for the quantification of the analytes.

Density of free-living marine nematodes

Sediments were first sieved (1mm and 0.04 mm) and nematodes, the most abundant taxon

among the meiofauna, were separated following a resuspension-decantation methodology

(Wieser 1960). Then they were stained with Rose-Bengal (0.2 g L-1

). The counting was

performed after 24 hours of colouring, pouring the sample in a tank Dollfus Plaid background

with 200 boxes of 5 mm side and separated by raised limits to prevent movement of animals

during counting. The determination of nematode densities in each sample was performed

under a binocular microscope WILD-M3B type (x10). Nematode numbers was determined by

the lateral displacement of the vessel Dollfus on the platen of the microscope.

Bacterial community analysis

Total genomic DNA was extracted from 250 mg of frozen sediment using the Ultra Clean soil

DNA isolation Kit (MoBio Laboratories, CA) following the manufacturer’s recommendations

with minor modifications as previously described (Duran et al. 2008).

The 16S rRNA genes were amplified by PCR with the bacterial universal fluorescent-labeled

primers 63F HEX (5-Hexa-chloro-fluorescein;5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) and

1387R TET (Tetrachloro-fluorescein; 5’ GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’) (Marchesi et al.

1998). The PCR amplification mixture contained: 12.5 µL AmpliTaq Gold 360 Master Mix

(Applied Biosystems), 0.25 µL of each primer (20 µM), 0.5 µL of the DNA extracts diluted

10× were added to the PCR reactions. A final volume of 25 μL was adjusted with distilled

water. Thermal cycling was carried out, in a PTC200 thermocycler (MJ Research), under the

171

following conditions: 95°C for 10 min, 35 cycles of 95°C for 45 s, 58°C for 45s, 72°C for 1

min, with a final extension step at 72°C for 10 min. PCR products were then purified using a

DNA purification kit (MoBio Laboratories, CA). Purified PCR products were digested with

four units of enzyme AluI (Takara, Japan).

One µl of the digested DNA from each sample was mixed with 8.75 μL of deionized

formamide and 0.25 μL of Rox 500 (Applied Biosystems). After an injection step of 10 s,

electrophoresis was carried out for up to 30 min applying a voltage of 15 KV. T-RFLP

profiles were analyzed with Gene Scan Software version 3.1 (Applied Biosystem). Data sets

were constructed by using peak height thresholds of at least 30 fluorescence units. Then, raw

data were normalized by dividing each peak height by the total signal intensity of the

corresponding profile (Stauffert et al. 2014). T-RFLP profiles of sampling replicate (three

independent replicates per Site) were averaged in order to obtain a profile per Site as

previously described (Paissé et al. 2011). T-RFLP profiles were compared with Heat map and

Venn diagram. The Heat map was performed with CIMminer at the Genomics and

Bioinformatics Group of the Center for Cancer Research (CCR) web site

(http://discover.nci.nih.gov/cimminer/). The Venn diagram was draw with Venny (Oliveros

2007).

Statistical analysis

One-way analysis of variance (ANOVA) was used to test for overall differences of abundance

of free-living nematodes between sites and the Tukey HSD multiple comparisons test was

used in pairwise comparisons. Significant difference was assumed when p<0.05.

http://discover.nci.nih.gov/cimminer/

172

Results and discussion

Pesticide use

The survey of pesticides used by farmers showed that organochlorine pesticides (OCPs) were

used for long time even after prohibition by law. The organophosphorus pesticides are used

since the 80s, the survey relates the current use of these compounds. The most commonly

pesticides used in the agricultural watershed of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex are

herbicides and fungicides (Table 2). These results were in agreement with the statistics

determined by Schreinemachers and Tipraqsa (2012) for a large cross-section of countries

using FAO data for the period 1990–2009, which demonstrated that intensification of

agriculture increases pesticide use, with a decrease of insecticides and an increase of

herbicides and fungicides. The repartition of active ingredients corresponds to 9461 kg from

herbicides, 13445 kg from fungicides and 341kg from insecticides for 113.390 ha of crops

(cereal and fodder) per application. So farmers use 0.2 kg of active ingredient per hectare,

corresponding to the range of concentrations used in low-income countries, lower amount in

comparison to the range between 3-4 kg of active compounds per hectare used in France and

United States (Schreinemachers and Tipraqsa 2012). Additionally, the field survey showed

that iodosulfuron, mesosulfuron, 2,4 D, glyphosate and fenoxaprops were largely used as

herbicides. Among the fungicides tebuconazol and epoxiconazol were dominant. Finally,

deltamethrin was the most insecticide widely used around the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon

complex (Table 2).

173

Table 2. Estimated quantities of the main active compounds used in the agricultural areas of

the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex by farmers’ survey

Farmers are now using organophosphorus compounds, the second generation of pesticides.

These compounds are used worldwide for controlling weeds in oat (Uludag et al. 2007),

wheat (Vazan et al. 2011), soybean crops (López González et al. 2013; Reddy and Duke

2015) and as curative compounds to control fava bean rust for example (Emeran et al. 2011).

The survey of farmers also revealed that the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex received

OCPs for long time. The input of OCPs was from farmers that used these compounds even

after prohibition by law and from obsolete DDT stocked (50 tons, AFE, 2006) in totally

neglected state for forty years until 2011, the year when DDT stock was moved.

Organophosphorus pesticides have short half-lives, they can be degraded quickly (Readman et

al. 1992) while OCPs have longer half-lives and they are very persistent in the environment

Active ingredient Quantity of active

ingredient used

(Kg)

Amount of active

ingredient sold

(Kg)

Herbicides

Iodosulfuron

1007

1205

Fenoxaprop 2650 1536

2,4D 2309 2400

Mesosulfuron 609 1013

Glyphosate 2886 2160

Fongicides

Tebuconazol

4630

3750

Epoxiconazol 8815 7350

Insecticides

Deltamethrin

341

300

174

(Cruz et al. 2003; Kalyoncu et al. 2009), this persistence is due to their lipophilic and

hydrophobic properties (Kalyoncu et al. 2009). The half-lifes of DDT and HCH in surface soil

were estimated as 6.7 and 4.9 years, respectively (Brevik et al.1996; Toan et al. 2009). The

impact of OCPs in aquatic organisms is more important than that of organophosphorus

pesticides and considered really alarming (Alava et al. 2011; Tao et al. 2013) because OCPs

contents were higher (Serrano et al. 1999; Hernandez et al. 2000; Fatta et al. 2007). We

choose to determine the OCP contents, the first generation of pesticides, because of their

persistence in the environment and their alarming impact on aquatic organisms estimating

thus the old contamination in the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex.

Pesticides concentrations in sediment

Because the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex received OCPs for many years and

organophosphorus pesticides are rapidly degraded, only their degradation products can be

found in aquatic ecosystems but not the active substance, we focused the study on OCPs. The

OCPs content was determined in four representative sites of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon

complex. The sites were selected based on a preliminary analysis of twenty sites around the

complex (personal communication). Site 2 in the lake and Site 3 in the lagoon were the sites

most contaminated by pesticides, sites surrounded by many farmers. Two other sites, Site 1 in

the lake and Site 4 in the lagoon, were chosen as “control” because they presented lower

pesticide concentration. The chemical analyses confirmed that pesticides were detectable in

sediment at the four sites (Table 3). The old contamination by OCPs (first generation

pesticides) was proved by detecting 16 compounds of OCPs among the 22 searched in the

sediments of the complex at levels that reached 2 ppm (Table 3). First of all, it is important to

notice that DDT was below the detection limit in all sites but the detection of its metabolites

even at low levels in the sediment (Table 3) of the four sites suggested that DDT was still

used around the complex.

175

Table 3. Concentrations (ngg-1

dry wt sediment) of OCPs in sediment from the four sites

studied in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. SD are indicated. LOD: limit of detection.

Sites Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

α HCH

γ HCH

β HCH

δ HCH

HCB

α Endosulfan

Dieldrin

β Endosulfan

Heptachlor


Endrin

Endrin aldéhyde

Aldrin

2,4’-DDE

4,4'-DDE

2,4’-DDD

4,4'-DDD

4,4'-DDT

α chlordane

β chlordane

cis-Nonachlor

trans-Nonachlor

TotalOCPs

2.7±0.2

0.3±0.1

84.2±10.3

34.2±5.6

0.2±0.04

2.1±0.2

5.0±0.5

2.3±0.1

2.7±0.5

11.8±1.9

< LOD

4.5±0.5

0.7±0.2

< LOD

1.3±0.1

0.8±0.2

0.6±0.1

< LOD

< LOD

0.1±0.07

< LOD

< LOD

154±17

1.8±0.02

0.3±0.05

235±10.5

45.8±8.1

0.1±0.1

107.3±0.2

744±36

< LOD

1.1±0.01

12.8±2.2

862±59

3.0±0.1

1.1±0.03

0.2±0.2

1.5±0.2

3±0.1

1.5±0.7

< LOD

0.5±0.4

0.4±0.3

< LOD

<LOD

2021±113

2.0±0.2

0.2±0.01

182.2±15.7

37.7±5.2

< LOD

22.6±0.7

140±12

3.5±1.2

0.3±0.1

13.3±1.7

163±13

4.8±0.5

0.9±0.7

< LOD

1.2±0.4

1.1±0.7

0.9±0.1

< LOD

< LOD

< LOD

< LOD

< LOD

574±49

3.6±0.9

0.3±0.1

84.8±17.4

5.7±2.1

< LOD

7.4±2.4

36±4

< LOD

3.0±0.9

8.7±5.1

40±4

2.4±0.1

0.2±0.1

< LOD

1.1±0.4

0.4±0.08

< LOD

< LOD

< LOD

< LOD

< LOD

< LOD

195±25

Focusing on the most abundant OCPs detected, hexachlorocyclohexane, dieldrin and endrin,

the results showed that Site 2 at Lake and Site 3 at Lagoon were the most contaminated with

OCPs reaching respectively 2021 and 574 ng g-1

dry weight of total OCPs (Fig 2, Table 3).

176

Fig 2. Concentrations of organochlorine pesticides at the different sites (colors). The error bar

corresponds to the standard deviation (n=3).

The Site 2 showed higher concentrations for lindane (235 ng g-1

), endrin (862 ng g-1

) and

dieldrin (744 ng g-1

) while the concentrations at Site 3 were 182 ng g-1

of lindane, 163 ng g-1

of endrin and 140 ng g-1

of dieldrin. Thus, the Ichkeul Lake, the protected area and UNESCO

site, was more contaminated with OCPs than Bizerta Lagoon (Fig 2).This result was logical

since agricultural watershed of Ichkeul Lake is broader than that of Bizerta Lagoon. Since the

Site 2, located next to an agricultural area in the Ichkeul Lake, was more contaminated

(2021ng g-1

of total OCPs) than the other site located at mouth of the river (574 ng g-1

of total

OCPs), it is likely that pesticides enter in the aquatic ecosystem by direct input through

lixiviation rather than through the river flow. This observation was in accordance with

previous report indicating that pesticides may enter water bodies through both diffuse and

point sources (Vymazal and Březinová 2015), but diffuse sources are probably the most

important. Among diffuse pollution, surface runoff and erosion, leaching and drainage

represent the major pathways. The concentrations of OCPs in Site 2 and Site 3 were

0,0

500,0

1000,0

1500,0

2000,0

2500,0

Beta BHC Endrin Dieldrin ∑ Pesticides

Co

nce

ntr

atio

ns

(ng.

g-1)

Site1

Site2

Site3

Site4

177

comparable to those detected in the tissues of fish (Mugilcephalus and Dicentrarchuslabrax)

from Bizerta Lagoon ranging between 1.25 and 227 ng.g-1

dry wt (Ben Ameuret al. 2013). The

bioconcentration and bioamplification of these OCPs in fishes and mussels present a potential

risk for consumers. The concentration range of OCPs detected in the complex was much

higher than those detected in other regions such as in Singapore coastal marine sediments

(Wurl and Obbard 2005) and in the coast of Quanzhou Bay in southeast China (Yang et al.

2013). The same range of OCPs’ level was detected in harbor sediments from Sea Lots, Port-

of-Spain, Trinidad and Tobago (Mohammed et al. 2011). The OCPs concentrations in

Baiyangdian wetland (China) were in the range 3.60–11.12 ng g−1

(Guo et al. 2014) much

lower than that determined in our study. No correlation could be established between OCPs

contents and physical-chemical parameters. A positive correlation between the concentrations

of total pesticides and total organic carbon content was found in the sediments of the Danshui

River (China; Hung et al. 2007). In our study no correlation between total organic carbon and

OCPs contents could be established. Indeed,the highest organic carbon content in the lagoon

being detected at Site 4 (lower OCPs content) and the lowest organic carbon at Site 3 (higher

OCPs content) while organic carbon was similar in both sites of the lake though OCPs

contents were contrasted (Table 3 and 4). This observation is in accordance with a previous

study in coastal sediments at Sousse (Tunisia; Pavoni et al. 2000). It is thus unclear why the

Site 2 retains the highest OCPs content, further sediments characterization, as granulometry

for example, together with the analysis of a larger number of sites are required in order to

determine the rules for OCPs accumulation in sediment. A recent study showed that pesticides

accumulate in sediments through terrigenous fine-grained sediment discharge (Gwiazda et al.

2015) that corresponds to the situation of the Site 2 in which OCPs arrive by lixiviation.Such

behaviour is due to the capacity of OCPs with high Koc to be absorbed on soil particles, as it

178

is the case for endrin (Koc: 10,000), dieldrin (Koc: 12,000) and hexachlorocyclohexane (Koc:

50,000).

Table 4. Physical-chemical parameters at the sampling sites of the complex Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon

Sites Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

Temperature (°C) 23.4 22.9 23.1 23.7

pH 8.32 8.27 8.34 8.42

Salinity (PSU) 2.4 2.6 27 29

Conductivity (mscm-1

) 4.7 5.0 42.6 45.3

Dissolved oxygen (mg L-1

) 9.7 10.7 8.6 8.7

Nitrite (µM) 0.03 0.15 0.57 0.74

Nitrate (µM) 1.28 1.97 8.21 6.91

Phosphore (µM) 0.17 0.27 1.46 1.72

Ammonium (µM) 6.87 3.94 8.37 11.54

Chla (µgL-1

) 1.50 3.98 0.49 0.91

Suspended material (mg) 0.04 0.06 0.02 0.03

Organic carbon (mgg-1

) 3.52 3.27 2.09 5.17

Nematode abundances

The average densities of free-living marine nematode, at different sites of the Ichkeul Lake

were generally low, 25 individuals/10 cm2 in Site 1 and 133 individuals/10 cm

2 in Site 2, in

comparison to that recorded at Bizerta Lagoon with 571 individuals/10 cm2 in Site 3 and 832

individuals/10 cm2 in Site 4 (Fig3). This result was consistent with previous reports showing

that the abundance of free-living marine nematodes in the Bizerta Lagoon (between 373-7087

individuals/10 cm-2

, Aissa 1991; between 150-1000 individuals/10 cm-2

, Essid 2008)

exceeded that observed in the Ichkeul Lake (between 128-740 individuals/10 cm-2

; Beyrem

179

1999). This may be due to the nature of the clay sediment at the Ichkeul Lake and/or to the

important variation of salinity observed at the Ichkeul Lake between seasons and/or the

contamination level. In the Ichkeul Lake, the Site 2, the most contaminated by pesticides,

presented higher abundance of free-living marine nematodes than Site 1. This can be

explained by the growth of some nematodes species resistant to pesticides as demonstrated in

previous reports showing that the density of free-living marine nematodes was higher in

microcosms contaminated by permethrin than the uncontaminated controls (Boufahja et al.

2011). In contrast, in the Bizerta Lagoon the abundance of free-living marine nematodes was

higher at the less contaminated Site 4 than at the contaminated Site 3. It is likely that the level

of pesticide content in the Bizerta Lagoon was under the lethal doses and thus the sensitive

nematode species were not removed. These results were in accordance with a previous study

showing that the abundance of free-living marine nematodes decreased in contaminated

microcosms by hydrocarbon after elimination of sensitive species (Mahmoudi et al. 2005). It

is important to notice that the toxic compounds may have indirect effects on macrofaunal

communities (Fleeger et al. 2003) through the microbial activity as demonstrated recently

(Ben Said et al. 2015). Also, the presence of contaminant may change the behaviour of

macrofauna modifying the predation/grazing rate that, in turn, alter species abundances and

community composition (Fleeger et al. 2003).

180

Fig 3. Average densities of nematodes (individuals/10 cm2) in the different sites from the

complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. The error bar corresponds to the standard deviation.

Bacterial communities

The T-RFLP profiles from the different sites contained 98 T-RFs, with an average of 61±4 T-

RFs in all sites (Fig4). The T-RFs repartition between the different sites, depicted by the Venn

diagram (Fig5), revealed that most T-RFs (28) were shared between all sites. Such

observation suggested an ecological continuum between both ecosystems that are closely

linked via the Tinja River (Fig1). The related bacterial members to these T-RFs may play an

important role in ecosystem functioning probably ensuring most basic functions. They also

have the capacity to tolerate different environmental conditions, particularly the important

salinity fluctuation between seasons observed in the Ichkeul Lake.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

Ne

mat

od

e a

bu

nd

ance

(i

nd

ivid

ual

s/1

0 c

m2 )

182

Fig 4. Comparison of bacterial communities from the studied sites by heat map with

clustering analysis. The circles indicate the specific T-RFs for Site 1 (blue), Site 2 (yellow),

Site 3 (green) and Site 4 (red).

The Venn diagram also revealed that each ecosystem was characterized by specific T-RFs.

The Ichkeul Lake was characterized by the T-RFs 73, 89, 170, 174 and183 whereas the T-RFs

120, 180, 188, 221, 235, 236 and 247 were detected exclusively in the Bizerta Lagoon (Fig4

and 5). These T-RFs explained the clear separation of the bacterial communities of the

different ecosystems observed in the clustering analysis (Fig 4), which could be explicated by

the differences in salinity. Such influence of salinity on bacterial community is in accordance

with a previous report showing that salinity is a main driver for bacterial communities

organization (Xi et al. 2014). Similarly, a previous observation in the Bizerta Lagoon showed

that the lowest bacterial diversity was detected in sites with highest salinity (Ben Said et al.

2010).

183


Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared T-RFs between sites.

The specific T-RFs for each site are indicated.

Additionally, the Venn diagram revealed that each site had specific T-RFs indicating that

bacterial communities were structured according to the environmental conditions as

previously reported (Ikenaga et al. 2010; Paissé et al. 2010). Regarding the sites with the

highest OCPs content, the Site 2 was characterized by four specific T-RFs (97, 146, 258, 285

and 335) and the Site 3 by five specific T-RFs (54, 263, 315, 403 and 428). These T-RFs were

linked with high levels of endrin, dieldrin and lindane suggesting that they are resistant to

OCPs. It is likely that the related bacterial members to these T-RFs might play a role in OCPs

degradation/transformation determining thus the fate of OCPs in the environment. Previous

studies showed that the presence of pesticides caused changes in bacterial community

structure (Sura et al. 2012), decreasing bacterial diversity and demonstrating pesticide

removal capacities (Lopez et al. 2003; Tien et al. 2013). River biofilms have been particularly

studied, they have been found to be able to metabolize the herbicides atrazine and diclofop

methyl (Lawrence et al. 2001), the organophosphorous pesticide diazinon (Tien et al. 2011)

and the carbamate pesticides methomyl, carbaryl and carbofuran (Tien et al. 2013). Such

studies allowed the identification of resistant bacteria with capacity to degrade pesticides.

Several strains have been isolated for their capacity to remove pesticides as for example

bacterial strains affiliated to Pseudomonas pseudoalcaligenes, Micrococcus luteus, Bacillus

sp. and Exiguobacterium aurantiacum (Lopez et al. 2005).Gram-positive bacteria have been

found in heavily pesticide-polluted sediments (Rajendran et al. 1994; Stainer et al. 1977;

Widenflak et al. 2008). Recently, a metagenomic study of pesticide-contaminated marine

ecosystems allowed the detection of nearly complete biodegradation pathways of DDT and

atrazine, and the partial degradation pathway of lindane (Fang et al. 2014). The genes

184

involved in pesticide degradation, such as the hdt (DDT degradation), hdg (lindane

degradation), and atzB (atrazine degradation) genes, were the most abundant in sites with

highest pesticide content while generalist genes, such as carA (laccase), lip (lipase) and mnp

(peroxidase) genes, were most abundant in site contaminated with other organic compounds

(Fang et al. 2014). Thus, our T-RFLP results suggested that the presence of OCPs selected

bacterial populations having the capacity to cope with the presence of such toxic compounds.

It is important to notice that Site 2 and Site 3 share two T-RFs (38 and 143) that were not

detected in the other sites (Fig4 and 5). It is likely that members related to these T-RFs may

have the capacity to cope both the environmental fluctuations and the presence of OCPs,

which could represent an ecological advantage. Bacterial strains harbouring such capacities

may also have a biotechnological potential. It will be of interest to isolate, characterize and

determine their metabolic potential.

Regarding the sites with the lowest pesticide contents, T-RFLP patterns (Fig4 and 5) showed

that the Site 1 was characterized by four specific T-RFs (63, 100, 118 and 381) and the Site 4

by seven specific T-RFs (40, 60, 80, 158, 300, 321 and 357). It is likely that these T-RFs were

sensitive to OCPs with no capacity to degrade these pesticides. This observation is in

accordance with a previous study reporting that T-RFLP analyses identified sensitive T-RFs

corresponding to bacterial strains unable to resist to the presence of pesticide (Widenfalk et al.

2008). Such sensitive species, because they cannot develop in adverse conditions, are

indicative of an ecological alteration that can serve as “early warming” as previously

suggested for soil (Donkova and Kaloyanova 2008).

Conclusion

The comparison of different sites in the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex allowed the

description of different benthic communities (bacterial and free-living nematodes) according

185

to the content of OCPs. First of all, we could not determine a correlation between the density

of the free-living nematodes and the levels of OCPs. In contrast, the T-RFLP bacterial

community analysis highlighted three groups of T-RFs: i) T-RFs detected in all sites

corresponding to “generalist” bacterial populations able to develop in diverse conditions and

to perform general biogeochemical functions, ii) T-RFs detected only in an ecosystem (Lake

or Lagoon) irrespective of the presence of OCPs, which are probably controlled by the

salinity, and iii) T-RFs specific for a site corresponding to “specialist” bacterial populations,

which may be useful as ecosystem health markers and to estimate the degradation capacities.

The T-RFs from the later group, particularly those inhabiting the sites with high OCPs content

(Site 2 and Site 3) correspond probably to bacterial members resistant to and capable to

degrade OCPs, particularly endrin, dieldrin, β HCH (lindane). They represent a metabolic

potential for the implementation of bioremediation processes in marine ecosystems. In

contrast, T-RFs only detected in the sites with low OCPs content (Site 1 and Site 4) are

sensitive to OCPs, not capable to degrade these pesticides. However, further studies are still

required, particularly in a multi-contamination context, to determine the impact of

organophosphorus pesticide and others pollutants such as PAHs, metals and organo-metals on

the “specialist” bacteria. The combination of both culture-dependent and culture-independent

approaches will be required to characterize their ecological role and their metabolic potential.

Acknowledgements

The authors would like to thank Mme Nabiha M’barek (National Agency of Environment

Protection Tunisia) and Mr Taher Kaabi (Commissariat Regional Commission for

Agricultural Development ofBizerta) for their logistic contribution. We acknowledge the

Regional Platform for Environmental Microbiology PREMICE supported by the Aquitaine

Regional Government Council (France) and the urban community of Pau-Pyrénées (France).

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196

CHAPITRE V : CONCLUSIONS GENERALES

&

PERSPECTIVES

Nos travaux visaient à caractériser l’écotoxicologie du complexe lac Ichkeul – lagune de

Bizerte. Les polluants organiques présents dans le complexe ont été révélés par une enquête

de terrain et des analyses chimiques. Puis l’impact de la présence de ces contaminants dans le

sédiment du complexe sur les communautés microbiennes et la densité des nématodes libres

marins a été déterminé. Les teneurs en HAP dans le sédiment dépassent les limites tolérées au

niveau de la station 12 de la lagune de Bizerte, station soumise au trafic maritime, placée sur

le trajet des navires allant vers le port de Menzel Bourguiba. Cette station est plus contaminée

que la station 9 située dans le canal recevant la pollution provenant du trafic maritime ainsi

que du port commercial de Bizerte. Concernant les pesticides, le recensement effectué auprès

des agriculteurs, des revendeurs de produits phytosanitaires et le commissariat régional de

développement agricole de Bizerte a permis d’identifier les molécules les plus utilisées au

niveau des zones agricoles du bassin versant du complexe lac Ichkeul – lagune de Bizerte:

l’iodosulfurone (1007 kg), le mésosulfurone (609 kg), le 2,4D (2309 kg), le glyphosate (2886

kg) et le fénoxaprop (2650 kg) comme matières actives des herbicides ; le tébuconazole (4630

kg) et l’époxiconazole (8815 kg) comme fongicide et la deltaméthrine (341 kg) matières

active des insecticides. Ainsi cette enquête nous a permis d’identifier la contamination

ancienne provoquée par les pesticides organochlorés, qui ont de très longues durées de vie. Ils

ont été utilisés même après leur interdiction et stockés dans des sites de pesticides obsolètes

délaissés. La station au niveau de Menzel Bourguiba sur le bord de la lagune de Bizerte était

un site de stockage qui a été déménagé en 2012. Les analyses chimiques des pesticides

organochlorés ont prouvé la contamination ancienne par ces pesticides qui existe encore dans

le sédiment, surtout dans le lac Ichkeul. La comparaison des teneurs en pesticides entre les

197

stations situées à l’embouchure des oueds du lac Ichkeul et la station 8, soumise uniquement à

la contamination par les eaux de ruissellement provenant des zones agricoles sur le bord du

lac, a montré que la station 8 était la plus contaminée en pesticides organochlorés de tout le

complexe, avec des teneurs qui dépassent les normes. Ceci peut être dû aussi au mouvement

d’érosion du sédiment suite à l’apport sédimentaire par les oueds vers le lac ce qui amène la

contamination ancienne de plus en plus loin des embouchures des oueds.

La structure des communautés bactériennes du sédiment des 20 sites prospectés du

complexelac Ichkeul–lagune de Bizerte a été déterminée par T-RFLP. Les analyses par des

CCA, visant à associer la structure des communautés bactériennes avec les concentrations en

polluants, ontmontré qu’indépendamment des saisons, les communautés bactériennes des

stations de la lagune de Bizerte sont impactées par les HAP alors que celles du lac Ichkeul

sont influencées par les pesticides. En s’intéressant à chaque écosystème seul et

dépendamment des saisons, les CCA ont montré que les communautés bactériennes du lac ont

été plus influencées par les HAP en septembre (fin de la période sèche) qu’en avril (fin de la

période pluvieuse). Ceci est en rapport avec l’hydrologie de l’écosystème puisque pendant la

saison sèche l’eau lagunaire entre vers le lac. Concernant la lagune de Bizerte, la pollution par

les HAP et les pesticides est plus prononcée en avril qu’en septembre. Donc, du point de vue

écotoxicologique les résultats permettent de conclure que la lagune influence le lac par les

HAP pendant la saison sèche alors que le lac influence la lagune par les pesticides pendant la

saison pluvieuse (Fig 1.).

198

Fig 1. L’inter-relation lac-lagune de point de vue écotoxicologique

L’impact de la présence des HAP et des POC dans le sédiment a été étudié aussi sur la densité

des nématodes libres marins. La station 8, la plus contaminée en pesticides, représente la

densité la plus élevée en nématodes libres marins, ce qui est le contraire de la réponse des

nématodes libres marins par rapport aux HAP.

Les analyses chimiques ont montré que la station 17 est la moins contaminée de tout le

complexe, la station 12 de la lagune est la plus contaminée en HAP dans tout le complexe, la

station 8 du lac Ichkeul est la plus contaminée en pesticides de tout le complexe et enfin la

station 5 du lac Ichkeul possède une contamination multiple par les HAP et les pesticides. Le

pyroséquençage a été effectué pour ces 4 sites intéressants afin d’analyser de manière

199

exhaustive leurs communautés bactériennes. Certaines OTUs ont été détectées dans les 4

sites, ces OTUs peuvent être responsables du fonctionnement de base de tout écosystème

aquatique, des écosystèmes semi-fermés, ou de cet écosystème précisément. Les fonctions de

base assurées sont la dégradation de la matière organique, le déroulement des cycles de

carbone, azote… Les OTUs détectées exclusivement dans la lagune sont résistantes à la

salinité élevée. D’autres OTUs ont été présentes uniquement dans le lac Ichkeul, ceux sont

des OTUs résistantes à la variation de la salinité, elles ont été détectées en fin de la période

pluvieuse à des salinités faibles, est-ce qu’on retrouve les mêmes aux deux saisons? Des

analyses sont donc nécessaires pour des échantillons collectés fin de la période sèche pour

pouvoir comparer.

Dans nos travaux de recherches futurs, nous allons nous intéresser à :

Déterminer les souches bactériennes sensibles et résistantesà tout un ensemble de

contaminants et multicontaminants.Les analyses effectuées autour de la lagune et du

lac ont montré des sites contaminés par des multicontaminants, une mixture de

plusieurs types de contaminants. Ainsi les analyses de la structure des communautés

permet de déterminer des espèces sensibles et résistantes à tout un ensemble de

contaminants et multicontaminants.

Etudier in vitro l’impact de la mixture des HAP, mixture des POC et le mélange HAP-

POC sur les communautés benthiques. Est-ce que la communauté bactérienne après

contamination sera la même trouvée dans les sites in situ contaminés par le même type

de contamination? L’étude in vitro sera effectuée pour tester les effets de la mixture

des HAP, mixture des POC et le mélange HAP-POC, les plus trouvés dans le sédiment

du complexe avec des profils qui ressemblent à ceux rencontrés dans le lac et la lagune

c'est-à-dire avec des concentrations des HAP plus élevées dans la lagune et les teneurs

des pesticides plus élevés dans le lac, sur la densité et la diversité des communautés

200

benthiques (bactériennes et des nématodes libres marins), avec la détermination des

doses des contaminants ajoutés au début de l’expérience et à la fin de l’expérience à

fin de suivre la dégradation de ces contaminants. L’efficacité de l’étude in vitro a été

prouvée dans les travaux de Louati et al., 2013 qui ont déterminé l’impact des HAP

sur les communautés benthiques.

L’analyse chimique des pesticides organophosphorés dans le sédiment du complexe, et

la détermination de leur impact sur le benthos. Dans ce présent travail on a déterminé

les teneurs en pesticides organochlorés (contamination ancienne). L’analyse chimique

des pesticides organophosphorés, qui sont utilisés actuellement dans le bassin agricole

du complexe ainsi que leurs principales produits de dégradation, du fait de leurs faible

demie vie, dans le sédiment du complexe et dans des matrices biologiques telles que

les bivalves et l’étude d’impact des polluants détectés en forte concentration sur les

communautés benthiques (bactériennes, de nématodes libres marins et des bivalves)

donnera une vision complète sur la contamination par les pesticides dans le complexe.

Il faut viser les bivalves aussi pour voir la différence des teneurs entres les matrices et

déduire s’il yaura un effet de bioaugmentation et bioconcentration.

Suivi du transfert des pesticides dans le bassin versant et dans le complexe. Le

transfert des pesticides depuis la pulvérisation des champs jusqu’à l’arrivée aux

écosystèmes aquatiques, la colonne d’eau puis le sédiment doit être étudié à fin de

déterminer l’extension de la contamination par les pesticides dans les différents

compartiments, les pertes, et les teneurs arrivant aux écosystèmes aquatiques. Ce ci

peut être réalisé par l’implantation des capteurs de pesticides dans les compartiments à

étudiés et les analyses chimiques derrières avec des périodes du temps bien

déterminés.

201

Isolement des bactéries qui dégradent les pesticides et tester leurs capacités en

bioremédiation. Ceci peut être réalisé par isolement des bactéries capable de dégrader

les pesticides au niveau des sédiments des sites du complexe les plus contaminés en

pesticides (site 8) et les utilisées dans des tests de bioremédiation par bioaugmentation.

De même pour les HAP dans le site 12.

202

Résumé

L’objectif principal de ce travail était de réaliser une étude écotoxicologique du complexe lac

Ichkeul-lagune de Bizerte. Un recensement des pesticides agricoles les plus utilisés dans le bassin

versant agricole a été effectué afin de déterminer les pesticides les plus problématiques. Le

recensement effectué auprès des agriculteurs, des revendeurs de produits phytosanitaires et le

commissariat régional de développement agricole de Bizerte a permis d’identifier les molécules les

plus utilisées au niveau des zones agricoles du bassin versant du complexe lac Ichkeul – lagune de

Bizerte: l’iodosulfurone, le mésosulfurone, le 2,4D, le glyphosate et le fénoxaprop comme matières

actives des herbicides ; le tébuconazole et l’époxiconazole comme fongicide et la deltaméthrine

matières active des insecticides.

Ensuite, les concentrations en pesticides, HAP et PCB ont été déterminées. Les résultats ont montré

une contamination au niveau de certains sites du complexe. Les stations situées dans la lagune de

Bizerte ont des teneurs en HAP dépassant les limites tolérées. Les concentrations en pesticides

dépassent les normes au niveau de quelques sites du lac Ichkeul.

Enfin, l’impact de ces polluants sur les communautés microbiennes et la densité de nématodes a été

déterminé. La CCA combinant les résultats des analyses chimiques et les données T-RFLP des

communautés bactériennes met en évidence que les communautés bactériennes du lac sont influencées

parles pesticides alors que celles de la lagune sont influencées par les HAP. La répartition des T-RFs

montre la présence de T-RFs spécifiques dans les sites contaminés : le T-RF 114 bp caractérise le site

le plus contaminé en pesticide, les microorganismes associés à ce T-RF correspondent probablement à

des microorganismes résistants aux pesticides et capables de les dégrader. La composition des

communautés bactériennes a été déterminée par pyroséquençage 454 sur les sites les plus

représentatifs : le moins contaminé du complexe, le plus contaminé en HAP, le plus contaminé en

pesticides et un site présentant une contamination multiple HAP-Pesticides. L’impact de la présence

des pesticides sur la densité des nématodes libres marins a été étudié.

L'analyse taxinomique des données de pyroséquençage regroupe les séquences dans 44

embranchements différents. En général, Proteobacteria étaient l’embranchement le plus dominant avec

une prédominance de Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria et deltaproteobacteria dans les

sédiments. Les communautés bactériennes des quatre sites ont 211 OTU commun. Le lac Ichkeul a été

caractérisé par 219 OTU spécifique et la lagune de Bizerte 235 OTU. Le Site 2, le plus contaminé en

pesticides présente l’abondance la plus élevée en nématodes libres marins.

203

Abstract

The main objective of this work was to conduct an ecotoxicological study of the complex

Ichkeul Lake-Bizerta lagoon. A survey of the most used agricultural pesticides in the watershed of the

complex was conducted to determine the most problematic compounds. The survey of pesticides use

with farmers, dealers of pesticides and the Regional Commissioner for Agricultural Development

Bizerte has helped to identify the most used pesticides in agricultural areas of the watershed of the

complex Ichkeul Lake-Bizerta lagoon: iodosulfuron, the mesosulfurone, 2,4D, glyphosate and

fenoxaprop as herbicides active materials, tebuconazol epoxiconazol as fungicide active materials and

deltamethrin as insecticides.

Then, the concentrations of pesticides, PAHs and PCBs were determined in the sediment of the

complex. The results showed a contamination of some complex sites. Stations located in the lagoon of

Bizerte have a level of PAH in excess of permissible limits. Pesticide concentrations exceed the

standards at some sites from the Ichkeul Lake.

Finally, the impact of these pollutants on microbial communities and nematode density was

determined. CCA combines the results of chemical analyzes and T-RFLP data of bacterial

communities shows that the bacterial communities of the lake are influenced by pesticides while those

of the lagoon are influenced by PAHs. The distribution of T-RFs showed the presence of specific T-

RFs in contaminated sites: the T-RF 114 bp characterizes the most contaminated site in pesticides,

microorganisms associated with the T-RF are probably microorganisms resistant to pesticides and

capable of degrading this pollutant. The composition of bacterial communities was determined by 454

pyrosequencing of the most representative sites: the least contaminated of the complex, the most

contaminated by PAH, the most contaminated by pesticides and a site with multiple PAH-pesticides

contamination. The impact of the presence of pesticides on the density of free living marine nematodes

was studied.

The taxonomic analysis of the pyrosequencing data grouped the sequences into 44 different phyla. In

general, Proteobacteria were the most dominant phyla with predominance of Gammaproteobacteria,

Alphaproteobacteria and Deltaproteobacteria within the sediments. Besides Proteobacteria, there are a

number of sequences affiliated to the following major phyla detected in all four sites: Chloroflexi,

Bacteroidetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Actinobacteria, Gemmatimonadetes, Firmicutes,

Cyanobacteria, Spirochaetes, Acidobacteria. The bacterial communities of the four sites shared 211

common OTUs. The Lake Ichkeul was characterized by 219 specific OTUs and the Bizerta lagoon by

235 OTUs. Site 2, the most contaminated by pesticides has the highest abundance of free living marine

nematodes.

Impacts écologiques de la présence de quelques substances ...

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