BIOCH1MIE, 1972, 54, 1381-1389. M6moires originaux

Glutamate d6shydrogdnase de levure sp6cifique du NADP. II. Quelques param~tres mol~culaires.

R e n 6 e VENARD et A n n e FOURCADE (*). Laboratoire de Biologie Physico-Chimique, Universitd de Paris-Sud,

Centre d'Orsalt, 91 Orsoy (France). (7/7/1972).

Summary. - - Physica l proper t ies of a NADP-specifie g lu t ama te dehydrogenase f rom Saccharomyces cerevisiae.

The isola t ion and purif icat ion of the enzyme made it possible to s tudy its molecula r propert ies which different ia tes it f r om g lu tamate dehydrogenase obta ined f rom an ima l sources.

Po lyacry lamide gel e leetrophoresis at two different pH's (7.9 and 9.1) and different gel concent ra t ions , show tha t the p ro te in migra tes as a single NADP-GDH act ivi ty band. By ana ly t ica l u l t r acen t r i fuga t ion , a single peak appeared even at p ro te in concen t ra t ion higber t h a n 2 mg/ml . Ex t rapo la t ion to inf ini te d i lu t ion gives s ° ---- 10 S which differs f rom t h a t of the m a m m a l i a n enzyme : 13 S. ORD measu remen t s and lack of a second peak indicate t h a t the enzyme does not undergo a concen t ra t ion dependent polymer i - zation. Molecular weight has been de te rmined by l ight -sca t te r ing measurements , electro- phoresis and gel f i l t rat ion. The molecula r weight is 280,000 and th i s va lue is lower t h a n t ha t of the enzyme of m a m m a l i a n source.

Elect rophoresis w i t h sodium dodeeyl su l fa te gives a single band of a polypept ide chain having a molecular weight of 48,000. Thus, the active pro te in can be considered as an hexamer made of apparen t ly six ident ical subuni t s .

D a n s u n e p u b l i c a t i o n a n t 6 r i e u r e , n o u s a v i o n s d 6 c r i t u n e m 6 t h o d e d ' e x t r a c t i o n et de p u r i f i c a t i o n de la g l u t a m a t e d 6 s h y d r o g 6 n a s e de l c v u r c (Sac- charomyces cerevisiae) s p 6 c i f i q u e d u N A D P + ( N A D P - G D H E.C.1.4.1.4.) . C e r t a i n es c o n s t a n t e s ci- n 6 t i q u e s a v a i e n t 6t6 d 6 t e r m i n 6 e s s u r u n e e n z y m e d o n t le d e g r 6 de p u r i f i c a t i o n 6 ta i t d6 jh t r 6 s a v a n c 6 [1]. D i f f 6 r e n t e s m o d i f i c a t i o n s de la t e c h n i q u e de p r d p a r a t i o n n o u s o n t p e r m i s d ' o b t e n i r l ' e n z y m e tou t ~ f a i t p u r e b i e n que n o n c r i s t a l l i s 6 e [2]. N o u s a v o n s p u a l o r s p r d c i s e r q u e l q u e s - u n s d e ses p a r a - m 6 t r e s p h y s i c o - c h i m i q u e s e t 6 t a b l i r u n mod61e de s t r u c t u r e q u a t e r n a i r e . I1 6 ta i t 6 g a l e m e n t i n t 6 r e s - s a n t de c o m p a r e r ces p a r a m 6 t r e s h c e u x de s GDH e x t r a i t e s des a n i m a u x s u p 6 r i e u r s et des m i c r o - o r g a n i s m e s d6jh 6 tud i6s p a r a i l l eu r s .

I. M A T E R I E L E T M E T H O D E S .

L o t s de la r 6 a c t i o n :

g l u t a m a t e + N A D P + + H 20 ~ u - c 6 t o g l u t a r a t e + N A D P H + H + + NH+4 l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e es t 6va lu6e en s u i v a n t la v a r i a t i o n d ' a b s o r b a n c e 340 n m c a r a c t 6 r i s t i q u e d u n o y a u p y r i d i n i q u e r6du i t . Les v a l e u r s de s p a r a m 6 t r e s c i n d t i q u e s n o u s o n t c o n d u i t s h 6 t u d i e r la v i t e s s e de la r 6 a c t i o n

(*) Avec la co l labora t ion technique de B6n6dicte Bocher.

d a n s le s ens << i n v e r s e >> : a m i n a t i o n r 6 d u c t i v e de l ' u - c 6 t o g l u t a r a t e [2].

Les v a r i a t i o n s d ' a b s o r b a n c e s o n t m e s u r 6 e s a v e c u n s p e c t r o p h o t o m 6 t r e B a u s c h et L o m b 505 d u n s u n c o m p a r t i m e n t t h e r m o s t a t 6 [3] .

Les s p e c t r e s d ' a b s o r p t i o n on t 6t6 r6a l i s6 s au m o y e n d ' u n s p e c t r o p h o t o m b t r e "h d o u b l e f a i s c e a u

C a r y 15.

Le p H des s o l u t i o n s a 6t6 m e s u r 6 a v e c u n p H m ~ t r e R a d i o m e t e r 4 B m u n i d ' 61ec t rodes c o m -

b in6es .

Les m e s u r e s de d i f f u s i o n de la l u m i 6 r e o n t 6t6 e f fec tu6es h l ' a i d e d ' u n g o n i o d i f f u s i o m 6 t r e c o n s - t r u i t a u l a b o r a t o i r e [4]. L a c u r e de m e s u r e es t t r a v e r s 6 e p a r u n f a i s e e a u de lumib, r e m o n o c h r o - m a t i q u e (~, = 436 n m ) p o l a r i s 6 e v e r t i c a l e m e n t . La l u m i 6 r e d i f fu s6e d a n s u n e d i r e c t i o n f a i s a n t u n a n g l e 0 a v e c la l u m i 6 r e i n c i d e n t e es t rec, ue p a r u n p h o t o m u l t i p l i c a t e u r d o n t le c o u r a n t d ' a n o d e es t a m p l i f i 6 et m e s u r 6 a v e c u n g a l v a n o m 6 t r e c o u p l 6 h u n s u i v e u r d e spo t . L a v a l e u r de l ' i n t e n - s i t6 d i f fus6e es t c o m p a r 6 e h ce l le d ' u n e s o l u t i o n d e t r y p s i n e (P.M. ---- 23.500 /t p H = 2).

Les c o u r b e s de d i s p e r s i o n o p t i q u e r o t a t o i r e s o n t r 6 a l i s 6 e s a v e c u n s p e c t r o p o l a r i m b t r e Spec - t r o p o l I F i c a d a n s l ' i n t e r v a l l e de l o n g u e u r s d ' o n d e

95

1382 R. Venard el A. Fourcade.

eompris entre 550 et 220 nm. Nous avons utilis~ comme cellule de mesure une cuve de quartz dont le trajet optique est 6gal h 0,1 dm.

Les u l t racent r i fugat ions analyt iques ont 6t~ effectu~es avec une ul t racentr i fugeuse Beckman Spinco, module E, avee une vites se de rota t ion ~gale h 59 780 t r / m n h 20 ° dans une cellule de 12 ram.

Pour les analyses 6lectrophor6tiques, nous avons utilis~ un proc6d6 d6riv6 de eelui mis au point par Szylit pour d 'autres d6shydrog6nases [5] ; l '~leetrophor~se est r~alisde sur des gels de po lyacry lamide en tampon con t inu Tris-borate 82 mM, EDTA 23 mM pour lequel, h 20 °, le pH est ~gal h 9,1 et la conduct ivi t6 est de 600 O-Lcm-L Sur des gels h 5,5 p. cent en aerylamide, de 7 em de longuenr et de 0,6 em de diam~tre, nous obte- nons une migra t ion suffisante pour d6terminer la mobil i t6 ~lectrophor6tique au bout de 45 minutes sous une tension moyenne de 160 V;

On r~v~4e les prot6ines en les colorant soit par l ' amido-Schwartz en solution h 0,5 p. cent dans de l 'acide ac6tique h 7 p. cent, soit, lorsque les concent ra t ions en prot6ine sont faibles, par le bleu de Coomassie en solution h 0,05 p. cent dans de l 'acide t r iehlorac~t ique h 12,5 p. cent [6].

Afin de v~rifier que la bande prot~ique corres- ponda i t bien h l 'enzyme, nous avons adapt6 a la GDH la m6thode de Market et MSller [7~ qui est bas6e sur la r6duct ion par le NADPH d 'un sel de t6trazolium qui, h l '6tat r6duit, est insoluble et color6 en r o u g e ; on immerge les gels du ran t 10 minutes h 37 ° et h l 'obscuri t6 dans le tampon d'61ectrophorbse addi t ionn6 de glutamate de so- d ium (1,7 p. cent), de NADP (0,2 p. cent), de ph6- nazine m6thosulfate (0,1 p. cent) et de b romure de (dim6thyl thiazoly)) t6trazolium (0,3 p. cent).

II. TECHNIQUE PREPARATIVE.

Le proc6d6 de pr6para t ion a d6jh 6t6 d6crit [1]. Les modif icat ions apport6es depuis sont expos6es dans un autre t ravai l [21.

Nous nous contenterons de rappeler ses p r in - cipales 6tapes :

1. extract ion par incuba t ion dans le t ampon phosphate 0,1 M, pH 7,6 h 37 ° ;

2. pr6cipi ta t ion f ract ionn6e su ivant la m6thode de Grisolia [8] ;

3. chromatographic sur DEAE-cellulose en gra- dient de concent ra t ion saline ;

4. chromatographic sur tarots mol6eulaire (Bio- gel A 1,5 M ou P 200).

Aprbs les 6tapes 3 et 4, les solutions sont con- centr6es par dialyse sous vide.

III. RESULTATS.

1) Crit~res de puret~.

Diff6rents crit~res nous ont permis d 'es t imer la puret6 de la prot6ine.

Le test 61ectrophordtique a 6t6 effectu6 en fai- sant var ier les condi t ions exp6rimentales, c'est-h- dire en jouant d 'une par t sur l'effet de fil tration des gels en u t i l i sant des concent ra t ions en acryl- anfide de 3 h 9 p. cent et, d 'aut re part , sur la

I

g

I

1 2 3 4

a b a b a b a

i

i

J b

FIG. 1. - - Migration 61ectrophor6tique de la NADP- GDH de levure dans diff6rentes conditions exp~rimen- tales.

1- tampon Tris-HC1 0,07 M pH 7,9. Gel h 5,5 p. cent en acrylamide. Dur6e de la migration 2 h 30. 2-3-4- tampon Tris-borate, EDTA pH 9,1. 2 : gel h 5,5 p. cent en acrylamide. 3 : gel h 7,4 p. cent en aerylamide. 4 : gel /t 9 p. cent en acrylamide. Dur6e de la migration 45 min. (a) coloration sp6eifique des prot6ines

(6charLtillon : 20 ug)- (b) coloration sp6eifique de l'enzyme

(6ehantillon : 2 ,~g).

charge des prot6ines en modif iant la valeur du pH du tampon d'61ectrophor6se : pH 9,1 ( tampon Tris-borate, EDTA) et pH 7,9 ( tampon Tris-HCl 0,07 M). Les r6sultats de l 'analyse 61ectrophor6- t ique met tent en 6vidence une bande un ique cor- r e spondan t h u n seul cons t i tuan t actif (fig. 1).

Les clich6s d 'u l t racent r i fuga t ion analy t ique d 'une solution h 5 m g / m l en tampon phosphate 0,1 M pH 7,6 pr6sentent un pic un ique sym6tr ique t r adu i san t la pr6sence d 'un cons t i tuant un ique (fig. 2 A).

Apr~s chromatographic de la solution prot6ique sur Biogel A 1,5 M, ]e d iagramme d'61ution mont re

BIOCItIMIE, 1972, 54, n ° 11-12.

Paramdtres moldculaires de la glutamate ddshgdrogdnase. 1383

6 g a l e m e n t u n p i c u n i q u e a u q u e l es t r a t l a c h 6 e t o u t e l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e de la s o l u t i o n (fig. 2 B).

Les f igures 1 et 2 (A, B) r e g r o u p e n t les r 6 s u l t a t s de ces d i f f 6 r e n t e s a n a l y s e s .

2) Conservation el stabilitY.

L ' e n z y m e p u r e es t c o n s e r v 6 e dar ts u n e s o l u t i o n de t a m p o n p h o s p h a t e 0,1 M p H 7,6 'h 4 ° ; la con -

N o u s a v o n s aus s i v6r i f i6 la s t a b i l i t 6 de l ' e n z y m e h des p H p lu s a l c a l i n s : en s o l u t i o n h p H 7,9 d a n s d u t a m p o n Tr is-HC1 0,07 M et h p H 9,1 d a n s du t a m p o n T r i s - b o r a t e 82 raM, E D T A 23 mM (fig. 3). N o u s p o u v o n s d o n c c o n c l u r e que la N A D P - G D H de l e v u r e est t r6s s t a b l e en m i l i e u a l c a l i n a l o r s que , d a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s , l ' e n z y m e de i n a m m i f 6 r e s es t e n c o r e a c t i v e m a t s i n s t a b l e p H 8 et s ' i n a c t i v e r a p i d e m e n t fi p H 9 [9].

2 8 0 n m

J Q2

4O 50 t u l a l a

A B

FIG. 2. - - A - - Diagramme d 'u l t r acen t r i fuga t ion ana ly t ique de la NADP-GDH de levure en solut ion dans le t a m p o n phospha te 0,1 M pH 7,6.

Concent ra t ion enzymat ique 4,8 mg /ml . 0 = 20 ° ; vi tesse du ro to r : 59 780 t r / m n . B - - Diagramme d'61ution de la chromatograph ie sur Biogel A 1,5 M d 'une solu-

t ion de NADP-GDH de levure en t a m p o n phospha te 0,1 M pH 7,6.

c e n t r a t i o n p r o t 6 i q u e es t c o m p r i s e e n t r e 5 et 20 m g / m l . D a n s ces c o n d i t i o n s l ' a e t i v i t 6 sp6c i f i que es t c o n s t a n t e p e n d a n t t r o i s roots .

I

^ ^ ,_ ^ ± _

: a en~g • • a

Fro. 3. - - Stahi l i t6 de solut ions de NADP-GDH de levure dans diff6rents t a m p o n s :

e - - e t ampon Tr i s -bora te 82 mM, EDTA 23 mM pH 9,1.

[ : ] - - ra t ampon Tris-HCl 0,07 M pH 7,9. A - - A t ampon Tris-HC1 0,1 M pH 9. (Concentra t ion enzymat ique : 9 ~tg/mi dans le t am-

pon cor respondant ) . L 'enzyme est conserv6e h 4°C h une concent ra t ion de

9 ~g /ml dans le t a m p o n correspondant . L'activit6 est mesur6e dans le sens inverse.

3) Propri~,t~s optiques.

a) S p e c t r e d ' a b s o r p t i o n .

Le s p e c t r e d ' a b s o r p t i o n de 1 ' e n z y m e en s o l u t i o n d a n s le t a m p o n p h o s p h a t e 0,1 M p H 7,6 es t r e p r 6 - s en t6 s u r la fig. 4. N o u s o b s e r v o n s u n m a x i m u m

278 n m , u n m i n i m u m h 250 n m a i n s i que des 6 p a u l e m e n t s 'h 283 et 290 n m , c a r a c t 6 r i s t i q u e s des c h r o m o p h o r e s T y r et T r p ; c e u x - c i n ' a p p a r a i s s e n t p a s s u r u n s p e c t r e de GDH e x t r a i t e de foie de p o r c d a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s de c o n c e n t r a t i o n .

La v a l e u r d u r a p p o r t T y r / T r p d 6 t e r m i n 6 e en u t i l i s a n t le p r o c 6 d 6 de G o o d ~ ' i n et M o r t o n [10] e st de 2 , 4 ; d a n s le cas de la GDH de fo ie de bceuf, ce r a p p o r t ca l cu l6 h p a r t i r de l ' a n a l y s e de sa c o m p o s i t i o n en a c i d e s a m i n 6 s est 6gale

h 2,6 [ H ] .

b) Coe f f i c i en t d ' e x t i n c t i o n m o l 6 c u l a i r e .

Afin de d 6 t e r m i n e r le c o e f f i c i e n t d ' e x t i n c t i o n , n o u s a v o n s m e s u r 6 d ' u n e p a r t l ' a b s o r b a n c e h 280 n m et, d ' a u t r e p a r t , la c o n c e n t r a t i o n p r o t 6 i q u e • h p a r t i r de l ' i n c r 6 m e n t d ' i n d i c e de r 6 f r a c t i o n : on m e s u r e la d i f f 6 r e n c e de l ' i n d i c e de r 6 f r a c t i o n de

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 11-12.

1 3 8 4 R. Venard el A. Fourcade.

la s o l u t i o n d ' e n z y m e d i a l y s 6 e et d u t a m p o n oe d i a l y s e s e r v a n t de r 6 f 6 r e n c e . La v a r i a t i o n d ' i n d i c e An 6va lu6e , p e r m e t de c a l c u l e r ]a c o n c e n t r a t i o n de la s o l u t i o n p r o t 6 i q u e en a d m e t t a n t u n e v a l e u r

An de 0,185 p o u r le r a p p o r t - - , c 6 t a n t e x p r i m 6 e

Ac en g / m l .

DO

oA

2~,o 2'eo ~o a20 ~0 ~.;,

Fro. 4. - - Spectre d ' absorp t ion de ]a NADP-GDH de levure en solut ion dans le t a m p o n phospha te 0,1 M pH 7,6.

Concent ra t ion en prot6ine : 4,5 mg /ml . Tra je t opt ique : 2 mm.

A p a r t i r de p l u s i e u r s p r 6 p a r a t i o n s , n o u s a v o n s o b t e n u u n e v a l e u r m o y e n n e d u c o e f f i c i e n t d ' e x t i n c -

t i o n E 1 c m = 1,07 "h 280 n m . Darts le cas de la 1 m g / m l

GDH de fo ie de b.oeuf la v a l e u r h a b i t u e l l e l n e n t a d o p t 6 e , 6gale h 0,97, es t h l ' h e u r e a c t u e l l e su je t h d i s c u s s i o n [12, i13].

P o u r u n e m a s s e m o l 6 c u l a i r e de 280 000 d a l t o n s , c o m m e n o u s le v e r r o n s p,lus l o in , le c o e f f i c i e n t d ' e x t i n c t i o n m o l 6 c u l a i r e de la N A D P - G D H de l e v u r e h 280 n m en s o l u t i o n d a n s le t a m p o n p h o s - p h a t e 0,1 M p H 7,6 es t 6gal /t 3.10L

c) D i s p e r s i o n o p t i q u e r o t a t o i r e .

La d i s p e r s i o n o p t i q u e r o t a t o i r e m e s u r 6 e e n t r e 550 et 220 n m es t r e p r 6 s e n t 6 e su r la f igure 5. A l o r s que , d a n s le c a s de la GDH de m a m m i f 6 r e s , n o u s o b s e r v o n s u n e r o t a t i o n p o s i t i v e a v e c u n m a x i m u m d a n s le v i s i b l e et le p r o c h e u l t r a v i o l e t , n o u s o b t e n o n s , d a n s le cas de la N A D P - G D H de ! evu re , u n e r o t a t i o n n 6 g a t i v e et m o n o t o n e ; d a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s de c o n c e n t r a t i o n p r o t 6 i q u e 5 m g / m l le p h 6 n o m b n e de p o l y m 6 r i s a t i o n l i n 6 a i r e n ' a p p a r a i t p r o b a b l e m e n t p a s [14J.

E n t r e 300 et 270 n m , o n o b s e r v e u n ou p l u s i e u r s e f fe t s C o t t o n d a n s la z o n e d ' a b s o r p t i o n de s c h r o - m o p h o r e s a r o m a t i q u e s . D a n s 1 ' u l t r a v i o l e t l o i n t a i n , l ' e f fe t C o t t o n n ~ g a t i f se s i t ue h 234 ~ 1 nm, l ' a m p l i t u d e d e ce m i n i m u m est [m']234 - - 2820 ___ 80 ° .

I1 est p o s s i b l e de r e n d r e c o m p t e de la d i s p e r - s i on r o t a t o i r e h 1 'a ide de la r e l a t i o n de Moffi t t d a n s la z o n e v i s i b l e e t u l t r a v i o l e t t e p r o c h e en a d o p t a n t p o u r la g r a n d e u r ~o la v a l e u r 212 n m [15]. P o u r u n e c o n c e n t r a t i o n p r o t 6 i q u e de 5,5 m s / ml , n o u s o b t e n o n s : ]es v a l e u r s des p a r a m b t r e s a o = - - 45 ° et b o ---- - - 150 ° (fig. 6a).

-IN .~

f

2O

40

2.so [ a o o ~o. ~ao

, , .~A ~ -

r 30 ~

BIOCHIM1E, 1972, 54, n ° 11-12.

FIe,. 5. - - Dispers ion opt ique ro ta to i re de la NADP-GDH de levure.

A : solut ion de t a m p o n phospha te 0,1 M pH 7,6. B ; C ; D : solut ions de NADP-GDH de ]evure dans

le t a m p o n phospha te 0,1 M pH 7,6. Concent ra t ion en enzyme :

B : 1,37 mg/ml . C : 5,35 mg/ml . D : 0,17 mg/ml .

Temp6ra ture : 20 ° ; t r a j e t opt ique : 1 era.

Param~lres mol~culaires de la glutamate ddshydrogdnase. 1385

L o r s q u ' o n fa i t v a r i e r la c o n c e n t r a t i o n p r o t 6 i q u e d a n s l ' i n t e r v a l l e 0,7 - - 5,5 m g / m l , le t e r m e b o g a r d e u n e v a l e u r c o n s t a n t e a lo r s que, c o m m e l ' i n d i q u e la f igure 6b, le p a r a m ~ t r e a o p r 6 s e n t e une fa ib le v a r i a t i o n en f o n c t i o n de la c o n c e n t r a t i o n p r o t 6 i q u e ; p a r e x t r a p o l a t i o n ~ d i l u t i o n iuf in ie , la v a l e u r a o est 6gale ~ - - 5 ° . Le p o u r c e n t a g e de s t r u c t u r e h61ico ida le 6valu6 ~ p a r t i r de la va ]eu r du p a r a m ~ t r e b o s e r a i t de 24 p. cen t .

Q 2 0 4 o 6

~2_~ °

- 5 ( . - a . B

• • 2o

- I00

- 1 5 q

Fro. 6. - - A --- Dispersion optique rotatoire d 'une solution de NADP-GDH de levure ~ diff6rentes con- centrat ions dans le t ampon phosphate 0,1 M pH 7,6.

Traitenleut graphique par la relat ion de Moffitt pour ~o -~ 212 nm.

Concentrat ion en enzymes A - - A 0,7 m g / m l e - - o 3,5 m g / m l u - - u 4,2 m g / m l © - - © 5,3 mg/ml . B - - Variat ion du param6tre ao en fonction de la

concentrat ion enzymatique.

L o r s q u ' o n r e p r 6 s e n t e les v a r i a t i o n s du p o u v o i r r o t a t o i r e sp6c i f ique p a r l ' 6 q u a t i o n de S h e c h t e r et Blout [16], les v a l e u r s des p a r a m ~ t r e s A19 ~ et A ~ son t r e s p e c t i v e m e n t de ÷ 465 ° e t - - 390 ° et con - d u i s e n t h d e s p o u r c e n t a g e s de s t r u c t u r e en h61ice

d i f f 6 r e n t s : 33 et 17 p. cen t , ce qu i m o n t r e qu ' i l ex i s t e une s t r u c t u r e au t r e que l 'h61iee a e t la pe lo t e s t a t i s t ique .

4) Coe[ficient de s~dimenlation. Les m e s u r e s on t 6t6 e f fec tu6es sur des s o l u t i o n s

p r o t 6 i q u e s d o n t la c o n c e n t r a t i o n d 6 t e r m i n 6 e p a r s p e c t r o p h o t o m 6 t r i e est c o m p r i s e e n t r e 0,8 et 4,3 m g / m l .

Sur la f igure 7, p a r e x t r a p o l a t i o n h d i l u t i o n in f in ie de la d r o i t e 1/s ---- f (c) on d 6 t e r m i n e u n e

v a l e u r S°0o~ = 10 S.

C o m m e nous l ' a v i o n s d6j~ vu, d a n s l ' i n t e r v a l l e de c o n c e n t r a t i o n 6tudi6, les c l i ch6s m o n t r e n t un

Y~

0.1 -- _

i

FIG. 7. - - D6terminat ion du coefficient de s6dimen- ta t ion de la NADP-GDH de levure en solution dans le tampon phosphate 0,1 M pH 7,6.

0 : 20 ° ; vitesse du rotor : 67 770 t r / mn .

p i c u n i q u e ce qui t r a d u i t l ' a b s e n c e de p o l y m ~ r e s a in s i que nous l ' a v i o n s d6jh o b s e r v 6 au c o u r s des p r e m i e r e s a n a l y s e s 61ec t rophor6 t iques .

5) Masse moldculaire. P l u s i e u r s m 6 t h o d e s n o u s on t p e r m i s d ' u n e p a r t

de d 6 t e r m i n e r la m a s s e m o l 6 c u l a i r e et d ' a u t r e p a r t d ' o b t e n i r q u e l q u e s i n f o r m a t i o n s su r la f o r m e de la NADP-GDH de l evu re .

t :

I A .

0) 014 ¢~ ~ .g/m~

F16. 8. - - Ddterminat ion de la masse molfculaire de la NADP-GDH de levure en solution dans le tampon phosphate 0,1 M pH 7,6 par diffusion de la lumi6re.

Angle d 'observat ion 90 °. I

- - : intensit~ spfcifique ; C : concentrat ion en mg/ C

m l ; I : intensit~ diffusSe exprim6e en unit6s arhi- t ra ires choisies de telle sorte que, pour une solut ion

I de t rypsine /l pH 2 (PM = 23 500), ~ - = 0,23.

a) D i f fu s ion de la lumi~re .

L ' i n t e n s i t 6 de la l u mi ~ r e d i f fus6e a 6t6 m e s u r 6 e su r des s o l u t i o n s d o n t la c o n c e n t r a t i o n p r o t 6 i q u e

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1386 R. V e n a r d et A. F o u r c a d e .

6tait compr ise entre 0,162 et 0,626. m g / m l sous un angle d 'observa t ion de 90 °. La valeur de la masse mol6cula i re est obtenue par ex t rapola t ion h dilu- t ion infinie de la droi te I / c en fonct ion de la concen t ra t ion prot6ique e repr6sent6e dans la figure 8 ; en ut i l isant comme prot6ine 6talon la t ryps ine h pH 2, la valeur ainsi trouv6e est 6gale

280 000 -- 10 000.

b) Elec t rophor6se sur gels de po lyacry lamide .

La stabilit6 des solutions enzymat iques aux pH alcal ins et l ' absence de polym6r isa t ion nous ont pe rmis d 'u t i l i ser la t echnique d'61ectrophor6se pour 6valuer la masse mol6culaire . Noos avons suivi la m6thode d ' t t ed r i ck et Smith [17], les pro- t6ines servant de r6f6rence 6tant la s6rum albu- mine sous diff6rents 6tats de polym~risat ion, la catalase, la xan th ine oxydase et l 'ur~ase.

A ~ m

0~

FI6. 9. - - D~termination de la masse mol&ulaire de la NADP-GDH de levure par analyse 6]ectropho- r~tique.

A(log Rm) : pente des droites repr6sentant la varia- tion du logarithme de Rm en fonction de la concen- tration en acrylamide des gels.

Prot6ines servant h l'~talonnage : • xanthine oxydase, [] SAB (trim6re), • SAB (t~tram6re), ,) SAB (dim6re),

catalase, • SAB (monom6re). ur~ase, GDH de levure.

Comme l ' i nd ique la figure 9, la masse nml6cu- laire ainsi d6termin6e est 6gale A 270 000 ± 10 00O pour la NADP-GDH de levure.

c) F i l t ra t ion sur agarose.

Les propri6t6s de tamis mol6cula i re soat telles que les volumes d'61ution de prot6ines globulaires suppos6es sph6riques, en mi l ieu de force ionique suffisante, ne d6pendent que de leur volume mol6- culaire [18]. On peut donc h par t i r de ces pro- pri6t6s d6terminer leur masse mol6culai re : il

existe une re la t ion l in6aire entre le logar i thme de la masse mol6cula i re et le r appor t V,JV o (V o 6rant le volume d 'exc lus ion et V e le volume d'61ution de la prot~ine). En ut i l isant une colonne de Biogel A 1,5 M, la masse mol6cula i re de la NADP-GDH de levnre a 6t6 6valu~e par r appor t A des prol~ines de r6f6rence qui sont la catalase, la s6rum-albu- mine et la xanth ine oxydase. La valeur trouv6e est 6gale h 320 000 ± l0 000 (fig. 10).

PM

5,4

I

is d' 1,b ,~,o FIG. 10. - - D~termination de la masse mol&ulaire

de la NADP-GDH de levure par filtration sur Biogel A 1,5 M.

La colonne (2,7 X 38 cm) est dquilibrde avec le tam- pon phosphate 0,1 M pH 7,6.

Prot6ines servant h l'6talonnage : 0 catalase • SAB • xanthine oxydase • NADP-GDH de levure.

Cette dern i6re valeur , plus 61ev6e que celles pr6- c6demment obtenues, dolt ~tre due au fair que la mol6eule n 'est pas sph6rique [19]. En d6terminant le coefficient de f r ic t ion d 'une mol6cule sph& r ique 6quivalente dont la masse mol6cula i re est 6gale h 280 000 et le coefficient de s6dimenlat ion 6gal h 10 S, et en adoptant pour le volume par t ie l sp6cifique une valeur moyenne de 0,74 cm3/g, on t rouvera i t une valeur de 1,35 h laquelle cor respon- dra i t un r appor t axial de 6 pour l ' e l l ipsoide non hydra t6 co r respondan t et de 4 si l 'on admet un degr6 d 'hydra ta t ion de 0,35 g d 'eau par g ramme de prot6ine [19]. Ce r6sultat est en bon accord avec ceux d6termin6s pour diff6rentes GDH [20, 21], le monom6re act if de la GDH de foie de b<euf avec un rappor t axial 6gal ~ 2 faisant except ion [22].

6) Exis tence de sous-unitds.

On peut p r o v o q u e r la coupure des l iaisons hydrog~ne et hyd rophobes responsables du main- tien de la s t ructure qua te rna i re d 'une prot6ine par addi t ion de dod6cyl sulfate de sodium. Les

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P a r a m ~ t r e s moldcu la i res de la g l u t a m a t e ddshydrog~nase . 1387

masses mol6culaires des chaines po lypep t id iques obtenues aprbs act ion du SDS sur la GDH, en pr6- sence de 2 8-mercapto6thanol qui emp6che les recombina isons , peuvent 6tre d6termin6es en appl iquant la t echnique mise au point par Weber et Osborn [23'], les prot6ines de r6f6rence utilis6es pour l '6talonnage sont, sous forme dissoci6e, la s6rum albumine, la catalase, la GDH de foie de bceuf, la LDH, la t ryps ine et la ~-lactoglobuline.

Aprbs une migra t ion durant 7 heures sur des gels de po lyac ry l amide h 10 p. cent en acrylamide , sous une tension moyenne de 200 V e t une densit6 de courant de 10 m A / c m 2, on repbre les bandes prot6iques pa r le bleu de Coomassie.

Dans le cas de la NADP-GDH de levure on met ainsi en 6vidence une seule bande prot6ique inac- tive. Corinne nous le voyons sur la figure 11, la repr6senta t ion du logar i thme de la masse mo16- culaire en fonct ion de la mobili t6 co r respondan te des diverses prot6ines d6natur6es pe rmet d 'at t r i - buer it la cha lne po lypep t id ique ainsi obtenue dans le cas de la NADP-GDH une masse mol6cu- laire de 48 000 ___ 2 000.

l e 9 P m

. . . . . |

% 2 . , , •

FIG. 11. - - D6termination de la masse mol6culaire des chaines polypeptidiques de la NADP-GDH de le- vure apr6s dissociation de la prot6ine en pr6sence de SDS.

Gels de polyacrylamide h 10 p. cent en acrylamide. Tampon phosphate 0,1 M pH 7,1 - - SDS 0,1 p. cent. Prot6ines servant h l'6talonnage : • ~-lactoglobuline, • GDH de foie de b~uf, O LDH, V SAB, • trypsine, • eatalase. [] NADP-GDH de levure.

Ces diff6rents r6sultats pe rmet ten t de repr6- senter la mol6cule act ive de NADP-GDH de levure comme un hexam~re de masse mol6culai re 6gale

280 000 ----- 10 000 daltons, form6 de 6 protom6res ident iques ou tout au moins trbs semblables (6 × 48 000).

IV. DISCUSSION.

L 'ob ten t ion de la NADP-GDH de levure h l '6tat pur nous a pe rmis de d6 te rminer quelques-uns

des parambtres phys ico-ch imiques de cette mol6- cule.

La valeur du coefficient d 'ex t inc t ion sp6cifique est diff6rente de celle g6n6ralement at tr ibu6e ~ la GDH des mammifbres ; elle se r app roche de celles d6termin6es pour des GDH extrai tes de d ivers mic roorgan i smes [21] t raduisant une composi t ion diff6rente en acides amin6s, dans le cas d 'orga- nismes pr imit i fs .

Les clich6s d 'u l t racen l r i fuga t ion mont ren t un seul p ic dont le coefficient de s6dimentat ion extra- pol6 ~ concent ra t ion prot6ique nulle S~o. ~ est 6gal it 10 S ; cette valeur est iden t ique ~ celle obtenue pour une NADP-GDH isol6e de Neuro- spora crassa [20], mats est plus faible que celle at tr ibu6e it la GDH des mammifbres : 13 S [12]. La pr6sence d 'un seul pic, quel le que soil la con- cent ra t ion prot6ique, t radui t l ' absence de r6act ion de polym6risa t ion. Cette absence de polym6risa- tion est confirm6e par les r6sultats obtenus au cours de l 'analyse 61ectrophor6tique et par l 'a l lure de la courbe de d ispers ion opt ique rotatoire . Par des techniques diff6rentes, d ivers auteurs ont d6j~ mont r6 que les GDH extrai tes de mic roorgan i smes ne pr6senta ient pas de r6action de polym6r isa t ion [21, 20] con t ra i r emen t aux GDH isol6es de mammifbres ou de ba l rac iens [24, ~5].

L 'absence de polym6r isa t ion et la stabilit6 aux pH alcal ins nous ont permis de d6ter ininer la masse mol6culai re de la NADP-GDH de levure ; pa r 61ectrophor~se, la va leur trouv6e est de 270000, dans des condi t ions ident iques nous n 'avons observ6 aucune migra t ion de la GDH de foie de b~euf en ra ison de son 6tat polym6ris6.

Comme la solution est monodisperse , l ' in ter- pr6tat ion des r6sultats obtenus par diffusion de la ]umibre s'est av6r6e plus faci le que dans le cas de la GDH de mammifbres . Nous avons pu es t imer la masse mol6culai re de la NADP-GDH (M~ 280000). Cette valeur, plus faible appa remmen t que celle de la GDH de mammifbre , est cependan t comparab le h celle que l 'on obtient pour diff6- rentes GDH extrai tes de champignons et de bac- t6ries [21, 20, 26].

Comme la mol6cule ne pr6sentai t pas de r6ac- t ion d ' a s so c i a t i o n -d i s so c i a t i o n , nous avons pu ut i l i ser le proc6d6 de fi l tration sur lamis mol6- eulaire pour d6 te rminer la masse mol6culaire . Mats le r6sultat appa remmen t anormal par com- para ison avec les mesures effectu6es par d 'autres techniques nous a condui t it 6valuer h 6 le r appor t axial de la mol6cule 6quivalente non hydrat6e. I1 est ident ique it ceux calcul6s pour des GDH isol6es de diff~rents mic roorgan i smes U21, 20], mats tr~s

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1388 R . V e n a r d e l A . F o u r c a d e .

d i f f 6 r e n t de ce lu i d 6 t e r m i n 6 p o u r l ' un i t6 ac t ive de la GDH de fo ie de bceuf [22].

A p r 6 s d i s s o c i a t i o n de la mo16cule a c t i ve en p r6 - s e n c e de SDS, on o b s e r v e p a r 6 tude de la m i g r a - t i on 6 1 e c t r o p h o r 6 t i que s u r gel de p o l y a c r y l a m i d e u n e seu le b a n d e c o r r e s p o n d a n t h une m a s s e mo- 16culaire de 48 000. La mo l6cu l e ac t ive de NADP- GDH de l e v u r e se p r 6 s e n t e r a i t d o n c sous f o r m e d ' u n h e x a m 6 r e f o r m 6 de 6 sous -un i t6s a p p a r e m - m e n t i d e n t i q u e s . Ce r6su l t a t s ' 6 ca r t e n e t t e m e n t de ce lu i d 6 t e r m i n 6 d ' a p r 6 s sa c o m p o s i t i o n en a c i d e s a m i n 6 s duns le cas de la NADP-GDH e x t r a i t e de N e u r o s p o r a c ras sa ; la sous -un i t6 a u n e m a s s e m o l 6 c u l a i r e de 30 000, e t l a mo l6cu l e ac t ive se p r 6 s e n t e r a i t sous la f o r m e d ' u n o c t a m 6 r e [27].

Or, d u n s un a u t r e t r ava i l , n o u s a v o n s m o n t r 6 que la NADP-GDH de l evu re p o s s 6 d a i t des p r o - p r id t6s r 6 g u l a t r i c e s [28] h l ' e n c o n t r e de ce qu i a 6t6 a f f i rm6 p o u r des GDH sp6c i f i ques d ' u n seul c o e n z y m e p r o v e n a n t le p l u s f r 6 q u e m m e n t de m i c r o o r g a n i s m e s [29].

C o m m e nous a v o n s r e t r o u v 6 au n iveau de l ' ac t i - vit6 c a t a l y t i q u e c e r t a i n e s p r o p r i 6 t 6 s r 6 g u l a t r i c e s des GDH e x t r a i t e s d ' a n i m a u x s u p 6 r i e u r s , d a n s la m e s u r e off nous s o m m e s en p r 6 s e n c e d ' u n e s t r u c - t u re a p p a r e m m e n t p l u s s t ab le et p l u s s imp le , la NADP-GDH isol6e de l e v u r e c o n s t i t u e d o n c un b o n mod61e p o u r e s s a y e r d ' a n a l y s e r le m 6 c a n i s m e d ' a c t i o n et de r 6 g u l a t i o n de la L - g l u t a m a t e d6s h y - d r o g 6 n a s e .

Remerciements .

Ce travail a 6t6 fai l dans le laboratoire de M. le Professeur Tonnelat que nous tenons h remercier ainsi que M n~ Guinand pour les encouragements et les con- sells qu' i ls nous ont prodigu6s tout au long de ce tra- vail.

R~svM~.

L 'obtent ion de eette enzyme de levure (Saccharo- myces cerevisiae) h l '6tat pur a permis de d6terminer ses propri6t6s mol6culaires qui la diff6rencient de l 'enzyme des mammif6res .

Les 6lectrophar6ses sur gel de polyaerylamide it pH 7,9 et 9,1 pour diff6rentes concentrat ions en poiy- acrylamide et en prot6ine d6e61ent une seule bande active. Par u l t raeentr i fugat ion analytique, on obt ient un pie unique m6me h des concentrat ions prot6iques sup6rieures h 2 mg/ml . La valeur du coefficient de s~dimentat ion est d6termin6e par extrapolat ion h dilu- t ion infinie : S ° = 10 S, diff6rente de celle que l 'on obt ient pour l 'enzyme des mammif6res : s °

• w , 2 0

---- 13 S. L'absenee d 'un second pie d 'une part, et les valeurs des param6tres rotatoires d 'antre part, indi- quent que l 'enzyme ne se polym6rise pas. La masse mol6culaire a 6t6 d6termin6e par diffusion de la ln- mi6re, par 61eetrophor6se et par tamis mol6eulaire. La valeur MW ~ 280 000 est inf6rieure h eelle de Fen- zyme d'origine animale. En dissoeiant la prot6ine par le dodeeyl sulfate de sodium, les auteurs ont identifi6

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 11-12.

une seule esp6ce de sous-unit6 de masse mol6culaire de 48 000, ce qui montre que la prot6ine active se pr6sente sous forme d 'un hexam6re constitu6 de sous- unit~s identiques.

ZUSA.~IMENFASSUNG.

Physikal ische Eigenschaften ether NADP-spezifischen Glutamat-Deshydrogenase aus Saccharomyces cerevi- siae.

Die Isolierung und Reinigung des Enzyms erm6- gliehte die Untersuchung seiner molekularen Eigen- schaften, wodurch sic sich yon der aus t ierischer Herkunft erhal tenen Glutamat-Deshydrogenase unter- scheidet.

Polyal~rylamidgel-Elektrophorese bet zwei verschie- denen pH (7,9 und 9,1) und verschiedenen Gelkonzen- t ra t ionen zeigt, dass das Prote in als ein einzelner Aiktivitiitsstreifen yon NADP-GDH veandert. In der analyt ischen Ul t razentr i fugat ion erscheint ein einzel- her Pik sogar bet Pro te inkonzent ra t ionen fiber 2 mg / ml. Extrapola t ion anf Konzentra t ion Null ergibt s~0*,w = 10 S, einen Wert der heim Sfiugetier-Enzym

verschieden ist (13 S). ORD-Messungen und die Ahwe- senheit eines zweiten Piks zeigen, dass das Enzym keiner konzentrationsabh~ingigen Polymer isa t ion unter- geht. Das Molekulargewicht 'wurde durch Lichtdisper- s ionsmessungen, Elektrophorese und Gelfiltration be- s t immt. Das Molekulargewicht ist 280.000 und dieser Wert ist niedriger als derjenige des S~iugetierenzyms.

El~1~trophorese mit Nat r iumdodezylsu l fa t ergibt einen einzelnen Streifen ether Polypept idket te mit einem Molekularge~vicht yon 48.000. So kann das aktive Prote in als ein Hexamer betrachtet werden, das aus sechs anscheine~d ident ischen Untere inhei ten gehildet wird.

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