Evaluation Externe de la Qualité pour améliorer le Diagnostic

Moléculaire des Tumeurs SolidesCancer du poumon et du côlon

 Réunion Biomarqueurs Grand EstStrasbourg, 3 et 4 mai 2013

Dr Etienne RouleauInstitut Curie, Paris - France

http://www.fotocommunity.de/pc/pc/cat/9479/display/30415918

Critères de performances

Critères de performanceRéponse clinique• Objectif : identification des tumeurs sensibles au traitement

– Identification des cancers colorectaux KRAS sauvages

– Identification des cancers du poumon EGFR mutés

DIAG

Anti-EGFR : <2%

Anti-EGFR : 43% [28-57]

Taux de réponse

F Di Fiore et al British Journal of Cancer (2010) 103, 1765–1772.

Anti-EGFR : 10%

Taux de réponse

Critères de performanceRéponse clinique

Dahabreh et al Ann Intern Med. 2011;154:37-49.

45 publicationsSe 0.49 (CI, 0.43 to 0.55)Sp 0.93 (CI, 0.87 to 0.97).

Critères de performanceUn unique test ?

Critères de performance

Linardou H et al The Lancet Oncology 9,2008 : 962-972

Ex2 bi-ds : 34,4% (87/253)Se 0,47 [0,35-0,60]Sp 0,87 [0,62-0,96]

AD : 37,6% (225/598)Se 0,48 [0,42-0,54]Sp 0,99 [0,89-1,00]

Critères de performanceHétérogénéité des méthodes

(1) Taqman

(2) HRM

(3) Pyroséquençage

(4) SNAP Shot

(5) Séquençage direct

Di Fiore F et al. British Journal of Cancer (2007) 96, 1166 – 1169

(5) (4)

(3)

(2)

(1)Spathis A et al. Anticancer Res. 2010 Jun;30(6):1969-75.

Critères de performanceHétérogénéité des méthodes

HRM/sequencing

Pyrosequencing

Sanger Sequencing

Snap Shot

Total

Allele specific (Taqman…)

3748

2457

1913

1926

16 300

5133

35%

37%

37%

42%

38%

40%

65%

63%

63%

58%

62%

60%

6%

4%

5%

10%

5%

3%

Other methods 1123 38% 62% 3%

Data 2009 INCA – on declaration - 946 patients without any technique informationKRAS+ : muted KRAS, KRASwt : wild-type KRAS, NC : non contributive

Nomber of patients KRAS+ KRASwt NC

Critères de performanceHétérogénéité des méthodes– KRAS

Sensibilité minimale Total0-5 4

5-10 1310-15 1915-20 120-25 10>30 1Total 48

Méthode(s) utilisée(s) TotalTaqman et apparenté 11

HRM/Séquençage 9Pyroséquençage 8

Séquençage 9SNaPshot/extension 6

HRM/Pyroséquençage 3HRM/Taqman 2

HRM/Séquençage/Taqman 1Taqman/Sanger 1

Total 50

Nombre de méthodes Total1 332 163 1

Total 50

Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses KRAS, B) Sensibilité globaledéclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse.

A) B)

C)

5 participants utilisent au moins un kit commercialTherascreen KRAS Pyro (Qiagen - CE-IVD) / COBAS KRASAutres sociétés impliquées : 11 Life Tech, 6 Qiagen, 3 Roche

111+48-11-94

Critères de performanceMéthodes maisons – KRAS

tggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGtGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAgGCAAgAGTGcCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACgAATATGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgatacagataaaggtttctctgaccattttcatgagtacttattacaag

121 paires de bases homologuesTableau : Distribution des amplicons en fonction des amorces déclarées dans le cadre du STIC MOKAECM. En majuscule, région avec une forte homologie sur la partie codante du gène KRAS.

Critères de performanceHétérogénéité des méthodes– KRAS

2009 MOKAECM

2012 EQA

Séquençage Sanger 27% 18%Taqman 16% 22%HRM/Sanger or Pyro 13% 24%Pyrosequençage 13% 16%SnapShot 12% 12%Combinaisons 20% 8%

Tableau : Evolution des techniques utilisées pour le génotypage KRAS en France entre le STIC MOKAECM en 2009 et l’EEQ 2012.

Critères de performanceHétérogénéité des méthodes – EGFR exon 21

Exon 21 TotalHRM/séquençage 10Taqman 9pyroséquençage 8Séquençage 7Snapshot/séquençage 2Taqman/séquençage 2digestion enzymatique 1HRM/pyroséquençage 1HRM/Taqman/séquençage 1pyroséquençage/Taqman 1SNaPshot/pyroséquençage 1Taqman/Snapshot 1Non renseigné 1Total 45

Nombre de méthodes (exon 21) Total1 262 183 1

Total 45

Sensibilité exon 21 Total0-5 5

5-10 910-15 1415-20 420-25 1025-30 1Total 43

A) B)

C)

Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses EGFR exon 21, B) Sensibilité globale déclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse.

Critères de performance

Un laboratoire = une technique

un protocole

Plusieurs laboratoires = une techniqueun protocole

Plusieurs laboratoires = plusieurs techniquesplusieurs protocoles

Critères de performance

• Quelle est la performance réelle des analyses moléculaires KRAS and EGFR au niveau national ?

• Plusieurs facteurs : techniques (AS/DS), protocoles / SOP, organisation du laboratoire

• Critère principal : Réponse au traitement• Critères indirectes

– Statistique des mutations - Sans biais de sélection : ERBB2, KRAS- Avec un biais de sélection : EGFR

- Validation de méthode : limite de détection- Contrôles internes de qualité- Contrôles externes de qualité

GGT GGC34

35

38

(AS) (DS)

Programme

KRAS & EGFR EQA

OrganisationContexte

• Bonne pratique de laboratoire• Preuve de la compétence• Accréditation des laboratoires• Nombreux tests « maisons »• Suite de MOKAECM / ERMETIC• Ne pas confondre EEQ et CQI• EEQ et leurs recommandations

Recommandation ESPISO17043

OrganisationProgramme participatif

LeuvenNijmegen

AFAQAPCurie

Partner Platforms

Joint partners

Reference Platforms

OrganisationProgramme participatif

• Plateformes partenairesEGFR– Ile de France Ouest - Hôpital de FOCH (Dr DENOUX – Plateforme HUVEGEN), – Centre Hospitalier Universitaire de Nancy (Pr VIGNAUD), – Paris - Hôpitaux Paul Brousse-Bicêtre-Antoine Béclère (Pr LEMOINE), – Lille – Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH), – Clermont – Centre Jean Perrin (Pr PENAULT-LLORCA), – Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET), – Marseille – Assistance-Publique des Hôpitaux de Marseilles (Pr OUAFIK)

KRAS– Bordeaux - Institut Bergonier (Pr SOUBEYRAN), – Centre Hospitalier Universitaire de Nice (Dr PEDEUTOUR), – Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET-Dr LE MARECHAL), – Paris - Hôpital Ambroise Paré (Pr EMILE), – Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH), – Centre Hospitalier Universitaire de Rouen (Pr SABOURIN), Lyon - Centre Léon Bérard (Dr

WANG)

• Plateforme de référence : Nijmegen laboratory (H van Krieken, M M.Ligtenberg)

Envoi du statut moléculaire des blocs sélectionnés

Plateformes partenaires

AFAQAP

Institut Curie

Louvain (Leuven)Laboratoires participants

Envoi de 4 blocs sélectionnés et validés

Accord pour la mise en place des lots de lames

Réalisation de lots validés

Retour des réponses

Résultats individuelsNimègue (Nijmegen)

Comité de pilotage

Confrontation des résultats avec le statut moléculaire initial

ANONYMISATION

AN

ON

YM

ISA

TIO

N

Expert moléculaire

Expert pathologique

Expert qualité

Blocs (échantillons primaires)

Lames pour valider l’homogénéité

Sélection des blocs

x48Coupes des lames

Préparation des lots

Envoi des lots

x48

x1 x1 x1

x4810x3 lames

OrganisationPourquoi 10 échantillons ?

Réception des lots

Lame HE

Macrodissection

Extraction ADN

Détermination moléculaire

Validation technique

Validation biologique

Interprétation des résultats

Etape préanalytiqueRelecture histologique

Etape analytiqueRéalisation de l’analysemoléculaire

Etape postanalytiqueRéalisation du compte-rendu

Scan des lames HE

Résultats brutsImage des résultats

Compte-rendu d’analyse

10x3 lames

14

jou

rs

EGFRwt EGFRm

OrganisationMatériel de référence

Contrôle de tout le processus

= spécimen biologique

Prêt à l’emploi

Reproductible

Quantité disponible

Stabilité dans le temps

Tout

Identique

Lames

A valider

Limitée

Limitée

Consentement / éthique Oui

Eventail de situation Limité

Partiel

Partiel

Oui

A valider

Limitée

Limitée

Oui

Limité

Partiel

Non

Oui

Oui

Illimitée

Oui

Non

Important

Tout / partiel

Proche

Lames

Oui / à valider

Illimité

Oui

Non

Important

ADNExtrait

Bloc artificiel

ADNPlasmides

CEQCIQ

Calibrateur

OrganisationPérimètre et objectifs

Bloc3 lames 6µ

HES

Analyse histologique

Analyse moléculaire

Sélection du matérielEnrichissement

Choix technologiqueProcess analytique

ADN

OrganisationParticipants

• Participation nationale

• 45 EGFR / 50 KRAS participants– EGFR : 4– KRAS : 9– EGFR & KRAS : 41

• 450 EGFR et 500 KRAS cas (3 lames)

RésultatsGENOTYPE

GénotypeBilan des erreurs

• 9 erreurs concernant 8 participants

• KRAS – 4 erreurs– 3 participants avec au moins 1 erreur (6%/50)– 0 participant avec une erreur de génotype grave

• EGFR– 5 erreurs– 5 participants avec au moins 1 erreur (11%/45)– 4 participants avec une erreur de génotype grave

GénotypeBilan des erreurs

• 4 erreurs avec des conséquences thérapeutiques– Un faux positif (1 EGFR « activating mutation ») : -2 points– Deux faux négatifs (2 EGFR) : -2 points– Un échec d’amplification (1 EGFR exon 21 mutation) : -2

points

• 5 erreurs sans conséquence thérapeutique– Erreurs de mutation (2 KRAS – 1 EGFR) : -2 points– Un échec pour un KRAS muté (1 KRAS muté) : -2 points– Une erreur d’échantillon sur le rapport (1 KRAS muté ) : -1

point

GénotypeSensibilité et spécificité nationale

Tables : Résultats globaux des EEQ KRAS et EGFR.

EGFR 18/20 20/20 % succès Totallot1 2 21 91% 23lot2 3 19 86% 22

Total 5 40 89% 45

KRAS 16/20 18/20 19/20 20/20 % succès Totallot1 1 24 96% 25lot2 1 1 23 92% 25

Total 1 1 1 47 94% 50

KRAS Sensibilité : 100% Spécificité : 100%0% erreurs avec un impact thérapeutique

EGFR Sensibilité : 98,7% Spécificité: 99,6%0,89% erreurs avec un impact thérapeutique

Génotype Données de la littérature

• UK NEQAS EGFR – Deans ZC, et al. J Clin Pathol 2013;66:319–325.– 3 rounds 2010-2011: Erreurs : 24% - 6,7% - 6,4%– 49 participants dernier round

• UK NEQAS GIST KIT/PDGFRA– Wong et al. J Clin Pathol 2012;65:786–790.– 13%, 33%, 19% et 4% (2008-2011)– 8 à 16 participants

GénotypeExactitude du génotype

• Description de la délétion– EGFR : délétion sans description (7 cases)– EGFR : erreurs de génotype (13 cases)

• Echantillon EGFR : B200– Mutation : c.2239_2248delinsC, p.Leu747_Ala750delinsPro– c.2240_2254del, p.Leu747_Thr751del– c.2238_2249delinsP, p.Leu747_Ala750delinsPro– c.2239_2247del ; p.Leu747_Glu749del– c.2236_2248delinsGAAC, p.Leu747_Ala750delinsPro

• Echantillon EGFR : B484– Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del– c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del

• Echantillon EGFR : B009– Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del– c.2240_2254del, p.Leu747_Thr751del

Génotype Sur-interprétation ?

Echantillon EGFR B110– Non exclusion– 4/23 soit 17% d’échec– Interprétation : échec ou sauvage– Laboratoire de référence : échec– Curie / Partenaire : sauvage

0

1

2

3

4

5

6

30 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100

NC

Percentage of neoplastic cells B110 EGFR (NC : test failure)

No

mb

re d

e p

arti

cip

ants

Génotype Sur-interprétation ?

Importance d’avoir des seuils d’interprétation

RésultatsDELAI DE RENDU

Délai de réponseApproche analytique

• Le délai de réponse de chaque participant sera évalué entre l’arrivée des échantillons au laboratoire et la validation du rendu des résultats sur le site internet: celui-ci étant idéalement de 10 jours (en référence aux nécessités cliniques), l’analyse comparera le résultat du laboratoire par rapport à l’ensemble des laboratoires français.

• Délai : réception du colis – soumission sur le site– EGFR - moyenne 16,6 jours– KRAS - Moyenne 14,6 jours

Délai de réponseProgramme KRAS

0

2

4

6

8

10

12

4-7 8-9 10-11 12-13 14-15 16-17 18-19 20-21 22-23 24-25 26-27 28-29

Délai en jour

No

mb

re d

e p

arti

cip

ants

Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ KRAS (classe 5).

32/50

Délai de réponseProgramme EGFR

0

2

4

6

8

10

12

8-9 10-11 12-13 14-15 16-17 18-19 20-21 22-23 26-27 28-29

Délai en jours

No

mb

re d

e p

arti

cip

ants

Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ EGFR (classe 5).

27/45

Délai de réponseCorrélation KRAS et EGFR

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40

Délai KRAS

Déla

i EG

FR

Figure : comparaison des délais de rendu pour lesparticipants aux deux programmes EGFR et KRAS

Dél

ai E

GF

R

RésultatsCOMPTE-RENDU

Comptes-rendusApproche analytique

• Les comptes rendus fournis par les participants sont analysés systématiquement en vue de formuler des recommandations d’amélioration ; l’évaluation portera sur l’interprétation, les données saisies et la présence de plusieurs items selon les recommandations de l’INCa

• Grille des contrôles EQA Européens

• Anonymisation de tous les comptes-rendus

• Double lecture de tous les rapports

Comptes-rendusInterprétation

KRAS

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Résultat du génotype Information pourl'interprétation

Interprétation durésultat

c.34G>T (p.Gly12Cys)

c.35G>A (p.Gly12Asp)

WT

Figure : Score des items correspondants à l’interprétation (évaluation sur trois dossiers).

% d

es r

épon

ses

corr

ecte

s

Comptes-rendusInterprétation

EGFR

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Résultat du génotype Information pour l 'interprétation Interprétation du résultat

WT

c.2235_2249del

c.2239_2248delinsC

Figure : Score des items correspondants à l’interprétation (évaluation sur trois dossiers).

% d

es r

épon

ses

corr

ecte

s

Comptes-rendusScore EQA ESP (/4.5)

Comptes-rendusScore EQA ESP - KRAS (/4.5)

0

2

4

6

8

10

12

0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25 2,5 2,75 3 3,75 4,25

Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ KRAS.

12/50

Comptes-rendusScore EQA ESP - EGFR (/4.5)

-

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 0,25 0,5 0,75 1,5 1,75 2 2,25 3 3,75

Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ EGFR.

9/45

Comptes-rendusPoints à améliorer

Moins de 50% de participants avec l’item– Sous numéro d'échantillon : numéro de coupe– Nombre de lames : 3– Raison de la prescription : « mise sous

traitement »– Limite de détection de la technique– Pagination– Date de prélèvement– NM séquence de référence

Cellularité

Estimation de la cellularitéCellularité KRAS

010

20304050

607080

90100

12A

002

12A

008

12A

012

12A

045

12A

061

12A

099

12A

100

12A

114

12A

181

12A

204

12A

280

12A

409

12A

410

12A

449

12A

808

12A

840

Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2013(ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)

Estimation de la cellularitéCellularité EGFR

0102030405060708090

100

12B

003

12B

004

12B

009

12B

018

12B

042

12B

092

12B

108

12B

110

12B

140

12B

200

12B

249

12B

400

12B

484

12B

501

12B

660

12B

800

12B

890

Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2012(ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)

Estimation de la cellularité

Facteurs de performance

Données statistiques Lien entre activité et délais de rendu

0

5

10

15

20

25

10-99 100-249 250-499 500-999 1000-2999

Number of labs

Turnaround time

Nombre d’analyse KRAS par an

Données statistiques Participation à des EEQ - KRAS

Impact sur le score du compte-renduEEQ en general pas d'impact 71%EEQ régional NS négatif oui 67,5% vs non 72,38%EEQ Europeen NS meilleur oui 74% vs 70%CQ EQA NS meilleur oui 75% vs 70%

Participation à un EEQ régional Total KRASnon 39oui 11

Total 50

Participation à un EEQ européen Total KRASnon 32

ESP KRAS EQA 11EMQN 3CAP 1

EMQN/ECAT 1UKNEQAS 1

ECAT 1Total 50

Participation à un autre EEQ Total KRASNON 23OUI 27Total 50

Tables : Participation à un autre EEQ pour l’analyse KRAS

Données statistiques Participation à des EEQ - EGFR

Participation à un EEQ régional Total EGFRNon 30oui 15

Total 45

Participation à un EEQ européen Total EGFRNon 38

EQA/EMQN 6UKNEQAS 1

Total 45Participation à un autre EEQ Total EGFRNON 24OUI 21Total 45

Impact sur le score du compte-renduEEQ en général NS plutôt négatif 72% non et 70,17% ouiEEQ régional NS plutot neg 72% non et 69% ouiEEQ européen NS oui 73,5% vs 71,4% non

Tables : Participation à un autre EEQ pour l’analyse EGFR

Données statistiques Accréditation / certification

3 participants avec l’analyse dans la portée d’accréditation

Accréditation Total EGFRNon 35Oui 5Total 40

2 participants avec l’analyse dans la portée d’accréditation

Tables : Nombre de participants accrédités ou certifiés – portée d’accréditation

Accréditation Total KRASNon 40Oui 5Total 45

Conclusion

Conclusion

• Performance nationale– KRAS 100%– EGFR <100%– Hétérogénéité des méthodes

• Spécificité du programme français– Programme participatif national – Matériel de référence : 3 validations– Animation d’un réseau

• Facteur de performance– Activité (pas sur le génotype)– Participation à des EEQ

ConclusionPerformance n’est pas que l’EEQ

• Importance d’un travail commun d’amélioration et d’homogénéisation des pratiques

• Nécessité d’une intégration européenne

• Nécessité d’un matériel qualifié– Contrôle de qualité externe– Contrôle de qualité interne

• Nécessité de recommandation d’interprétation– Bases de données de mutations– Mise en place d’un réseau d’essai fonctionnel

• Vers une approche multiparamétrique

BIOMARKERTESTING

accreditation

IQC

SOP

EEQ

ConclusionApproche multiparamétrique

Harris TJ, McCormick F. Nat Rev Clin Oncol. 2010 May;7(5):251-65. Epub 2010 Mar 30.

Breast cancerAmplification ERBB2

GISTMutations c-KIT

Mutations PDGFRα

Colorectal cancerMutations KRASMutations BRAF

Thyroid cancerMutations KRASMutations BRAF

Lung CancerMutations EGFR

Amplification EGFRMutations KRAS

Translocation EML4-ALK

MelanomaMutations BRAF

…

ConclusionApproche multiparamétrique

ConclusionApproche multiparamétrique

KRAS BRAF HER2 PIK3CAALK

translocationMET

amplification

Réponses 91% 89% 52% 72% 2% 2%

46 42 41 24 33 1 1

BRAF MSI PIK3CAMethylation du promoteur de

MLH1DPYD/UGT

Réponses 57% 36% 18% 9% 2%44 25 16 8 4 1

Tableaux : Réponses au questionnaire d’inscription pour les paramètres à ajouterà l’EEQ 2013. A) Cancer du colorectal, B) Cancer du poumon, C) EEQ d’extraction

EEQ d'extraction

Non

Réponses 82% 18%51 42 9

A)

B)

C)

ConclusionApproche multiparamétrique

• Fournisseur d’EEQ – Identification du matériel– Qualification du matériel

• Vérification de la qualité et du génotype• Technique médiane• Validation externe• Validation NGS (PGM – AmpliSeq Côlon / Poumon)

• EQA 2013– 56 Participants : 46 EGFR – 50 KRAS– Approche multiparamétrique

• KRAS, BRAF, MSI• EGFR, KRAS

– Amélioration de la qualification• 10 mutations validées• 10 variants supplémentaires d’intérêt détectables

Programme KRAS & EGFR

Jean-François Emile

Yves Denoux

Pierre Laurent-Puig & Hélène Blons

Cédric Le Marechal & Laurent Doucet

Jean-Marc Guinebretière – Xavier Sastres

Antoinette Lemoine

Karen Leroy

L’houcine Ouafik

Florence Pedeutour & Paul Hofman

Frederique Penault-Llorca

Jean-Christophe Sabourin

Isabelle Soubeyrans

Jean-Michel Vignaud

Qing Wang

Fahrid Zemerich

AFAQAP

Jean-Pierre Bellocq

Caroline Egele

Dominique Fetique

Institut Curie

Catherine Noguès

Ivan Bièche

Catherine Andrieu

Chloé Derouet

Frédéric Maraone

Audrey Margogne

Departement of Pathology of the Radboud University Nijmegen Medical Centre

Han van Krieken

Marjolijn Ligtenberg

Institut National du Cancer

Etienne Lonchamps

Frédérique Nowak

Biomedical Quality Assurance Research unit of the University of Leuven Els DequekerSilke Sterck

Lien Tembuyser

Merci pour attention !

Plateforme NGSThomas Rio FrioVirginie Bernard Quentin Leroy