Explorations des réponses Immunitaires

2012

L3 Médecine

Rappel sur les réponses Immunitaires

DIFFERENTS TYPES DE REPONSES IMMUNITAIRES

Naturelle = innée AdaptativeNon spécifique Spécifique

Barrière cutanéo-muqueuseSubstances bactéricides

pHEquilibre de la flore

InterféronsSyst. Complément

Phagocytes (PN, mono/mρ)Cellules NK

Cellules dendritiques

Récepteurs spécifiques (TCR BCR)Qlqs jours

Mémoire Immunitaire+efficace lors du 2ème contact

base des vaccinations

Lymphos TLymphos BAnticorps

Immédiate

Défenses Immunitaires innées et adaptatives dansla défense anti-infectieuse

1) Bactéries à multiplication extracellulaire + certains champignons+ certains virus et parasites• Système du complément

Voie alterneVoie des lectinesVoie classique (Ag/Ac)

• Polynucléaires neutrophiles•Anticorps

Neutralisation des toxines bactériennesInhibition de l’adhérence des bactéries aux épithéliumsOpsonisation

Coopération entre ces différents acteurs

2) Bactéries à x intracellulaire + cellules infectées par Virus +parasite à x intracellulaire

Cellules T (CD4-CD8)MacrophagesNK

Agent Pathogène: Inflammation tissulaireComplément Interactions PAMP/PRR (TLR)C3a C5a

PN Macrophage

Monocyte

NK C. Dendritique

CytokinesPro-inflammatoires (TNF, IL1, IL6…)

IFNγ

Ag

Organes lymphoïdes

1) Immunité Innée

Exploration du Complément:

Lyse du GRMesure de l’hémoglobine libérée

GR de mouton + Ac anti GR de mouton

Sérum du sujet contenant le complément

Voie classique

Activation du complexe terminal

GR de lapinVoie Alterne

DO

[C]

50%

Mesure fonctionnelleCH50

Mesure des protéinesdu complément

C3- C4..:NéphélémétrieDosage fonctionnelle

Résultats: Augmentation : processus inflammatoire Diminution : consommation, déficit

Reconnaissance et destruction de la cible par les phagocytes: Ex: PN

CIBLE IgG 1 et 3

C3biC3b

PAMPS et TLR

Etude numérique : NFSEtude fonctionnelle : Mesure de l’expression des molécules d’adhérence

Mesure du mouvement (chimiotactisme)Mesure de la production des formes réactives de l’O2Exploration de la voie des Toll Like Récepteurs

Cellule NK

CD2 CD16CD56

RécepteursInhibiteurs

Récepteursactivateurs+<

Cellule NK

CMH I

NK activée

CMH II

CD25

CelluleTumorale

Ouinfectée

CMH I

Cellule modifiée

tuée

Exploration numérique (cytométrie en flux à l’aide d’Ac spécifiques des molécules distribuées sélectivement sur les NK).

Exploration fonctionnelle (cytolyse).

Processus de maturation

Gram- Gram+ Fungi

Agents pathogènes = NON SOI

cytokines

Virus

C. Dendritique mature:C. Présentatrice de l’Ag

Activation des Lymphos T

CD4CD8C.dendritique immature:phagocytaire

Réponses innées Réponses adaptatives

cytokines

Motifs conservés au cours de l’évolution qui sont reconnus par les récepteurs des cellules de l’I° innée

Tissus Organes lymphoides périphériques

Cellule Dendritique= lien entre Immunité innée et Immunité adaptative

± détruits

I. innée

T CD4Naïf

GATA-3STAT-6

T-betSTAT-4

RORgTSTAT-3

FoxP3

IFNγ

IL4

IL17

TGFβ1

Cellulaire(pathogènes à xIntracellulaire

Humorale(pathogènes à xExtracellulaire

Neutrophile(pathogènes à xExtracellulaire

Régulation Négative

TH1

TH2

TH17

Treg

IL12

IL4

TGFβ1

TGFβ1IL6

2) Immunité adaptativePolarisation de la réponse T

Thymocyte

CD4: TH1 / TH2

APC Naive T cell

Th1

Th2

Co-stimuli IL-2

IL-12

IL-4

IL-2IFNγ

IL-4IL-5IL-10IL-13

Immunité Humorale(pathogènes à xExtracellulaire)

Immunité cellulaire (pathogènes à xIntracellulaire)(virus, bacteria, Leishmania major)

Th0

CD4

2) Immunité adaptativeTH1/TH2

IFN-γ

Th1

IL-2

Th1Th1

IL-2

CTL

IFN-γ

Pré-CTL

IL-12

CD28

TCR Th1

CD80/86

CMH II

CD4

CPA

cible

CD8

TCR CMH I

FasFas- LApoptose

PerforineGranzymes

Lyse

Th1 Th1

Th1

Th1 Th1

Macrophage

IFN-γ

NKIFNγIL-22-1 Immunité cellulaire

CD4

CD8

TCD4 reconnait peptideassocié aux MHC classe II

T CD8 reconnaît peptideassocié aux MHC classe I

CD4

2

B mémoires

Anticorps Plasmocytes

2-2 Réponse anticorps: activation des LymphosB1) Pontage de l’IgM mb par l’Ag signal 1

expression MHC Classe IIB7 (costimulation)

2) LTH2 CD4 reconnaît peptide + MHC IIprésenté par le LB

+ signal de costimulation B7/CD28 Activation LTH2 qui exprime CD40L

Interaction CD40/CD40L signal 2 dans LB3) LTH2 produit des cytokines

LB exprime récepteurs de cytokinesActivation, prolifération et différenciation

des LB

Explorations de l’Immunité adaptative

In VitroNFS= Nombre de lymphocytes circulantsCytométrie en Flux:- Phénotypage lymphocytaire T et B - Marqueurs d’activation lymphocytaire- Marqueurs cellule naïve/cellule mémoireTests fonctionnels:- Prolifération- Production de cytokines- production d’Acs (B) /Tests de cytotoxicité (T)

In VivoProduction d’Acs (B)

Tests d’Hypersensibilité retardé (T)

Numération lymphocytaire dans le sang circulant

Nombre de lymphocytes total dans le sang circulant chez l’adulte : 1000-4000/mm3

Population CD3+= lymphos T: 50 - 80%900-3000 /mm3

Population CD3+/CD4+: 32 - 52%450-1500 /mm3

Population CD3+/CD8+: 20 – 40%300 - 1000 /mm3

Rapport CD4/CD8 : 1-3Population CD19+= lymphos B: 5-20%

100- 450 /mm3

Résultats à interpréter en fonction de l’âge chez l’enfant.

Centrifugation sur unmilieu de séparation de densité d = 1.077

Ficoll-Hypaque

C. Mononucléées

polynucléairesGR

centrifuger

Exploration des Fonctions lymphocytaires

ISOLEMENT DES LYMPHOCYTES-Principe/méthode : - gradient de densité

- récupération d’un anneau cellulaire contenantlymphocytes et monocytes

Proliferation lymphocytaire : principe

Prolifération = reflet global de la capacité de réponse événement tardif

Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS NON SPECIFIQUES

1) Lectines d’origine végétale :liaison à des sucres spécifiques sur la membrane des cellulesT Phytohémagglutinine (PHA)

Concanavaline A (Con A)B/T Pokeweed mitogène (PWM)

2) Ac monoclonaux dirigés contre: des récepteurs membranaires :

capacité d’entraîner l’agrégation de récepteurs membranairesdoivent être préalablement fixés sur un support pour mimer lescontacts intercellulaires

T anti TCRB anti IgM

3) Activation de voies métaboliques impliquées dans la transmissiondes signaux intracellulaires

court-circuitent les signaux membranaires

Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)activateur de PKC

ionomycine = ionophore calciqueactivateur d’enzyme Ca2+ dépendante

Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS NON SPECIFIQUES (suite)

Prolifération polyclonale: capacité générale de réponse selon les voies transductionnelles engagées

Diagnostic d’un déficit Immunitaire sévère

1) Antigènes de rappel :antigènes de vaccination

tuberculineanatoxine tétanique …

antigènes de l’environnementcandidinestreptocoqueCMV…

Mesure la capacité à développer une réponse mémoire spécifique

2) Alloantigènes :d’histocompatibilité (MLR)

Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS SPECIFIQUES

Exploration de l’Immunité Humorale

In Vitro : Dosage des classes d’Igs: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD•Néphélémétrie•ELISA

In Vivo : Production d’Acs spécifiques en réponse à un rappel d’Ag vaccinal.

Numération des Lymphos B (cytométrie) CD19-CD20-Ig de Mb

Etude de leur Production d’Anticorps in vitro

Après une activation par un agent stimulant des lymphocytes B :Récolte des cellulesaprès 6 à 7 jours de culture: ELISPOT

YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y

Y YPAL PAL

substratjaune

violet

YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y

Ac

Marqueurs lymphocytes B

Marqueur fidèle (toutes les populations quelque soit leur niveau d’activation/differenciation : CD19)

Marqueurs de différenciation : CD27-/IgM+/IgD+ naifsCD27+/IgM+/IgD+ mémoire avant commutationCD27+/IgM-/IgD- mémoire après commutation

Explorations de l’Immunité cellulaireIn Vitro

NFS= Nombre de lymphocytes circulantsCytométrie en Flux:- Phénotypage lymphocytaire T: CD3+ CD4+/- CD8+/-- Marqueurs d’activation lymphocytaire (HLA-DR)- Marqueur cellule naïve/cellule mémoire CD45RA+/CD62L+

CD45RA- ou RO+/CD62L+ central mémoireCD45RA- ou RO+/CD62L-effecteur mémoireCD45RA+ ou RO-/CD62L-revertant

Tests fonctionnels:- Prolifération- Production de cytokines- Tests de cytotoxicité

In VivoTests d’Hypersensibilité retardé

2) Mesure de la prolifération lymphocytaire T par2-1-Incorporation de thymidine tritiée 3TH

Expression en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif) par rapport à des normes chez des sujets sains

In Vitro

Activation des cellules en culturenon spécifique / spécifique

Récolte du surnageant de culture après 24 à 48 h

Récolte du culot cellulaire après 18 à 24 h

- Dosage Immunoenzymatique- Dosage Cytométrie en flux

- Quantification des ARNm

Quantification des cellulesCD4+/CD8+ productrices

- Cytométrie en flux- ELISPOT

3)Mesure de la production de cytokines par les cellules immunitaires

In Vitro

3-1- Mesure de la production extracellulaire par technique ELISAIn Vitro

Différents types d’ELISA

Production de cytokines : Méthodes

3-2- Mesure de production intracellulaire :par cytofluorométrie en intracytoplasmique

Activation des cellulesnon spécifique/spécifique

Blocage de la sécrétion

Marquage de membraneAg de surface

Marquage intracellulairecytokine

Lecture en cytométrie de flux

In Vitro

Cellules T activées traitées parun inhibiteur qui bloque letransport des protéines

⇒ blocage des Cytokines dans le RE

Fixation et perméabilisation

des cellules

Pénétration des Acanti Cytokine et liaison aux

Cytokines intracytoplasmiques

d ’après Immunobiology 5, C. A. Janeway

3-2-Quantification des cellules T productrices d’IFNγ après stimulation- par des peptides de 9 aa ⌦ réponse des LT CD8+ spécifiques- par des Ag ou peptides 20 aa ⌦ réponse des LT CD4+ spécifiques

In Vitro

3-3-Numération des cellules secrétrices :par ELISpot (Enzyme Linked Immuno Spot)

Quantification des cellules T productrices d’IFNγ après stimulationpar des peptides de 9 aa ⌦ réponse des LT CD8+ spécifiquespar des Ag ou des peptides de 20 aa ⌦ réponse des LT CD4+ spécifiques

Expression des résultatsen nb de spots/106 cellules mononucléées

YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y

IFNγ

Peptidesou antigène

YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y

Y Y

PAL PAL

substratjaune

violet

In Vitro

4) Test de cytotoxicité :Mesure de la cytotoxicité par relargage de Cr radioactif

1er temps : développement in vitro des cellules effectrices cytotoxiques

coculture- de cellules mononucléées du sang périphérique

- avec des cellules dites stimulantes, irradiées qui possèdent lesantigènes contre lesquels on veut développer des CTL(infection virus recombinant, chargement peptides, transfection gène)

Obtention après 5 jours de cellules cytotoxiques spécifiquesde l’antigène choisi

In Vitro

Cellules cibles marquéesavec du Na2

51CrO4

Addition des cellules Tcytotoxiques

pendant au moins 4H

Cellules cibles tuées larguentLe chrome radioactif

Immunobiology 5, C. A. Janeway

2ème temps : mesure de la cytotoxicité par relargage du 51Crpar des lignées cellulaires exprimant les molécules du CMH identiques aux CTL et l’antigène étudié

Radioactivité libérée proportionnelle au nombre de cellules détruites

In Vitro

IFN-γ

Th1

IL-2

Th1Th1

IL-2

IL-12

CD28

TCR Th1

CD80/86

CMH II

CD4

CPA

Th1 Th1

Th1

Th1 Th1

Macrophage

IFN-γIL-2

Nbs autres cytokines et chimiokines

Après un 1er contact avec l’Ag CD4 TH1 mémoiresSensibilisées à l’Ag:Ex: tuberculine aprèsInfection tuberculeuseVaccination BCG

Hypersensibilité retardéeIn Vivo

Retardé: délai nécessaire à la rencontre de l’Ag avec T spécifiques,proliférationet migration mono/macrophages

Hypersensiblité retardée : Etude in vivo

Injection intra-dermique de tuberculineLecture 48 h et 72 h après l’injection :indurationmesurer le diamètre de l’induration< 5mm = Réaction négative:

Pas de contact antérieur avec BK ou BCGDéficit de la réponse Immunitaire si contact antérieur

> 5mm = Réaction positive: contact antérieureParfois phlycténulaire ou nécrotique: suspicion d’infection

Histologie montre la présence de lymphocytes T et de nombreux monocytes/macrophages

•Hypersensiblité retardée à la tuberculine

•Hypersensibilité à différents Ags présents dans la nature:Candidine etc…

In Vivo