République Algérienne Démocratique et PopulaireMinistère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORAN

FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Mémoire présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Magister en BiologieAnimale.

Option : Embryogenèse et Oncogenèse

Evaluation de l’activité sulfhydryl oxydase/quelescine Q6(SQX/Q6) humaine dans les lignées cellulaires du cancer

broncho-pulmonaire.

Présenté par :

Mademoiselle SEDDIKI Lamia

Soutenue le :

Devant le Jury composé de :

Pr. EL KEBIR Fatima Zohra Président Université D’Oran

Dr. SAHRAOUI Tewfik Directeur Université D’Oran

Pr. SLIMANI Miloud Examinateur Université D’Oran

Pr. AOUES Abdelkader Examinateur Université D’Oran

Année Universitaire 2008-2009

1

Remerciements

Je remercie Dr Sahraoui Toufik pour m’avoir encadrée tout le long de ce travail et pour

le temps qu’il m’a consacré pour réussir ce stage.

Je tiens à remercie tout les membres de jurys qui ont accepté de juger mon travail.

Je tiens à remercie vivement tout les membres de ma famille de leur présence, de leur

soutien :

Mon père, Ma mère et tous mes frères et sœurs.

Et enfin je remercie toute personne qui m’a aidé de loin ou de près dans la réalisation de

ce travail

2

SUMMARY

The broncho-pulmonary cancer is a major problem of public health because of its prognosis and its

more frequency, from where tobacco and the pollution are the first reasons. Our work carried on a

functional survey of the quiescin– sulfhydryl oxidize/ (SOx/Q6). The results of the epidemiological

Oran region shows that tobacco is the leading cause of development of lung cancer in this region, plus

the majority of patients present with advanced disease. The quiescin– sulfhydryl oxidase is the

enzymes that catalyze the formations of the bridges disulfide. Their secretion has been studied

according to the cellular formation. While using the DTT as substrate, we valued oxydative activity in

the supernageant of human lung fibroblasts (WI38) and of lung the epithelial tumoral cells lines non–

small– cells. The analyses of western - blot shows two types of SOx/Q6 a long and the short one at the

WI38. However, the analyses of western - blot of the middle with 10% FBS show the presence of the

bovine SOx/Q6, it is confirmed by the oxydative activity.

On the other hand, the results show that the secretion of the SOx/Q6 varies according to the tumoral

cells lines either : i) a secretion that increases at the time of the proliferation, ii)a secretion that

increases at the time of the confluence, iii) secretion that increases the after - confluence.

Keywords: Sulfyhydryl oxydase. Human quiescin Q6. Oxidative activity. Secretion. Lung cancer.

3

RESUME

Le cancer broncho-pulmonaire est un problème majeur de santé publique en raison de son pronostic

et de sa grande fréquence, d’où le tabac et la pollution sont les premières causes. Notre travail a porté

en premiers sur l’étude épidémiologique de la région oranaise et en second sur l’étude fonctionnelle de

la sulfhydryl oxydase/quiescine Q6 (SOx/Q6). L’ensemble des résultats épidémiologique de la région

oranaise montre que le tabac est la première cause de développement du cancer broncho-pulmonaire

dans la région, de plus la majorité des patients se présentent au stade avancé de la maladie.

Les sulfhydryls oxydases/ quiescine Q6 sont des enzymes qui catalysent les formations des ponts

disulfure. Leur sécrétion a été étudiée en fonction de la formation cellulaire. En utilisant le DTT

comme substrat, nous avons évalué l’activité oxydasique sécrétée dans les surnageants de fibroblastes

pulmonaire (WI38) et des lignées cellulaires tumorales épithéliales non à petites cellules. Les analyses

de western–blot montrent deux types de SOx/Q6 une longue et l’autre courte chez les WI38.

Cependant, les analyses de western –blot du milieu avec 10% SVF montrent la présence de la SOx/Q6

bovine, cela est confirmé par l’activité oxydasique.

D’autre part, les résultats montrent que la sécrétion de la SOx/Q6 varie en fonction des lignées

cellulaires tumorales soit une sécrétion qui augmente au moment de la prolifération, soit une sécrétion

qui augmente au moment de la confluence, soit sécrétion qui augmente l’après–confluence.

Mot clé: Sulfhydryl oxydase. Quiescine Q6. Activité oxydasique. Sécrétion. Cancer broncho-

pulmonaire

4

Sommaire INTRODUCTION .................................................................................................................................... 9

CHAPITRE I ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................... 11

I.1 Anatomie et structure des poumons ................................................................................................... 12

I.1.1 Physiologie des poumons ........................................................................................................... 13

I. 1.1.1 Les échanges gazeux ........................................................................................................... 13

I.1.1.2. La ventilation ....................................................................................................................... 13

I.1.1.3 Les centres respiratoires ....................................................................................................... 13

I.1.1.4 Les voies nerveuses .............................................................................................................. 14

I.1.1.5 La mécanique ....................................................................................................................... 14

I.1.2 Embryologie ............................................................................................................................... 15

I.1.3 Histologie .................................................................................................................................... 18

I.1.3.1 Conduction de l’air .............................................................................................................. 19

I.1.4 Le poumon périphérique ............................................................................................................. 21

I.1.4.1 Zone de conduction .............................................................................................................. 21

I. 1.4.2 Zone de transition ................................................................................................................ 22

I.1.4.3 Zone d’échanges gazeux ...................................................................................................... 22

I.1.4.4 L’épithélium alvéolaire ........................................................................................................ 23

I.2.Etiologie et épidémiologie du cancer des poumons .......................................................................... 25

I.2.1 Définition du cancer ................................................................................................................... 25

I.2.2 Le cancer broncho-pulmonaire ................................................................................................... 26

I.2.3 Etiologie ...................................................................................................................................... 26

I.2.3.1 Les principales causes du cancer broncho-pulmonaire ........................................................ 26

I.2.4 Epidémiologie descriptive du cancer des poumons .................................................................... 31

I.2.4.1 Cancer des poumons en Algérie ........................................................................................... 31

I.2.4.2 Cancer des poumons en France ............................................................................................ 32

I.2.4.3. Cancer des poumons en Canada .......................................................................................... 32

I.2.5. Épidémiologie analytique .......................................................................................................... 33

I.3.Anatomie pathologique des cancers broncho-pulmonaire ................................................................. 35

I.3.1 Classification des cancers broncho-pulmonaire ......................................................................... 35

I.3.1.1 Cancer bronchique épidermoïde ........................................................................................... 35

5

I.3.1.2 Cancer bronchique à petites cellules .................................................................................... 35

I.3.1.3.Adénocarcinome bronchique est divisé en 4 sous-groupes histologiques ........................... 37

I.3.1.4. Epithéliome bronchique à grandes cellules ......................................................................... 38

I.3.1.5 Carcinomes adénosquameux ................................................................................................ 38

I.3.2 Diagnostic du cancer broncho-pulmonaire ................................................................................. 39

I.3.2.1. Les signes cliniques ............................................................................................................. 39

I.3.2.2. Signes radiologiques ............................................................................................................ 41

I.4. Introduction à la famille de la sulfhydryl oxydase ........................................................................... 42

I.4.1. La famille de la sulfhydryl oxydase ........................................................................................... 42

I.4.2. Structure de la sulfhydryl oxydase/Quiescine Q6 .................................................................. 45

CHAPITRE II MATERIELS ET METHODES ..................................................................................... 47

II.1 L’étude épidémiologique du cancer pulmonaire de la région oranaise ........................................ 48

II.2 Matériel biologique ...................................................................................................................... 49

II.2.1 Lignées cellulaires .................................................................................................................. 49

II.3. Préparation d’anticorps spécifiques dirigés contre la sulfhydryl oxydase de rat ........................ 49

II.3.1 Extraction des anticorps anti-sulfhydryl oxydase de rat à partir de jaune d’œuf de poule .... 49

II.3.2 Purification des anticorps spécifiques anti-sulfhydryl oxydase de rat par chromatographie

d’affinité .......................................................................................................................................... 50

II.3.3 Electrophorèse sur gel polyacrylamide 12% en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) ....... 51

II.3.4 Western blot et révélation par chimioluminescence .............................................................. 51

II.4 Mesure de l’activité oxydasique des sulfhydryl oxydases ........................................................... 52

II.4.1 Principe de dosage de l’oxydation du DTT par le DTNB ...................................................... 52

II.4.2 Mesure de l’activité oxydasique des surnageants de culture ................................................. 53

II.4.3 Analyse de l’activité protéasique à cystéine .......................................................................... 54

II.5 Analyses statistiques ................................................................................................................. 54

RESULTATS .......................................................................................................................................... 55

DISCUSSION ......................................................................................................................................... 69

CONCLUSION ET PERSPECTIVES .................................................................................................. 75

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................ 77

Annexe ................................................................................................................................................... 82

6

Abréviations

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ARNm : Acide Ribonucléique Messager

ATCC : American Type Culture Collection

dNTP : désoxynucléosides 5’ triphosphate

DTNB : Acide 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoïque

DTT : Dithiothréitol

ERV : Essential for Respiration and Viability

IFN- : Interféron gamma

MEM : Minimum Essential Medium

Mr : Masse moléculaire relative

NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate, forme réduite

pb : paire de base

PCR : Polymerase Chain Reaction

PDI : Protéine Disulfure Isomérase

RPMI 1640: Roswell Park Memorial Institute

rSOx: Sulfhydryl oxydase de rat

SOx/Q6: Sulfhydryl oxydase quiecine Q6

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

SVF : Sérum du Veau Fœtal

TAE : Tris Acétate EDTA

TRX : Thiorédoxine

TNM : T : la taille de la tumeur, N : l’existence d’adénopathies satellites, M : métastases

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Liste des figures

Figure 1 : Description anatomique des poumons

Figure 2 : Description anatomique des poumons et des bronches

Figure 3 : Schéma représente les modifications morphologiques des poumons en état

d’inspiration et d’expiration

Figure 4 : Une coupe microscopique d’un tissu pulmonaire périphérique.

Figure 5 : Représentation de la structure de la barrière alvéolaire.

Figure 6 : Poumon périphérique : zone d'échanges gazeux

Figure 7: Les étapes d’évolution d’une tumeur maligne.

Figure 8 : Dissection d'un poumon cancéreux.

Figure 9 : Effet multiplicateur du tabagisme et de l’exposition à l’amiante sur le risque relatif de

cancer du poumon.

Figure 10 : Schéma d’activation du récepteur EGFR par l’EGF

Figure 11 : Taux de mortalité due au cancer du poumon, hommes et femmes

Figure 12 : Biopsie d'un poumon souffrant de carcinome à petites cellules

Figure 13 : Adénocarcinome bronchique iconographie.

Figure 14 : Structures protéiques de la thiorédoxine, de la protéine disulfure isomérase, de la

sulfhydryl oxydase/Quiéscine Q6

Figure 15 : Schéma représentant l’activité de la sulfhydryl oxydase/QuiescineQ6 (SOx/Q6).

Figure 16 : Purification des anticorps IgY anti SOx/Q6 par chromatographie.

Figure 17 : Réaction d’oxydation du DTT catalysée par la sulfhydryl oxydase de rat.

Figure 18 : Réaction du DTNB avec les thiols libres.

Figure 19 : Répartition des cas recensés en fonction de la localisation du cancer pulmonaire.

Figure 20 : Répartition des cas étudiés en fonction de l’âge.

Figure 21 : La répartition des cas étudiés selon le stade d’évolution du cancer broncho-

pulmonaire.

Figure 22 : Répartition des cas en fonction du type histologique du cancer broncho-pulmonaire

les plus représentatifs de la région oranaise.

Figure 23 : Purification des IgY anti-rSOx spécifiques par chromatographie d’affinité.

Figure 24 : Analyse de la pureté des IgY spécifiques par affinité sur gel de polyacrylamide à

12%.

Figure 25 : Analyse par western blot du seuil de détection de rSOx par les IgY spécifiques.

Figure 26 : Analyse par Western blot de la reconnaissance de la sulfhydryl oxydase/quiescine Q6

humaine par les IgY spécifiques.

8

Figure 27: Analyse par Western blot de la présence de sulfhydryl oxydase dans le sérum de veau

fœtal.

Figure 28 : Activité oxydasique de la sulfhydryl oxydase de rat.

Figure 29 : Activité oxydasique du milieu de culture contenant le sérum de veau fœtal.

Figure 30 : Les activités oxydasiques corrigées des surnageants des lignées cellulaires

pulmonaires

Figure 31 : Les activités oxydasiques corrigées des surnageants des lignées cellulaires

pulmonaires.

Figure 32 : Comparaison des activités oxydasiques entre les lignées cellulaires et la WI38.

Figure 33 : Comparaison des activités oxydasiques entre les lignées cellulaires.

Figure 34 : Comparaison des activités oxydasiques entre les lignées cellulaires.

9

INTRODUCTION

Le cancer broncho-pulmonaire est la première cause de mortalité par le cancer dans le monde, dont

15 000 en Algérie, 22 000 en France et 19 000 au Canada. En Algérie les chiffres s’avèrent

inquiétants. La première cause en est le tabagisme.

Les études ont montré une relation positive et fortement significative entre le cancer broncho-

pulmonaire et le tabagisme. La fumée de cigarette est constituée de 4 000 produits chimiques, dont la

plupart sont cancérigènes. L’exposition permanente des cellules des poumons (les pneumocytes) à la

fumée engendre des changements moléculaires irréversibles tel que le dérèglement des systèmes

détoxification et antioxydants.

La mortalité causée par le cancer du poumon est trois fois plus élevée chez les femmes que chez les

hommes. Cependant la mortalité chez les hommes a stagné, ou a régressé légèrement par apport aux

femmes [1]. La gravité de la maladie est due au diagnostique tardif au stade métastatique. La majorité

(80 %) des cas de cancer broncho-pulmonaire correspond à des tumeurs non à petites cellules.

Par ailleurs, les connaissances épidémiologiques étiologiques, et histologiques se sont affinées. Les

données biologiques concernant la cancérogenèse, les mécanismes d’invasion locale et de métastases à

distance ont eu leurs retombées dans le domaine des cancers intra thoraciques.

Environs 80% des cas de cancer broncho-pulmonaire correspondent à des tumeurs non à petites

cellules (NSCLC). On distingue en particulier l’adénocarcinome et le carcinome épidermoïde qui sont

les formes les plus représentées. Les profils d’expression géniques de ces deux types majeurs de

cancer font apparaître des changements moléculaires avec en particulier une surexpression de gènes de

détoxification ou antioxydants [2].

Les sulfhydryls oxydases SOx sont des enzymes qui catalysent la réactiond’oxydation de résidus thiol

par l’oxygène moléculaire pour former des ponts disulfures. Les substrats des ceux type d’enzyme

peuvent être deux protéines ou deux péptides et dans ce cas le pont disulfure permet leur dimérisation.

De plus, les ponts disulfures peuvent être formé à partir de résidus cystéyls d’une et permet son

repliement.

La SOx/Q6 est impliquée dans le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules. Dans ce contexte,

l’objectif de notre travail, d’estimer l’expression de SOx/Q6 dans les lignées tumorales pulmonaires

modèles par analyse du niveau de sécrétion de SOx/Q6 humaine à différents stades de prolifération par

mesure de l’activité oxydasique.

Dans ce contexte, notre travail est réparti en deux. La première partie de ce mémoire est la partie

bibliographique composée de trois chapitres, le premier chapitre est consacré aux généralités sur les

poumons et les bronches du point de vu embryologique, anatomique et physiologique, le deuxième

chapitre traite les phénomènes lésionnels bénins et malins, et un dernier chapitre traite l’étiologie et

épidémiologie du cancer des poumons.

10

La deuxième partie, la partie paratique est consacrée au travail pratique, l’evaluation de l’activité

enzymatique de la SOx/Q6, puis une exposition des resultats suivie de la discussion. Et nous terminons

par une conclusion générale et les perspectives.

11

CHAPITRE I ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

12

I.1 Anatomie et structure des poumons

Les deux poumons sont situés dans la cage thoracique et séparés l'un de l'autre par un

espace, le médiastin (où se trouvent le cœur, l'œsophage et les gros vaisseaux).

Chaque poumon a grossièrement une forme conique, avec

un apex qui remonte jusqu'à la base du cou,

une face latérale convexe qui s'applique contre la paroi thoracique,

une base concave qui repose sur le diaphragme,

et une face interne plaquée contre le médiastin qui reçoit en sa partie médiane, le hile, la

bronche souche, branche de division de la trachée, les vaisseaux sanguins et les nerfs.

Chaque poumon est entouré d'une enveloppe, la plèvre, composée de deux feuillets étroitement

appliqués l'un sur l'autre et se réunissant au niveau du hile, en formant une sorte de sac sans

ouverture autour d'une cavité virtuelle, la cavité pleurale. Le feuillet externe de la plèvre étant

lui-même accolé à la paroi thoracique, la cavité pleurale qui permet le glissement des poumons

lors de chaque mouvement respiratoire. [3]

Les poumons sont anatomiquement séparés en lobes par des " scissures ", visibles sur leur face

externe.

Le poumon droit compte trois lobes, supérieur, inférieur et moyen,

Le poumon gauche deux seulement, supérieur et inférieur.

Figure 1 : Description anatomique des poumons

A : Poumons dans la cage thoracique. 1) lobe supérieur droit ; 2) lobe moyen droit ; 3) lobe

inférieur droit ; 4) lobe supérieur gauche ; 5) lobe inférieur gauche. B : ensemble de poumons :

(1) trachée, (2) bronches souches (3) [Encarta 2008]

13

Les artères pulmonaires, issues du cœur droit et contenant du sang pauvre en oxygène mais

chargé en gaz carbonique, pénètrent dans les poumons au niveau du hile comme les bronches

souches. Elles se divisent en artères lobaires puis segmentaires et, de façon parallèle à la

ramification bronchique, par divisions successives, elles se terminent à la surface des alvéoles

en un fin réseau de capillaires. Le sang libère le gaz carbonique et se charge d'oxygène, le

transport gazeux se faisant à travers la barrière alvéolo-capillaire. Au-delà, les capillaires se

réunissent à nouveau pour former le réseau veineux pulmonaire, qui aboutit aux veines

pulmonaires, lesquelles se jettent dans l'oreillette gauche. [3]

I.1.1 Physiologie des poumons

I. 1.1.1 Les échanges gazeux

L’oxygène et le gaz carbonique se déplacent entre l’aire et le sang par simple diffusion, c’est à-

dire d’une zone de haute pression à une zone de faible pression partielle. La loi de Fick établit

que la quantité de gaz qui traverse une couche de tissu est proportionnelle à la surface de cette

couche et inversement proportionnelle à son épaisseur. La barrière gaz-sang est extrêmement

mince, et sa surface est comprise entre 50 et 100 m². Elle est par conséquent bien adaptée à sa

fonction d’échange gazeux.

I.1.1.2. La ventilation

C'est un processus qui va permettre les échanges gazeux entre l'air et les alvéoles pulmonaires.

La réserve d'oxygène dans les poumons est à peine suffisante pour couvrir les besoins de

l'organisme pendant deux minutes. Au bout de deux minutes, on va avoir des lésions plus ou

moins importantes de certains organes et surtout au cerveau. Il faut renouveler l'air en

permanence contenu dans les poumons. Cette fonction de ventilation doit se faire sans arrêt

tout au long de la vie, elle est vitale. La fonction de ventilation est dite automatique. Elle est

sous la dépendance de cellules nerveuses appelées centres respiratoires.

I.1.1.3 Les centres respiratoires

Ils sont situés au niveau du bulbe rachidien et de la protubérance annulaire. On distingue les

centres inspiratoires et les centres expiratoires. Ces deux centres sont sous la dépendance d'un

système régulateur. Les cellules des centres inspiratoires ont une activité rythmique et adresse

régulièrement des incitations motrices aux nerfs des muscles inspiratoires. Ces cellules sont

aussi sous la dépendance de différents facteurs qui contrôlent, régularisent et adoptent l'activité

des centres. Facteurs: émotions, vomissements, volonté, hyperthermie, effort.

14

I.1.1.4 Les voies nerveuses

a) Les voies afférentes. Ce sont des voies qui partent du poumon et vont vers les centres

bulbaires. Il y a trois voies afférentes.

Les voies d'origine pulmonaire. Il y a le nerf pneumogastrique (10eme

paire de nerf

crânien). Ces voies transmettent les messages du poumon qui sont captés par des récepteurs

périphériques (mécanorécepteur) aux centres bulbaires.

Les nerfs de Héring et Cyon. Ils transmettent des informations d'origine chimique. On les

appelle chémorécepteurs. Comme ils donnent un petit peu d'informations sur les tensions et les

pressions, appelés aussi les « baro-recepteurs ».

Figure 2 : Description anatomique des poumons et des bronches

(Encyclopédie Encarta 2008)

b) Les voies efférentes. Elles vont du cerveau aux poumons. Leur rôle c'est d'agir sur les

muscles lisses des bronches et sur les muscles respiratoires.

I.1.1.5 La mécanique

Il y a deux éléments importants: les muscles et la cage thoracique. La ventilation se fait grâce à

l'augmentation et à la diminution du volume de la cage thoracique qui permet l'introduction et

le rejet de l'air par différences de pressions (pour que l'air puisse entrer jusqu'aux alvéoles

pulmonaires, il faut que la pression qui règne à l'intérieur des poumons devienne plus basse que

la pression de l'atmosphère). Un adulte a en moyenne 16 mouvements ventilatoires par

minutes. L'air inhalé qui arrive aux alvéoles est appelé alvéolaire. Il n'a plus la même

composition que l'air ambiant (figure 3).

15

Figure 3 : Schéma représente les modifications morphologiques des poumons en état

d’inspiration et d’expiration

I.1.2 Embryologie

Le poumon des vertébrés prend son origine embryologique dans une excroissance de

l'œsophage, la vessie natatoire, et est donc formé d'endoderme (doublé secondairement de

mésoderme pour la vascularisation). Le poumon des Oiseaux est très modifié formant une série

de tubes entre deux sacs aériens où l'air circule dans un seul sens (contrairement aux autres

poumons où l'air fait des mouvements de va-et-vient au cours d'un cycle inspiration/expiration).

Il existe également des « poumons » chez les invertébrés qui ne sont pas homologues des

poumons de vertébrés, puisqu'ils sont formés par invagination de l'ectoderme. On les trouve

chez les Chélicérates (araignée, scorpion) et chez les Gastéropodes Pulmonés (escargot) où

c'est la cavité palléale qui joue le rôle de poumon, communiquant avec l'extérieur par un petit

orifice appelé pneumostome. D'une manière générale, les poumons permettent une respiration

en milieu aérien tout en évitant la déshydratation [3].

- Embryologie des voies aériennes profondes

On se limitera à une étude succincte du développement embryonnaire des voies aériennes

profondes, le développement des voies aériennes supérieures ayant été inclus dans la mise en

place du splanchnocrâne.

- Organogénèse

Cette période s’étend de la fin de S3 (après la mise en place de l’embryon tridermique) jusqu’à

la fin du deuxième mois. Durant cette courte période, environ 95 % des organes sont

préformés. Au niveau de l’appareil respiratoire, cela se traduit par la mise en place des voies de

conduction [9].

16

- Arbre broncho-pulmonaire

Il dérive de l’entoblaste du tube digestif primitif antérieur. Dès J22 apparaît sur la face ventrale

du tube digestif primitif antérieur une évagination, en forme de gouttière, le diverticule

respiratoire ou bourgeon bronchique. Ce diverticule se développe en direction ventrale et

caudale tout en se divisant par dichotomie. Toutes les structures des épithéliales pulmonaires

dérivent de l’entobalste.

- Le tissu conjonctif

Il dérive naturellement du mésoblaste. Du fait des plicatures embryonnaires, le tube digestif

primitif est composé de deux tubes coaxiaux, l’entoblaste, central, entouré d’un tube de

mésoblaste. Ce mésoblaste périentoblastique est tout naturellement entraîné par le diverticule

respiratoire et sera à l’origine de toutes les structures conjonctives des voies aériennes

profondes :

Voies aériennes : chorion de la muqueuse, les cartilages

Mésenchyme pulmonaire : mésenchyme axial associé à l’arbre bronchique, les grandes

cloisons conjonctives intra-pulmonaire

Conjonctif du parenchyme : interstitium interalvéolaire

La plèvre provient des lames latérales du mésoblaste :

- Splanchnopleure : feuillet viscéral

- Somatopleure : feuillet pariétal

- La vascularisation

Le diverticule respiratoire entraîne aussi avec lui la vascularisation du tube digestif primitif.

Cette vascularisation, issue du système aortique dorsal (4ème et 6ème arcs aortiques), va

accompagner le développement de l’arbre bronchique, mais lui restera restreinte, préfigurant la

circulation bronchique (qui appartient à la grande circulation).

Ultérieurement, un deuxième réseau, issu du tube cardiaque, va se développer. Il va migrer tout

au long de l’arbre bronchique pour coloniser plus tard le parenchyme. Il constitue la circulation

pulmonaire ou petite circulation [9].

- Histogénèse

Cette période va de la fin de S8 (2ème mois) jusqu’à la naissance. Elle correspond à la période

foetale, caractérisée par une croissance pondérale et une maturation histologique qui se traduit

par une différenciation cellulaire, chaque cellule développant les fonctions spécifiques du tissu

auquel elle appartient.

17

Au niveau de l’appareil respiratoire, cette période correspond à l’achèvement de la mise en

place des voies de conduction et surtout par la différenciation de la zone d’échange.

- Arbre bronchique

La croissance, avec division dichotomique, se poursuit jusqu’à S16 ou l’on atteint le stade

bronchiole terminale (16ème génération de division). Cela correspond à un envahissement des

cavités pleurales, formées dès S5 par le septum transversum, les plis pleuro-péricardiques et les

membranes pleuro-péritonéales)

- Zone d’échange

De S16 à S18, chaque bronchiole terminale va donner naissance à deux ou plusieurs

bronchioles respiratoires.

A S28 (6ème mois), les cellules épithéliales des ramifications distales de cet arbre bronchique

s’aplatissent. Elles se différencient en pneumocytes (I et II) qui sont les cellules spécifiques de

l’épithélium alvéolaires. Ces portions distales constituent alors les bronches trapues,

précurseurs des futurs sacs alvéolaires. Cette différenciation commence au niveau de l’apex et

se propage jusqu’au niveau des bases (sens cranio-caudal). Un mois plus tard, les pneumocytes

II ont définitivement acquis la capacité de synthétiser et de sécréter le surfactant alvéolaire.

L’appareil respiratoire est désormais fonctionnel ; il ne restera plus, à la naissance, qu’à laisser

pénétrer l’air dans l’appareil respiratoire (1er cri), ce qui va déployer les sacs alvéolaires, grâce

au surfactant alvéolaire, et à résorber le peu de liquide qui les remplissait durant la vie in utero

[3].

- Réseau vasculaire pulmonaire :

Lors de la différenciation des bronches trapues, le réseau pulmonaire se densifie dans le

mésoblaste voisin, donnant un réseau capillaire très dense entourant chaque sac alvéolaire, à

S36.

Néanmoins, ce réseau n’acquière sa configuration définitive qu’après la naissance (au delà de 7

– 9 ans). Dans les parois inter-alvéolaires épaisses cohabitent deux réseaux capillaires

adjacents, un pour chaque alvéole. Au cours de la phase d’hypertrophie, l’étirement des parois

oblige les deux réseaux à fusionner pour donner le réseau terminal.

- Le tissu conjonctif

Le tissu conjonctif est définitivement structuré.

- Période post-natale

Cette période est caractérisée par la succession de trois phases : les deux premières

correspondent à une évolution permettant le passage progressif du poumon d’un nouveau-né à

un poumon adulte.

18

- Phase d’hyperplasie alvéolaire

Durant cette période, on va continuer à fabriquer du parenchyme pulmonaire, jusqu’à l’âge de 7

– 10 ans, pour accompagner la croissance staturo-pondérale de l’enfant (tableau 1).

Tableau 1 : nombre d’alvéoles et de bronchioles respiratoires [3].

Naissance Adulte

Nb d’Alvéoles 24 X 106 280 – 300 X 106

Nb de Bronchioles respiratoires 1,5 X 106 14 X 10

On va donc décupler le nombre d’éléments, avec une période de croissance rapide jusqu’à l’âge

de 5 ans où l’on est aux environs de 260 X 106 d’alvéoles (environ 90% du potentiel), suivi

d’une phase d’amortissement qui prend fin entre 8 et 10 ans.

- Phase d’hypertrophie alvéolaire

Le programme d’hyperplasie étant épuisé, la croissance pulmonaire sera complétée par une

hypertrophie alvéolaire.

-Phase de régression

Dès l’âge de 20 ans, on observe un début de bronchiolisation très progressive, qui va

s’accentuer sensiblement chez le sujet âgé.

I.1.3 Histologie

En histologie, l’appareil respiratoire est composé de trois types d’éléments :

- de l’air : particulièrement évident à l’observation de coupe histologique de poumon

- du sang, qui représente 50% du volume du parenchyme (Interstitium interalvéolaire)

- des tissus

Les tissus constitutifs du poumon sont composés uniquement d’épithéliums et de tissus

conjonctifs, une structure histologique relativement simple pour résoudre les contraintes

mécaniques qui lui sont imposées (Figure 4).

19

Figure 4 : Une coupe microscopique d’un tissu pulmonaire périphérique.

(Coloration hématéine éosine safran, grossissement x 100).

La structure de l’arbre bronchique est étroitement adaptée à sa fonction : conduction et

conditionnement de l’air [9].

I.1.3.1 Conduction de l’air

Les voies aériennes se divisent de façon dichotomique : chaque bronche mère donne 2

bronches filles. Il y a 23 générations de voie aérienne dont les 16 premières sont

"conductrices". Ainsi à la trachée succèdent 2 bronches souches, 5 lobaires, 20 segmentaires et

environ 3000 bronchioles lobulaires.

La structure histologique de la paroi des voies aériennes est très bien adaptée à la conduction

car elle permet d’associer rigidité, flexibilité et extensibilité. Elle est formée de différentes

couches dont la composition et la répartition varient de la trachée à la bronchiole afin de

s’adapter au mieux au diamètre des voies aériennes et à leur fonction.

La muqueuse tapisse la lumière bronchique. Elle est composée d’un épithélium de type

respiratoire reposant sur une membrane basale et d’un chorion conjonctif constitué de fibres

collagènes et élastiques, contenant des vaisseaux sanguins et lymphatiques. Les fibres

élastiques permettent une certaine flexibilité et un retour à la normale après dilatation des

bronches.

Entre le chorion et le cartilage s’insère un muscle lisse, absent au niveau de la trachée mais

présent sur tout l’arbre bronchique. Au niveau de la trachée, le muscle est situé à la partie

postérieure du mur cartilagineux. La contraction musculaire permet de réguler le flux aérien

lors de l’inspiration et de l’expiration.

Entre le muscle et le cartilage, la sous-muqueuse contient outre les trajets vasculaires et

lymphatiques, des glandes séromuqueuses s’ouvrant dans la lumière bronchique.

20

Enfin l’adventice (la couche la plus externe) est constituée d’un tissu conjonctivo-adipeux

lâche contenant vaisseaux et nerfs [9].

I.1.3. 2 Composition de l’épithélium respiratoire

L’épithélium respiratoire est composé de 5 types de cellules :

1-Les cellules ciliées sont les plus abondantes. Ces cellules ciliées jouent un rôle fondamental

dans l’épuration pulmonaire.

2-Les cellules caliciformes (1 pour environ 5 cellules ciliées) ont un noyau refoulé vers la base

par une vacuole supranucléaire contenant du mucigène qui participe, avec les secrétions des

glandes séro-muqueuses à la formation du mucus. Celui-ci permet d’emprisonner les impuretés

de l’air inspiré et d’absorber certains gaz (SO2, ozone…). Les cellules ciliées persistent dans

les bronches de petit calibre au delà des cellules caliciformes. Le nombre de cellules

caliciformes augmente avec celui des impuretés dans l’air inspiré. Le nouveau-né en est

dépourvu. A l’opposé, il existe une hyperplasie des cellules caliciformes chez les fumeurs.

3-Les cellules basales sont des petites cellules situées dans la partie profonde de l’épithélium

contre la membrane basale. Elles sont très importantes dans le renouvellement cellulaire car

elles sont capables de remplacer n’importe quel autre type de cellule bronchique.

4-Les cellules à bordures en brosse ne sont visibles qu’en microscopie électronique.

5-Les cellules chromaffines ou argentaffines sont peu nombreuses, visibles en microscopie

électronique ou sur coupe histologique après un immunomarquage à l’aide de marqueurs

neuro-endocrines (comme la chromogranine A ou la Synaptophysine). Ces cellules se groupent

pour former des corps neuro-épithéliaux : chémorécepteurs capables de détecter les variations

de teneur en O2 ou CO2 de l’air.

Le rôle des glandes séro-muqueuses est lui aussi important dans le conditionnement de l’air.

Celui du mucus est décrit ci-dessus. La sécrétion des glandes séreuses humidifie l’air

préalablement purifié par le mucus et les cils.

21

Figure 5 : Représentation de la structure de la barrière alvéolaire

I.1.4 Le poumon périphérique

Le parenchyme pulmonaire représente 85% du volume pulmonaire total (87% d'air ; 13% de

tissu chez l'adulte). Le poumon périphérique est un secteur anatomique situé au confluent des

zones de conduction de l’air et d’échanges gazeux. Il comprend différentes zones continues :

- Une zone de conduction : la bronchiole terminale

- Une zone de transition : la bronchiole respiratoire

- Une zone d’échanges gazeux : l’alvéole

Le territoire desservi par une bronchiole respiratoire est considéré comme une unité

fonctionnelle de tissu pulmonaire appelée acinus pulmonaire ou " lobule pulmonaire primaire ".

I.1.4.1 Zone de conduction

Les bronchioles sont les ramifications les plus fines de l’arbre bronchiques de diamètre

inférieur à 1 mm. Elles n’ont ni cartilage ni glandes séro-muqueuses. Elles sont revêtues d’un

épithélium cylindrique simple fait de cellules ciliées qui sont progressivement associées au

niveau des bronchioles terminales à des cellules de "Clara". Les cellules de Clara sont des

cellules pyramidales dont le pôle apical est garni de microvillosités. Dans la partie apicale de

leur cytoplasme existent des grains de sécrétion expulsés par exocytose. Ce produit fait de

glycosaminoglycanes se répand sur la surface bronchiolaire afin de la protéger. Le chorion est

riche en fibres élastiques. Le muscle devient discontinu mais toujours actif : il se contracte en

22

fin d’expiration et se relâche à l’inspiration. En cas de crise d’asthme la contraction se prolonge

et l’inspiration devient difficile. A noter la présence tout au long des bronchioles suivant les

trajets lymphatiques d’un tissu lymphoïde. Celui ci peut devenir hyperplasique au cours de tout

type d’agression bronchiolaire. La présence de follicules lymphoïdes est alors responsable

d’une lésion appelée "bronchiolite folliculaire". [5]

I. 1.4.2 Zone de transition

Les bronchioles respiratoires est une zone est extrêmement vulnérable car elle est située entre

les voies de conduction et d’échanges gazeux. Ainsi des lésions atteignant la bronchiole

respiratoire sont fréquentes chez les fumeurs. Il existe 3 générations de bronchioles

respiratoires. Leur structure histologique est identique à celle de la bronchiole terminale à ceci

près que plus elles sont périphériques plus leur paroi est interrompue par la présence

d’alvéoles. Leur chorion contient des cellules musculaires disperses (Figure 6).

Figure 6 : Poumon périphérique : zone d'échanges gazeux

I.1.4.3 Zone d’échanges gazeux

- L’acinus pulmonaire et la barrière alvéolo-capillaire

Au fur et à mesure le nombre d’alvéoles s’ouvrant dans la bronchiole respiratoire est tellement

important qu’il n'y a plus réellement d’épithélium bronchiolaire : on parle alors de canal

alvéolaire. Un acinus (ou lobule pulmonaire primaire) est constitué d’une bronchiole

respiratoire donnant naissance de 3 à 6 canaux alvéolaires. Chaque canal alvéolaire lui même se

divise de 2 à 3 fois. Chaque canal alvéolaire final s’ouvre au niveau de l’atrium sur 2 ou 3 sacs

alvéolaires. A ce niveau le muscle disparaît, l’armature est uniquement faite de fibres

collagènes et élastiques. Les fibres élastiques permettent aux alvéoles de s’élargir lors de

23

l’inspiration. Les alvéoles se contractent ensuite "passivement" lors de l’expiration. Les fibres

collagènes évitent une trop grande distension des murs alvéolaires et donc leur rupture.

Les alvéoles sont des "sacs" de 200µm de diamètre. Leur structure histologique est adaptée à

leur fonction essentielle : l’échange oxygène/gaz carbonique. La surface d’échange de

l’ensemble des 300 millions d’alvéoles représente à peu près 140 m2 ; 12000L d'air filtrés face

à 6000 L de sang perfusés par jour. Dans chaque alvéole on distingue la lumière alvéolaire

bordée par un épithélium alvéolaire et le "mur" ou cloison inter alvéolaire (interstitium) où

circule un réseau capillaire abondant.

I.1.4.4 L’épithélium alvéolaire

L’épithélium alvéolaire se compose de 2 types de cellules dites type I et II

1-Les pneumocytes de type I recouvrent 97% de la paroi alvéolaire. Leur rôle principal est

d’être une barrière protégeant l’alvéole mais perméable aux gaz.

2-Les pneumocytes de type II sont des cellules volumineuses.

Elles produisent et secrètent le surfactant. Cette substance est composée de protéines et de

phospholipides.

Il recouvre la surface alvéolaire et diminue la tension de surface. Ainsi la force d’inspiration

nécessaire pour dilater l’alvéole est moins grande. De plus en l’absence de surfactant l’alvéole

a tendance à se collaber. Chez l’enfant prématuré une insuffisance de surfactant peut-être

responsable de la maladie des membranes hyalines. Le surfactant a aussi un rôle antibactérien.

Elles ont des capacités de présentation antigénique et de sécrétion de cytokines et donc rôle

important dans les processus inflammatoires pulmonaires

A l’état normal les principaux éléments cellulaires retrouvés dans la ‘lumière alvéolaire’ sont

les macrophages qui se déplacent sur la paroi alvéolaire, immergés dans le surfactant.

La barrière alvéolo-capillaire (air-sang) de 0,1 à 0,5 µm d’épaisseur, est formée par différentes

couches :

- Le surfactant (phospholipides et protéines)

- Un film aqueux de quelques microns les pneumocytes

- L'interstitium pulmonaire : myofibroblastes

- La membrane basale résultant de la fusion de la membrane basale des pneumocytes d’un côté

et des cellules endothéliales de l’autre.

- Les cellules endothéliales forment la paroi des capillaires ; elles ont une fonction métabolique

importante (angiotensine, prostaglandine, bradykinine, sérotonine).

24

Cette barrière est perméable aux gaz ainsi l’oxygène qui est amené dans la lumière alvéolaire

lors de l’inspiration passe à travers la barrière dans la circulation capillaire et sera transporté

dans tout l’organisme par la circulation vasculaire. A l’inverse, le gaz carbonique, ramené aux

poumons par la circulation capillaire, passe à travers la barrière alvéolo-capillaire et est éliminé

lors de l’expiration.

En cas d’agression le poumon périphérique réagit dans un premier temps par un élargissement

des murs alvéolaires en rapport avec un afflux d’éléments inflammatoires (polynucléaires,

lymphocytes). Puis ces lésions peuvent avoir une évolution fibrosante : les murs alvéolaires

sont alors siège d’une hyperplasie de fibres musculaires puis d’une fibrose collagène.

25

I.2.Etiologie et épidémiologie du cancer des poumons

I.2.1 Définition du cancer

La tumeur cancéreuse ou le cancer est un terme générique qui désigne toutes les tumeurs

malignes qu’elles soient d’épithéliale ou conjonctive. La tumeur cancéreuse est définie come

étant une prolifération indéfinie d’une ou plusieurs cellules appelées clone. Ces clones

échappent aux mécanismes de régulation proliférative, envahissent et détruisent les tissus

normaux et provoquent la mort des patients par extension des cellules tumorales à tout

l’organisme [5].

Figure 7 : Les étapes d’évolution d’une tumeur maligne. 1) cellules génétiquement

altérée, 2) hyperplasie, 3) Dysplasie, 4) carcinome in situ, 5) cancer invasif [6].

Figure 8: Dissection d'un poumon cancéreux. Les tissus

blancs sont des tissus cancéreux, les tissus noirs d’une

personne fumeuse [6].

26

I.2.2 Le cancer broncho-pulmonaire

Le cancer broncho-pulmonaires se développe dans les bronches et dans les poumons. Il existe

deux types de cancer broncho-pulmonaire :

1. Cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC) une forme de cancer la plus

répandue, qui progresse moins rapidement que les autres types, on trouve trois variétés :

- Carcinomes épidermoïde

- Adénocarcinome,

- Carcinome à grandes cellules.

2. Cancer broncho-pulmonaire à petites cellules (CBPC), forme de cancer plus rare qui

progresse plus rapidement que celui non à petites cellules, il existe trois variétés :

- Carcinome à petite cellules,

- Carcinome mixte à petites et grandes cellules,

- Carcinome mixte à petites cellules.

I.2.3 Etiologie

I.2.3.1 Les principales causes du cancer broncho-pulmonaire

Avec prés de 22 700 décès en 2000, le cancer du poumon est au premier rang des causes de

décès par cancer pour l’homme et au troisième pour la femme.

Le cancer broncho-pulmonaire est habituellement causé par le tabagisme ou l’exposition à la

fumée secondaire, mais il peut avoir d’autres causes. La principale cause est le tabagisme, ce

qui représente 80% des cancers du poumon recensés, dont 90% chez les hommes et moins de

70 % chez les femmes.

I.2.3.1.1 Les facteurs de risque environnementaux et professionnels

Les facteurs de risque professionnels et à moindre titre, environnementaux sont actuellement

considérés comme la seconde cause bronchique chez les hommes.

I.2.3.1.1.1 Le tabac

Depuis les années cinquante, il a été démontré formellement que le tabagisme était un facteur

de risque indéniable de néoplasie pulmonaire [19]. Il en est même le premier facteur de

risque, quel que soit le type histologique, même s’il favorise davantage le développement de

carcinomes épidermoïde et d’adénocarcinomes à petites cellules. Il n’y a pas de seuil minimal

de consommation en dessous duquel la consommation tabagique ne présenterait pas un

27

facteur de risque de cancer du poumon [20]. On sait que l’élément déterminant pour le risque

de carcinogenèse est plus la durée d’exposition au tabac que le nombre total de cigarettes

fumées [7].

Le fait de commencer à fumer jeune accroît le risque carcinogénique [21]. On voit apparaître

un décalage d’une vingtaine d’années entre les courbes de consommation du tabac et

l’incidence du cancer du poumon. Ceci est lié à l’histoire naturelle de la carcinogenèse

pulmonaire [8]. La fraction des cancers bronchiques attribuable au tabac est évaluée à 91 %

chez l’homme et à 57 % chez la femme. Le risque de développer un cancer du poumon chez

l’homme fumeur est 24 fois plus important que chez le non-fumeur; chez la femme, par

contre, il est 9 fois plus important chez la fumeuse que chez la non-fumeuse. On note une

diminution du risque chez les patients ayant arrêté de fumer par rapport à ceux chez qui le

tabagisme persiste. Cette diminution est d’autant plus importante que la durée d’abstinence

tabagique est longue. On estime qu’une personne ayant arrêté depuis 10 ans à cinq fois moins

de chance de développer un cancer bronchique qu’une personne persistant dans ce

comportement [5].

Un model schématique communément admis décrit l’évolution de l’épidémie tabagique. Cette

épidémie se décompose en quatre phases. Dans une société, le tabagisme s’installe d’abord

chez les hommes dont le niveau socio-économique est élevé. Puis il envahit les hommes dont

le statut socio-économique est plus faible. L’épidémie tabagique croît jusqu’à un maximum

puis subit une régression. C’est ce qui s’est passé aux Etats-Unis et en Europe où la

proportion d’hommes fumeurs est depuis quelques années en régression. L’épidémie atteint

de la même manière la femme, mais avec quelques années de décalage. Ceci explique qu’en

France l’épidémie des maladies liées au tabac a sûrement atteint son pic probable chez

l’homme, alors que chez la femme l’épidémie des maladies liées au tabac ne fait que débuter

[22]. Si la plupart des pays occidentaux se trouvent dans cette phase de décroissance, les pays

en voie de développement sont, quant à eux, toujours en phase de croissance de

consommation tabagique.

C’est non seulement la consommation active de tabac, mais aussi l’inhalation passive de la

fumée exhalée par les fumeurs actifs qui accentuent le risque cancérigène pour le poumon. A

cet égard, il est intéressant de noter que, depuis 2002, l’OMS (Organisation Mondiale de la

Santé) a reconnu le rôle cancérigène pour le poumon de l’exposition passive à la fumée de

tabac, même si le risque est nettement moindre que chez le fumeur actif.

28

I.2.3.1.1.2 L’exposition à l’amiante

De par ses propriétés d’isolant thermique et son incroyable résistance, l’amiante a connu de

multiples utilisations industrielles. De nombreux ouvriers sont ou ont été exposés à l’amiante

(production de garniture de frein, extraction de minerais, installation de matériel friable à base

d’amiante, électriciens, plombiers, maçons,..). Une étude française de 2003 montre que 12 %

des cancers du poumon chez les hommes de plus de 55 ans et environ 7 % dans la tranche

d’âge de 35 à 55 ans peuvent être attribués à une exposition professionnelle à l’amiante [23].

On note un effet synergique du tabagisme et de l’exposition à l’amiante sur le risque de

développer un cancer bronchique [24] (figure 9).

Figure 9 : Effet multiplicateur du tabagisme et de l’exposition à

l’amiante sur le risque relatif de cancer du poumon [24].

I.2.3.1.1.3 Autres expositions à risque

En 1997, la silice a été classée comme cancérigène par le Comité International de Recherche

sur le Cancer. Récemment, l’exposition au cadmium chez des ouvriers flamands a été

reconnue comme responsable de cancer du poumon [19]. Par ailleurs arsenic, nickel, chrome,

gaz moutarde sont autant d’autres facteurs reconnus.

- Le radon

Le radon est un gaz radioactif naturel émis par certains sols et, en particulier, par les sols

schisteux auquel le poumon est exposé par inhalation. Une méta-analyse de 2003 montre une

29

augmentation de 24 % du risque de cancer de poumon chez les patients exposés dans leur

maison à une radiation au radon de 150 Bq/m3 [20].

I.2.3.1.1.4 La pollution atmosphérique

La mortalité par cancer du poumon est plus importante en milieu urbain qu’en milieu rural

[10]. Les hydrocarbures polycycliques aromatiques provenant de la combustion du fuel fossile

et des émissions du diesel plus abondant dans l’air urbain pourraient expliquer cette

observation [22].

-L’alimentation

Une analyse regroupant 8 études prospectives concernant 3.206 cas détectés de cancer du

poumon parmi 430.281 sujets suivis pendant 6 à 16 ans a démontré, pour une consommation

tabagique identique, une réduction de 16 à 23 % du cancer bronchique chez les individus

consommant régulièrement des fruits. L’effet protecteur de la consommation de légumes est

moins important [23].

Co morbidités

Les patients porteurs d’une broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) ont un

risque relatif significativement plus important de développer un cancer du poumon, quel que

soit le type histopathologique de celui-ci [24]. Les fibroses et les cicatrices pulmonaires

augmentent aussi le risque du cancer du poumon, particulièrement celui d’adénocarcinome.

I.2.3.2 Prédisposition génétique

La relation entre tabagisme et cancer du poumon est indiscutable. Mais, comme seuls 10 à 15

% des fumeurs réguliers et que des personnes n’ayant jamais fumé développeront cette

pathologie, on pense qu’il existe une certaine sensibilité génétique aux agents cancérigènes

environnementaux. Quelques études se sont concentrées sur le polymorphisme génique au

niveau des voies métaboliques d’activation des substances cancérigènes, des voies de

détoxification et des mécanismes de réparation de l’ADN. Pour se lier à l’ADN et induire des

lésions géniques, les hydrocarbures polycycliques aromatiques (présents dans les cigarettes)

doivent être métabolisés par des enzymes du cytochrome P450. Le CYP1A1 et le CYP2D6

font partie de celles-ci. Pour le CYP1A1, le polymorphisme MspI et une mutation au niveau

du codon 462 de l’exon 7 du gêne codant pour cette enzyme (cette dernière mutation appelée

Ile462Val entraîne le remplacement de la valine par l’isoleucine à proximité du site protéique

liant l’hème) étaient associés à un risque accru de développer un cancer du poumon. Les

sujets porteurs du phénotype CYP2D6 métaboliseur rapide de la débrisoquine pourraient être

30

à risque accru de développer une néoplasie pulmonaire, mais les résultats des études portant

sur ce sujet sont contradictoires.

La gluthation S-transférase est une enzyme détoxifiant les métabolites réactifs des

hydrocarbures aromatiques polycycliques. Certains polymorphismes géniques de cette

enzyme ont été associés au cancer du poumon. Une méta-analyse a montré que les patients ne

possédant pas l’allèle GSTM1 étaient plus à risque que ceux le possédant. La conjugaison de

la présence de l’allèle CYP1A1 Ile462Val et de l’absence d’allèle GSTM1 augmenterait de

quatre fois le risque de développer un cancer du poumon chez le sujet non fumeur [15].

I.2.3.2.1 Modifications géniques au sein de la tumeur

Certaines études ont montré que le récepteur au facteur de croissance épithélial (EGFR) était

régulièrement modifié dans les néoplasies épithéliales [26]. L’EGFR est une tyrosine kinase

de la famille ErbB. Ce récepteur se trouve sous forme de monomère lorsqu’il n’est pas activé

par le ligand. La fixation du ligand sur le domaine extra-membranaire de la protéine entraîne

la dimérisation de celle-ci et l’activation via la consommation d’ATP d’une voie de

signalisation intracellulaire importante pour la survie et la multiplication cellulaire [18] (10).

Le gène EGFR est un oncogène capable d’induire une néoplasie lorsqu’il est muté. En fait, le

système EGF/EGFR peut faciliter la cancérisation par trois mécanismes : la surstimulation de

l’EGFR par un excès de production d’EGF [27], la surexpression d’EGFR [28] ou l’activation

excessive et spontanée par mutation de l’EGFR [29]. Une étude ayant analysé les mutations

EGFR sur 759 pièces tumorales bronchopulmonaires montrait que le gène codant pour cette

protéine était muté dans 149 pièces tumorales (19,6 %). Ces mutations étaient plus fréquentes

chez les non-fumeurs, les femmes, les patients atteints d’adénocarcinomes et ceux provenant

de l’Est Asiatique. L’EGFR est codé par un gène situé au niveau du chromosome 7p12. Les

principales mutations se trouvent entre l’exon 18 et l’exon 21 [17, 30].

31

Figure 10 : Schéma d’activation du récepteur EGFR par l’EGF. La liaison de l’EGF

entraîne une dimérisation du récepteur qui stimule le domaine intracellulaire de l’EGFR. Via

l’ATP, plusieurs cascades cellulaires sont activées : la prolifération tumorale d’un côté (sys

RAS-RAF), l’activation antiapoptotique d’un autre côté (sys Akt et Stat 3/5) [28].

I.2.4 Epidémiologie descriptive du cancer des poumons

I.2.4.1 Cancer des poumons en Algérie

Il est la première cause de mortalité par cancer chez les hommes en Algérie. Le Dr Ameur

Soltane, président de l’Association algérienne du cancer des poumons, a révélé que 2 500

à 3 500 nouveaux cas de cancer des poumons sont enregistrés chaque année en Algérie, et

qu’entre 80 et 87% des personnes atteintes du cancer des poumons meurent dans les cinq ans

qui suivent le diagnostic. Il a ajouté qu’un cas sur quatre peut subir une opération. Cela

intervient au moment où le nombre de décès annuel est de 15000, selon le Dr Maghraoui du

service de chirurgie thoracique de l’hôpital d’Oran .Ce dernier affirme que le tabac est à

l’origine de 90% des cas, alors que 10 % de ce type de cancers sont liés aux facteurs

professionnels dont l’amiante. Rien que dans le secteur sanitaire, il a été recensé 96 cas de

cancer à l’amiante entre 1998 et 2005. Il convient enfin de signaler que la prévalence du

cancer a connu une évolution rapide en Algérie et le coût de sa prise en charge est de plus en

plus élevé. (Amina Azoune. Le jeune indépendant - Algérie - 06/04/2006).

Le Pr. Berrabah du CHU d’Oran, a estimé que «le gros problème qui se pose en Algérie est

l’insuffisance de la prévention». «Le tabac qui était l’apanage des hommes se féminise ;

beaucoup de femmes fument, ce qui fait craindre une flambée du cancer des poumons chez la

femme d’ici 10 à 15 ans», a-t-il noté.

Dans notre pays, ce type de cancer est en nette progression, et ce, malgré les progrès

scientifiques réalisés durant les 20 dernières années dans la connaissance des mécanismes

32

intimes du cancer bronchique et l’amélioration de sa prise en charge, notamment par la

découverte de nouvelles drogues.

I.2.4.2 Cancer des poumons en France

Le réseau français des registres des cancers (Francim) et l’Institut national de la santé et de la

recherche médicale (Inserm) estiment le nombre total de nouveaux cas de cancers en France,

en 2000, à 280 000, dont 58 % survenant chez les hommes. Pour la même année, le nombre

de décès par cancer est estimé à 150 000 dont 61 % chez l’homme.

Le cancer du poumon vient en 4e position pour son incidence (28 000 nouveaux cas) après le

cancer du sein (42 000), de la prostate (40 000), et du colon et rectum (36 000) et en première

place pour sa mortalité. 23 152 cancers du poumon ont été diagnostiqués chez l’homme en

2000 et 4 591 chez la femme. Compte tenu de l’efficacité modeste des traitements, le cancer

du poumon est la première cause de mort par cancer avec environ 27 000 décès en 2000, dont

23 000 chez l’homme et 4 500 chez la femme (Inserm, année 2000). Selon l'assurance

maladie, 14 237 nouveau cas en France métropolitaine en 2002.

Tableau 1 : Taux d’incidence (standardisé au monde) du cancer du poumon pour 100 000

hommes et femmes (source Cnamts 1997- 2002)

Hommes Femmes

1997 41,3 7,3

1998 41,5 7,7

1999 40,4 7,9

2000 40,8 8,6

2001 40,9 9,1

2002 40,1 9,6

I.2.4.3. Cancer des poumons en Canada

Au Canada, en 2005, on estime que 22 200 personnes ont reçu un diagnostic de cancer du

poumon, soit 12 000 hommes et 10 200 femmes.

Au cours de la même période, 10 700 hommes et 8 300 femmes ont été emportés par cette

maladie. Le cancer du poumon est, de loin, le plus mortel des cancers au pays.

Chaque semaine, 427 Canadiens apprennent qu’ils sont atteints de ce cancer, tandis que

365 en meurent.

33

Au Canada, 1 homme sur 11 (soit 8,8 %) court le risque d’être atteint du cancer du poumon au

cours de sa vie. Chez les femmes, ce risque est de 1 femme sur 17 (soit 5,9 %).

Le risque de succomber à cette maladie, chez les Canadiens, est de 1 homme sur 12, et de

1 femme sur 20. Tant pour les hommes que pour les femmes, la principale cause du cancer du

poumon est le tabagisme. (Institut national du cancer du Canada, Statistiques canadiennes sur

le cancer 2005).

I.2.5. Épidémiologie analytique

Le cancer broncho-pulmonaire primitif est la première cause de décès par cancer chez

l'homme et ce dans tous les pays développés. On estime le nombre de nouveaux cas par an à

28000 en France et à plus de 150000 aux Etats-Unis. L'incidence et la prévalence sont proches

ce qui témoigne du pronostic désastreux de cette maladie. Le cancer broncho-pulmonaire est

donc un véritable problème de santé publique. Paradoxalement, une de ses particularités est

d'être accessible à la prévention puisque son principal facteur de risque, le tabagisme est

identifié.

I.2.5.1. L'âge

L'âge médian de survenue d'un cancer broncho-pulmonaire est de 60 ans et 75 % des patients

ont entre 50 et 70 ans au moment du diagnostic.

I.2.5.2. Le sexe

Si l’on concentre l’analyse sur des types spécifiques de cancer, le cancer du poumon reste le

plus mortel chez les hommes dans tous les pays de l’OCDE (à l’exception de la Suède) et

demeure l’une des principales causes de décès par cancer chez les femmes. La consommation

de tabac est le facteur de risque le plus important pour le cancer du poumon.

En 2004, les pays qui affichaient les taux les plus élevés de décès par cancer du poumon

étaient les pays d’Europe centrale et orientale (la Hongrie, la Pologne, la Républiques tchèque

et slovaque), les Pays-Bas, la Grèce et la Corée. Dans tous ces pays, la proportion de fumeurs

chez les hommes a été de tout temps (et reste) relativement élevée. C’est en Suède que le taux

de décès par cancer du poumon est le plus faible; ce pays est également l’un de ceux dans

lesquels les hommes fument le moins (figure 11).

34

Figure 11 : Taux de mortalité due au cancer du poumon, hommes et femmes

(Eco-Santé OCDE 2007)

35

I.3.Anatomie pathologique des cancers broncho-

pulmonaire

I.3.1 Classification des cancers broncho-pulmonaire

La dernière classification de l’OMC éditée en 1999, préserve les nomenclatures consacrées

par le temps et les nouvelles acquisitions liées aux progrès des techniques qui permettent de

compléter et d’affiner la simple analyse morphologique. Cette classification est représentée

dans tableau 3.

I.3.1.1 Cancer bronchique épidermoïde

Il se localise préférentiellement dans une bronche lobaire ou segmentaire et se présente

volontiers sous la forme d'une tumeur végétative en "chou-fleur" obstruant plus ou moins la

lumière bronchique. En même temps que la tumeur progresse dans la lumière bronchique elle

envahit la sous-muqueuse et le tissu péri-bronchique. Lorsque la tumeur est périphérique une

nécrose centrale est habituelle ; lorsque la tumeur est proximale il s'y associe une pneumonie

obstructive.

Histologiquement cette tumeur se caractérise par l'existence de ponts intercellulaires, de

kératinisation et par la formation de "perles" cornées.

L'ultrastructure des formes bien différenciées comporte des cellules à cytoplasme abondant

avec un réticulum endoplasmique, un appareil de Golgi et des mitochondries peu importants

mais des ribosomes et des filaments intermédiaires abondants. Ces derniers s'agrègent

volontiers pour former des desmosomes.

I.3.1.2 Cancer bronchique à petites cellules

Il se localise généralement près des voies aériennes proximales. La tumeur est mal limitée et

s'étend dans la sous -muqueuse et les tissus de connexion. L'extension endo-bronchique est ici

beaucoup plus rare et lorsqu'il existe une obstruction bronchique elle est généralement due à

une compression extrinsèque. L'invasion des vaisseaux et des lymphatiques est très précoce et

les relais ganglionnaires hilaires et médiastinaux sont inévitablement envahis.

36

Tableau II Classification histologique des carcinomes broncho-pulmonaires extrait de

l’OMS, 1999.

1. Carcinome épidermoïde

1.1 Papillaire

1.2 A cellulaires claires

1.3 A petites cellules

1.4 Basaloïde

2. Carcinome à petites cellules

2.1 Carcinome à petites cellules

3. Adénocarcinome

3.1 Acineux

3.2 Papillaire

3.3 Broncho-alvéolaire

3.3.1 Non mucineux

3.3.2 Mucineux

3.3.3 Mixte (mucineux et non mucineux)

4. Carcinome à grande cellules

4.1 Carcinome neuroendocrine à grandes cellules

4.1.1 Carcinome neuroendocrine à grandes cellules composites

4.2. Carcinome basoloïde

4.3 Carcinome lympho-épithéliale like

4.4 Carcinome à cellules claires

4.5 Carcinome à grande cellules de phénotype rhabdoïde

5. Carcinome adéno-squameux

6. Carcinome pléiomorphe, sarcomatoïde ou avec éléments sarcomateux

6.1 Carcinome à cellules fusiforme et / ou géantes

6.1.1 Carcinome pléiomorphe

6.1.2 Carcinome à cellules fusiforme

6.1.3 Carcinome à cellules géantes

6.2 Carcinosarcome

6.3 Blastome

7. Tumeurs carcinoïde

7.1 Carcinoïde typique

7.2 Carcinoïde atypique

8. Carcinome du type glandes salivaires

8.1 Carcinome muco-épidermique

8.2 Carcinome adénoïde kystique

8.3 Autres

9. Carcinomes inclassables

37

Figure 12: Biopsie d'un poumon souffrant de carcinome à petites cellules.

Le sous-type oat-cell est fait de cellules uniformes mesurant 1 à 1,5 fois la taille d'un

lymphocyte. Le cytoplasm est quasi absent. Les noyaux sont hyperchromatiques, contenant

une chromatine fine et dispersée et de petits nucléoles.

Le sous-type intermédiaire est fait de cellules plus grandes, rondes ou polygonales, contenant

un cytoplasme un peu plus abondant. Les noyaux sont moins hyperchromatiques. Les cellules

de ces deux sous-types sont arrangées en rubans ou en rosettes. Ces tumeurs sont volontiers

très nécrotiques. Parfois il existe deux composantes, l'une correspondant à un cancer

bronchique à petites cellules typique, l'autre à un cancer épidermoïde ou à un adénocarcinome.

Il s'agit alors de la variante composite.

En microscopie électronique, la présence de granules neurosécrétoires est très évocatrice du

diagnostic de carcinome bronchique à petites cellules.

I.3.1.3.Adénocarcinome bronchique est divisé en 4 sous-groupes

histologiques

Acinaire, papillaire, bronchiolo-alvéolaire et carcinome solide avec formation de mucus. La

signification clinique de cette subdivision est très discutée avec l'exception de la forme diffuse

de l'épithélioma bronchiolo-alvéolaire (figure 12).

38

Figure 13 : Adénocarcinome bronchique iconographie.

L'adénocarcinome se localise volontiers en périphérie dans les régions souspleurales. Il est

habituellement bien limité bien qu'il puisse exister des aspects spiculés, irréguliers. Lorsqu'il

s'agit d'un bronchiolo-alvéolaire, il n'y a pas de destruction de l'architecture alvéolaire et les

alvéoles sont littéralement tapissés par les cellules cancéreuses ; radiologiquement l'image est

alors celle d'une pneumonie. L'adénocarcinome montre une différenciation glandulaire de

degré variable pouvant ou non former des papilles.

En microscopie électronique l'aspect varie selon le degré et le type de différenciation.

Les cellules sont columnaires ou cuboïdales avec des microvillosités de surface, un réticulum

endoplasmique et un appareil de Golgi relativement abondant, et des granules sécrétoires.

En immuno-histochimie le marquage pour l'antigène carcino-embryonnaire (ACE) est très

fréquent de même que pour les cytokératines de bas poids moléculaire.

I.3.1.4. Epithéliome bronchique à grandes cellules

L'épithéliome bronchique à grandes cellules est essentiellement un diagnostic d'exclusion et

s'applique aux tumeurs qui n'ont pas l'aspect d'un cancer bronchique à petites cellules et qui

n'ont ni différenciation épidermoïde ni différenciation glandulaire. La proportion d'épithélioma

à grandes cellules varie donc largement selon le degré de sophistication des colorations et des

techniques anatomo-pathologiques et selon la quantité de tissu disponible pour le diagnostic. Il

s'agit en général de tumeurs périphériques volumineuses. Histologiquement les tumeurs

consistent en des nappes de cellules contenant un cytoplasme éosinophile abondant.

I.3.1.5 Carcinomes adénosquameux

Les carcinomes adénosquameux sont très rares surtout si l'analyse est faite en microscopie

optique. Si on se fonde sur la microscopie électronique, la fréquence peut aller jusque 40 %.

Le pronostic semble être identique à celui de l'adénocarcinome [31].

39

I.3.2 Diagnostic du cancer broncho-pulmonaire

I.3.2.1. Les signes cliniques

I.3.2.1.1 Signes en rapport avec la tumeur bronchique

1- La toux est le plus fréquent des symptômes inauguraux. Elle n'amène cependant que

rarement le patient à consulter car il la considère comme banale et due au tabagisme. Cette

toux est liée à la stimulation des récepteurs endobronchiques par des phénomènes mécaniques

(compression par la tumeur) ou des phénomènes inflammatoires. Ces récepteurs sont moins

fréquents en périphérie au niveau des bronchioles qu'au niveau des grosses bronches.

2 - L'expectoration :

L'apparition d'une expectoration purulente avec ou sans fièvre peut être due à une infection en

amont d'une sténose ou à une nécrose tumorale. Celle-ci est surtout le fait des carcinomes

épidermoïdes. Classiquement le carcinome bronchiolo-alvéolaire serait responsable d'une

sécrétion muqueuse abondante. Ce phénomène est en fait rare et tardif.

3 - La dyspnée :

En cas de tumeur à développement central, la dyspnée sera liée à l'obstruction par un bourgeon

néoplasique ou à la compression extrinsèque d'une grosse bronche. En cas d'obstruction d'une

grosse bronche on pourra entendre un ronchus fixe, un wheezing voire un cornage si la tumeur

est située dans la trachée.

4 - L'hémoptysie :

N'est pas un symptôme très fréquent mais elle alerte davantage le patient.

I.3.2.1.2 Signes en rapport avec l'extension loco-régionale

Le syndrome cave supérieur associant des céphalées, une cyanose de la face, un oedème en

pèlerine, une turgescence des jugulaires, une circulation collatérale thoracique antérieure est

relativement fréquent et en rapport avec l'engainement ou la compression de la veine cave

supérieure par la tumeur ou par une adénopathie latéro-trachéale droite.

- Une compression oesophagienne par la tumeur ou par une adénopathie sera à l'origine d'une

dysphagie.

- Les épanchements pleuraux sont généralement secondaires à l'envahissement de la plèvre

viscérale et donc néoplasiques, mais parfois ils sont simplement liés à une atélectasie.

40

- Une tamponnade, une arythmie récente signent l'envahissement péricardique par la tumeur ou

ses extensions lymphatiques.

- Un hoquet ou une paralysie phrénique sont en rapport avec une compression du nerf

phrénique.

- Des douleurs pariétales thoraciques lorsqu'elles sont fixées, insomniantes, évoqueront

l'envahissement de la paroi par la tumeur.

- Une dysphonie témoigne généralement d'une compression du nerf récurrent gauche sous la

crosse de l'aorte, par une adénopathie ou par la tumeur.

- Une adénopathie sus-claviculaire généralement de consistance élastique, mobile ou fixée au

plan profond peut révéler un cancer bronchique.

- Le syndrome de Pancoast-Tobias reconnait le plus souvent une étiologie cancéreuse et

associe des douleurs scapulaires puis des douleurs de type radiculaire C8 - D1 irradiant

jusqu'au 5e doigt, un syndrome de Claude-Bernard Horner homolatéral avec myosis,

enophtalmie, et rétrécissement de la fente palpébrale. Ces signes sont liés au développement

d'un cancer de l'apex envahissant le plexus brachial, le ganglion stellaire sympathique et

détruisant les 2 premiers arcs costaux.

Tous les signes en rapport avec une extension loco-régionale éliminent d'emblée toute

possibilité chirurgicale à l'exception parfois de l'envahissement pariétal [31].

I.3.2.1.3 Signes en rapport avec l'extension métastatique

Les sites métastatiques les plus fréquents sont le foie, l'os et le système nerveux central. C'est

ainsi qu'une hépatomégalie douloureuse parfois marronnée avec ou sans perturbation des

fonctions hépatiques, des douleurs osseuses, des manifestations neurologiques (déficitaires ou

épileptiques), des nodules sous-cutanés violacés peuvent révéler un cancer bronchique primitif.

Les métastases surrénaliennes et gastro-intestinales sont fréquentes mais ne s'accompagnent

généralement pas de symptômes cliniques.

I.3.2.1.4 Signes en rapport avec des syndromes paranéoplasiques sont fréquents

Certains ne sont rencontrés que dans le cancer bronchique non à petites cellules: syndrome de

Pierre-Marie ou ostéoarthropathie hypertrophiante pneumique, hypercalcémie alors que

d'autres sont spécifiques du cancer bronchique à petites cellules : hyponatrémie du syndrome

de Schwartz-Bartter en rapport avec une sécrétion inappropriée d'hormone antidiurétique,

syndrome de Cushing, syndrome de Lambert-Eaton. D'autres enfin se voient indifféremment

dans tous les types histologiques : syndromes hématologiques, cutanés etc...

41

I.3.2.1.5 Autres cas

Certains cancers bronchiques notamment ceux se présentant comme un nodule solitaire en

plein parenchyme sont parfois détectés lors d'un examen radiographique pulmonaire de

rencontre et n'occasionnent aucun signe clinique.

I.3.2.2. Signes radiologiques

Ils sont très variables mais souvent évocateurs et permettent de différencier les cancers

centraux développés dans le tiers interne des champs pulmonaires, des cancers périphériques.

Les premiers se présentent souvent sous la forme d'une opacité polycyclique hilaire, ganglio-

tumorale accompagnée ou non d'une atélectasie ou d'un trouble de ventilation d'un ou deux

lobes voire de tout un poumon. Parfois l'opacité hilaire se poursuit vers le médiastin supérieur

par une opacité latérotrachéale voire même une ombre en cheminée signant l'envahissement

ganglionnaire médiastinal.

Ces images sont volontiers le fait des cancers bronchiques à petites cellules mais aussi de

certains épidermoïdes ou des indifférenciés à grandes cellules, beaucoup plus rarement des

adénocarcinomes.

Les seconds se présentent parfois sous forme d'un nodule solitaire, à contours spiculés,

grossièrement arrondi et correspondent volontiers à des adénocarcinomes. Lorsque la masse

tumorale est plus importante elle est fréquemment le siège d'une nécrose centrale donnant une

image de pseudo-abcès dont les parois sont épaisses et les limites internes irrégulières. Cette

image est quasi-pathognomonique d'un cancer épidermoïde.

Les cancers périphériques proches de la paroi peuvent s'accompagner d'une lyse costale, d'un

épanchement pleural.

Les cancers bronchiolo-alvéolaires diffus sont à l'origine d'une image de comblement

alvéolaire non systématisée comportant un bronchogramme aérique et pouvant s'étendre dans

les deux champs pulmonaires.

Le syndrome de Pancoast-Tobias se traduit volontiers par une coiffe apicale accompagnée de

la lyse des premiers arcs costaux [31].

42

I.4. Introduction à la famille de la sulfhydryl oxydase

Le cancer bronchique est la première cause de décès par cancer dans le monde. La première

cause en est le tabagisme. A Oran seul 88 nouveaux patients sont détectés chaque année et

présentent un mauvais pronostic. La gravité de la maladie est due au diagnostique tardif au

stade métastatique. La majorité des cas de cancer broncho-pulmonaire correspond à des

tumeurs non à petites cellules (NSCLC). On distingue en particulier l’adénocarcinome et le

carcinome épidermoïde qui sont les formes les plus représentées. Les profils d’expression

géniques de ces deux types majeurs de cancer font apparaître des changements moléculaires

avec en particulier une surexpression de gènes de détoxification ou anti-oxydants [32].

I.4.1. La famille de la sulfhydryl oxydase

Au niveau cellulaire ou tissulaire, la balance du niveau des réducteurs et des oxydants est en

équilibre. Un déficit ou une surproduction de l’un des acteurs moléculaires, va influencer le

comportement de la cellule [33].Les deux systèmes antioxydants les mieux connus sont, le

système glutathion réduit/ glutathion oxydé (2GSH/GSSG) et le système thiorédoxine réduite/

thiorédoxine oxydé (TRX(SH)2/TRXSS). Une déficience de l’un d’entre eux ou une

augmentation importante du taux de pro- oxydants et de radicaux libres (ROS, NO) induit des

lésions de l’ADN, dont des mutations dans les gènes pro- et anti-oncogène et entraîne de ce

fait une prolifération cellulaire [34].

La super-famille de la Thiorédoxine comprend la thiorédoxine (TRX1), la Protéine Disulfure

Isomérase (PDI), auxquelles sont associées des protéines reliées fonctionnellement comme la

thiorédoxine réductase. La thiorédoxine est une petite protéine ubiquitaire (Mr11500)

contenant un motif très conservé Cystéine-Glycine-Proline-Cystéine (CGPC), qui constitue

son site actif. Elle est impliquée dans l’activité de facteurs de transcription (NFB, AP-1,

ASK1) ce qui va moduler l’expression de gènes cibles et les fonctions cellulaires associées

(prolifération, apoptose, résistance aux agents antitumoraux). Une surexpression de la

thiorédoxine dans les cellules cancéreuses favorise la prolifération cellulaire et augmente la

résistance d’une variété de cellules à la chimiothérapie [35].

La protéine-disulfure isomérase (PDI) est très abondante dans le réticulum endoplasmique où

elle catalyse l’oxydation, la réduction des ponts disulfure ainsi que leur isomérisation en

utilisant le site actif Cystéine-Glycine-Histidine-Cystéine (CGHC) [36]. Elle est caractérisée

43

par la présence de deux domaines thiorédoxine fonctionnels similaires et une séquence de

rétention dans le réticulum endoplasmique Lysine-Aspartate-Glutamate-Leucine (KDEL).

44

SOx/Q6

’courte ’

SOx/Q6

’longue ’

PDI

Thiorédoxine

SOxN

CGPC

CGHC CGHC

N N

C73GHC75 CRDC CSAC512455 515452

C73GHC75 CRDC CSAC

NN

452 455 515512

CGHC CRDC CSAC

N

SOx/Q6

’courte ’

SOx/Q6

’longue ’

PDI

Thiorédoxine

SOxN

CGPC

CGHC CGHCCGHC CGHC

N N

C73GHC75 CRDC CSAC512455 515452

N N

C73GHC75 CRDC CSACC73GHC75 CRDC CSACC73GHC75 CRDC CSAC512455 515452

C73GHC75 CRDC CSAC

NN

452 455 515512C73GHC75 CRDC CSAC

NN

C73GHC75 CRDC CSACC73GHC75 CRDC CSACC73GHC75 CRDC CSAC

NN

452 455 515512

CGHC CRDC CSAC

N

CGHC CRDC CSACCGHC CRDC CSACCGHC CRDC CSAC

N

Figure 14 : Structures protéiques de la thiorédoxine, de la protéine disulfure

isomérase, de la sulfhydryl oxydase/Quiéscine Q6 (SOx/Q6) et de la sulfhydryl

oxydase de neuroblastome (SOxN). Les domaines thiorédoxine sont présentés en orange

et les domaines ERV1 en vert, les séquences transmembranaires en noir, l’extension C

terminale en violet. N: site de glycosylation potentiel (Seddiki, 2009).

Figure 15: Schéma représentant l’activité de la sulfhydryl oxydase/QuiescineQ6

(SOx/Q6). La SOx/Q6 forme un pont disulfure en présence d’oxygène moléculaire

en produisant du peroxyde d’hydrogène.

45

I.4.2. Structure de la sulfhydryl oxydase/Quiescine Q6

Récemment, la nouvelle famille des sulfhydryl oxydases FAD dépendantes a été décrite. les

premiers membres de cette famille ont été nommés sulfhydryl oxydase/Quiescine Q6

(SOx/Q6) [37], [38]. En effet, l’expression du gène SOx/Q6 humain est spécifiquement induit

dans les fibroblastes WI38 lors de leur entrée en quiescence [39]. Ceci laisse suggérer une

implication potentielle de ce gène dans la prolifération cellulaire. Un second membre de cette

famille a été récemment décrit à partir des cellules de neuroblastome et appelé sulfhydryl

oxydase dérivé de neuroblastome (SOxN), cette protéine joue un rôle dans la sensibilisation

des cellules à l’interféron gamma (IFN-) un inducteur de l’apoptose. La protéine est localisée

au niveau de la membrane plasmique et au niveau la membrane nucléaire [40].

Ces sulfhydryl oxydases (SOx) sont des flavoenzymes qui oxydent les groupements thiols des

protéines et des petites molécules pour former des ponts disulfures selon la réaction

2R- SH + O2 R-S-S-R+ H2O2.

Le gène de la quiescine Q6 humaine produit deux transcrits majeurs, un transcrit long de 5600

nucléotides codant pour une forme longue de la protéine (Mr de 80000) et un transcrit court

de 4800 nucléotides codant pour une forme courte (Mr 60000) (figure 14).

La structure protéique déduite des ADNc des sulfhydryl oxydases/ Quiescine Q6 présente un

domaine thiorédoxine de type PDI dans la région N terminale et un domaine catalytique ERV

(essentiel à la respiration et la viabilité) dans la région C terminale. SOx/Q6 longue possède

une extension de 143 acides aminés en position C terminale qui possède une séquence trans-

membranaire potentielle.

Les quatre protéines citées précédemment, la TRX, PDI, SOxN et la SOx/Q6 possédent sur le

plan structural au moins un domaine thiorédoxine mais ont sur le plan fonctionnel des actions

antagonistes qui varient entre l’oxydation et la réduction, ce qui suggère qu’il puisse y avoir

des interactions fonctionnelles entre ces protéines.

Les études montrent la présence de SOx/Q6 dans de nombreux tissus humains. Cette protéine

peut être aussi sécrétée par les cellules [37].Ceci suggère que SOx/Q6 puisse être impliquée

dans la formation de ponts disulfure d’une large variété de protéines au sein de la cellule

(figure 15) [41] et que cette molécule puisse aussi participer au dépôt et l’état de réticulation

de la matrice extra cellulaire (deux protéines ou deux peptides) par la catalyse de ponts

disulfure [41].

Dans cette optique, nous allons vérifier l’existence de la protéine Sox/Q6 dans les différentes

lignées cellulaires broncho-pulmonaires et les variétés de cette protéine par western blot, et

46

ainsi que son activité oxydasique dans les surnageants. Cependant, on ne peut pas exclure la

sécrétion d’autres sulfhydryl oxydases.

Ces résultats pouvant être comparés à ceux de l’expression des ARN messagers dans les

différentes lignées tumorales étudiées obtenus.

47

CHAPITRE II MATERIELS ET METHODES

48

II.1 L’étude épidémiologique du cancer pulmonaire de la région

oranaise

Une étude rétrospective a porté sur 173 patients atteints d’un cancer du poumon et traités au

service de radiothérapie du CHU Oran, entre Janvier 2004 et Décembre 2007. Les résultats

portent les caractéristiques épidémiologiques, cliniques, anatomo-pathologiques d’où :

160 cas masculins (92,5% des cas) et 13 cas féminins (7,5% des cas)

Les résultats ont été traités de la façon suivante :

- La répartition selon la localisation du cancer dans les poumons (droit et gauche)

- La répartition des cas en fonction des tranches d’âges

- La répartition des patients selon la classification du TNM et par type histologique

49

II.2 Matériel biologique

II.2.1 Lignées cellulaires

Les travaux ont été réalisés à partir d’une lignée de fibroblaste pulmonaire

embryonnaire humain WI38, et de cellules épithéliales pulmonaires tumorales humaines

(Calu-1, H1838, H358, H460, H23, A549, H520) (annexe 2). Ces lignées proviennent de

l’ATCC (American Type Culture Collection). Elles sont cultivées dans leurs milieux de

culture appropriés (MEM, RPMI 1640 (GIBCO)) avec 10% de sérum du veau fœtal (SVF)

(référence, 10106-169, Biological Industries) à 37°C et 5% de CO2.

II.2.1.2 Les surnageants de culture cellulaire

Les surnageants de culture ont été récupérés à pré-confluence soit trois jours après

ensemencement (T1), à confluence soit cinq jours après ensemencement (T2) et à post-

confluence soit sept jours après ensemencement (T3). Les échantillons sont conservés à -20°C

puis concentrés 20 fois avec des concentrateurs Vivaspin 2 mL (Vivasciences) ayant un seuil

de rétention de 10 000 par centrifugation répétées de 3 minutes à 5000g à 4°C (Universal 16

R). Un cocktail d’inhibiteurs de protéases (Sigma, P8340) est ajouté aux surnageants

concentrés dans la proportion de 1/50.

Des témoins SVF ont été réalisés parallèlement. Le milieu de culture RPMI avec 10% de SVF

a été incubé à 37°C et 5% de CO2 pendant 3, 5 et 7 jours avant concentration.

II.3. Préparation d’anticorps spécifiques dirigés contre la sulfhydryl

oxydase de rat

II.3.1 Extraction des anticorps anti-sulfhydryl oxydase de rat à partir de

jaune d’œuf de poule

Les IgY totales anti-sulfhydryl oxydase de rat sont extraites de jaunes d’œuf, provenant

de poules immunisées (399 et 400) contre la sulfhydryl oxydase de rat (rSOx), avec le

″Eggcellent Chicken IgY Purification kit″ (Pierce, 44918). La purification est basée sur une

délipidation suivi d’une précipitation. Les anticorps sont conservés en tampon phosphate 50

mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, à -20°C. La concentration en IgY obtenue est analysée par

spectrophotométrie à 280 nm (SHIMADZU, UV-160A) et par électrophorèse en gel de

polyacrylamide.

50

II.3.2 Purification des anticorps spécifiques anti-sulfhydryl oxydase de rat

par chromatographie d’affinité

Toutes les étapes de purification sont réalisées à 4°C. Le gel de Sépharose activé au bromure

de cyanogène (CNBr-actived Sepharose 4B, Pharmacia) sur lequel a été couplé de la

sulfhydryl oxydase de rat (rSOx) (colonne disponible au laboratoire) est équilibré avec du

tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4, NaCl 0,5 M.

Les IgY totales purifiées à partir de l’œuf 399 soit 35,73 mg d’IgY dans 9 mL sont mises en

contact avec le gel 1mL pendant 2 heures sous agitation à 4°C. La colonne est ensuite lavée en

tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4, NaCl 0,5 M. L’élution des IgY non fixées est suivie par

mesure de l’absorbance à 280 nm. Les IgY spécifiques sont alors éluées avec un tampon

glycine 100 mM, pH 3,0, contenant 15 % de D (+) tréhalose (Sigma, T-5251), un ose

protégeant les IgY de la dénaturation et neutralisées immédiatement avec du tampon Tris 1M,

pH 8,0. La colonne est conservée dans du tampon borate 1M, NaCl 0,5, pH 7,4 à + 4°C.

Figure 16: Purification des anticorps IgY anti SOx/Q6 par chromatographie. Le gel de Sépharose activé au bromure de cyanogène sur lequel a été couplé de la sulfhydryl

oxydase de rat (rSOx) est équilibré avec du tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4, NaCl 0,5 M.

Les IgY totales purifiées sont mises en contact avec le gel.L’élution des IgY non fixées est

suivie par mesure de l’absorbance à 280 nm. Les IgY spécifiques sont alors éluées avec un

tampon glycine à pH 3.(Seddiki, 2009)

51

II.3.3 Electrophorèse sur gel polyacrylamide 12% en conditions

dénaturantes (SDS-PAGE)

Cette technique nous a permis d’analyser les fractions d’élution de la chromatographie

d’affinité en visualisant directement les protéines par coloration du gel au bleu de Coomassie.

Le SDS est un détergeant anionique qui se fixe sur les protéines et leur donne une charge

globale négative. Le même nombre de molécules de SDS se fixe par unité de masse de

protéines ; la charge des protéines est proportionnelle à leur masse moléculaire relative (Mr).

Soumis à un champ électrique, les complexes SDS-protéine migrent de la cathode vers

l’anode en fonction inverse de leur masse moléculaire relative.

Les fractions à déposer ont été préalablement diluées en tampon échantillon réducteur (voir

annexe), chauffées à 100°C pendant 3 minutes puis centrifugées. Les échantillons ont été

analysés sur gel à 12%. La migration a été faite à 10 mA dans le gel de concentration, et à 20

mA dans le gel de séparation. Le Magic Mark (Invitrogen) est un marqueur de taille allant de

12 000 à 20 000 et est visualisé lors de la révélation par luminescence.

II.3.4 Western blot et révélation par chimioluminescence

La qualité des IgY spécifiques est analysée par la technique du western blot. Des échantillons

contenant rSOx ou hQ6 sont soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS 12%

comme décrit précédemment. Après la migration, le gel est soumis à un électrotransfert en

milieu liquide sur membrane de nitrocellulose Hybond-ECL (Amersham Pharmacia Biotech)

avec le système de transfert Mini-Trans-Blot Cell (Bio-Rad) pendant 15 heures à 4°C, à 40 V

en tampon Tris 24 mM, glycine 192 mM, éthanol 20% (Générateur Bio-Rad Power Pac 3000).

Le gel de polyacrylamide-SDS est coloré au bleu de Coomassie et la membrane au rouge

Ponceau pour contrôler la qualité du transfert. La membrane est placée dans du rouge Ponceau

pendant 10 minutes, puis décolorée dans des bains successifs d’eau ultra-pure.

La membrane est ensuite incubée dans du tampon PBS (tampon phosphate de sodium 10 mM,

pH 7,4, NaCl 0,15 M) Tween 20 0,1%, lait écrémé déshydraté 10%, pendant une heure à 37°C

afin de saturer les sites de fixation non spécifiques. La membrane est ensuite incubée avec

37,5 µL de la fraction contenant les IgY spécifiques anti-sulfhydryl oxydase de rat, dilués dans

10 mL de tampon PBS, Tween 20 0,1%, lait 5% à température ambiante, pendant 1 heure sous

agitation. Puis, la membrane est lavée 3 fois 5 minutes dans le PBS, Tween 20 0,1%, et

incubée à température ambiante, pendant 1 heure sous agitation avec des IgG de lapin anti

IgY de poulet conjugués à la peroxydase (Sigma, A9046) dilués au 1/15000 dans du PBS,

Tween 20 0,1%, lait 5%. A nouveau, la membrane est lavée 3 fois 10 minutes. Les protéines

52

ayant fixé les anticorps sont alors révélés par chimioluminescence avec un kit substrat ECL

(Amersham Pharmacia Biotech). En présence d’H2O2, la peroxydase libère H2O +1/2O2.

L’oxygène oxyde le luminol en milieu alcalin et le luminol oxydé, instable, revient à son état

fondamental stable en émettant de la lumière à 428 nm qui va impressionner un film

photographique (précipitation des sels d’argent).

II.4 Mesure de l’activité oxydasique des sulfhydryl oxydases

II.4.1 Principe de dosage de l’oxydation du DTT par le DTNB

Pour réaliser cette mesure, nous avons utilisé comme substrat le dithiothréitol (DTT)

(Référence 708984 lot 85849121, Boehringer) qui possède deux groupements SH. La

sulfhydryl oxydase, mise en présence de DTT réduit, catalyse la formation d’un disulfide

interne suivant la réaction décrite dans la figure 16.

Figure 17 : Réaction d’oxydation du DTT catalysée par la sulfhydryl oxydase de rat.

L’oxydation du DTT réduit par la sulfhydryl oxydase conduit à la formation d’un pont

disulfure (catalague Boehringer).

La quantité de thiols libres présente dans le milieu est évaluée grâce au réactif des thiols

l’acide 5,5’-dithiobis 2-nitrobenzoïque (DTNB). Le DTNB (référence D-8130, lot 54H0479,

Sigma) réagit avec les thiols libres pour former un disulfide mixte libérant ainsi l’acide 5-thio-

2-nitrobenzoïque (TNB) (figure 17), chromophore qui possède un maximum d’absorption à

412 nm avec un coefficient d’extinction molaire de 13600 M-1

.cm-1

. Cette méthode nous

permet de mesurer la disparition des thiols libres présents dans le milieu réactionnel en

fonction du temps et de déduire la vitesse d’oxydation.

OH

OH

s

s

+ H2O2 + O2 Thiol

oxydase

DTT réduit DTT oxydé

SH OH

SH OH

53

+

Acide 5-thio-2-nitrobenzoïque Disulfide mixte

(Chromophore : coloration jaune)

Figure 18 : Réaction du DTNB avec les thiols libres.

II.4.2 Mesure de l’activité oxydasique des surnageants de culture

Les mesures de l’activité oxydasique sur les surnageants de culture concentrés ont été

effectuées dans les conditions suivantes:

Surnageant de culture

Concentré 20 fois

Témoin sulfhydryl

oxydase (rSOx)

Témoin DTT

Volume de tampon 34,6 µL 37,6 µL 39,6 µL

Volume de rSOx 0 µL 2 µL 0 µL

Volume d’échantillon 5 µL 0µL 0 µL

Volume de DTT 200 mM 0.4 µL 0.4 µL 0.4 µL

Volume total 40 µL 40 µL 40 µL

La sulfhydryl oxydase purifiée à partir des sécrétions des vésicules séminales de rat a été

utilisée comme témoin d’activité (6,6 10-7

M). Un témoin DTT seul et un témoin DTNB sont

réalisés lors de chaque étude d’activité. La concentration finale en DTT est 2 mM. Le tampon

utilisé est un tampon Tris 0,1 M, pH 8,14, NaCl 0,15 M. Chaque mélange réactionnel est

incubé au bain-marie à 25°C et nous avons prélevé 5 µL de milieu réactionnel à différents

temps. Les 5 µL alors sont ajoutés immédiatement à un mélange préparé extemporanément de

600 µL de tampon (tampon Tris 0,1 M, pH 8,14, NaCl 0,15 M) et 7 µL de DTNB 20 mM

(référence D-8130, lot 54H04019, SIGMA). L’absorbance à 412 nm est mesurée avec un

spectrophotomètre CARY 100 SCAN.

+ R-SH H

R

H

O

H

H

DTNB

54

II.4.3 Analyse de l’activité protéasique à cystéine

Afin de tester une éventuelle présence d’activité protéasique à cystéine dans les

surnageants potentiellement activé par l’incubation avec le substrat DTT 2mM, nous avons

utilisé le substrat fluorigénique Z-FR-AMC (Benzyloxycarbonyl-L-phénylalanyl-L-arginyl-7-

amino 4 méthyl-coumarine) (Calbiochem). L’activité a été mesurée par la fluorescence

détectée due à la libération le fluorophore AMC. La fluorescence est mesurée avec un

spectrofluomètre, lecteur de microplaques Spectramax Gemini (Molecular Devices, France).

Les mesures ont été effectuées avec une microplaque de 96 puits contenant par puits 100 µL

de tampon d’acétate de sodium 0,2 M, DTT 4 mM, pH 5,0 auquel est rajouté 80 µL

d’échantillon de surnageants non concentrés, puis 25 µL de substrat (10 mM dilué dans le

DMF (diméthylformamide). L’incubation s’étend sur deux heures et la lecture s’effectue toutes

les 30 secondes à une longueur d’onde d’excitation de 350 nm et une longueur d’onde

d’émission de 460 nm. Le surnageant utilisé pour ce test provient de la lignée cellulaire H1838

issus d’adénocarcinome pulmonaire aux différents temps, T1, T2, T3, le témoin est le milieu

seul sans SVF. Les temps T1, T2 et T3 correspondent aux temps de 3, 5 et 7 jours après

ensemencement respectivement.

II.5 Analyses statistiques

L’analyse statistique a été réalisée par le test one-way ANOVA et post test de Tukey's

Multiple Comparaison Test : L’activité oxydasique des SOx/Q6 dans les différents surnageants

en fonction du temps de culture des cellules et pour la comparaison entre les résultats de

l’activité oxydasique entre les lignées cellulaires.

55

RESULTATS

56

Résultats et discussion de l’étude

épidémiologique

57

I.1.L’étude épidémiologique du cancer pulmonaire de la région

oranaise

Une étude rétrospective a porté sur 173 patients atteints d’un cancer du poumon et traités au

service de radiothérapie du CHU Oran, entre Janvier 2004 et Décembre 2007.

I.1.La mise en évidence des données épidémiologiques

I.1.1.La répartition du cancer pulmonaire en fonction la localisation

La nature a fait que l’Homme est une paire de poumon. Cependant la taille des poumons n’est

pas identique (figure 2), le poumon gauche est plus petit que le poumon droit.

Dans cette optique nous avons étudié lequel des deux poumons est le plus touché par le cancer

chez les patients. Les résultats montrent que 57% le poumon droit atteint et 43% pour le

poumon gauche (figure19). On n’a pas pu obtenir une hypothèse convaincante pour expliquer

cette tendance.

Figure 19: Répartition des cas recensés en fonction de la localisation

du cancer pulmonaire.

I.1.2.La répartition des cas étudiés en fonction des tranches d’âge

Les données recueillies du service radiothérapie montrent que le plus grand pourcentage

(30%) des patients malades fait parti de la tranche d’âge de 50 et 60 ans. Ce qui correspond à

une durée de 25 à 35 ans de tabagisme, bien sûre si on considère que le facteur inducteur est la

fumée. En revanche les jeunes moins de 40 ans, la pathologie est moins observée avec 4% ce

qui pourrait s’expliquer par une exposition à la fumée secondaire (tabagisme passif) puis le

tabagisme, soit une exposition à un autre facteur cancérigène, ou même une prédisposition à ce

type de cancer (tableau 3, figure 20).

58

Tableau 3: Répartition des cas étudiés au CHO d’Oran en fonction de l’âge

Age < 40 41-50 51-60 61-70 71-80 >80

Nombre 6,92 25,95 51,9 48,44 25,95 13,84

Pourcentage 4% 15% 30% 28% 15% 8%

Figure 20 : Répartition des cas étudiés en fonction de l’âge

I.1.3.La répartition des cas étudiés selon le stade d’évolution de la pathologie

La classification TNM de l’Union Internationale Contre le Cancer (UICC) est le mode de

classification le plus communément utilisé, il se repose sur l’extension tumorale locale,

régionale et métastatique.

Les lettres T, N et M correspondent respectivement à la taille de la tumeur, l’existence

d’adénopathies satellites et aux métastases.

En se basant sur cette classification, on a observé qu’une grande partie des patients

diagnostiqués est au stade très avancé de la maladie, le pic a enregistré 59% au stade final T4

(tableau4, figure 21).

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

< 40 41-50 51-60 61-70 71-80 >80

Age

P

O

U

R

C

E

N

T

A

G

E

59

Tableau 4 : Répartition des cas selon la classification du TNM

Figure 21 : La répartition des cas étudiés selon le stade

d’évolution du cancer broncho-pulmonaire.

I.1.4.La répartition des cas étudiés selon le caractère histologique

Les tumeurs broncho-pulmonaire sont essentiellement mais non exclusivement, représentées

par les tumeurs épithéliales dont on distingue trois variétés principales : les carcinomes

épidermoïdes, les adénocarcinomes et les tumeurs neuroendocrines.

Le carcinome épidermoïde est une tumeur constituée de cellule de différenciation

malpighienne. Les adénocarcinomes sont des carcinomes de différenciation glandulaire, d’où

la localisation est à prédominance parenchymateuse, sont très hétérogènes. Les tumeurs

neuroendocrines présentent un large spectre d’hétérogénéité ce qui lui procure de l’agressivité.

L’étude histologique sur les patients montre que 58,38% représente le type épidermoïde, et

35,83% est du type d’adénocarcinome (tableau 5, figure 22).

La prédominance du type épidermoïde se traduit par le fait d’une déviation du renouvellement

des cellules épithéliales, ceci peut être accidentel et fugace, mais sous l’influence de certains

TNM Cas P%

T1 0 0%

T2 31 21,38

T3 34 19,65

T4 102 58,95

60

facteurs (tel que le tabac) cette métaplasie de morphologie peut s’installer à long terme et subir

des altérations.

Tableau 5: Répartition des cas selon le type histologique

Type histologique Nombre de cas Pourcentage %

Carcinome épidermoïde 101 58,38%

Adénocarcinome 62 35,83%

Non précisé 10 5,78

Figure 22 : Répartition des cas en fonction du type histologique du cancer broncho-

pulmonaire les plus représentatifs de la région oranaise.

Résultats (II)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Carcinome épidermoide Adénocarcinome Non Précisé

61

II.1 Purification des anti-corps IgY spécifiques de la sulfhydryl oxydase de rat

A partir des œufs 399 et 400, nous avons extrait respectivement 52,8 mg et 23,37 mg d’IgY.

Les IgY spécifiques représentent entre 1 et 2 % de ces IgY totales soit entre 528 µg et 1 mg

pour l’œuf 399.

Nous avons entrepris la purification des IgY spécifiques anti-rSOx à partir de l’extrait de l’œuf

399 par chromatographie d’affinité sur le gel rSOx-Sepharose. Le profil d’élution à 280 nm

montre 2 pics de protéines. Un pic correspondant aux IgY non retenues et un deuxième pic

correspondant aux IgY spécifiques (figure 23).

Les interactions antigène- anticorps sont affaiblies par l’exposition à un pH acide, ce principe

est souvent utilisé pour la dissociation des complexes antigène-anticorps lors des

chromatographies d’affinité.

Cependant, la littérature nous indique qu’une instabilité particulière des IgY à pH acide

pouvait entraîner leur dénaturation. Au cours du protocole le risque de dénaturation existe

aussi bien pour les IgY spécifiques éluées que la rSOx couplée au gel. Nous avons choisi des

conditions qui permettaient de stabiliser très rapidement ces protéines et nous avons utilisé un

sucre très soluble, le D(+) tréhalose connu pour sa propriété stabilisatrice des protéines à des

concentrations relativement modérées [43].

Nous avons coloré ces fractions après électrophorèse en gel de polyacrylamide au bleu de

Coomassie. Nous avons ainsi pu sélectionner les fractions fixées analysées (figure 24) pour la

détection spécifique de la sulfhydryl oxydase. Nous avons aussi déterminé le seuil de détection

de nos IgY purifiées, il apparaît que les anticorps peuvent reconnaître une quantité de

sulfhydryl oxydase de rat de 5 ng (figure 25).

Par western blot, les résultats montrent que les anticorps spécifiques IgY rSOx sont capables

de reconnaître la SOx/Q6 humaine dans les surnageants de fibroblaste pulmonaire WI38 (Mr

84000) et dans le liquide séminal (Mr 64000) (figure 26). On peut donc considérer que la

bande de Mr 64000 observée dans le liquide séminal et la bande Mr 84000 observée dans les

surnageants de culture des fibroblastes WI38 correspondent respectivement aux formes courte

et longue de la quiescine Q6 humaine. Cependant, les résultats indiquent aussi que les

anticorps IgY spécifiques non seulement ont la capacité de reconnaître la quiescine Q6

humaine mais aussi la quiescine Q6 bovine présente dans le SVF et qui apparaît à une masse.

62

60000 80000

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figure 23: Purification des IgY anti-rSOx spécifiques par chromatographie d’affinité. Les IgY

extraites du jaune d’œuf de poule, reprises dans 9 ml de tampon phosphate, ont été ajoutées au gel de

Sepharose couplé avec rSOx sous agitation pendant 2 heures après lavage en tampon borate. Les IgY

spécifiques ont été éluées avec du tampon glycine 100 mM, pH 3,0 contenant 15% de D(+) tréhalose et

neutralisées immédiatement avec du Tris 1M, pH 8,0.

Figure 24: Analyse de la pureté des IgY spécifiques par affinité sur gel de polyacrylamide à 12%.

Le gel de polyacrylamide à 12% coloré en bleu de Coomassie. Puits 1: étalon MagicMark, puits 2

fraction non fixée n°1 (12 µl), puits 3 fraction non fixée n° 21 (12 µl), puits 4), 5), 6) ,7), 8) fractions

fixées 1, 2, 3, 4, 5 (12 µl), puits 9 IgY totales (1µl).

Purification d'Igy spécifique rSOx

0

0,5

1

1,5

2

2,5

10 30 50 70 90

volume

DO

à 2

80 Tp glycine

pH 3

63

moléculaire relative de 84000 (figure 27) et peut potentiellement interférer avec les mesures

d’activité oxydasiques.

II.2 Analyse des activités oxydasiques des surnageants de culture cellulaire

Nous avons déterminé l’activité oxydasique dans les surnageants de culture de différentes

lignées cellulaires tumorales pulmonaires en fonction de l’état de confluence.

En raison des faibles quantités de sulfhydryl oxydase sécrétées par les cellules en culture nous

avons dû concentrer 20 fois chaque échantillon avant de procéder à l’analyse de son activité.

Nous avons employé une méthode colorimétrique avec le DTNB, celui-ci réagit avec les thiols

libres présents dans le milieu réactionnel. En présence de sulfhydryl oxydase, le DTT à 2 mM

disparaît progressivement du milieu réactionnel. La pente de la représentation de la

concentration en thiols libres en fonction du temps est proportionnelle à l’activité oxydasique

de l’échantillon.

Dans un premier temps, nous avons analysé l’activité de la sulfhydryl oxydase de rat (rSOx)

(6,6 10-7

M), enzyme purifiée à partir du liquide des vésicules séminales de rat. Nous

atteignons une oxydation totale du DTT au bout de 20 minutes (figure 26). Cette expérience

nous sert de témoin vis-à-vis de l’activité sulfhydryl oxydase sécrétée par les différentes

lignées cellulaires tumorales.

64

Figure 25 : Analyse par western blot du seuil de détection de rSOx par les IgY spécifiques.

1) étalon MagicMark, puits 2), 3), 4), 5) rSOx à des dépôts de 40, 20, 10, 5 ng respectivement.

Figure 26: Analyse par Western blot de la reconnaissance de la sulfhydryl oxydase/quiescine Q6

humaine par les IgY spécifiques. 1): étalon MagicMark, 2) rSOx purifiée (0,04µg), 3) liquide séminal

humain (3 µL), et 4) surnageant de culture des fibroblastes WI38 concentré 20 fois (3µL).

Figure 27: Analyse par Western blot de la présence de sulfhydryl oxydase dans le sérum de veau

fœtal. 1), 7 µL de surnageant de culture des fibroblastes WI38 concentré 20 fois, 2) milieu de culture

RPMI contenant 10% de SVF concentré 20 fois (7µL), 3) SVF pur (2µL).

66000

Puits 1 2 3 4 5

Puits 1 2 3 4

66000

84000

Puits 1 2 3

84000

65

rSOx

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30

Temps (minutes)

A 4

12

nm

Figure 28: Activité oxydasique de la sulfhydryl oxydase de rat. La sulfhydryl oxydase de rat a été

incubée avec 2 mM de DTT, à 25°C. la concentration en thiols est exprimé en absorbance (A) à 412

nm.

Figure 29 : Activité oxydasique du milieu de culture contenant le sérum de veau fœtal. Analyse de

l’activité oxydasique dans le SVF seul en fonction des temps d’incubation T0, T1, T2, T3. 5µL de SVF

concentré 20 fois a été incubé avec 2 mM de DTT, à 25°C. L’activité est exprimée en ∆A412

nm/minute. Les T1, T2 et T3 correspondent aux temps d’incubation de 3, 5 et 7 jours respectivement.

(= p<0,01 ; = p<0,001).

T0 T1 T2 T30.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0035

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

ute

SVF

***

***

**

66

Le milieu de culture des cellules contient 10% de SVF, nous avons donc avant d’exploiter les

résultats, mesuré l’activité oxydasique du SVF. Pour cela nous avons incubé le SVF dans les

mêmes conditions que les milieux conditionnés par les lignées cellulaires soit en étuve à CO2

à 37°C pendant 3, 5 et 7 jours. La présence d’une activité oxydasique dans le SVF a été

observée, cette activité présente une tendance à baisser avec le temps d’incubation, cette

baisse s’est avéré très significatif (p<0,001) (figure 29). Au vu de cette baisse d’activité au

cours du temps, nous avons effectué un contrôle dans le but de vérifier si l’activité sulfhydryl

oxydase dans les surnageants pouvait être dégradée par des protéases présentes en utilisant le

substrat Z-FR-AMC. C’est un substrat qui est clivé en particulier par les protéases à cystéine.

Le substrat a été rajouté aux surnageants de la lignée cellulaire H1838, et au milieu de culture

seul. Après incubation, les courbes de fluorescence obtenues montrent une absence d’activité

protéasique dans les surnageants analysés. Cette activité associée au milieu de culture a été

soustraite des valeurs d’activité oxydasique obtenues pour les surnageants de culture pour

obtenir une valeur plus représentative de la sécrétion de SOx/Q6 cellulaire.

Les résultats montrent que l’activité de la sulfhydryl oxydase sécrétée dans les surnageants

de culture cellulaire des lignées WI38, Calu-1, H1838, H358, H460, H23, A549, H520

(figure 30 et 31) présente une augmentation en fonction du temps d’incubation, indiquant une

capacité de synthèse et de sécrétion conservée pour les différentes lignées.

Une comparaison de la sécrétion et d’activité oxydasique entre les lignées cellulaires : WI38

et les autres lignées cellulaires est de significatif soit très significatif. D’autre part la

comparaison entre les lignées H358 et H1838 avec les autres lignées les résultats sont

également entre significatif et très significatif (p<0,05 et p<0,001, n=3).

67

Figure 30: Les activités oxydasiques corrigées des surnageants des lignées cellulaires

pulmonaires. Les valeurs d’activité oxydasique du SVF sont soustraites des valeurs brutes des

surnageants de cultures cellulaires. Les lignées cellulaire ont été incubées à 37°C soit à un temps de 3

jours (T'1), soit 5 jours (T'2), soit à 7 jours (T'3) dans du milieu culture contenant 10% de SVF. Les

activités oxydasiques sont exprimées ∆ A412nm/ minute (=p<0,05 ;= p<0,01 ; =

p<0,001).

H1838

T'1 T'2 T'30.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

***

***

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

T'1 T'2 T'30.000

0.005

0.010

0.015

0.020

WI38

***

***

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

H23

T'1 T'2 T'30.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

T'1 T'2 T'30.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

H549

***

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

68

Figure 31 : Les activités oxydasiques corrigées des surnageants des lignées cellulaires

pulmonaires. Les valeurs d’activité oxydasique du SVF sont soustraites des valeurs brutes des

surnageants de cultures cellulaires. Les lignées cellulaire ont été incubées à 37°C soit à un temps de 3

jours (T'1), soit 5 jours (T'2), soit à 7 jours (T'3) dans du milieu culture contenant 10% de SVF. Les

activités oxydasiques sont exprimées ∆ A412nm/ minute. (=p<0,05 ;= p<0,01 ; =

p<0,001).

H460

T'1 T'2 T'30.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

***

***

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

H520

T'1 T'2 T'30.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

***

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

Calu-1

T'1 T'2 T'30.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

*

**

Temps (Jours)

A

412 n

m/

min

H358

T'1 T'2 T'30.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

**

***

Temps (Jours)

A 4

12 n

m/

min

69

DISCUSSION

Des résultats de la sulfhydryl oxydase

70

Discussion des résultats de la sulfhydryl oxydase

Le peu d’étude effectuée sur la protéine SOx/Q6 montre son implication dans le cancer

broncho-pulmonaire non à petites cellules. Dans ce contexte, le but de ce travail est de

vérifier l’expression de SOx/Q6 dans les lignées tumorales pulmonaires et analyser le niveau

de sécrétion de la SOx/Q6 humaine à différents stades de prolifération par mesure de

l’activité oxydasique.

Les sulfhydryl oxydases FAD dépendante, ont été identifiées et caractérisées par leur activité

oxydasique dans divers tissus et en particulier dans les vésicules séminales de rat [44]. Leur

identification avec la quiescine Q6 a été plus récente [45], [38]. Les quiescines sont des gènes

qui s’expriment dans la lignée fibroblastique pulmonaire humaine WI38 lors de son entrée en

quiescence [39]. Parmi ces gènes se trouvent des gènes de chaînes de protéines de la matrice

extracellulaire (collagènes, décorine) ainsi la SOx/Q6. Un second ADNc issus d’une

expression pulmonaire a aussi été décrit et nommé ″Cell Growth Inhibiting Factor″ (CGIF).

Ces deux ADNc correspondent à deux formes d’épissage issues du gène SOx/Q6. L’ADNc

quiescine Q6 correspond à la forme longue codant pour une protéine de Mr 80000 et l’ADNc

CGIF correspond à la forme courte codant pour une protéine de Mr 66000.

De nombreuses questions restent à résoudre concernant ces enzymes, celle de leurs fonctions

cellulaires et celle de leur implication dans les pathologies pulmonaires. Il est mené en

parallèle avec des études sur l’expression des messagers dans ces mêmes lignées, ainsi que

des études sur l’implication de ce gène dans le cancer broncho-pulmonaire au sein du groupe

thématique. A l’aide des anticorps anti-sulfhydryl oxydase de rat obtenus chez la poule et

purifiés, nous avons pu mettre en évidence les deux formes protéique de quiescine Q6

humaine par immunodétection, soit la forme longue (Mr 84000) dans le surnageant de

fibroblaste pulmonaire WI38, soit la forme courte (Mr 66000) dans le liquide séminal

humain. Ces anticorps sont capables de reconnaître les deux formes de la SOx/Q6 qui ne

semblent pas co-exprimées dans les mêmes échantillons biologiques.

Par ailleurs, en utilisant les anticorps purifiés, nous avons pu détecter une forme longue de

Mr proche de 84000 présentes dans le SVF. Cette observation corrèle avec les résultats déjà

décrits dans la littérature [46]. Ces résultats suggèrent aussi que la sulfhydryl oxydase bovine

porte des épitopes communs avec les sulfhydryls oxydases/ quiescine Q6 humaine et de rat,

ce qui est représentatifs de l’homologie que possèdent entre eux les différents membres de la

famille des SOx/Q6. Cependant, la présence de SOx/Q6 bovine dans le SVF risque

d’interférer avec le dosage de l’activité oxydasique sécrété, par les cellules.

71

Nous avons effectivement observé au cours des expériences que le sérum de veau fœtal seul

présente une faible activité oxydasique avec le substrat DTT. Cette activité décroît avec le

temps d’incubation en étuve à CO2. Nous n’avons observé aucune activité protéolytique dans

les surnageants non concentrés issus de la lignée cellulaire ce qui suggère que la protéolyse

ne semble pas influencer sur le niveau d’activité oxydasique mesuré.

La présence de la sulfhydryl oxydase/ quiescine Q6 bovine dans le milieu de culture à 10 %

de SVF interfère cependant avec les mesures d’activité de SOx/Q6 sécrétée par les cellules.

Pour cette raison nous avons soustrait l’activité oxydasique des milieux de culture des

activités brutes pour faire ressortir l’activité propre des lignées cellulaires.

Nous avons observé une accumulation progressive de l’activité oxydasique en fonction du

temps d’incubation. Cependant, les niveaux d’activités sont variables en fonction des lignées

cellulaires. Les lignées cellulaires tumorales pulmonaires sécrètent de façon nettement plus

faible que les fibroblastes WI38 (p<0,001) (figure 32). Cependant la comparaison de

l’activité oxydasique entre les lignées cellulaires montre que les H358 et H1838 la plus forte

sécrétion au stade 3 de façon significatif (p<0,05) à très significatif (p<0,01;p<0,001)

(figure 33).

72

Figure 32 : Comparaison des activités oxydasiques entre les lignées cellulaires et la WI38.

Représentation des activités oxydasiques des lignées cellulaires en valeurs corrigées par jour

et par nombre de cellules. (= p<0,001 ; n=3).

Figure 33 : Comparaison des activités oxydasiques entre les lignées cellulaires.

Représentation des activités oxydasiques des lignées cellulaires en valeurs corrigées par jour

et par nombre de cellules. (=p<0,05 ; = p<0,01 ; = p<0,001 ; n=3).

WI38 H358 H1838 Calu 1 H23 H460 A549 H520

0

2.5×10-9

5.0×10-9

7.5×10-9

1.0×10-8

1.3×10-8

Lignées cellulaires

Ac

tivit

é o

xyd

asiq

ue n

orm

ali

sée à

S 3

H358 H1838 Calu 1 H23 H460 A549 H5200

1.0×10-10

2.0×10-10

3.0×10-10

4.0×10-10

5.0×10-10

6.0×10-10

*

**

**

***

***

**

*****

***

Lignées cellulaires

Ac

tivit

é o

xyd

asiq

ue n

orm

ali

sée à

S 3

73

Figure 34 : Comparaison des activités oxydasiques entre les lignées cellulaires.

Représentation des activités oxydasiques des lignées cellulaires : WI38, H1838, Calu -1 et

H358 en valeurs corrigées par jour et par nombre de cellules (=p<0,05 ;= p<0,01 ;

= p<0,001, n=3).

WI 38

S1 S2 S30

4.0×10-9

8.0×10-9

1.2×10-8

1.6×10-8

2.0×10-8

**

*

Stade de la culture

Ac

tiv

ité

ox

yd

as

iqu

e n

orm

ali

sé

e

H 1838

S1 S2 S30

5.0×10-10

1.0×10-09

1.5×10-09

** **

Stade de la culture

Ac

tiv

ité o

xyd

as

iqu

e n

orm

ali

sé

eH 358

S1 S2 S30

1.0×10-10

2.0×10-10

3.0×10-10

4.0×10-10

5.0×10-10

6.0×10-10

***

Stade de la culture

Ac

tiv

ité o

xy

das

iqu

e n

orm

ali

sé

e

74

La présentation de l’accumulation de l’activité au cours du temps a été normalisée par jour et

par le nombre de cellules afin d’essayer de voir si la production était sensible à l’état de

passage à l’état de quiescence.

Nous avons pu déterminer trois comportements de sécrétion de l’activité oxydasique chez les

cellules étudiées. Un comportement observé chez la lignée cellulaire WI38 où la sécrétion est

induite par la confluence, un comportement présenté par les lignées H1838, H23 et Calu1,

caractérisé par une forte sécrétion au moment de la croissance. Alors que les lignées cellulaires

H358, H460, H520, A549 enregistrent une augmentation importante de la sécrétion post-

confluence (figure 34).

On peut supposer que le moment de sécrétion de SOx/Q6 et la modulation de son niveau

diffèrent d’un groupe de lignées cellulaires à un autre. Un groupe a tendance à une sécrétion

liée à la prolifération, un groupe a tendance à une sécrétion régulée par la confluence comme

les fibroblastes WI38, un autre a tendance à une sécrétion plus tardive comme les cellules

H358 après confluence. Enfin, un troisième groupe semble avoir perdu la modulation de la

sécrétion vis-à-vis de la confluence. Ces résultats suggèrent probablement que l’expression de

SOx/Q6 est au besoin de la cellule de produire des protéines contenants un ou plusieurs ponts

disulfures. Dans l’intestin grêle, par immunohistologie, les cellules neuroendocrines qui

sécrètent des peptides contenant des ponts disulfures, présentent un marquage de QSOx1

intense [47].

75

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

76

Conclusion et perspectives

Toutes les études ont confirmées l’effet néfaste du tabac sur la santé du fumeur et sur son

entourage par le tabagisme passif. La fumée de la cigarette et la pollution induisent des

dérèglements du métabolisme cellulaire engendrant ainsi le cancer broncho-pulmonaire.

Les données épidémiologiques de la littérature indiquent que le pourcentage du cancer

broncho-pulmonaire est en croissance continue. A Oran, le pourcentage du cancer broncho-

pulmonaire est de 17,5 % parmi les différents types de cancers. Une estimation de 88 cas

annuel est enregistrée à Oran toute seule, dans un état avancé de la maladie, de plus la durée de

survie est estimée de 5 ans.

Pour une meilleure survie des patients, il faut améliorer leurs prise en charge la plus adaptée

possible aux différentes caractéristiques des patients. Celle-ci repose sur une analyse précise

des facteurs pronostiques.

Dans cette optique, nous avons vérifié l’existence de la protéine SOx/Q6 dans les surnageants

des différentes lignées cellulaires broncho-pulmonaires et les variétés de cette protéine, ainsi

que sa production et son activité extracellulaire.

Les résultats obtenus d’activité sont en corrélation avec les résultats de western blot montrent

que la SOx/Q6 essentiellement la forme longue contribue à l’activité oxydasique dans les

surnageants, issus des lignées broncho-pulmonaire. Cependant, on ne peut pas exclure la

sécrétion d’autres sulfhydryl oxydases. Nous somme donc en présence d’une protéine

d’expression ubiquitaire même dans les lignées tumorales pulmonaires dont il faudra envisager

l’inactivation de la SOx/Q6 pour aborder le rôle cellulaire.

Nous envisageons donc d’étudier l’effet de l’inactivation par siRNA de SOx/Q6 sur le

comportement des lignées tumorales pulmonaires (migration, invasion par exemple). Une autre

étape consistera à produire les mutants des domaines thiorédoxine et ERV de SOx/Q6. Enfin,

la compréhension de la non-expression de la forme courte dans ces cellules tumorales

pulmonaires humaines contribuera à la compréhension des mécanismes de régulation de

l’expression des SOx/Q6 et à l’analyse de leur implication dans le cancer broncho-pulmonaire.

77

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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82

Annexe 1

Réactifs pour SDS-PAGE

Réactifs : - Tris ( Euromedex, 26-128-3094B)

- SDS en solution 20% (Euromedex, EU0660B)

- Polyacrylamide 40% w/v (Qbiogene, Biac 3751)

- TEMED (Euromedex, 50406)

- Glycine (Euromedex, 26-128-6405)

- HCl en solution à 37% (Merck, 1L 1000)

Solutions :

1) Tris-SDS pH 8,8 (Tris 0,75 M, SDS 0,2 % w/v)

- Tris ………………………22,7 g

- SDS 20% …………………2,5 mL

- HCl ……………………….ajuster à pH 8,8

- H2O………………………..qsp 250 mL

2) Tris-SDS pH 6,8 (Tris 0,25 M, SDS 0,2% w/v)

- Tris …………………………..7,6 g

- SDS 20%.................................2,5 mL

- HCl …………………………..ajuster à pH 8,8

- H2O………………………….qsp 250 mL

3) Tampon échantillon non réducteur :

- Tris 0,25 M, SDS 0,2% pH 6,8....5 mL

- SDS 20%.……………………….4 mL

- Glycérol 30%……………………6 mL

- Bleu de bromophénol …………...40 µL

- H2O………………………….qsp 20 mL

Pour obtenir un tampon échantillon réducteur, nous ajoutons 10 % de mercaptoéthanol (Sigma, M-

7154) lors de la préparation des échantillons.

4) Tampon d’éléctrode Tris-glycine (Glycine 0,192M, Tris 0,05M)

- Glycine…………………………...28,8 g

- Tris …………………………..........6 g

- SDS 20% …………………………5 mL

- H2O……………………………….qsp 1000 mL

5) Persulfate d’ammonium 10%

- Persulfate d’ammonium………......0,1 g

- H2O……………………………….1 mL

Gel de séparation (polyacrylamide 12%)

- Acrylamide ……………………......1,2 mL

- Tampon pH 8,8 …………………….2 mL

- TEMED……………………………0,005 mL

- Persulfate d’ammonium…………...0,033 mL

- H2O………………………………..0,8 mL

Gel de concentration (polyacrylamide 5%)

- Acrylamide …………………….......0,250 mL

- Tampon pH 6,8 …………………....1 mL

- TEMED……………………………0,005 mL

- Persulfate d’ammonium…………...0,100 mL

- H2O………………………………...0,850 mL

100 µL de Persulfate 10% et 5µL TEMED à ajouter au moment de couler le gel

Solution de coloration : rouge Ponceau

-Rouge ponceau …………………… 2 g

-Acide trichloracétique…………….. 30 g

-H2O……… ………………………. 1 L

83

Annexe 2

Tableau 6 : L’origine des lignées cellulaires humaines utilisées et la provenance des lignées est

de l’ATCC (American Type Culture Collection)

Lignées cellulaires Origine

WI38 Fibroblaste pulmonaire

Calu-1 Carcinome épidermoïde, site de métastase est

dans la membrane pleurale

H23 Adénocarcinome non à petites cellules

H1838 Adénocarcinome non à petites cellules

H358 Carcinome broncho-alvéolaire

A549 Carcinome épithéliale

H520 Carcinome Adéno-squameux

H460 Carcinome à cellules géantes, site de métastase

est dans la membrane pleurale