Biochimlca et Blophysica Acta, 320 (1973) 427-441 Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

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GLYCOPROTEINES SULFATES DES MEMBRANES DE L'OEUF DE POULE ET DE L'OVIDUCTE

ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE GLYCOPEPTIDES SULFATES

JACQUES PICARD, ANNICK PAUL-GARDAIS et MICH~LE VEDEL

Laboratoire de Biochimie, Facultd de Mddecine Saint Antoine, 27 Rue Chaligny, 75571 Paris Cedex 12 (France)

(Rrqu le 19 mars, 1973)

SU M MARY

Sulfated #lycoproteins from egg shell membranes and hen oviduct. Isolation and char- acterization of sulfated glycopeptides

Sulfated glycopeptides were isolated from pronasic and tryptic digests of egg shell membranes and hen oviduct. They were precipitated by cationic detergents and separated by preparative electrophoresis, after removal of small quantities of glucu- ronoglycosaminoglycans detected only in the oviduct (isthmus and magnum). The principal isolated sulfated glycopeptides were divided according to increasing elec- trophoretic mobilities into two groups A and B. The homogeneity of the purified glycopeptides was confirmed by gel filtration and polyacrylamide gel electrophoresis.

Glycopeptides from pool preparation of tissue are analysed and carbohydrate and amino acids average values are estimated. Hexosamines (mainly N-acctylgluco- samine), hexoses (galactose, glucose, mannose) and fucose were found in Glycopep- tides A. The molar ratio of hexose/hexosamine was 0.4. N-Acetylneuraminic acid and sulfate were also present in Glycopeptides A. The molar ratio of sulfate/hexo- samine ranged from 0.1 to 0.25. The Glycopeptides A composition indicated the pres- ence of chains with many glycosyl groups and a few of amino acids residues. The carbohydrate components of Glycopeptides B from egg shell membranes and magnum were found to be hexosamines (N-acetyigalactosamine and N-acetylglucosamine in equimolar proportions), hexoses (galactose mainly and glucose), N-acetylneuraminic acid, and fucose. The molar ratio of hexose/hexosamine was I. Sulfate was also pres- ent and the molar ratio of N-acetylneuraminic acid and sulfate to hexosamine was ranged from 0.8 to 1. The main amino acid residues in these glycopeptides were serine and threonine with destruction of these hydroxyamino acids during alkali treatment. Glycopeptides B probably consist of short carbohydrate chains, linked to the poly- peptide through O-glycosidic bonds involving N-acetylgalactosamine and serine and threonine. Approximately 40 % of the amino acid residues were linked to carbohy- drate chains.

Abr~viations: Gal, galactose; Glc, glucose; Man, mannose; GIcN, glucosamine; GaiN: galactosamine.

428 J. PICARD et al.

Glycopeptides B from egg shell membranes magnum and egg white were very similar in their carbohydrate and amino acid composition and in their properties.

Glyeopeptides A from egg shell membranes, isthmus and magnum showed similarities and divergences especially in the amino acid composition. These results suggest that magnum and isthmus in oviduct are both concerned with the synthesis of egg shell membrane glycoproteins.

INTRODUCTION

Des 6tudes histochimiques ont montr6 la presence de complexes mucopoly- saccharides-prot6ines dans les membranes de roeuf de poule ~'2. Ces membranes, apparaissent apr6s le passage de l'oeuf, clans une portion r6tr6cie de l'oviducte, l'isthme, qui fait suite au magnum 3. EII¢.~ se calcifient au cours du s6jour de l'oeuf clans l'ut6rus et les mucopolysaccharides semblent intervenir dans ces processus t'2.

La nature biochimique du complexe glucidique de ces membranes reste ce- pendant mal eonnue. Les tests de la coloration m6tachromatique et histoenzymatique semblent indiquer la pr6sence de glycosaminoglycanes sulfates ~. Toutefois, de r&:entes recherches indiqueraient seulement la pr6sence d'aeide hyaluronique darts les mem- branes,/t une concentration tr~s faible, inf6rieurs/t 0.1 ~o du poids see 4 et la presence de chondroltine sulfate ou d'autres glycuronoglycosaminoglycanes n'est pas 6tablie 5. La pr6sence d'hexosamine dans les membranes est doric li6e/t d'autres constituants 6. En outre, bien que divers nucl6otides-sucres et nucl~otides-sucres sulfates aient ~t6 identifi6s dans le magnum inf6rieur et risthme de l'oviducte, l'UDPglycuronate n'apparait dans ces tissus qu'en quantit6s tr6s faibles 7-9.

Enfin l'origine exacte des glycoprot~ines des membranes de l'oeuf, leur parent6 avec les glycoprot~ines des segments de roviducte qui poss~dent des cellules muei- pares n'ont pas 6t6 envisag6es. C'est pourquoi nous avons, dans le pr6sent travail, charch6/t identifier les glycopeptides polyanioniques isol6s/t partir des glycoprot6ines des membranes de l'oeuf et de l'oviduete et tent6 de pr6ciser le r61e des divers segments de cet organe dans r6dification des complexes glucidiques membranaires.

MATERIEL ET METHODES

Prdlevement des tissus Les deux segments de roviducte: magnum et isthme sont pr~lev6s sur des

poules pondeuses (Rhode Island), provenant d'un m~me 61evage, dont le cycle de ponte a 6t6 pr~alablement contr616. Ces poules sont syst*matiquement sacrifi6es 1 h apr6s l'ovulation. Le magnum (poids frais moyen 18-20 g) et l'isthrne (poids frais moyen 4--5 g) sont pr~lev~s, d6coup6s en menus fragments, soumis/~ une deshydratation par l'ae6tone/t froid. Les membranes coquilh~res (poids frais moyen 0.4--0.5 g) pr61ev~es sur des oeufs pondus, sont 6galement r6duites ~ l'6tat de poudre ac~tonique. Le blanc d'oeuf est utilis6 apr6s dilution clans le tampon Tris.

Prdparation des glycopeptides Les tissus ainsi trait6s sont soumis/t la prot6olyse d'abord par la pronase,

1 mg pour 100 mg de tissu frais, en milieu Tris 0.1 M-CaCI 2 0.004 M (pH 8.5) (2 fois 24 h/t 56 °C); ensuite par la trypsine,/t raison de 1 mg pour 100 mg de tissu

GLYCOPROTEINES SULFATES DEB MEMBRANES 429

frais /t pH 7.8, 36 h, ~t 37 °C. Des essais de prot~olyse ont dgalement ~t~ effectuds avec pronase scule et papaine.

Apr~s inactivation des enzymes par la chaleur, le milieu de protdolyse est centrifuge, dialys~ contre de l'eau courante et de l'eau distillde. Les glycopeptides sont pr~ipitds darts la fraction p r~demment dialys~¢ par le chlorure de cetylpyri- dinium ~t la concentration finale de 1% en milieu NaCI 0.03 M. Apr~s une prdcipita- tion de 18 h ~t 30 °C, les glycopeptides complexes par le chlorure de cetylpyridinium, sont isol~s par centrifugation, solubilis~s dans le NaCI 1.25 M en milieu chlorure de cetylpyridinium 0.1% et purifids par deux prdcipitations alterndes par l'~thanol (2.5 vol., 18 h ~t 4 °C) et par le chlorure de cetylpyridinium. Les glycopeptides pr~cipitds par l'~thanol, en presence d'ac~tate de sodium, sont conservds au dessicateur ~t + 4 °C. La fraction saline surnageante, ne prdcipitant pas au chlorure de cetylpyridinium est soumise ~t des analyses de contr61e apr~s ~limination du ddtergent par l'alcool iso~ amylique 1 vol. pour 1 vol. 1°.

Pour ces prdparations, les enzymes utilisdes dtaient la pronase grade 2B (Cal- biochem) (45 000 unitds/g); la trypsine 2 lois cristallisde (Sigma) (10000 unitds ester dthylique de benzoylarginine/mg) et la papaIne 2 fois cristallisde (Sigma).

Sdparation des glycopeptides Les glycopeptides ainsi obtenus sont s6pards ~t des fins analytiques et pr6para-

tives par 61ectrophor~se sur acdtate de cellulose (Cellogel Chemetron) 1 i. Dans un but analytique, la sdparation 61ectrophor6tique est rd~disde dans diff6rents syst6mes tam- pons: acdtate de zinc 0.15 M (pH 6.0), 150 V, dur6e 1 h 30 rain; formate de pyridine 0.1 M ~t pH variable 2.0, 2.6, 3.0, 150 V, durd¢ 1 h; phosphate 0.05 M (pH 7.2), 150 V, durde 1 h. Apr6s migration 61ectrophor~tique les bandes sont colordes au Bleu d'Alcian ~t 0.5 % dans le m6lange m6thanol-acide acdtique--cau (50 : 10 : 40, v/v/v) ou par la rdaction au PAS (l'acide periodique-base de Schiff).

Dans un but pr~paratif, les glycopeptides sont fractionn6s par ~lectrophor~se sur P6vikon en presence de marqueurs colords. Ces derniers sont prdpar~s selon Dudman et Bishop 12. A cette fin, 10-20 mg de glycopeptides isol~s des membranes coquill~res, du magnum et de l'isthme, sont color,s par le Rouge Procion (ICI), soumis/t une gel filtration sur Sephadex G-25 pour 61iminer l'excZ's de colorant et les sels. Les glycopeptides ainsi colords sont concentr6s; il est v6rifid que leur mobilit~ ~lectrophor6tique apes coloration reste inchangde. L'61ectrophor~se preparative est effectu6e en tampon formate de pyridine 0.05 M ~t ~.J-I, 2.6 et 3.0 sous 1500 V, 80 mA, durde 3 h (Appareil Refrig~r6). Les d6p6ts sont compris entre 50 et 80 mg de glyco- peptides totaux. Les marqueurs color6s sont d~pos~s lat~ralement et permettent de suivre la migration. Aprb.s migration, les glycopeptides sdpards sont 61u6s par l'eau distiilde et concentrds. Le rendement atteint 80 %.

La composition des diff~rentes preparations de glycopeptides et l'homog6n~it6 des fractions obtenues apr~s sdparation sont contr61des par 61ectrophor~se sur acd- tate de cellulose, usuellement en tampon formate de pyridine. Des preparations de glycopeptides, isol~s par ~lectrophor~se preparative sur P6vikon, sont soumises, apr~s une prdcoloration,/t des gels filtrations sur Sdphadex G-25, G-50, G-75, G-100, G-200 en tampon phosphate 0.002 M (pH 7.0).

Ces preparations de glycopeptides isol~s sont ~galement analysdes par 61ectro- phor~se en gel de polyacrylamide en tampon Tris 0.05 M (pH 8.6), 5 mA par gel,

430 J. PICARDet al.

duroc 1 h 30 rain. Les gels de concentration variable (Syst6me 398) sont pr6par6s scion la technique de Rodbard et Chrambach 13 et color6s au Bleu d'Alcian. La masse mol6culaire est estim~e en accord avec Mathews et Decker ~ 4.

Action des mucopolysaccharidases Les glycopeptides ou glycosaminoglycanes-peptides obtenus par s6paration

~lectrophor6tique sont soumis ~ l'action des chondroitinases (Miles-Seravac) ABC et AC en milieu Tris en pr~ence de s6rum albumine bovine cristallis~/t pH 8.0 (ref. 15). L'activit6 de ces chondroltinases (5 unit~s par ampoule)est pr6alablement con- tr61~e en presence de glycuronoglycosaminoglycanes (Standards internationaux obli- geamment fournis par A..Dorfman, M. Mathews et J. Cifonelli, Chicago). Le milieu r~ctionnel contient dans 50/zl; I0 gl de tampon, 30/tg de glycopeptide purifi6, 0.1 unit6 de chondroitinase ABC ou de chondroltinase AC. Une preparation ne contenant pas d'enzyme est incub6e dans les m~mes conditions pendant 30 rain A 37 °C. Apr6s inactivation par la chaleur 1 min~ 100 °C et centrifugation, 10/zl du surnageant sont d6pos6s sur bande d'ac~tate de cellulose pour analyse par 61ectrophor6se. La proportion de substrat hydrolys~ est d6termin~e par comparaison des bandes comme cela a 6t6 ant~rieurement publi6 t6.

Analyse des constituants glucidiques et peptidiques Constituants glucidiques. Les concentrations en oses, hexosamines, acides uro-

niques, acides sialiques et sulfates sont d~termin~s pour chacun des glycopeptides isol~s.

Les hexoses totaux sont d~termin~s sur les glycopeptides directement, soit par la m6thode colorim~trique au phenol sulfurique 17, soit par la m~thode h l'aniline 18. Ces m~thodes permettent de d~terminer des quantit~s d'hexoses de l'ordre de 10/~ 50/zg pour la premiere, de 5 A 20/zg pour la seconde. Les dosages sont effectu6s, en utilisant parall~lement des standards internes dont la composition quantitative et qua- litative est identique ~ celle du glycopeptide soumis au dosage. Cette composition a ~t~ pr&dablement d6termin~e par l'analyse quantitative en chromatographic gaz liquide.

Les acides uroniques sont ~galement doses par la m~thode colorim~trique au carbazol de Dische 2°.

Pour les constituants lib~r~s par hydrolyse, les concentrations en acide et le temps d'hydrolyse sont syst~matiquement d~termin6s par une ~tude cin~tique pour chacun d'entre eux. Les hydrolyses sont effectu6es en triple, chaque hydrolyse est soumise ~ des dosages en double.

Le fucose est dos~ apr~s hydrolyse HCI 1 M, 7 min~ 100 °C soit par colori- m~trie scion la m6thode de Dische 19, soit par chromatographic gaz-liquide.

Sur les hydrolysats (HC! 4 M, 4 h h I00 °C), les hexosamines sont dos~es par la m6thode d'Elson-Morgan modifi~e 21'22.

Les acetylhexosamines sont dos~es scion la m6thode de Reissig et Leioir 23 apr~s hydrolyse m6nag6~ 2 h, 4 h, 6 h,/t 100 °C en milieu ac~tique (CH3COOH 1 M et 2 M) (ref. 24).

Le dosage des acides sialiques est effectu6 par la m6thode colorim~trique de Warren 25, apr~s hydrolyse acide (HCI 0.01 M, 80 °C, 1 h et H2SO4 0.005 M, 80 °C, 2 h) et apr6s hydrolyse enzymatique par la neuraminidase de Vibrio Cholerae (Boeh- ringwerke) 26.

GLYCOPROTEINES SULFATES DES MEMBRANES 431

Les sulfates sont d6termin6s apr6s hydrolyse HCI 4 M, 3 h ~t 100 °C, par dosage n~ph~lom6trique du BaSO4 en milieu HCI 1 M. La m6thode de Dodgson et al. 27 est modifi~ comme suit. Le r6actif au BaCI2 est pr~par6 par addition de 15 ml de Tween 80 ~t 80 ml de BaCI 2/t 10 ~ dans l'eau bidistill~e. A un ~hantil lon conte- nant de 10/t 50 tag SO, 2- on ajoute 0.3 ml de r~actif Tween-BaCl 2 dans un volume final de 3 mi. Apr~s 45 min d'attente ~t la temperature du laboratoire, la lecture est effectu~e ~t 500 nm en se r6f6rant ~ une courbe standard.

S~paration et identification des constituants glucidiques. Apr~ passage des hydro- lysats HCI 2 M, 2 h des glycopeptides sur colonne de Dowex 50 × 8, 200-400 mesh, forme H ÷, les hexoses sont identifi6s par chromatographie en couche mince sur plaque Eastman Kodak 51 IV en solvant propanol-ac6tate d'6thyle-eau (5 : 1 : 1, v/v/v) avec r6v~lation au chlorure de triph6nylt6trazolium 28. Les proportions relatives des diff6rents hexoses pr6sents sont ~tablies par chromatographie gaz-liquide sur appareil Girdell apr~s trim6thylsililation 29. La colonne utilis~e est une colonne de Carbowax 20 M, 80--100 mesh, de longueur 3 m. La temperature est programm6e de 120 b. 210 °C.

Apr6s passage de rhydrolysat correspondant sur colonne de Dowex 50 × 8, les hexosamines ~lu~s par HCI 0.3 M (ref. 30) sont identifi~es par chromato- graphie en couche mince sur plaque, Eastman Kodak 51 IV dans le syst6me solvant 6thanol-NH,OH 25 ~--eau (85:0.5 : 14.5, v/v/v) avec r6v61ation au chlorure de triph~nyl t6trazolium 28. Elles sont s~par~s et dos~es A l'analyseur d'amino acides Beckman 31.

Les acides uroniques provenant de l'hydrolysat HCI 2 M, 2 h, des glyco- peptides sont s~par6s par passage sur colonne de Dowex 50×8, forme H +, et sont identifi6s par chromatographie sur plaque de gel de silice en solvant acetate d'~thyle-pyridine--acide ac~tique--eau (5 : 5 : 1 : 3, par vol.) 32.

Les acides sialiques sont s6parbs par chromatographie descendante sur Whatman No. I, d'hydrolysats H2SO4 0.005 M e n solvant n-butanol-n-propanol-HCl 0.1 M (1 : 2 : 1, v/v/v) 33, avec r~v~lation au r~actif d'Erlich.

Constituants peptidiques. Les prot6ines totales sont dos~es selon la m~thode de Lowry, la composition en amino acides des glycopeptides est ~tablie sur des hydro- lysats effectu~s en milieu HCI 6 M. Les temps d'hydrolyse b. 110 °C en ampoule scell~e sous vide sont de 24 h et 48 h. Le contenu peptidique moyen est 6valu~ par rapport b. l'hexosamine totale.

L'hydrolyse alcaline de ces m~mes glycopeptides est r6alis6e en presence de NaOH 0.5 M, 24 h, ~t 20 °C (ref. 34); elle est suivie d'hydrolyse acide HC! 6 M, 24 h, b. 110 °C sous vide.

Dans les deux cas, les amino acides ont ~t~ doses sur un analyseur Beckman Unichrom selon la technique de Devenyi 35 modifi6e par Bourrillon (communication personnelle).

RESULTATS

Isolement des glycopeptides Les glycopeptides des membranes coquill6res, des segments de roviducte de

poule, magnum et isthme sont obtenus apr6s prot6olyse par pr6:ipitation par le chlorure de cetylpyridinium. Ce d6tergent cationique les pr6cipite en totalit~ comme le

432 J. PICARD et aL

orlgln

Magnum

I I

C ............. J D I

Isthmus Membranes

A A

B B . . . . . . . . . . . .

C ............. C

D

Fig. 1. Schema de separation des glycopeptides sulfates des membranes de l'oeuf et de roviducte. L'~lectrophor6se est r~alis~e en tampon formate de pyridine 0.1 M (.oH 3.0) (volt Materiel et M6thodes).

prouve ranalyse du surnageant. L'hexosamine de ces glycopeptides pr~ipit6s re- pr~sente 0.08 % du poids frais de tissu dans le magnum, 0.03 ~o dans l'isthrne et les membranes coquill~res.

L'exarnen des pr6parations/t l'61ectrophor6se en tampon formate de pyridine 0.1 M (pH 3.0) montre quatre bandes m6tachrornatiques dans le magnum et l'isthme, trois bandes pour les membranes coquill~res. Les glycopeptides sont d6sign6s selon leur ordre de rnobilit6 croissante A l'~lectrophor~se en tampon formate de pyridine cornrne des glycopeptides de Niveau A, B, C, et D (Fig. 1). Les membranes coquill6res ne renferrnent pas de glycopeptide de Niveau D. Le blanc d'oeuf, qui a 6galement 6t6 6tudi6, ne donne qu'un seul glycopeptide de Niveau B. Sur la base de rhexosamine, l'irnportance relative de ces glycopeptides varie avec le tissu d'origine. Dans les membranes coquill~res et risthme, le glycopeptide principal est le A, il repr6sente respectivement 78 ~o et 53 ~o des glycopeptides totaux. Dans le magnum le glyco- peptide principal est le B, il repr6sente 70 ~o des glycopeptides totaux (Tableau I). Ces glycopeptides sont obtenus dans les m~rnes proportions apr~s prot6olyse par la pronase ou par la papagne.

TABLEAU I

REPARTITION DES DIFFERENTS GLYCOPEPTIDES SULFATES DANS LES MEMBRA- NES DE L'OEUF ET L'OVIDUCTE Les r6sultats sont exprim~ en pourcentage des glycopeptides sulfates totaux de chaque tissu, sur la base de l'hexosamine.

Type Magnum Isthme Membranes coquill~res

A 20 53 78 B 68 24 18 C 6.5 16 4 D 5.5 7

GLYCOPKOTEINES SULFATES DES MEMBRANES 433

TABLEAU II

MOBILITES ELECTROPHORETIQUES DES GLYCOPEPTIDES SULFATES

La mobilit6 est indiqu6e par rapport au chondroltine sulfate A en tampon formate de pyridine 0.1 M (pH 3.0). Le d6placement du chondrottine sulfate A dans les conditions exp6rimentales est de 59 mm (voir M6thodvs).

Type de glycopeptides A B C D

Membranes coquill6res 0.71 0.83 0.93 Magnum 0.76 0.83 0.93 1 lsthme 0.71 0.83 0.98 1

La comparaison en 61¢ctrophor6se des d6placements des glycopeptides avcc ceux des glycosaminoglycanes standards de r6f6rence (chondroltine 4-sulfate) est donn6¢ dans le Tableau II. Apr6s 61ectrophor6se en tampon formate de pyridine et 61ution des bandes, les glycopeptides ainsi isol6s restent homog6nes lorsqu'ils sont sou- mis /L de nouveiles 61ectrophor6ses dans les diff6rents syst6mes tampons d6crits. Iis sont encore homog6nes apr6s gel filtration sur S6phadex. Les glycopeptides de Type A, exclus d 'un S6phadex G-25, sont frein6s au cours de la gel filtration sur S6phadex G-50. Les glycopeptides de Type B sont ralentis par gel filtration sur S6phadex G-200.

Par 61ectrophor6se en gel de polyacrylamide, les Glycopeptides A donnent une seule bande, les Glycopeptides B 6galement. Les masses mol6culaires est im~s par cette m6thode, sont comprises entre 90 000 et 110 000 pour les Glycopeptides A et comprises entre 70 000 et 80 000 pour les Glycopeptides B.

I.¢s glycopeptides isol6s sont soumis s6par6ment a l'action des chondroIti- nases ABC et AC. Ils ne sont pas attaqu6s,/t rexception des glycopeptides de Niveau D qui sont hydrolys6s par ces deux chondroltinases. Ces Glycopeptides D poss6dent les m~mes mobilit6s 61ectrophor6tiques et les m~mes caract6res d'hydrolyse que les chondroItines 4-sulfate et 6-sulfate et sont pr6sents dans le magnum et risthme en proportions inf6rieures/L I0 % des glycopeptides totaux.

Composition glucidique Le Tableau III donne les concentrations en hexosamines, hexoses, acides

sialiques, sulfates pour les diff6rents glycopeptides isol6s. Les Glycopeptides A des membranes coquill6res et de risthme pr6sentent un rapport hexoses/hexosamines voisin de 0.5; ils contiennent peu d'acides sialiques, leur degr6 de sulfatation est faible. Les Glycopeptides B pr6sentent un rapport hexoses/hexosamines voisin de 1, ils sont fiches en acides sialiques, leur degr6 de sulfatation variable est compris entre 0.6 et 1. Les Glycopeptides C pr~sentent un rapport hexoses/hexosamines compris entre 0.6 et I, une concentration en acides sialiques variable, un degr6 de sulfatation 6galement variable, sup6rieur/t celui des Glycopeptides A et B.

L'hexosamine de ces glycopcptides est pr6sente sous la forme N acetyl6¢, en majeure partie ou en totalit6. L'hydrolyse m6nag6¢ en milieu acide faible lib6re 60 % des hexosamines totales enti6rement dos6cs ~ l'6tat de N-acetylhexosamines.

Los glycopeptides sont d6pourvus d'acides uroniques comme en t6moignent l'absence de coloration caract6ristique au carbazol et l'absence de taches d'acides uroniques ou des lactones dans les identifications chromatographiques.

434 J. PICARD et al.

TABLEAU III

COMPOSITION EN OSES, HEXOSAMINE, ACIDES SIALIQUES, SULFATE DES DIFFE- RENTS GLYCOPEPTIDES

Les r~sultats sont exprim~s en moles pour 1 mole d'hexosamine.

Tissu Type du Hexosamine Hexose Fucose Acides Sulfate glycopeptide sialiques

Membranes A I 0.4 0.20 0.046 0.25 coquill6res B 1 1 0.02 0.83 0.60

C 1 0.92 (Traces) 0.28 0.8

Magnum A 1 0.82 0.20 0.25 0.9 B 1 1.09 0.02 0.75 0.98 C 1 0.70 (Traces) 0.14 i.16

Isthme A 1 0.46 0.24 0.01 0.14 B 1 0.90 0.02 0.59 0.70 C 1 0.6 (Non de- 0.034 1.3

termin6)

Blanc d'oeuf B 1 1.03 0.02 0.70 0.61

Ces glycopeptides renferment en outre de faibles quantit6s de fucose. Le rap- port molaire fucose/hexosamines darts les Glycopeptides A est de 0.2; il est de 0.02 clans les Glycopeptides B. Les Glycopeptides C (membranes, magnum) n'en renfer- ment que des traces (Tableau III).

L'acide sialique pr6sent darts ces deux types de glycopeptides est exclusive- merit de l'acide N-acetylneuraminique. Celui-ci a 6t6 identifi6 par chromatographie sur papier des hydrolysats sulfuriques; aucune tache d'acide N-glycolylneuramini- que n'apparait. L'hydrolyse enzymatique et l'hydrolyse darts HzSO 4 dilu6 6ffectu6es parall61ement lib~rent autant d'acide sialique. (Celui-ci est notablement d6truit par hydrolyse chlorhydrique).

La nature des hexosamines et des hexoses et leurs proportions relatives sont donn6es dans le Tableau IV pour les diff6rents Giycopeptides A et B.

Les Glycopeptides A contiennent de la glucosamine et de la galactosamine, la glucosamine est l'hexosamine pr6dominante. Le rapport GIcN/GalN voisin de 30 est identique pour les Glycopeptides A des membranes coquill6res et de l'isthme, il est 16g6rement diff6rent pour le Glycopeptide A du magnum (GIcN/ GaIN ----24). Les hexoses pr6sents dans ces Glycopeptides A sont le galactose, le glucose et le mannose. Le galactose et le glucose y sont pr6sents darts la proportion d'un glucose pour deux galactoses; la proportion de mannose reste faible (Tableau IV).

Les Glycopeptides B contiennent de la glucosamine et de la galactosamine. Le rapport GlcN/GalN est de 1 pour les glycopeptides des membranes coquill6res, du magnum et du blanc d'oeuf, Pour le Giycopeptide B de l'isthme ce rapport est de 3. L'analyse des hexoses pour ces Glycopeptides B montre une pr6dominance du galactose, le glucose ne repr6sente que 10 ~o des hexoses totaux, le mannose est pr6- sent/t l'6tat de traces.

Outre ces particularit6s de leur composition glucidique, les glycopeptides de Type A et B se distinguent par la valeur de leur contenu peptidique; celui-ci, 6valu6

G L Y C O P R O T E I N E S S U L F A T E S DES M E M B R A N E S 435

T A B L E A U IV

D I S T R I B U T I O N DES H E X O S E S E T DES H E X O S A M I N E S D A N S LES G L Y C O P E P T I D E S , S U L F A T E S

Les rGsultats son t exprim~s en pourcen tage de la concent ra t ion en hexoses et en hexosamines des glycopeptides.

Tissu Type des Hexosamines Hexoses

glycopeptides GIcN GaIN Gal Glc Man

M e m b r a n e s A 97 3 60 35 5 coquillGres B 50 50 90 10 Traces

M a g n u m A 96 4 60 35 5 B 50 50 95 3 2

I s t hme A 97 3 61 37 2 B 75 25 95 3 2

Blanc d ' o e u f B 50 50 100 Traces Traces

sur la base de l'hexosamine, est de 1 pour les glycopeptides de Type B, et de 0.04 pour les glycopeptides de Type A.

Composition en amino acides La composition en amino acides des glycopeptides de Type A et de Type B

des membranes de l'oeuf et de l'oviducte figure sur le Tableau V. Cette composition

T A B L E A U V

C O M P O S I T I O N E N A M I N O A C I D E S DES G L Y C O P E P T I D E S S U L F A T E S A ET B DES M E M B R A N E S D E L ' O E U F E T D E L ' O V I D U C T E

Les r ~ u l t a t s son t e x p r i m ~ en #mo l e s d ' ami no acides pour 100 m g de prot~ines.

Membrane Maonum Isthme Blanc d' oeuf

A B A B A B

Asp 98 24 66 18 90 36 14 T h r 61 219 6 219 71 187 215 Ser 105 190 29 208 100 181 210 Giu 138 59 160 50 131 66 71 Pro 73 141 91 127 54 104 138 Gly 249 31 634 25 403 212 19 Ala 85 68 75 63 58 63 72 Cys . . . . . . . V ~ 54 59 27 45 30 39 49 Met 1 14 - - 4 4 - - 18 Ile 31 35 37 29 18 29 34 Leu 59 82 35 72 23 61 81 Tyr - - 8 --- - - 3 4 5 Phe 35 24 3 22 18 20 22 Lys 50 40 22 42 58 32 38 His 19 13 22 12 23 14 13 Arg 35 20 9 18 20 18 18

436 J. PICARD ¢t al.

TABLEAU VI

,PRINCIPAUX AMINO ACIDES DES GLYCOPEPTIDES SULFATES A ET B

Les r6sultats sont exprim~s en pourcentage du nombre total de r6sidue d'amino-acides

Type Amino acides Membrane Magnum lsthme Blanc d'oeuf

A

B

Asp 9 6 8 Ser 10 3 9 Glu 13 13 12 Giy 23 52 37

Thr 21 23 18 Ser 19 22 17 Pro 14 13 10 Gly 3 3 20

21 21 14 2

apparait tr6s diff6rente entre les deux groupes de giycopeptides. Les Glycopeptides A des membranes de l'oeuf et de l'isthme renferment une forte proportion de glycocolle (1 acide amin6 sur 3 ou sur 4) de l'acide glutamique (1 acide amin6 sur 8); ils sont pauvres en thr6onine. La s6rine et racide aspartique repr6sentent chacun 10 ~o des r6sidus. La distribution en amino acides des Glycopeptides A des membranes de l'oeuf et de l'isthme pr6sente de nombreuses analogies mais aussi quelques diff6rences, notamment clans les proportions de proline, glycocolle et alanine; ceUe du magnum en diff6re surtout par une proportion de glycocolle tr6s 61ev6e. La composition des giycopeptides de Type B montre une majeure partie de s6rine et de thr6onine qui atteint jusqu'/t 45 % des amino acides pr6sents. Ces glycopeptides sont 6galement riches en proline. La distribution en acides amin6s est presque identique darts les Gly- copeptides B isol6s des membranes de l'oeuf et du magnum. Elle est 6galement tr6s voisine dans le blanc d'oeuf. Dans le Glycopeptide B isol6 de l'isthme, la proportion de giycocolle est plus 61ev6e. Les principales caract6ristiques de cette composition en amino acides sont r6sum6es dans le Tableau VI.

Apr6s hydrolyse alcaline des giycopeptides de Type B, on observe une dis- parition importante de la s6rine et de la thr6onine qui sont d6truites/~ 75 et 69 respectivement dans le Glycopeptide B des membranes (Tableau VII). Au cours de la

61imination la seule hexosamine d6truite de mani6re importante est la galactosamine (67 ~ ) et la quantit6 de galactosamine disparue correspond tr6s sensiblement/L la

TABLEAU "vii

DESTRUCTION DE LA THREONINE ET DE LA SERINE DES GLYCOPEPTIDES B PAR HYDROLYSE ALCALINE

Les r~sultats sont exprim~s en poutcentag¢ de destruction de la thr6onine et de la s~rine des glyco- peptides.

Type Tisau Threonine Serlne

B Membrane 69 75 Magnum 69 78 Blanc d'oeuf 55 67

GLYCOPROTEINES SULFATES DES MEMBRANES 437

somme thr6onine + s~rine d~grad6e. Ces r~sultats sont en faveur d'une liaison s6rine (thrb3nine) O-glycosidique impliquant la galactosamine. Des r6sultats analogues sont observes dans les autres Glycopeptides B du magnum et du blanc d'oeuf, avec une chute tr~s importante de la s6rine et de la thr6onine apr~s hydrolyse alcaline. La galac- tosamine y est ~galement d~truite dans les proportions de 66 ~o pour le Glycopeptide B du magnum et 58 ~ pour le Glycopeptide B du blanc d'oeuf. La composition en s6rine et thr~onine dans les glycopeptides de Type A n'est pas influencbe par l'hydro- lyse alcaline.

Par leur composition en amino acides, leur comportement ~t l'hydrolyse alca- line, par la composition diff~rente en glucides, par les proportions diff~rentes des deux hexosamines et des hexoses, les glycopeptides de Type Ae t de Type B se distingnent nettement. L'ensemble des r6sultats est en faveur de la similitude des Glycopeptides B des membranes de l'oeuf et du magnum, et probablement du Glycopeptide B du blanc d'oeuf. Par contre, les Glycopeptides A des membranes et de l'isthme malgr6 de glandes similitudes pr~sentent aussi des divergences notables.

DISCUSSION

L'isolement des glycopeptides sulfates obtenus par hydrolyse pronasique des glycoprot6ines des membranes de l'oeuf et de l'oviducte est bas6 sur la precipitation par les d6tergents cationiques et la s6paration 61eetrophor6tique. Le caract~re for- tement 61ectro-n6gatif de ces glycopeptides rend possible de tels fractionnements. L'utilisation de papaTne au lieu de pronase ne modifie ni les proportions ni les carac- t6ristiques essentielles de ces sulfoglycopeptides.

La concentration de ces glycopeptides repr6sente, dans les membranes de l'oeuf, une valeur 10 fois plus 61ev6e que ne le serait celle des glycuronoglycosamino- glyeanes dos6s par la m~thode au carbazol 4'5. Toutefois, ni la pr6sence de glycosami- noglyeanes bydrolysables par les ehondroltinases, ni meme celle d'acides uroniques, n'a pu ~tre d6eel6e dans les prot601ysats des membranes de l'oeuf utifis6s dans le pr6sent travail, quelle que soit la m6thode d'identification utilisbe. I1 est plus vrais- emblable d'attribuer l'intensit6 de la m6tachromasie des membranes aux sialoglyco- peptides sulfates isol6s, plut6t qu'~ des glycuronoglycosaminoglycanes.

Les sialoglycoprot6ines sulfates, d'ofa sont extraites les glycopeptides, sont pr6sentes/t la fois dans les membranes de l'oeufet dans les segments de l'oviducte qui les secr6tent. Ces segments renferment aussi du chondroltine sulfate isol6 dans le pr6sent travail, en accord avec d'autres auteurs 3~'37 mais la concentration de celui-ci repr6- sente moins de 10 % des sialoglycopeptides sulfates isol6s.

Caractdres des Glycopeptides A e t B L'~tude des glycopeptides a 6t6 effeetu~e /t partir de pools de membranes

d'oeufs et/t partir de segments d'oviductes provenant de plusieurs potties pondeuses; les fractionnements ont montr6 les m~mes glycopeptides, mais les r~sultats trouv6s pour les constituants analys~s repr6sentent n6cessairement des valeurs moyennes, et des faeteurs de variation individuelle ne sont pas exclus.

La structure des Glyeopeptides A est caract~ris6e par un tr6s faible contenu peptidique, par une forte proportion d'hexosamine (N-acetylglucosamine). La pr6- sence d'hexoses, et du fucose et, en faible quantit6, d'acide acetylneuraminique,

438 J. PICARD et ai.

sugg~re des caractSres communs avec les fucomucines 3s. Les proportions de fucose sont toutefois un peu plus faibles que dans ces derni~res. Ces glycopeptides sont sulfates. La pr&lominance de N-acetylglucosamine dans la composition glucidique est en faveur d'enchatnements de diacetylchitobiose. La singnlarit~e a plus remarquable r~side dans la richesse en glucose. D'autres glycopeptides provenant de divers tissus ou de mucines gastfiques a9-41 pr6sentent aussi une forte concentration en glucose. Les m6thodes d'obtention des Glycopeptides A 6vitent la possibilit6 de contamination par cet hexose.

Ces Glycopeptides A ne subissent pas de modification de leur composition apr~s hydrolyse alcaline. La prSsence d'une liaison fl-aspartylglucosaminylamine est possible aussi bien qu'une liaison s6dne O-glycosidique dans laquelle la s6rine pr6- senterait un C-terminal ou un N-terminal libre. La richesse des Glycopeptides A en glycocolle est 6levee. La pr6sence de prot6ines particuli6res complex~es aux mucopoly- sacchafides a d6j~t 6t6 suspect6e dans les membranes de roeuf. Ces prot6ines, g61ati- neuses, se distingueraient du collag6ne par la tr6s faible proportion d'hydroxyproline 1. Ce sont pr6cisement pour les acides amin6s qui abondent dans ces prot6ines g~lati- neuses, glycocolle, proline, alanine, que les diff6rences de composition entre les Gly- copeptides A sont les plus importantes. Les s6quences fiches en proline, glycocolle, alanine sont r~put6es dans le cas de certaines prot6ines peu sensibles a rhydrolyse pronasique "2.

Les donn6~s prc~Z'dentes semblent indiquer pour les Glycopeptides A la pr6- sence de longues chatnes glucidiques contenant globalement 250 mol6cules d'h6xo- samines, 100 d'hexoses, 60 de sulfates, 50 de fucose, et l0 d'acide sialique pour I0 r~sidus d'amino acides. La masse mol6culaire estim6~ par 61ectrophor6se en gel de polyacrylamide est comprise entre 90 000 et 110 000. Ces valeurs qui different de celles d6termin6es par gel filtration sont en accord avec la composition chimique. L'importance de la copule glucidique, et la valeur faible du contenu peptidique sont sans doute a l'origine des divergences observ6es dans les d6terminations de la masse mol~culaire (M). En outre de telles estimations ne sont exactes que pour une s6rie homologue.

Ces analyses toutefois ne permettent pas d'attirmer si une chatne ou deux chatnes glucidiques diff6rentes seraient li6es au r6sidu peptidique, comme pourrait le sug- g6rer la vari6t6 de composition en hexoses et hexosamines.

La structure des glycopeptides de Type B fait apparaitre une richesse 61ev6e en sulfates et en acide sialique avec des rapports hexoses/hexosamines, sulfates/ hexosamines, acide sialique/hexosamines voisins de 1. La glucosamine et la galacto- samine sont en proportions 6gales. Bien que la composition glucidique soit compatible avec celle des k~ratanes sulfates 24'43'4", la concentration importante en acide sialique, la pr6sence du glucose mais surtout la valeur du contenu peptidique et la distribution en amino acides apparentent plus ces glycopeptides au groupe des sialomucines 45. La composition en glucides et en amino acides montre que les Glycopeptides B isol~s des membranes de roeuf, du magnum et tr~s probablement du blanc d'oeuf sont tr6s similaires si ce n'est identiques.

La s6fine et la thr6onine repr6sentent a elles deux 45 ~ du nombre total des r6sidus d'amino acides presents dans le Glycopeptide B, et la somme de ces deux r6si- dus qui disparaissent par fl 61imination est approximativement 6gale au nombre de r~sidus de gala~tosamine 61imin6e par ce proc~d~. Dans ces conditions, la majeure

GLYCOPROTEINES SULFATES DES MEMBRANES 439

partie de la galactosamine se trouve impliqu~e dans les liaisons s6rine ou thr6onine O-glycosidique. Un acide amin6 sur deux, ou presque, se trouve 1i6/t une mol6cule de N-acetylgalactosamine. Les hexosamines 6tant pr6sentes en majeure pattie, ou en totalit6, sous la forme N-acetyl6e, la r~,~artition des chaines glueidiques montre en moyenne une proportion 6gale de N-acetylglueosamine et de N-acetylgalactosamine. Ces ehaines glueidiques renferment autant d'hexoses que de N-acetylhexosamines. I1 y a deux mol6cules de galaetose, une/t deux mol6cules d'acide sialique et une deux mol6cules de sulfates pour deux mol6cules de N-acetylhexosamine. Ces donn6es semblent indiquer la pr6sence d'une longue ehaine peptidique sur laquelle seraient braneh6es de nombreuses ehaines glucidiques courtes. La longneur moyenne des chaines glucidiques eorrespondrait /t celle d'un t6trasaccharide avec en outre une quantit6 variable d'acide sialique et de sulfate. Plusieurs types de chaines peuvent cependant coexister clans le produit isol6; ces ehaines pourraient diff6rer par la lon- gueur, certaines contiendraient du glucose.

Des 6tudes d'hydrolyse enzymatique sont en cours pour r6soudre ce problbme. La pr6sence de nombreuses chaines glucidiques courtes est suffsamment 6tablie pour expliquer l'inaptitude des enzymes prot6olytiques h d6grader davantage la chalne peptidique.

De telles structures ont 6t6 signal6es dans les mucines des sues digestifs 46. Les sulfosialoglycopeptides B proviendraient done de la d6gradation limit6e de gly- coprot6ines sulfat6es. La chaine glycopeptidique isol6e atteindrait d'apr6s les crit6res de d6placement sur gel de polyacrylamide une masse mol6eulaire de 70 000/t 80 000; Les crit6res d'exclusion en gel fltration assignent/t cette masse mol6culaire une valeur plus 61ev6e.

L'isolement de glycopeptides sulfates similaires et peut-6tre identiques,/t par- tir des membranes de l 'oeuf et de l'oviducte, indique le r61e de cet organe darts l'6dification des membranes. La diff6renciation des membranes de l 'oeuf apparait seulement dans l'isthme, mais au moins une glyeoprot6ine de ces membranes, ren- fermant le Glyeopeptide B, semble 8tre 61abor~e au niveau du magnum. L'identifica- tion du m~me Glycopeptide B darts les prot6ines du blanc d'oeuf, lui-mSme 6labor6 darts le magnum, est compatible avee cette vue. II est possible que l'isthme eontribue /t la formation d'autres glycoprot6ines, celle renfermant le Glycopeptide A notamment. Les r6sultats de l'analyse des Glyeopeptides A des membranes et de l'oviduete sont / t ce t 6gard moins nets. Mais des exp6riences m6taboliques semblent bien mettre en 6vidence le r61e de l'oviducte. La sulfatation de ces glycopeptides peut ~tre effec- tu6e in vitro en pr6sence de Y-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (35 S) et de pr6- parations de magnum et d'isthme 47. La demi-v/e des glyeoprot6ines sulfates des mem- branes de l'oeuf, de l'isthme et du magnum est identique et bien plus br6ve que celle des glyeuronoglyeosaminoglycanes de l'oviduete 4s. Ces r6sultats montrent des par- tieularit6s structurales et m6taboliques des glyeoprot6ines sulfates.

RESUME

Des glyeopeptides sulfates sont isol6s, apr6s prot6olyse de pools de membranes de l 'oeuf et d'oviduete (isthme et magnum), pr6cipitation par les d6tergents cationi- ques et 61eetrophor6se pr6parative. Selon leur mobilit6 ~lectrophor6tique, les princi- paux glyeopeptides sulfates sont s6par6s en deux Groupes A et B, qui restent homog6-

440 J. PICARD et a L

nes apr~s gel filtration et 61ectrophor~se sur gel de polyacrylamide. Les analyses donnent les valeurs moyennes suivantes: les Glycopeptides A sont caract6ris~s par un rapport hexose/hexosamine de 0.4. Ils renferment principalement de racetylgluco- samine, du galactose, du glucose et, en plus faible quantit6 du fucose, de racide N- acetylneuraminique et des sulfates. Ces f0ycopeptides semblent ~tre caract6ris,~s par une longue chatne glucidique l i~ a un petit nombre d'amino acides. Les Glycopep- tides B pr~entent des rapports hexose/hexosamine, sulfate/hexosamine et acide acetylneuraminique/hexosamine voisins de 1. La N-acetylglucosamine et la N-acetyl- galactosamine sont en proportion 6gale. L'hexose principal est le galactose. Les Glycopeptides B sont constitu~ par de courtes chatnes glucidiques li~es par des liai- sons s~rine et thr6onine O-glycosidiques/t la longue.chalne peptidique. Un amino acide sur deux de la chalne est 1i6 ~ des r~sidus glucidiques. Les caract6ristiques de ces glycopeptides les rapprochent des mucines. Les Glycopeptides B isol6s des glyco- prot6ines des membranes de roeuf, du magnum et du blanc d'oeuf ont une constitu- tion similaire, probablement identique. La composition des Glycopeptides A isol6s des membranes de l'oeuf et de risthme pr6sente des analogies rnais aussi des diff6- rences. Les r6sultats sont en faveur du r61e des segments de l'oviducte, le magnum, et l'isthme, dans la gen6se des membranes de roeuf de poule.

REMERCIEMENTS

Nous adressons nos remerciements ~ Mesdemoiselles Hermelin et Lehongre et ~ Mesdames Esquivie et Deudon qui ont bien voulu par leur collaboration tech- nique faciliter la r~alisation de ce travail.

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GLYCOPROTEINES SULFATES DES MEMBRANES 441

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