Séance thématique de l’ ACADÉMIE NATIONALE DE PHARMACIE

« Glycation des protéines - La réaction de MAILLARD »

Mercredi 22 janvier 2014

Identification et dosage des produits

avancés de glycation, aussi appelés AGEs

Applications à la chimie des aliments transformés

et à la biologie humaine

Frédéric J Tessier Enseignant-Chercheur en Chimie Analytique et Nutrition (PhD & HDR)

frederic.tessier@lasalle-beauvais.fr

Institut Polytechnique LaSalle Beauvais, Unité EGEAL

FJ Tessier : liens d'intérêt

Contrats institutionnels d'évaluation ou de prestations intellectuelles

et/ou participation à des comités d'experts ou à des séminaires (sans

rémunération à titre personnel) :

Prodietic, Biostime, Nutrition Santé, ULICE-Limagrain, La Gerbe d’Or,

Laiterie d’Isigny, CELNAT, ANIA, CNIEL, APRIFEL, CNIPT, L’alliance 7,

SEB, TEFAL, Fond Français Alimentation & Santé , PILEJE, Cuisinez

Juste, Candia, Elementa, AFDN, IMARS, Eurofoodchem, Cocotea

Dès 1912, Maillard faisait l’hypothèse

que cette réaction chimique

devait être impliquée dans :

Modification des nutriments pendant la cuisson des aliments

Formation de carbonates durant l’humidification abiotique des substances humiques du sol

Modification des protéines, in vivo, catalysée par l’hyperglycémie des sujets

diabétiques

Hodge, J. E. (1953).

“Chemistry of browning

reactions in models systems.”

JAFC 1(15): 928-943

Pourquoi s’intéresser à la réaction de Maillard ?

Modifications (bénéfiques ou néfastes) des nutriments

pendant la transformation thermique des aliments

Modifications chimiques des protéines, in vivo,

catalysées par l’hyperglycémie des sujets diabétiques

Pourquoi s’intéresser à la réaction de Maillard ?

MRPs e.g. pyrazines, acrylamide…

AGEs

e.g. carboxyméthyllysine

Nomenclature

« Glycation »

Grandes découvertes associées au

développement d’outils analytiques

Tessier (2010) Pathologie Biologie, 58, 214-219

Quels effets

pathogènes ?

Quelle contribution

relative de ces deux

sources d’AGEs ?

AGEs et

autres MRPs

alimentaires

AGEs formés

in vivo

Pourquoi s’intéresser à la réaction de Maillard ?

Structures chimiques

de quelques AGEs

CH2 NHNH C

O

NH2

NH2

NH

NH

N NH

N

NH+

NH CH2 COOH

NHNH

CH3

+

H

H

N

NCH3

CH3

OHNH

Lysine Arginine

Pentosidine

Vesperlysine A CML

MOLD

Argpyrimidine

GOLA

Hémoglobine Glyquée

Carboxyméthyl-lysine

Pentosidine

Acrylamide

NH CH2 COOH

N NH

N

NH+

CH2

NH2

O

Hémoglobine Glyquée

‘Glycated hemoglobin, not glycosylated or glucosylated’ Roth, 1983, Clin Chem, 29, p1991

‘The product of glycation is a glycoprotein, or, in the special case of the

reaction with hemoglobin, glycohemoglobin. When appropriate, a more

precise name such as deoxyfructosylhemoglobin may be used’ Sharon, 1986, Eur. J. Biochem 159, p1-6

1955, Science : « New hemoglobin in normal adult blood »

1957, J Clin Invest : « …Minor basic hemoglobin … »

1958, J Am Chem Soc: « …heterogeneity of normal adult …hemoglobin …»

1949, Archives of biochemistry : « The browning reaction of proteins with glucose »

1954, Nature : « A browning reaction between thiamine and glucose »

1956, Biochem J : « Non-enzymatic browning: the reaction between D-glucose and

glycine…. »

Spectroscopic examination

Electrophoretic separation

J Clin Invest 1957;36:1615-25

Carboxyméthyl-lysine NH CH2 COOH

Premier AGE identifié in vivo et dans les aliments

Encore l’un des AGEs les plus étudiés

Poly-Lysine Glucose + =

Identification of Nε-carboxymethyllysine as a degradation

product of fructoselysine in glycated protein (Ahmed, Thorpe &

Baynes, J Biol Chem)

1986

Carboxymethyllysine, a new compound of heat damage in

milk products (Buser & Erbersdobler, Milchwiss) 1986

Découverte de la CML

Identification of Carboxymethyllysine: A new Maillard

reaction product, in rat urine (Liardon et al., JAFC) 1987

Hydrolyse

Acide

Analyse d’acides aminés

par HPLC et GCMS

Conditions physiologiques

ELISA

NH2

(CH2)4

COOH

NH

HOOC

HPLC-

Fluo GC-MS GC LC-MS/MS

Review : Ames J.M. Ann. N.Y. Acad. Sci. (2008) 1126, 20

Method

of choice

Méthodes analytiques pour la

quantification de la CML dans les

aliments et les échantillons biologiques

Niquet-Léridon & Tessier, 2011,

Food Chemistry, 126, 655-663

Imm

un

oh

isto

ch

em

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ete

cti

on

of

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n

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(AG

E;A

-C)

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E;D

-F)

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lom

eru

lar

les

ion

s.

L’anticorps monocolonal anti-AGE (6D12) a pour structure épitopique la

CML et la CEL liées aux protéines.

Il existe aussi des anticorps monoclonaux spécifiques à différents AGES.

Miyata et al.,

Kidney International (1999) 56, S54-6

Techniques immuno-chimiques pour la

quantification de la CML dans les

échantillons biologiques

ELISA Immuno-histo-chimie Technical note. The serum concentration of the

advanced glycation end-product N epsilon-

(carboxymethyl)lysine is increased in uremia.…An

antibody used in a previous study…recognizes CML as

its major epitope. …..significant correlation between the

concentration of AGEs in serum measured by ELISA and

a GC/MS assay for CML in serum proteins. …ELISA

assays for CML should be useful for the clinical

measurement of AGEs in serum proteins.

(Kidney Int. 1997 52:1064-7)

Standardizing the immunological measurement of

advanced glycation endproducts using normal

human serum. ….. This suggests that in vitro AGE-

modified proteins might not be appropriate standards

for AGEs that occur naturally in vivo….. (J Immunol

Methods. 1997 207:79-88)

Goldberg et al.,J Am Diet Assoc.(2004)104,1287

(2)

? ELISA

Techniques immuno-

chimiques pour la

quantification de la CML

dans les ALIMENTS

0

5

10

15

20

25

CM

L (

µg

/g o

r m

L o

f fo

od

)

0

50

100

150

200

250

300

CM

L (

kU

/g o

r m

L o

f fo

od

)

ELISA

LC-MS/MS

Teneur en CML dans une sélection d’aliments

Fats Proteins Carbs

Overestimation

Underestimation

Goldberg et al J Am Diet

Assoc. 2004;104:1287-1291

Uribarri et al J Am Diet

Assoc. 2010; 110: 911-916

Jacolot, Léridon & Tessier,

Unpublished data

Données confidentielles non publiées

Pentosidine N N

H

N

NH+

Premier AGE « crosslink » identifié in vivo

Lysine Sucres

réducteurs + =

Structure elucidation of a senescence cross-link from

human extracellular matrix (Sell & Monnier, J Biol Chem)

1989

Découverte de la Pentosidine

Hydrolyse Acide Analyse par

HPLC-Fluorescence

Conditions physiologiques

Arginine +

N NH

N

NH+

(acid stable fluorescent AGE)

Pentosidine

NH2

NH2

NH

NH

N NH

N

NH+

N

NCH3

CH3

OHNH

Lysine Arginine

Pentosidine

Vesperlysine A

Argpyrimidine

Autres AGEs fluorescents

Cristallins

Non-diabétiques

Diabétiques

Tessier et al (1999) J. Biol. Chem., 274(30), 20796-20804

fluorescence@varianinc.com

Librairie de spectres Raman

(Alan Stitt, 2008, Belfast, UK)

AFR : the noninvasive autofluorescence reader

(AJ Smit, 2005, the Netherlands)

Fluorescence

de la peau

[AGEs] Pentosidine

CML

Complications

du diabète

Risques

cardiovasculaires

Corrélé Corrélé

Udo Mulder, 2007

Sujets sains et jeunes

Udo Mulder, 2007

Méthodes indirectes non invasives

CH2

NH2

O

Acrylamide

Source : Science & Vie (Février 2003)

CH2

NH2

O

Formation

de

l’acrylamide (major pathway)

(Minor pathways :

from acrolein, acrylic

acid wheat gluten…)

Acrylamide

Asp G

H2O

Asp G

G

Asparagine libre

CH2

NH2

O

Définition donnée par l’ANSES (2011) :

Composé Néoformé

Substance indésirable pouvant apparaitre

lors du traitement thermique industriel ou

domestique (cuisson…)

21 substances néoformées : l’acrylamide, formé lors du procédé de

transformation alimentaire, et 20 congénères d’hydrocarbures aromatiques

polycycliques (HAP), d’origine environnementale (combustion) ou formés lors du

procédé de transformation alimentaire (séchage, fumaison, cuisson)

L’ acrylamide

Génotoxique (métabolisation en

glycidamide)

Cancérogène Classé 2A par l’IARC (1994) « probablement cancérogène pour l’homme »

Données épidémiologiques insuffisantes

ou contradictoires

Neurotoxique à fortes doses

We found no consistent or credible evidence

that dietary acrylamide increases the risk of

any type of cancer in humans, either overall or

among nonsmokers. In particular, the collective

evidence suggests that a high level of dietary

acrylamide intake is not a risk factor for breast,

endometrial, or ovarian cancers, which have

generated particular interest because of a

conjectured hormonal mechanism of acrylamide.

Moreover, the absence of a positive association

between smoking and ovarian and endometrial

cancers suggests that any association of these

cancers with the much lower, more sporadic

dietary acrylamide intake is unlikely.

Acrylamide & Cancer

European Journal of

Cancer Prevention

2012, 21:375–386

The Joint FAO/WHO Expert Committee on

Food Additives noticed that the

epidemiological studies did not provide

any consistent evidence that dietary

exposure to acrylamide is associated with

cancer in humans

JECFA, 2011. WHO Technical Report- Series 959

1 portion/week (200g)

France (ICARE clinical study)

Students (18-24y)

(1) Tessier et al. Amino Acids 2012

(2) Sirot et al. Food and Chemical Toxicology 2012

(3) Loaëc et al. Food Additives & Contaminants 2014

Estimation de la contribution

relative des aliments

à l’exposition à l’acrylamide

Pain, céréales petit dej., viennoiseries 6%

Pain, céréales petit dej., viennoiseries 5%

Biscuits, pâtisseries, gâteaux 10%

Biscuits, pâtisseries, gâteaux 19%

Pommes de terre sautées, frites 45%

Pommes de terre sautées, frites 61%

Café, Chicorée 30%

Chips 4%

Chips 2%

Autres7%

Autres11%

France

Adult population (18-79y)

France

Children population (3-17y)

(2)

(1)

Sans les boissons

(3)

Acrylamide,

hydroxymethylfurfural and

Nε-carboxymethyl-lysine in

coffee substitutes and

instant coffees

Produits

préparés au

domicile ou

dans les

restauration

Produits agro-

alimentaires

“Advices on good practices for household consumers

or catering and restaurant processors could have an

impact on dietary exposure to acrylamide” (1)

(1) Capuano & Fogliano, food science and technology 44, 2011, 793-810

50% 50%

Contribution relative à

l’exposition à l’acrylamide Cuisson domestique et cuisson industrielle

600

1000

150

400

500

450

900

80

250

100

% des produits

qui dépassent la

recommandation

en 2010

15

18

3

3

12

11

20

15

7

6

Frites prêtes

à la conso.

Chips

CH2

NH2

O

KFC agrees to Prop. 65

potato warnings in California

May 2007

CH2

NH2

O

Conclusion

Mieux évaluer l’exposition alimentaire aux AGEs et autres produits de Maillard

à l’aide de dosages robustes et validés (ex : exposition domestique)

Discuter la nomenclature et la classification des AGEs et autres produits de

Maillard

Poursuivre la découverte des composés néoformés aussi bien dans les aliments

que dans les milieux biologiques

Mettre en place une véritable évaluation des performances des méthodes

analytiques actuellement utilisées pour quantifier les produits Maillard (validation et

comparaison de méthodes). Développer de nouveaux outils analytiques.

Overall, foods in the fat and meat (protein) groups contain

thirty-fold and twelve-fold higher advanced glycation end

product (AGE) content, respectively, than foods in the

carbohydrate group.

Choose Glycotoxin-Free Foods

Evaluer le risque associé à une exposition chronique à faible dose des AGEs et

autres produits de Maillard

EGEAL Unit Remerciements

Niquet-Léridon C

Jacolot P

Loaëc G