Impact of the bioprocess on theImpact of the bioprocess on theglycosylation glycosylation of recombinant proteinsof recombinant proteins::the the case case of recombinant erythropoietinof recombinant erythropoietin

Laura A. Palomares

Departamento de Medicina Molecular yBioprocesos

Instituto de BiotecnologíaUniversidad Nacional Autónoma de México

Sistemas protSistemas proteicos eicos multiméricosmultiméricos

Ensamblaje-desensamblajeIn vitro

Cuantificación y caracterización

Estrategias de purificación

Construcción de vectores

Estrategias racionales de producción

Funcionalización

Genotipificación

PPV RotavirusVacunas

Nanomateriales

Vectores viralesVAA-2

Terapia génica

HA Virus de la influenza

Vacuna

HOY…1. Las glicoproteínas

2. La N-glicosilación de proteínas

3. Factores que determinan el patrón de glcosilación de proteínas recombinantes

• Sistema de expresión

• El bioproceso

4. Ejemplos:

• Alcalino fosfatasa

• Eritropoyetina

Importancia de las glicoproteínas• ~ 50% proteínas humanas están glicosiladas• Biofarmacéuticos para terapia humana

> 165 aprobados> 500 en pruebas clínicasMercado total > USD $ 50,000 X 106

Crecimiento anual > 20%~ 70 % en pruebas clínicas son glicoproteínas

• Grupo principal:Anticuerpos monoclonales19 en el mercado> 370 en desarrollo

Hepatitis!

Cáncer!

Deficiencia de hGH!

Diabetes !

Infarto al miocardio!

Hemofilia!

Medicamentos recombinantesy su aplicación

0

25

50

75

100

0

5

10

15

19

82

19

83

19

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19

89

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90

19

91

19

92

19

93

19

94

19

95

19

96

19

97

19

98

19

99

20

00

20

01

20

02

20

03

20

04

Acumulados

Aprobados por añoM

edic

amen

tos

rec.

apro

bado

s ac

umul

ados

Med

icam

ento

s re

c.ap

roba

dos

por a

ño

Tabla 1. Las proteínas recombinantes farmacéuticas de más venta en el mundo son glicoproteínas. Las glicoproteínas se muestran en negrillas.

Proteína Marca registrada Ventas mundiales 2004 (millones de USD)

Eritropoyetina Bioyetin, Epogen, Procrit, Eprex*

4,700

Maba vs CD20 Rituxan 2,989

Maba vs TNFb Remicade 2,891

Darbopoyetina Aranesp 2,473

Insulina Glinux, Novolin, Humulin* 2,097

Maba vs receptor TNFb Enbrel 1,800

G-CSFc pegilado Neulasta 1,700

Interferon -1a Avonex 1,417

Maba vs receptorHER2 Herceptin 1,279

G-CSFc Filatil, Neupogen 1,180

Insulina LisPro Humalog 1,102

Interferon -1a Emaxem, Rebif 1,091

Interferon -1b Urbieta, Betaseron 1,057

Insulina glarginina Lantus 1,053

Interferon -2a pegilado Pegasys 1,000

Maba vs RSVd Synagis 943

* Algunas de las marcas comerciales existentes a. Anticuerpo monoclonal. b. Factor de necrosis tumoral. c. Factor estimulador de granulocitos d. Virus sincitial respiratorio Palomares y Ramírez, 2007

La La glicosilaciónglicosilación

• Modificación postraduccional

• Oligosacárido unido a un aminoácido

• O-glicosilación: unión a OH- de Ser/Thr

• C-glicosilación: unión a C2 de Trp

•• N-glicosilaciónN-glicosilación: unión a amida de Asn en

secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr, Xaa ≠ Pro

La La glicosilación glicosilación de de proteproteínasínas

GP120 del HIV

GP120 del HIV

Reconocimiento específico• Reconocimiento endógeno (propio)

Vida media en el torrente sanguíneo;Tráfico intercelular; Recambio de moléculas

• Reconocimiento exógeno (ajeno)Bacterias, virus, toxinas; Antigenicidad

Funciones estructurales y regulatorias• Correcto plegamiento y transporte• Estabilidad (Temp., pH, etc.)• Solubilidad• Funcionalidad

actividad específica, potencia• Estructura• Reconocimiento por anticuerpos• Resistencia/reconocimiento por proteasas

¿Por qu¿Por qué es necesaria la é es necesaria la glicosilaciónglicosilación??Muchas proteínas terapéuticas requieren una glicosilación auténticaMuchas proteínas terapéuticas requieren una glicosilación auténtica

Tipos Tipos de de N-glicanos N-glicanos y y su nomenclaturasu nomenclatura

ALTOS EN MANOSA HÍBRIDOS COMPLEJOS

PAUCIMANOSA

Núcleo deN,Nʼ-diacetilquitobiosa

(uniones β (1-4)

Pentasacáridocomún

La

La N

-glic

osila

ción

N-gl

icos

ilaci

ón PP

mRNAPP

P

Calnexina

Calreticulina

Retículo endoplásmico

Trans Golgi

1 2 3

4

56 7

8

910

111213

14

1217

17

14

15

15

15

15

16Fuc

ManNAcGlc

GalSia

Glu

13

Medial Golgi

Cis Golgi

Palomares y Ramírez, 2007

N-glicosilaciónN-glicosilación:: ModificaciModificación cotraduccionalón cotraduccional

Calnexina

Calreticulina

PP

mRNA

PP

Retículo endoplásmico

Oligosacariltransferasa

Monosacariltransferasa

Monosacariltransferasa

Flipasa ATP -dependiente

P

Fuc

Man

NAcGlc

Gal

Glc

Palomares y Ramírez, 2007

Procesamiento de glicanos en el Golgi1 52

78

7

34

10

6

9

78

8

11

78

Cis Golgi

Medial Golgi

Trans Golgi

Azúcar + ATP Azúcar-P Azúcar NDPNTP PPi

Azúcar(A)-NDP Azúcar(B)- NDP

UDP-GlucosaUDP-GalactosaUDP-N-acetilglucosaminaGDP-FucosaCMP-Acido siálico

Fuc

Man

NAcGlc

Gal

Sial Palomares y Ramírez, 2007

N-glicosilación

NeuNAc-9-P

ManNAc

ManNAc-6-P

UDP-GlcNAc

ATP

PEP

CDP

CMP

Citidina

Transp

Man

Man-6-P

Man-1-P

GDP-Man

ATP

GTP

AcCoA

Gluc

Fru-6-P

GlcN-6-P

GlcNAc-6-P

GlcNAc-1-PUTP

NH4+

Transp

NeuNAc CTP

CMP-NeuNAcNúcleo

ManN

Citoplasma

NTP= cualquier nucleótido

A.Golgi

Celular Actividades enzimáticasEstado fisiológico=> Condición y Tipo de Célula

Entorno Disponibilidad de precursoresEstado energéticoGlicosidasas extracelularesInhibidores/ tóxicos=> Condición y Modo de Cultivo

Proteína SecuenciaEstructura

Factores que potencialmente afectanFactores que potencialmente afectanla glicosilaciónla glicosilación

Selección del sistema de expresión

BuenaExcelenteMuy buenaMuy buenaSeguridad

ExcelenteMuy buenaMuy buenaBajaExcreción osecreción

Muy bajaMuy bajaBajaBaja-aceptable

Degradaciónproteolítica

SiSi*NoNoGlicosilacióncompleja

SiSiSiNoGlicosilaciónsimple

ExcelenteMuy bueno,excelente

AdecuadoOcasionalPlegamiento deproteína

AltoAltoMuy bajoMuy bajoCosto del medio

Bajo - buenoMuy bueno-excellente

Muy bueno,excelente

ExcelenteNivel de expresión

SuficienteSuficienteMuy buenoExcelenteAlta µ

MamíferosInsectosP. pastorisE. coliCaracterística

* Diferente a células de mamífero Adaptedo de Shuler y Kargi, 2002

Rutas Rutas de de N-glicosilación predominantes N-glicosilación predominantes enendiferentes taxadiferentes taxa

Fuc

Man

NAcGlc

Gal

Sia

Glu

Xil

Levaduras

α6α3

Hongosfilamentosos

Vertebrados

α6α3

Insectos Plantas

α3

Productividad vs Cantidad

Productividad

Calidad

Células de mamífero

Bacterias

Levaduras

Animales transgénicos

Células de insecto

Palomares et al., 2003; Lipscomb et al., 2005

ComparaciComparación entre células CHO y de insectoón entre células CHO y de insectoConcentración máxima de SeAP

producida por células CHO: 14 mg/L

producida por células de insecto: 240 mg/L

SeAP células insecto

SeAP células CHO= 17 !!!!!17 !!!!!

Pauc

i-m

anos

e

Alto

s en

man

osa

Hib

ridos G0

G1

G2

G4G3

Sial

ilado

s

0

20

40

60

80

High Five

CHO

Abu

ndan

cia,

%

EjemploEjemplo: : Anticuerpos Anticuerpos ((IgGIgG))

N-glicosilación y función efectora del Ac

Lisis mediada por complemento

Unión y activación de receptores Fcγ

Serrato et al., 2004, Instituto Bioclón, Grupo Alagón

0

10

20

30

40

50

60

Caballo

Ratón

Abu

ndan

cia,

%

Pauc

iman

Alta

man G0

G1

G2

G3

Sial

• Determina las características del producto recombinante

• Determina el proceso de producción

El El hospederohospedero

REGLA

Utilizar el sistema más simple que cumpla con todos los

requisitos del producto deseado

Las Las células células CHOCHO

Células de ovario de hamster chino

Las células animales más utilizadas para la producción de

proteínas recombinantes a nivel industrial

Patrón de glicosilación por hámsters

• Tipo de siálico (glicolilneuramínico vs. acetil neuramínico)

• Galactosa en enlace β1-3 en lugar de β1-4

• Alta fucosilación de proteínas

• No bisectados

Estructuras potencialmente inmunogénicas en humanos

Producción de Glicoproteínas Terapéuticaspor Cultivo de Células Animales

• Estrés hidrodinámico– diseño biorreactor– parámetros operación

• Modo de operación– lote, lote-alim., perfusión

• Control Medio Ambiente– glucosa > lactato– glutamina > amonio

• Precursores– nucleótidos azúcares

• Tiempo residencia-cosecha• Inhibidores glicosidasas

Importancia Importancia del del bioproceso sobre bioproceso sobre el el patrpatrón ón dedeglicosilación glicosilación de de proteínas proteínas recombinantesrecombinantes

Condición Causa Ref.____________________________________________________________________________________________Limitación de glucosa Glicosilación deficiente (interferon γ) 1Presencia/ausencia suplementos (SFB) Cambios en la microheterogeneidad, contenido 1, 2

de glicanos concentración de exoglicosidasaspH menor a 6.9 o mayor a 8.2 Disminuye procesamiento 3Baja temperatura (33 ºC) Incrementa ocupación de sitios N-glicosilación (tPA) 4Baja temperatura Aumento en sialilación (alcalino fosfatasa) 5Acumulación de amonio Disminuye galactosilación y sialilación (AcM) 6, 7Oxígeno disuelto menor a 10% Disminuye galactosilación y actividad sialilT (AcM) 8Gradientes de TOD > 7000 s Galactosilación y sialilación afectadas (AcM) 9Osmolaridad > 400 mOsm/Kg Disminuye galactosilación (AcM) 10Tiempo de cultivo Afecta la ocupación de sitios de N-glicosilación (tPA) 4Modo cultivo:perfusión, lote-alimentado Afecta sialilación (alcalino fosfatasa) 11Adición de N-acetilmanosamina Aumento de sialilación de células CHO e insecto 12, 13Tiempo de cultivo Liberación exoglicosidasas y reducción sialilación 14

(antitrombina)____________________________________________________________________________________________

Referencias. 1) Xie et al., 1997. 2) Serrato et al., 2007. 3) Borys et al. 1993. 4) Andersen et al., 2000. 5) Kaufmann et al., 2001.6) Gawlitzek et al., 2000. 7) Yang y Butler, 2000. 8) Kunkel et al., 1998. 9) Serrato et al., 2004. 10) Schmelzer y Miller 2002.11) Lipscomb et al., 2005. 12) Gu y Wang, 1998. 13) Lawrence et al., 2000. 14) Munzert et al., 1997.

Tomado de Palomares et al., 2004 y Palomares y Ramírez, 2007

Perfusión discontinuaLote-alimentado cíclico

Efecto del Modo de Cultivo en la GlicosilaciEfecto del Modo de Cultivo en la GlicosilaciónónProducciProducción de Alcalino Fosfatasa en Células CHOón de Alcalino Fosfatasa en Células CHO

LoteAlcalino fosfatasa (trunca)

Lipscomb et al., 2005

Characterizing N-glycosylationCharacterizing N-glycosylationWeak ion exchange HPLCSialic acid content

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Time, min

Rela

tive

fluor

esce

nce

units

S0S1

S2

S3

S4

2-D HPLCStructure confirmation

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Time, min

0

10

20

30

10 11 12 13 14 15 16 17

Glucose units

Weak ion exchange

Normal phase

Normal phase HPLC + exoglycosidasedigestionsStructure identification

0

10

20

30

40

50

60

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Glucose units

Sample

Galactosidase digestion

Rela

tive

fluor

esce

nce

units

Rela

tive

fluor

esce

nce

units

Rela

tive

fluor

esce

nce

units

ProducciProducción de alcalino ón de alcalino fosfatasa fosfatasa en células CHOen células CHO

Lipscomb et al., 2005

PerfusiónDiscontinua

Lote-alimentado

cíclicoLote

1.04 ± 0.053.9 ± 0.341.6 ± 0.6Rendimiento

equivalente volumen-día, mg

0.13 ± 0.050.1 ± 0.060.21 ± 0.04Productividadespecífica, pg/cel d

0.18 ± 0.040.25 ± 0.030.79 ± 0.2µmax, d-1

3.3 ± 0.41.5 ± 0.22.3 ± 0.1Xv max, x106 cel/mL

0

20

40

60

80

Perfusión

Lote alimentado

Lote

0

25

50

75

100

No sialidados Parcialmente sial. Totalmente sial.

Perfusión

Lote-alimentado

Lote

Abu

ndan

cia

rela

tiva,

%

Abu

ndan

cia

rela

tiva,

%

0

25

50

75

100

Lote Lote alimentado Perfusion

Ocu

paci

ón d

e si

tios,

%

No amplificado

1.6 ± 0.613.7 ± 2.5Rendimiento equivalentevolumen-día, mg

0.21 ± 0.041.9 ± 0.1Productividad específica,pg/cel d

0.79 ± 0.20.34 ± 0.09µmax, d-1

2.3 ± 0.11.1 ± 0.2Xv max, x106 cel/mL

Amplificado

0

25

50

75

100

No sialidado Parcialmente sial. Totalmente sial.

Lote amplificadas

Lote

Abu

ndan

cia

Rel

ativ

a, %

AmplificaciAmplificación de Plásmidoón de Plásmido

No amplificado

Amplificado

0

10

20

30

40

50

Lote amplificadas

Lote

Abu

ndan

cia

Rel

ativ

a, %

No amplificado

Amplificado

No sialidados Totalmente sial.Parcial sial

Lipscomb et al., 2005

16.6 ± 3.413.4 ± 2.48.3 ± 5.66.8 ± 0.4Totalmente sialidadas

Perfusióndiscontinua

Lote alimentadocíclicoLote

87.9 ± 5.835.6 ± 9.517.9 ± 113.8 ± 1.9% de ocupación de sitios

34.4 ± 12.718.2 ± 0.89.5 ± 5.26.4 ± 0.8Parcialmente sialidadas

49.1 ± 16.168.4 ± 3.282.4 ± 10.886.9 ± 1.2Formas no sialidadas

Contenido de ácido siálico

7.2 ± 0.68.2 ± 0.65.6 ± 0.114.2 ± 1.6Tetraantenarias, %

61.4 ± 10.550.6 ± 1.437.0 ± 6.341.2 ± 2.9Triantenarias, %

25.2 ± 8.332.6 ± 2.329.0 ± 4.024.8 ± 1.2Biantenarias, %

Formas complejas

6.2 ± 2.88.6 ± 2.128.0 ± 2.219.9 ± 0.57Manosa terminal, %

Perfil de N-glicosilación

1.04 ± 0.053.9 ± 0.341.6 ± 0.613.7 ± 2.5Rendimiento volumen-díaequivalente, mg

0.13 ± 0.050.1 ± 0.060.21 ± 0.041.9 ± 0.1Productividad específica,pg/cel d

0.18 ± 0.040.25 ± 0.030.79 ± 0.20.34 ± 0.09µmax, d-1

3.3 ± 0.41.5 ± 0.22.3 ± 0.11.1 ± 0.2Xv max, x106 cel/mL

No amplificadasAmplificadas

Lote

¿¿Calidad vs cantidadCalidad vs cantidad??¿¿AcercamientoAcercamiento molecular molecular vs acercamiento operativo vs acercamiento operativo??

ProducciónProducción de de SeAP SeAP en en células células CHO CHO

Lipscomb et al., 2005Promotor del virus mamario de ratón (receptor glucocorticoide)1x10-6 M metrotexatoInductor 1x10-6 M dexametasona

Producción Producción de de SeAP SeAP en en células células CHOCHO

Calidad Perfusión > Lote alimentado > Lote

• Modo de cultivo afecta sustancialmente:Perfil de glicanos% de ocupación de sitios de N-glicosilación(mayor sialidación y ocupación en perfusión)

¿Por qué? µ baja Estado pseudoestacionario Substratos clave abundantes Subproductos tóxicos bajos Mayor viabilidad y menor lisis y muerte celular Menor concentración de exoglicosidasas

• Amplificación de copias del gen heterólogo:aumento 10X productividad específica

No satura capacidad de glicosilación de línea celular

• Producida principalmente en riñones• Inducida por hipoxia• Se une a receptores en UFB-E y UFC-E• Activa ciclo celular en células blanco• Estimula proliferación, diferenciación y maduración

de células eritroides• USOS: Anemia crónica por falla renal, por

tratamiento contra SIDA, por quimioterapia;transfusión sanguínea alogénica en cirugía

EritropoyetinaEritropoyetina:: La La reinareina

Tabla 1. Las proteínas recombinantes farmacéuticas de más venta en el mundo son glicoproteínas. Las glicoproteínas se muestran en negrillas.

Proteína Marca registrada Ventas mundiales 2004 (millones de USD)

Eritropoyetina Bioyetin, Epogen, Procrit, Eprex*

4,700

Maba vs CD20 Rituxan 2,989

Maba vs TNFb Remicade 2,891

Darbopoyetina Aranesp 2,473

Insulina Glinux, Novolin, Humulin* 2,097

Maba vs receptor TNFb Enbrel 1,800

G-CSFc pegilado Neulasta 1,700

Interferon -1a Avonex 1,417

Maba vs receptorHER2 Herceptin 1,279

G-CSFc Filatil, Neupogen 1,180

Insulina LisPro Humalog 1,102

Interferon -1a Emaxem, Rebif 1,091

Interferon -1b Urbieta, Betaseron 1,057

Insulina glarginina Lantus 1,053

Interferon -2a pegilado Pegasys 1,000

Maba vs RSVd Synagis 943

* Algunas de las marcas comerciales existentes a. Anticuerpo monoclonal. b. Factor de necrosis tumoral. c. Factor estimulador de granulocitos d. Virus sincitial respiratorio

• 165 aminoácidos; 34 - 39 kDa• Ac. siálicos indispensables para actividad

biológica• 2 puentes S-S• Glicosilación

> 31% alfa; 24% beta N- (asn 24, 38, 83) O- (ser 126)• Actividad requiere glicosilación

EritropoyetinaEritropoyetina:: La La reinareina

• N-glicosilación en Asn 38 y 83 se requiere para secreción de EPO

• El tiempo de circulación de EPO depende del contenido de ácidos

siálicos (galactosas expuestas se unen a lectinas hepáticas)

• La estructura del oligosacárido (número de antenas) afectan la

actividad in vivo (tetraantenarios más activos que biantenarios) (Carga

de la molécula)

ConclusionsConclusions Higher content of G4 and S4 glycans in EPO fromserum-free vs serum-containing media

Suspended cultures in SFM were the most productiveand had a higher content of totally sialylated G4 glycans

EPO from controlled, instrumented bioreactors hadhigher content of totally sialylated glycans thannon-controlled cultures

A higher content of S4 glycans occurred at the stationaryphase of perfusion cultures

Decreased temperature increased the content of G4glycans

EPO glycosylation profile can be controlled by thepurification protocol

Suitable up-stream and down-stream process design toimprove EPO productivity and quality

Gracias…Vanessa Hernández, Karin Levy, Javier Dorantes

Apoyo económico: CONACyT, DGAPA-UNAM,Instituto Bioclón, Probiomed