Études non-cliniques (non-clinical studies) en vue du développement

de nouvelles molécules Évaluation de la sécurité des

médicaments

(principes actifs, excipients)

Introduction

• Evaluation de la sécurité = objectif principal du développement non clinique des médicaments

• Les études non cliniques précédent ou accompagnent le développement clinique

• Il n'est pas possible d'attendre l'ensemble des résultats des études toxicologiques avant d'administrer la molécule pour la première fois à l'homme (phase I)

Découverte Identification et Optimisation des

Leads (20 molécules, X années)

2009 2019

Développement théorique

Phase I Phase II Phase III Études cliniques

Études non-cliniques (animales)

Préclinique

Études animales long terme

Déclaration (AFSSAPS, CPP) IND (FDA)

AMM NDA

IND : investigational new drug application NDA : new drug application

Quand doit-on réaliser les études non-cliniques ?

• Recommandations : Cf ICH M3(R2) (décembre 2009) et ICH S9 (mai 2010)

• Objectifs – Assurer la sécurité des volontaires sains ou des patients

participant aux essais cliniques – Evaluation du rapport bénéfice/risque lors de l’analyse du

dossier d’AMM

• Etudes à réaliser avant phase I (pré-requis toxicologiques = études précliniques)

• Etudes à réaliser avant phase II ou III • Etudes à réaliser au cours de la phase III

Contexte général des études non-cliniques

• Les études non cliniques ont un impact sur le développement clinique

• Problème des faits nouveaux de toxicologie

• Ces études ne sont pas réalisées uniquement dans un but réglementaire

• Stratégie de développement non clinique

Aspects réglementaires

• Directives européennes

– 75/318/EEC

– 91/507 EEC

– 2001/83/CE

– 2009/120/CE

• Notes for guidance (EMA)

• Guidances for industry (FDA)

Guidelines ICH (International Conference on Harmonisation)

• Buts

– Harmoniser

– Réduire les différences entre les exigences des différentes agences réglementaires (Europe, USA, Japon)

• Organisation prenant en compte

– Les objectifs des différentes agences

– L’avis des représentants de l’industrie

The common technical document (CTD)

CTD module 2

Le CTD module 4 (M4S ICH guideline)

Réglementation applicable aux essais pharmaco-toxicologiques

• Il est nécessaire de recueillir des informations scientifiques indiscutables – compétence des expérimentateurs – qualité des protocoles

• Nécessité d’une reconnaissance mutuelle d’un pays à un autre – Directives européennes – Directives F.D.A. – Réglementation japonaise – Autres (Taiwan, Corée du Sud…)

• Bonnes pratiques de laboratoire – Arrêté du 20 janvier 1986 (BPL dans le

domaine de la toxicologie expérimentale)

• Expérimentation animale – Décret 87-848 du 19 octobre 1987 relatif aux

expériences pratiquées sur les animaux – Arrêté interministériel du 19 avril 1988 fixant

les conditions d’attribution de l’autorisation de pratiquer des expériences sur les animaux

Bonnes pratiques de laboratoire en toxicologie

• Historique – fraudes découverts par la FDA (années 60)

– premier document relatif aux GLP (1978-FDA)

– instruction du 31/5/1983 (France)

• Que définissent les règles de BPL – L’organisation du laboratoire et les responsabilités

– Le programme d’assurance de qualité (audit interne)

– Les niveaux de qualité des installations, des appareils, des réactifs

– Les conditions de stockage, réception et utilisation des produits à étudier

– La codification des procédures opératoires

– Les conditions d’exécution de études (protocoles, conduite des études)

– Le mode de rédaction du rapport

– Les modalités d’archivage

...

• Animaleries agrées – Structures de la firme

– Sous-traitants spécialisés

• Les pharmaciens inspecteurs de la santé ont pour mission d’effectuer des inspections dans des conditions définies

Expérimentation animale en toxicologie

• Evaluation de la sécurité – Médicaments

– Cosmétiques

– Produits phytosanitaires, …

• 7° amendement de la directive cosmétique impose des dates butoirs pour tests sur ingrédients de cosmétiques – 11 mars 2009 (sauf études en doses répétées,

toxicocinétique et toxicité pour la reproduction)

– 11 mars 2013 (toutes études)

L’expérimentation animale

nécessité, contraintes et méthodes dites substitutives

LA MOITIÉ DES FRANÇAIS SONT HOSTILES À L'EXPÉRIMENTATION ANIMALE

• Un français sur deux admet que les animaux soient utilisés dans la recherche contre le sida

• 57 % dans la lutte contre le cancer

• 38 % et 33 % dans le domaine de la recherche de médicaments contre la douleur et l'anxiété.

• Grande majorité d’hostiles aux expérimentations sur les animaux en cosmétologie (79 % des femmes et 81 % des hommes)

Les arguments contre l’expérimentation animale (1)

• Les animaux souffrent – Souvent faux (sauf étude sur douleur)

– La douleur fausse les résultats

• Le nombre d’animaux utilisé est trop élevé – partiellement vrai (2,2 millions/an en France dans

l’industrie)

– nombre en baisse (7 millions en 1980) mais augmentation récente

– cosmétiques < 1 %

Augmentation de l’utilisation des animaux à sang froid poissons en particulier

Catégories d’animaux

Objets des expériences

Animaux utilisés en toxicologie et pour évaluation de la sécurité

Les arguments contre l’expérimentation animale (2)

• Les données obtenues ne sont pas extrapolables à l’homme – Parfois vrai

– Essai sur plusieurs espèces

– Les conventions d’Helsinki et de Tokyo interdisent les essais directs sur l’homme

• Les expérimentations sont redondantes – parfois vrai

Relevance of Animal Testing for Toxicity in Humans

• Retrospective analysis of the pharmaceutical industry: concordance of animal and human toxicities: – Rodent (rat, mouse) + non-rodent (rabbit, dog, monkey):

71% – Non-rodent alone: 63% – Rodent alone: 41% (in 6/10 cases rodent toxicity does not

predict human tox) – Highest concordance : hematological, gastrointestinal, and

cardiovascular toxicities – Lowest concordance : cutaneous toxicity

* Olson et al., Regul toxicol pharmacol, 2000.

Les arguments contre l’expérimentation animale (3)

• Il existe des méthodes alternatives (de substitution, complémentaires)

– Vrai mais méthodes parfois non validées à ce jour (rôle de l’ECVAM)

– Ces méthodes sont de plus en plus utilisés quand cela est possible

• L’homme n’est pas une grosse souris, mais encore moins une grosse cellule en culture

L’expérimentation in vivo demeure une nécessité au moins dans certains cas

• Les techniques in vitro ne sont pas encore suffisamment validées et n’apportent pas toutes les informations

• La multiplicité des mécanismes de régulation et d’interactions entre cellules ou entre organes sont difficiles à reproduire in vitro

Advantages of in vitro tests

• Controlled testing conditions

• Reduction of variability between experiments

• Testing is fast (and cheap)

• Small amount of test material is required

• Human cells and tissues can be used

• Transgenic cells carrying human genes can be used

• Reduction of testing in animals

Limitations of in vitro tests

• General toxic effects cannot be assessed (e.g. weight reduction)

• In vivo dose-responses cannot be obtained (for human risk assessment)

• Interactions between tissues and organs cannot be tested

• Toxicokinetics cannot be evaluated

• Specific organ sensitivity cannot be assessed

• Chronic effects cannot be tested

EXTRAPOLATION DE L'ANIMAL À L'HOMME

• Pose souvent un problème

• Importance des études toxicocinétiques comparées

• Intérêt de l'étude de la variabilité inter-espèce du métabolisme

• Importance d'un choix rationnel des espèces.

Expérimentation animale : CHOIX DES ESPÈCES (généralités)

• Aucune espèce ne peut donner tous les résultats attendus.

• On s'adresse systématiquement à deux espèces au moins, dont une non-rongeur et une rongeur (attitude discutée dans certains cas)

LE RAT

• Espèce la plus utilisée pour les études de toxicologie réglementaire.

• Inconvénient : on ne peut prendre que peu de sang.

• Utilisé pour les études aiguës et chroniques

• Survie normale de souches utilisées en routine : 24 à 30 mois.

• Souches principales de rats utilisés en toxicologie : Sprague-Dawley, Fisher 344, Wistar, Long Evans

LA SOURIS

• Petite taille = inconvénient majeur.

• Avantages : prix peu élevé, facile à loger et à manipuler, peu de produit à distribuer.

• Deuxième espèce de choix (après le rat) pour les études de cancérogénèse expérimentale

• Souches les plus utilisées : CD-1 (Charles River), souche B6C3F pour les études de cancérogenèse.

LE LAPIN

• Lapin blanc Néozélandais.

• Etudes d'irritation de la peau et des yeux (existence de tests alternatifs)

• Très utilisé dans les études de tératogenèse

– sensibilité au Thalidomide

– faible nombre de couches cellulaires du placenta laissant passer les produits dans le foetus et induisant les effets embryo- ou foetotoxiques.

LE CHIEN

• Chien de race Beagle.

• Espèce la plus utilisée comme deuxième espèce non rongeurs pour les études de toxicologie subaiguë et chronique.

• Animal de choix pour les études de Toxicocinétique,

• Etudes d'inhalation

LES PRIMATES

• Les animaux de capture dans leur pays d'origine ne sont plus utilisés

• Elevage : animaux sains, d'âge connu

• Le Marmoset : inconvénient petite taille

• Le Cynomolgus est fréquemment utilisé en toxicologie comme seconde espèce non rongeurs ou parfois dans les études de reproduction.

AUTRES ESPÈCES

• Le porc (comme deuxième espèce non rongeurs).

• …

Place de la pharmacocinétique animale dans le dossier d’AMM

Bioanalyses

Validation des méthodes de bioanalyse

• Publication (mai 2001) d’un « guideline » (FDA) bioanalytical validation

• 2011 : guideline européen

• Applicable – Etudes de pharmacocinétique clinique

– Etudes non cliniques

– Toutes techniques (chromatographique, immunologique, microbiologique…)

– Tous milieux biologiques (sang, tissus…)

Différents types de validation

• Validation complète

• Validation partielle

• Cross-validation

Sélectivité

• Éviter les interférences avec

– Composés endogènes (hormones…)

– Composés exogènes fréquents (caféine, nicotine…)

– Métabolites

– Impuretés

– Co-médications

• Tests à réaliser pour les concentrations basses (LOQ)

Limite de quantification (LOQ)

• 5 fois le bruit de fond

• Réponse reproductible (CV < 20 %)

• Justesse 20 % de la valeur cible

Justesse et Précision

• Trois niveaux de concentration au moins (B, M, H)

• Justesse 15 % de la valeur cible 20 % à la LOQ

• CV < 15 %, 20 % à la LOQ

– Inter-série

– Intra-série

Stabilité

• Lumière

• Température

• Congélation/décongélation

Mais aussi : (nouveau)

• Effet Matrice

• Incurred sample reanalysis

• Dilution integrity

Contrôles de qualité

• Au moins 3 niveaux en double

• Au moins 4/6 à 15 % de la cible

• Si deux CQ en dehors de ces valeurs il ne doivent pas appartenir au même niveau

Objectifs des études de pharmacocinétique animale

• Décrire les différentes étapes ADME

• Support des études toxicologiques et pharmacodynamiques – Relations concentration effets

• Expliquer les variations inter-espèces – Mise en évidence de l’espèce la plus proche de l’homme

• Prédire certaines interactions médicamenteuses (induction, inhibition enzymatique) : attention aux extrapolations

• Mise en évidence des phénomènes d’accumulation…

• Des données (au moins partielles) de pharmacocinétique animale doivent être disponibles avant les premières administrations chez l’homme

• Il est souhaitable d’obtenir des informations sur le métabolisme le plus rapidement possible

Etudes des processus ADME

• Deux espèces (les mêmes qu’en tox)

• Plusieurs doses (mise en évidence des phénomènes de non linéarité)

• Dose unique vs doses répétées (mise en évidence des phénomènes de non stationnarité)

• Petits animaux : 3-4 animaux poolés/temps

• Estimation des paramètres pharmacocinétiques de base : Cmax, tmax, AUC, t1/2

• Description du métabolisme aussi complète que possible

• L’utilisation de molécules radiomarqués et la collection des urines et des fèces permettent la réalisation de bilan d’excrétion

Absorption

• Quantité et vitesse

• biodisponibilité

Distribution

• Tissue distribution studies

• Protein binding and distribution in blood

cells

• Placental transfer studies

Les études de distribution chez l’animal

• En dose unique

• En doses répétées (éventuellement)

• Chez la femelle gravide (éventuellement)

• Utilisation de molécules radiomarquées – 3H, 14C (+++)

– Avantage : facilité de mesure

– Inconvénient : on ne distingue pas toujours produit inchangé et métabolites

• Autoradiographie

autoradiographie

Diffusion dans les tissus lymphoïdes

Walker DK, Xenobiotica 2008

Distribution du maraviroc dans les tissus lymphoïdes associés à l’intestin chez le rat

Distribution du maraviroc chez le rat

Walker DK, Xenobiotica 2008

Distribution dans la circulation lymphatique comparable chez le rat et l’homme

Intérêt des techniques PET (Positron emission tomography)

Di Mascio et al. 2009

Distribution du tenofovir (PET)

Di Mascio et al. 2009

Liaison protéique

• Etude in vitro

• Différentes espèces dont l’homme

• Techniques

– dialyse à l’équilibre

– ultrafiltration

Metabolisme (comparison inter-espèces )

• Structures chimiques et quantités des métabolites dans les échantillons biologiques

• Schéma des voies métaboliques

• Métabolisme pré-systémique (effets de premier passage hépatique et intestinal)

• Métabolisme in vitro (rôle des cytochromes P450)

• Induction enzymatique et inhibition

Etudes in vivo

• Animal

• Molécule marquée

• Intérêt des techniques analytiques récentes

– LC/MS, LC/MS/MS

– LC/NMR

Etudes in vitro

• Métabolisme

– Hépatocytes, microsomes, systèmes d’expression hétérologue

– Animaux, humains

– Description

– Inhibition

– Induction

– Mise en évidence des isoformes de cytochromes P450 impliquées

Exemple de la mise en évidence du rôle du CYP3A4 dans le métabolisme de la vinorelbine (drug metab dispos, 2000, 28:

1121-7)

Mise en évidence des phénomènes d’induction enzymatique chez l’animal

• Traitement pendant quelques jours (rat en général)

• Obtention de microsomes hépatiques

• Mesure d’activités enzymatiques représentatives – E.R.O.D. (CYP1A)

– P.R.O.D. (CYP2B)

– …

• Ces études métaboliques doivent idéalement être conduites avant la phase III

• Conséquences sur le « labeling » – Exemple : ce médicament est métabolisé par le

CYP3A4, bien que des études cliniques n’aient pas été conduites, des interactions avec le kétoconazole, l’érythromycine… sont probables

Excrétion

• Voies et intensité de l’excrétion

• Excrétion dans le lait

Études d’interaction médicamenteuses

• Prédiction ?

• Problèmes de pertinence

Autres études pharmacocinétiques

• Études chez animaux pathologiques (insuffisance rénale…)

• Études non obligatoires