Examen de physique pour la biologieExamen de physique pour la biologie FIP Janvier 2010 Résumé La...

Examen de physique pour la biologie

FIP

Janvier 2010

Résumé

La seconde partie de cet examen porte sur l’article : ReversibleUnfolding of Single RNA Molecules by Mechanical Force de Jan Li-phardt, Bibiana Onoa, Steven B. Smith, Ignacio Tinoco Jr., CarlosBustamante, SCIENCE VOL 292 27 p.733. Durée 3H.

1 Pinces optiques

1.1

Donnez les principes physiques utilisés dans les pinces optiques.Quelles doivent être les caractéristiques des différents composants d’un mon-tage ?Donnez un schéma expérimental en précisant éventuellement quels sont leséléments optiques conjugués et on précisera pourquoi.

On considère un laser focalisé dans un échantillon aqueux pour formerune pince optique agissant sur une bille de 1 µm de diamètre. Cette pincepeut être caractérisée par un puits de potentiel V . On suppose que V est dela forme

V (x) = −Vp exp−δx22a2 (1)

(2)

où δx = x−x0 est l’écart de la position du centre de la bille x par rapportà la position du centre du puits x0, et a = 500 nm la demi largeur du puits.Pour calibrer le système, on mesure les fluctuations quadratiques moyennesde la bille au repos et on observe < δx2 > = 125 nm2 pour une puissancedu laser P =10 mW. On donne la viscosité de l’eau η = 10−3 Pl.

1.2

Déterminer la valeur de la raideur k des pinces optiques.Comment k varie-t-elle en fonction de la puissance du laser ?

1

Examen de physique pour la biologie 2

1.3

Evaluer numériquement la profondeur Vp du puits de potentiel.

1.4

Calculer la force maximale théoriquement applicable par ce piège.Est elle adaptée pour l’étude des moteurs moléculaires ?A quel déplacement δx correspond-elle ?

1.5

Quelle est la fréquence de coupure du mouvement de la bille (on s’inté-ressera uniquement à la zone linéaire du piège) ?En déduire le temps caractéristique du système. Quelle est sa significationphysique ?Comment varie-t-il en fonction de P ?

1.6

En s’inspirant de la stabilité d’une liaison chimique sous contrainte, éva-luer la probabilité qu’une fluctuation thermique fasse sortir la bille de sonpotentiel à force nulle, puis lorsqu’une force F =

√e

2 Fmax est appliquée. Onsupposera que la bille quitte le piège au voisinage du point où F = Fmax.

1.7

Evaluer UN ORDRE DE GRANDEUR de la puissance minimale utili-sable telle que le temps nécessaire pour qu’un évènement de cette nature seproduise soit 100s.

2 Traction sur une molécule d’ARN

En 2001 le groupe de C. Bustamante a pour la première fois tiré sur unemolécule d’ARN. Pour cela le groupe à fixé une molécule d’ARN de séquencedéterminée entre deux brins d’ADN eux mêmes fixés sur deux billes piégéesdans des pinces optiques , voir figure 1.

2.1

Quelle est la force typique pour étirer une molécule d’ADN double brin ?De quelle grandeur caractéristique de l’ADN dépend elle ?En quoi la physique de l’ARN diffère de celle de l’ADN double brin ? Quelssont les points communs ?Pourquoi faire des mesures d’énergie de repliement de molécules d’ARN?

J.F. Allemand, F. Chevy


La figure 2 représente les courbes force-extension obtenues pour une mo-lécule sans insert d’ARN (en rouge !) et une molécule avec insert d’ARN detype P5ab en présence de magnésium. Justifier les différences observées.Que représentent les sauts observés entre 13 et 15 pN et la pente de cessauts ?

2.2 Mesure d’ensemble

Une première mesure consiste à effectuer la transition plié -> déplié plu-sieurs fois. La variation de la force pour laquelle la transition plié -> dépliées’effectue reflète la nature stochastique de ce processus facilité par l’agitationthermique.

Ces mesures permettent de tracer la fraction de molécules dépliées enfonction de la force (voir figure 3). En utilisant la figure 2 en déduire lavariation de longueur typique ∆x(F1/2) et la variation d’énergie libre de latransition observée ∆Gt . F1/2 est la force ou en moyenne la moitié desmolécules sont dépliées.

Que contient cette énergie ? Comment en déduire la variation d’énergielibre de dépliement de l’épingle ?

2.3 Mesure directe

Retrouver ∆Gt par une analyse directe de la courbe de force.

2.4 Mesure temporelle

Comment adapter le dispositif de pinces optiques pour pouvoir travaillerà force constante ?

La figure 4 montre des enregistrements temporels de l’extension du sys-tème obtenus à différentes forces en présence de magnésium. En déduire unetroisième méthode de mesure de ∆Gt.

Quel est l’intérêt de cette méthode par rapport aux autres ?La figure 5 représente la valeur de la constante d’équilibre en fonction de laforce. Comment cette courbe s’obtient-elle à partir des données de la figure4 ?Les données précédentes permettent de mettre en évidence un état de tran-sition distant de δxuf = 11.5nm de l’état déplié et δxfu = 11.9nm de l’étatplié. Comment obtenir ces données à partir des données expérimentales pré-cédentes ?En absence de magnésium ces distances restent similaires mais la force né-cessaire au dépliement passe de 14, 5 à 13, 3pN . Quel est donc l’effet dumagnésium sur la réaction ?



2.5

En tirant sur l’ARN P5abc∆A on obtient le même comportement généralavec les mêmes états de transitions mais suivant le taux de charge il apparaîtmaintenant une hystérésis (cf figure 6). Interpréter physiquement. Quellepeut-être l’origine moléculaire de ce phénomène ?

2.6

On tire maintenant sur le séquence P5abc. Les résultats sont dans la fi-gure 7. Interpréter les résultats, et en particulier pour la figure C on préciseracomment arriver aux résultats présentés dans la légende de l’article.



Fig. 1. (A) Sequence and secondary structure ofthe P5ab, P5abc A, and P5abc RNAs. The fivegreen dots represent magnesium ions that formbonds (green lines) with groups in the P5c helixand the A-rich bulge (3). (B) RNA moleculeswere attached between two 2- m beads with500–base pair RNA:DNA hybrid handles.

Fig. 1 – Schéma de l’expérience : des molécules d’ARN utilisées pour l’ex-périence et schéma du dispositif : 3 molécules d’ARN avec des inserts ayantdes structures secondaires tertiaires différentes. Ces molécules sont hybri-dées à des molécules "poignée" d’ADN simple brin (500 paires de bases),elles-mêmes fixées à des billes.

Fig. 2 – Courbe d’extension obtenue en tirant sur un des ARN de la figure1 P5ab.



Fig. 3 – Proportion de molécules dépliées en fonction de la force.

Fig. 4 – Traces temporelles de l’extension en fonction du temps à différentesforces



Fig. 5 – Constante d’équilibre en fonction de la force

Fig. 6 – Courbes d’extension obtenues à différents taux de charge.



Fig. 3. (A) Stretch (blue) and relax (green) force-extension curves for P5abcin 10 mM Mg2 . Inset, detail of P5abc stretching curves showing unfoldingintermediates (red stars). (B) Comparison of P5abc force-extension curves inthe presence and absence of Mg2 . (C) The force-distribution of unfolding of

the first kinetic barrier at loading rates of 1 and 10 pN s 1. Best fit (leastsquares) values, xf3 u 1.6 0.1 nm, k0 2 10 4 s 1. (D) Lengthversus time traces for P5abc in EDTA (12). (E) Length versus time traces ofP5abc in 10 mM Mg2 . (F) Model for P5abc’s unfolding by force in Mg2 .

Fig. 7 – Résultats sur la séquence P5abc.


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