Evaluation Qualitative Et Quantitative Des Ac A
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EVALUATION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DES
ACIDES AMINES
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METHODES CHROMATOGRAPHIQUES.
METHODES ELECTROPHORETIQUES.
DOSAGES SPECIFIQUES.
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CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER.
CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE.
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE.
CHROMATOGRAPHIE SUR ECHANGEUR DIONS.
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Les protines: purification
La chromatographie est une technique de sparation qui utilise un support
qui possde des proprits physico-chimiques particulires.
Ce support va retenir les protines en fonction de critres variables.
- en fonction de la charge des protines.
- en fonction de leur affinit pour des molcules (ligands).
- en fonction de leur taille.
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Chromatographie sur colonne: rservoir
colonne
phase stationnaire
Solvant
(phase mobile)
collecteur
-
Les protines: purification
Chromatographie dchange dions:
La phase stationnaire est compose dune rsine qui peut tre
- charge positivement (changeuse danions)
- charge ngativement (changeuse de cations)
Les interactions molcules-colonne vont dpendre de la charge des
molcules. Ces interactions pourront tre modules par le pH et la force
ionique (concentration en sels) du milieu.
CH2
C
O
O
CH2
SO3-
C2H
4N
+
C2H
4
C2H
4
H
-
Exemple dune purification par change de cations: sparation de 3 acides amins Ser, Asp et Lys
- tape 1: la colonne (charge ngativement) est quilibre avec
une solution faiblement concentre en sels.
Les cations de la solution (ici Na+) vont se fixer sur les charges
ngatives de la phase stationnaire.
SO3-
Na+
Bille de rsine
-
- tape 2: la solution contenant le mlange des molcules sparer est
dpose sur la colonne.
Ce sont les molcules prsentes en plus grande concentration qui se
fixent la colonne.
Ici, les groupement chargs positivement vont se fixer la colonne la
place des ions Na+
Asp
Lys
Ser
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3+
COO-NH3+
NH3+ CH COO-
CH2
COO-
NH3+ CH COO-
CH2OH
-
- tape 3: On lue (on rince) la colonne avec une solution de NaCl un peu
plus concentre.
Les ions Na+ tant plus nombreux que prcdemment ils vont entrer en
comptition avec les acides amins pour se fixer sur la colonne.
Ils vont remplacer tout dabord les acides amins les moins positifs.
NH3+ CH COO-
CH2OH
NH3+ CH COO-
CH2
COO-
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3+
COO-NH3+
Asp
Lys
Ser
-
Les Protines: Purification
- tape 4: On augmente la concentration en NaCl de lluant.
La concentration en Na+ tant plus forte, seuls les acides amins les plus
chargs vont rester fixs la colonne.
NH3+ CH COO-
CH2OH
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3+
COO-NH3+
Lys
Ser
-
- tape 5: On augmente encore la concentration en NaCl de lluant.
Les ions Na+ sont en large excs, ils vont remplacer toutes les molcules
qui taient encore sur la colonne.
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3+
COO-NH3+
Lys
-
Les Protines: Purification
On a rinc la colonne avec un gradient de concentration en NaCl
1 2 3 4
1-2: On dpose le mlange, les molcules les plus charges se fixent tout
de suite alors que les moins charges se fixent plus bas.
3-4: On rince la colonne avec une solution de NaCl de concentration
croissante. On dcroche successivement les diffrentes molcules.
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Les protines: purification
Dans lexemple prcdent on a modifi la force ionique de lluant pour
dcrocher les diffrents acides amins.
On aurait galement pu modifier le pH de lluant et garder une
concentration en NaCl constante. En fonction de leur pKa respectifs les
acides amins auraient chang de charge et se seraient dcrochs de la
colonne.
Le principe est strictement le mme pour une protine.
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Chromatographie daffinit: On greffe sur la colonne une molcule qui
interagit de faon spcifique avec la protine que lon veut purifier.
1-2: Quand on met le mlange sur la colonne, seule la protine qui peut interagir avec le ligand se fixe.
3-4: Pour dcrocher la protine de la colonne, on lue avec une solution contenant le ligand.
Les protines: purification
21 3 4
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Chromatographie de permation sur gel (ou dexclusion):
On parle aussi de tamisage molculaire car cette technique spare les
protines en fonction de leur taille.
La colonne est remplie de billes poreuses. Les petites molcules pourront
passer par ces pores et entrer dans les billes alors que les grosses
molcules en seront exclues.
Les petites molcules vont donc perdre du temps dans les billes alors
que les grosses molcules vont trs vite traverser la colonne.
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Les protines: purification
retard
lution avec le
volume mort
(Vm)
grosses
molcules
excluespetites molcules
incluses
Chromatographie de permation sur gel
billes poreuses
Avec ce type de chromatographie, il ny a pas dinteractions directes
entre la phase stationnaire et les molcules.
ce sont les molcules les plus grosses qui migrent le plus vite.
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Les protines: purification
Dtection des protines:
On utilise les proprits dabsorption de la lumires des acides amins aromatiques.
Ces acides amins absorbent la lumire 280 nm
On pourra ainsi dtecter la sortie de toutes les protines de la colonne.
dtecteur280nm
Volume dlution
absorption
Pour savoir o se trouve la protines recherche il faudra doser son activit
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REACTION A LA NINHYDRINE.
Detecteur uv .
Enregistreur + Trace.
temps de rtention (min)
DO 215 nm
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L'lectrophorse est une technique biochimique de sparation fonde sur le fait que des molcules portant des charges lectriques diffrentes migrent des vitesses diffrentes lorsqu'elles sont places dans un champ lectrique.
llectrophorse est devenue une technique de routine dans les laboratoires o on lutilise pour sparer notamment les protines et les acides nucliques.
Llectrophorse des protines peut tre ralise sur des supports varis, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel dagarose
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Deux facteurs vont influencer la migration des protines: leur
charge et leur taille. Plus la protine est charge plus sa migration
sera importante. Au contraire plus la protine sera grosse moins
sa migration sera importante.
Le sens de migration de la protine va dpendre de son pI (point
isolectrique). En fonction du pH la protine sera charge
positivement ou ngativement, elle migrera donc vers lanode (charge +) ou la cathode (charge -).
migration protines charges - migration protines charges +
dpt
anode + cathode -
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Cuve pour lectrophorse clinique
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Prparation du gel et dpt des
chantillons
Les gels supports
prts l'emploi sont
constitus d'une mince
couche d'agarose
coule sur un support
plastique de 100 mm
x 75 mm permettant
leur manipulation
aise.
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Une fois le gel sorti de son
emballage, la zone de dpt est
essore avec une bande de papier
filtre pour faciliter la diffusion des
chantillons lors du dpt.
Essorage de la zone de dpt
La bande est ensuite retire et jete et on
dispose la mme place un masque de
dpt form d'une bande de plastique comportant 10 fentes.
Mise en place du masque de dpt
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Dpt des chantillons Essorage du liquide en excs
Un volume de 5 L des chantillons
analyser est dpos sur les fentes et
abandonn pendant 5 minutes pour
assurer leur diffusion au niveau de la
zone de dpt.
Le liquide non absorb par le gel est
ensuite essor avec une autre bande
de papier filtre et le masque de dpt
est jet.
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Gel en place dans la cuve
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Phase de migration
Le gel est alors mis en place dans la cuve et puis aprs fermeture du couvercle et
mise en marche de lalimentation, la migration des protines dmarre
La tension applique au gel et le temps de migration dpendent de la nature des
chantillons analyser.
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Ensemble du dispositif d'lectrophorse
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Fixation et coloration
Une fois la migration lectrophortique termine, le gel est plong pendant deux minutes dans le
fixateur (acide alcool), sch puis plong
pendant trois minutes dans le colorant.
Une succession de bains dans la solution de dcoloration permet ensuite d'liminer la
coloration du fond de faon faire apparatre les
bandes correspondant aux diverses protines
spares.
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Dcoloration du fond
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Le gel est ensuite sch ce qui
permet de le conserver dans de
bonnes conditions.
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lecture
peut se faire l'oeil nu (analyse qualitative)ou par densitomtrie (enregistrement de
l'absorbance en fonction de la distance de
migration) ; dans ce cas, l'intgration des
pics permet une analyse quantitative des
fractions.
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Trac densitomtrique du
protinogramme d'un srum humain
normal