Étude du microbiote de la sève d'érable et de son impact sur la ...

MARIE FILTEAU

ETUDE DU MICROBIOTE DE LA SEVE D'ERABLE ET DE SON IMPACT SUR LA QUALITÉ DU SIROP

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en Sciences et technologie des aliments pour l'obtention du grade de Philosophiœ Doctor (Ph.D)

DEPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2011

Marie Filteau, 2011

Résumé Récemment, les méthodes de récolte de la sève d'érable, mais aussi les méthodes

d'analyses microbiologiques ont évolué. Les travaux présentés avaient pour objectif la

caractérisation du microbiote acéricole par des méthodes moléculaires et la description

de son impact quantitatif et qualitatif sur la qualité du sirop d'érable. Des analyses

microbiologiques conventionnelles, physicochimiques et sensorielles ont été effectuées

sur des échantillons de sève et de sirop provenant de sites québécois au cours de la

période de récolte. De nouvelles méthodes moléculaires culture-indépendantes (profilage

PCR communautaire, MARISA) ont permis de caractériser la structure et la composition

du microbiote dans le temps et dans l'espace. Le site de production a été identifié

comme étant le facteur le plus déterminant pour la composition alors que la période de

récolte correspondait à un changement dans la structure des communautés microbiennes.

Le séquençage de banques de clones et des essais qPCR spécifiques ont permis

respectivement d'identifier et de quantifier les principales bactéries et levures de la sève

d'érable. Puisque Pseudomonas fluorescens, Rahnella spp., Mrakia spp., Mrakiella spp.

et Guehomyces pullulons ont été retrouvés à chaque site de production et qu'ils étaient

aussi présents tout au long de la période de récolte, ces microorganismes sont considérés

comme des membres stables du microbiote acéricole. Les analyses multivariées ont

révélé des associations entre l'abondance relative de plusieurs contaminants et les

propriétés de la sève et du sirop d'érable. Notamment des levures telles que Candida

sake, Williopsis sp. et G. pullulons sont successivement associées à la quantité de

glucose et de fructose dans la sève d'érable. En fin de saison, les bactéries du groupe P.

fluorescens et les levures du genre Mrakia sont positivement associées aux flaveurs

d'érable et de vanille. Ces résultats illustrent les deux facettes de l'impact de la

communauté microbienne de la sève d'érable qui peut être associée positivement et

négativement à la qualité de cette matière première et du produit fini, le sirop d'érable.

Éventuellement, la compréhension de ces relations et de ses mécanismes permettra de

développer des stratégies de modulation du microbiote et de gestion des systèmes de

collecte.

IV

Abstract Recently, both maple sap collection systems and microbiological identification methods

have evolved. The work presented aimed at characterizing maple sap microbiota with

molecular methods and describing its quantitative and qualitative impact on maple syrup

quality. Conventional microbiological methods, physicochemical and sensory analysis

were performed on maple sap and syrup samples from Québec production sites

throughout the harvesting period. New culture-independent molecular methods

(community PCR fingerprinting, MARISA) allowed characterization of microbiota

structure and membership in time and space. Production site was identified as the most

determining factor of membership while flow period was reflected by a change in

microbiota structure. Clone library sequencing and specific qPCR assays allowed for

maple sap bacteria and yeast identification and quantification respectively. As

Pseudomonas fluorescens, Rahnella spp., Mrakia spp., Mrakiella spp. and Guehomyces

pullulons were found at every production site and were present at all flow periods, these

microorganisms are considered stable members of the maple sap microbiota.

Multivariate analysis revealed links between the relative abundance of many

contaminants and maple sap and syrup properties. Notably, Candida sake, Williopsis sp.

and G. pullulons yeasts were successively associated with glucose and fructose

concentrations in maple sap. At the end of the harvesting season, P. fluorescens group

bacteria and Mrakia yeast were positively linked to maple and vanilla attributes of maple

syrup. These results illustrate both sides of the maple sap microbiota impact on maple

sap and syrup quality. Eventually, comprehension of these relationships and their

mechanisms will lead to the development of microbiota modulation and collection

system management strategies.

Remerciements Écrire une thèse est une étape importante au cours d'une vie, elle marque le début d'une

carrière, mais aussi l'aboutissement d'un long parcours. Je prends un moment pour

remercier les personnes suivantes qui m'ont accompagnée, encouragée et soutenue en

cours de route.

Pour m'avoir intégrée dans leur laboratoire, pour avoir cru en mes capacités, pour

m'avoir encouragée et prodigué des conseils judicieux et pour m'avoir appris à

développer un esprit critique, mon directeur Denis Roy et ma codirectrice Gisèle

LaPointe. Je leur suis particulièrement reconnaissante de m'avoir permis de concilier

travail, études et famille;

Pour m'avoir formée et guidée au laboratoire, mes maîtres de stage Julie Audy et Steve

Labrie;

Pour les discussions scientifiques éclairantes, Éric Rasolofo, Sébastien Matamoros et

Luc Lagacé;

Tous les collègues de laboratoire qui ont partagé mon quotidien et ma dépendance à la

caféine, Marie-Hélène Lessard, Marianne Blain-Fortin, Marianne Arteau, Rachelle

Rioux, Patricia Savard, Emilie Desfossés-Foucault, Joseph Lupien-Meilleur et bien

d'autres;

Pour leur aide technique, les stagiaires, Mélanie Depont, Morgane Jaffrelo, Annick

Robichaud et Maud Cunat;

Ma source d'optimisme et de réconfort, ma mère Lucie;

Parce que la vie ne serait pas pareille si on ne la partageait pas avec quelqu'un

d'extraordinaire, pour tout le bonheur qu'il m'apporte, mon mari Félix;

Parce qu'un sourire de leur part me donne l'énergie pour aller plus loin, mes filles

Morgane et Agathe.

Avant-Propos Cette thèse est présentée sous forme d'articles scientifiques soumis à des revues avec

comité de lecture. Pour répondre aux exigences de la faculté des études supérieures, les

chapitres rédigés en anglais sont précédés d'un résumé en français. Les références

biliographiques sont présentées à la fin du document. Les tableaux sont appelés « Tableau »

tout au long du document, il en est de même dans les sections écrites en anglais afin

d'uniformiser la liste des tableaux.

Le manuscrit comporte cinq chapitres dont le premier intitulé « Revue de littérature » se

veut, dans un premier temps, un résumé des connaissances actuelles concernant la sève, la

microbiologie de la sève et le sirop d'érable. Dans un deuxième temps, une introduction

aux méthodes moléculaires utilisées pour l'étude des communautées microbiennes est

présentée, suivie d'un survol des analyses multivariées. Finalement, le but, les hypothèses

et les objectifs sont inclus à la fin de ce chapitre.

Le second chapitre intitulé « Diversité saisonnière et régionale du microbiote de la sève

d'érable révélée par profilage PCR communautaire et banques de clones du gène de l'ARN

ribosomal 16S » a été publié sous forme d'article dans Systematic and Applied

Microbiology (Filteau, M., Lagacé, L., LaPointe, G, Roy, D., 2010, vol. 33, p. 165-173).

Ce chapitre illustre la variabilité du microbiote de la sève d'érable dans le temps et l'espace

à l'aide d'une nouvelle approche de profilage PCR communautaire, en plus d'identifier les

principaux contaminants bactériens. J'ai bénéficié de l'aide de Marianne Blain-Fortin pour

les extractions d'ADN et de Morgane Jaffrelo pour l'isolement des bactéries. Les comptes

microbiens ont été effectués par l'équipe du Centre ACER inc. à St-Hyacinthe.

Le troisième chapitre intitulé « Corrélation de la composition de la sève d'érable avec les

communautés bactériennes et fongiques déterminées par MARISA » a fait l'objet d'une

publication dans Food Microbiology (Filteau, M., Lagacé, L., LaPointe, G, Roy, D., 2011,

vol. 28, p. 980-989). Ces travaux présentent l'étude simultanée des bactéries et des levures

dans la sève d'érable par une méthode moléculaire multiplexe et le lien entre les

populations et la composition de la sève. J'ai reçu de l'aide de Annick Robichaud et de

Vlll

Maud Cunat pour l'optimisation de la méthode multiplexe. Les analyses physicochimiques

de la sève ont été réalisées par le Centre ACER inc.

Le quatrième chapitre intitulé « Les contaminants prédominants de la sève d'érable sont

corrélés aux propriétés physicochimiques et sensorielles du sirop d'érable » quantifie par

PCR quantitative les principaux contaminants de la sève d'érable et analyse leurs relations

avec les propriétés physicochimiques et sensorielles du sirop d'érable. Ces travaux ont été

soumis au International Journal of Food Microbiology. Morgane Jaffrelo a participé à la

recherche de marqueurs moléculaires et le Centre ACER inc. a fabriqué les sirops de

laboratoire en plus d'effectuer les analyses physicochimiques et sensorielles.

Pour la réalisation de ces trois manuscrits, j 'ai mis au point les méthodes moléculaires et

réalisé la presque totalité des manipulations relatives à celles-ci. De même, j 'ai effectué

l'intégralité du traitement des données, des analyses bioinformatiques, statistiques et

multivariées. J'ai élaboré tableaux et figures et rédigé les manuscrits. Le Dr Luc Lagacé a

dirigé l'équipe du Centre ACER inc. qui a effectué la collecte des échantillons et les

analyses microbiologiques, physicochimiques et sensorielles. Il a de plus révisé les

manuscrits dont il est coauteur et a fourni de judicieux conseils relatifs à l'orientation du

projet. Le Dr Gisèle LaPointe a été un guide précieux pour la réalisation du projet et la

rédaction. Le Dr Denis Roy est à l'origine de la conceptualisation et de l'orientation du

projet de recherche et a contribué à encadrer l'analyse et l'interprétation des résultats. Les

Dr Denis Roy et Gisèle LaPointe ont orienté et révisé les manuscrits afin d'ajouter à leur

clarté et leur valeur scientifique.

Finalement, le cinquième chapitre discute les principaux résultats obtenus dans cette étude.

Il comprend également les conclusions générales et les perspectives d'avenir en

acériculture suite à ce projet.

A ma mère Lucie, à mon mari Félix, à mes filles Morgane et

Agathe.

Table des matières Résumé iii Abstract iv Remerciements v Avant-Propos vii Table des matières xi Liste des tableaux xiv Liste des figures xv Liste des abréviations xvii Introduction 1 Chapitre 1 Revue de littérature 5

1.1 Portrait socio-économique du secteur acéricole 5 1.2 La fabrication moderne du sirop d'érable 7 1.3 La qualité du sirop d'érable 8 1.4 La composition chimique de la sève d'érable 10 1.5 La composition chimique du sirop d'érable 12 1.6 Les flaveurs du sirop d'érable 14 1.7 La microbiologie acéricole 16 1.7.1 Les biofilms 20 1.7.2 La diversité microbienne 21 1.8 L'analyse des communautés microbiennes 21 1.9 Les analyses multivariées 28 1.10 But 35 1.11 Hypothèse 35 1.12 Objectifs 35

Chapitre 2 Diversité saisonnière et régionale du microbiote de la sève d'érable révélée par profilage PCR communautaire et banques de clones du gène de l'ARN ribosomal 16S 37 2.1 Résumé 37 2.2 Abstract 38 2.3 Introduction 39 2.4 Material and methods 41 2.4.1 Maple sap samples 41 2.4.2 Microbial counts and isolate selection 41 2.4.3 DNA extraction 41 2.4.4 PCR fingerprinting 41 2.4.5 16S rRNA gene amplification 44 2.4.6 Clone library construction 44 2.4.7 DNA sequencing 44 2.4.8 Alignment and phylogenetic analysis 45 2.4.9 Operational taxonomie units (OTUs) determination and community analysis....46 2.4.10 Nucleotide sequence accession numbers 46 2.5 Results 46 2.5.1 Microbial counts 46 2.5.2 Community PCR fingerprints of maple sap 47

Xll

2.5.3 Maple sap 16S rRNA gene clone libraries 53 2.6 Discussion 58 2.6.1 Maple sap microbial community membership 60 2.6.2 Maple sap microbial community structure 62 2.7 Acknowledgements 63

Chapitre 3 Corrélation de la composition de la sève d'érable avec les communautés bactériennes et fongiques déterminées par MARISA 65 3.1 Résumé 65 3.2 Abstract 66 3.3 Introduction 67 3.4 Materials and methods 69 3.4.1 Maple sap samples 69 3.4.2 Chemical analysis 69 3.4.3 ARISA and MARISA 69 3.4.4 Fungal ITS1-5.8S-ITS2 clone libraries and sequencing 71 3.4.5 Identification of peaks 72 3.4.6 Nucleotide sequence accession numbers 72 3.4.7 Multivariate and statistical analysis 72 3.5 Results 73 3.5.1 Comparison of ARISA and MARISA profiles 73 3.5.2 MARISA peak identification 74 3.5.3 MARISA profile analysis 77 3.5.4 Maple sap composition and correlations with microbial communities 79 3.6 Discussion 84 3.6.1 MARESA method 84 3.6.2 Maple sap bacterial community 85 3.6.3 Maple sap fungal community 86 3.6.4 Correlations between microbial communities and maple sap composition 88 3.7 Conclusion 90 3.8 Acknowledgements 91

Chapitre 4 Les contaminants prédominants de la sève d'érable sont corrélés aux propriétés physicochimiques et sensorielles du sirop d'érable 93 4.1 Résumé 93 4.2 Abstract 94 4.3 Introduction 95 4.4 Material and methods 97 4.4.1 Maple sap and syrup samples 97 4.4.2 Laboratory syrups 97 4.4.3 Physicochemical analysis 97 4.4.4 Sensory analysis 98 4.4.5 DNA extraction 98 4.4.6 PCR amplification and sequencing 98 4.4.7 Quantitative PCR (qPCR) 101 4.5 Results 103 4.5.1 Microbial contaminant quantification 103 4.5.2 Maple syrup physicochemical and sensorial properties 110 4.5.3 Relationship between microbial contamination and maple syrup properties 112

Xlll

4.6 Discussion 117 4.7 Acknowledgements 122

Chapitre 5 Discussion et conclusion générale 123 5.1 Comparaison des méthodes moléculaires 125 5.2 Le système de récolte acéricole, un écosystème àpart 131 5.2.1 Origine de la contamination 131 5.2.2 Composition du microbiote 132 5.2.3 Structure et stabilité 134 5.3 L'impact du microbiote, une réponse multivariée 135 5.4 Limites de l'étude 140 5.5 Perspectives 141 5.5.1 La gestion du système de collecte de la sève d'érable 141 5.5.2 La modulation du microbiote 142 5.5.3 La typicité en gage de qualité 143 5.6 Conclusion générale 144

Références 147 Annexe 1 Affiche présentée au congrès « Annual NAMSC-IMSI- OMSPA

Meetings » à Stratford, ON en octobre 2010 159 Annexe 2 Preliminary analysis for qPCR target selection 163 Annexe 3 Overview of 2005 sample characteristics 165

Liste des tableaux Tableau 1.1 Classification du sirop d'érable 9 Tableau 1.2 Classification des défauts du sirop d'érable selon la FPAQ 9 Tableau 1.3 Composition de la matière sèche de la sève d'érable 10 Tableau 1.4 Composition chimique du sirop d'érable 13 Tableau 1.5 Microorganismes retrouvés dans la sève d'érable 17 Tableau 1.6 Caractéristiques des principales méthodes moléculaires culture-

indépendantes utilisées pour l'analyse des communautés microbiennes 27 Tableau 2.1 Summary of the 16S rDNA sequences retrieved for each library 45 Tableau 2.2 Pairwise comparison of maple sap microbial communities by flow period.56 Tableau 2.3 Variation in community membership and structure among five production

sites 57 Tableau 3.1 Identification of fungal peaks 75 Tableau 3.2 Maple sap isolates used for identification of bacterial peaks 76 Tableau 3.3 Tukey-Kramer HSD mean comparison of maple sap concentrate

composition 80 Tableau 4.1 Sequences used for specific primer design 99 Tableau 4.2 Target, primers and type of qPCR assay 102 Tableau 4.3 qPCR standard curves parameters 103 Tableau 4.4 qPCRgene copy number of 2005 samples 107 Tableau 4.5 Sap concentrate psychrophilic plate counts 108 Tableau 4.6 Average physicochemical and sensorial property values of producer syrups.

I l l Tableau 5.1 Comparaison de l'abondance relative (%) des principaux contaminants

bactériens déterminée par différentes méthodes moléculaires 126 Tableau 5.2 MRBP de chacune des méthodes moléculaires sur 12 échantillons 2005.. 130 Tableau 5.3 Microorganismes nouvellement répertoriés dans la sève d'érable dans cette

étude 133 Tableau 5.4 Analyse des espèces indicatrices 139 Tableau 5.5 Correlation entre l'abondance relative de P. fluorescens et Mrakia et les

attributs sensoriels du sirop d'érable 140

Liste des figures Figure 1.1 Aire de répartition de l'exploitation commerciale de l'érable 5 Figure 1.2 Évolution de la production acéricole selon les données de la FPAQ

(2010) 6 Figure 1.3 Évolution de la production, du nombre d'entailles, de la valeur du sirop

d'érable produit au Québec et des exportations canadiennes selon les données de la FPAQ (2010) 6

Figure 1.4 La roue des flaveurs de l'érable 14 Figure 1.5 Principe des principales méthodes de profilage utilisées pour l'analyse

des communautés microbiennes 23 Figure 1.6 Construction d'une banque de clones 26 Figure 1.7 Quantification par la PCR en temps réel 28 Figure 1.8 Processus de préparation des données pour les analyses multivariées 31 Figure 1.9 Analyse en composante principale 32 Figure 2.1 Heat map and Ward dendrogram of PCR fingerprint replicates obtained

with primers L and A for 50% sap flow samples 43 Figure 2.2 Average microbial counts of 19 production sites in Québec for the 2005

season 47 Figure 2.3 Phylogenetic affiliation and typing of 44 maple sap isolates 48 Figure 2.4 Examples of PCR fingerprint consensus profiles obtained with primer L 50 Figure 2.5 Heat map and Ward dendrogram of combined consensus PCR

fingerprints obtained with primers L and A 51 Figure 2.6 Principal component analysis of combined PCR fingerprints from

primers L and A 52 Figure 2.7 Phylogenetic architecture and relative abundance of OTUso.03 of five

maple sap producers 54 Figure 2.8 Relative abundance of phylogenetic classes found in each clone library,

sorted by the sap flow period 55 Figure 3.1 Example of replicate MARISA profiles 71 Figure 3.2 Comparison of ARISA and MARISA amplification profiles of maple sap

DNA 74 Figure 3.3 Dominance curve plot of the 25 predominant MARISA peaks (out of

175 peaks) in 57 sap samples 77 Figure 3.4 NMS plot based on Bray-Curtis similarities of the Hellinger transformed

MARISA data 79 Figure 3.5 Joint plot of PCA on correlations between chemical properties (blue

vectors) of 0% sap flow period samples (green dots) and MARISA peak data (black vectors) 81

Figure 3.6 Joint plot of PCA on correlations between chemical properties (blue vectors) of 50% sap flow period samples (orange dots) and MARISA peak data (black vectors) 82

Figure 3.7 Joint plot of PCA on correlations between chemical properties (blue vectors) of 100% sap flow period samples (purple dots) and MARISA peak data (black vectors) 83

xvi

Figure 4.1 qPCR counts of maple sap predominant contaminants according to flow period in 2005 104

Figure 4.2 Total bacteria and specific qPCR count means per geographical region at the 100% flow period in 2005 105

Figure 4.3 Gene copy counts of maple sap samples throughout the 2008 harvesting season 109

Figure 4.4 Global sensorial and odor profiles of 2008 producer maple syrups 110 Figure 4.5 Ordination plot of samples from the multiple factor analysis based on

microbial relative abundance in maple sap (calculated with gene copy number) and maple syrup physicochemical and sensorial properties 113

Figure 4.6 Vector map of variables from the multiple factor analysis 114 Figure 4.7 MFA group representation 115 Figure 5.1 Schéma de concepts illustrant les facteurs qui influencent la qualité du

sirop d'érable et les éléments analysés au cours du projet 124 Figure 5.2 Comparaison de la classification hiérarchique avec la méthode de Ward

des différentes méthodes moléculaires 127 Figure 5.3 Résultats de la MFA (analyse de facteurs multiples) 128 Figure 5.4 Modélisation de l'effet quantitatif de la contamination bactérienne de la

sève d'érable sur l'analyse sensorielle du sirop de laboratoire 136 Figure 5.5 Courbes polynomials (p <0.01) correspondant à l'effet des comptes

bactériens de chacun des groupes de profils PCR communautaires sur les sucres réducteurs de la sève et du sirop de laboratoire 138

Liste des abréviations ACP; PCA: Analyse en composante principale; Principal component analysis

ADN; DNA: Acide désoxyribonucléique; desoxyribonucleic acid

ADNr; rDNA: Acide désoxyribonucléique ribosomal; ribosomal desoxyribonucleic acid

ANOSIM: Analyse de similarité; Analysis of similarity

AP-PCR: réaction de polymerisation en chaine arbitrairement amorcée; Arbitrary primed polymerase chain reaction

ARISA: Analyse de régions intergéniques ribosomales automatisée; Automated ribosomal intergenic spacer analysis

ARNr; rRNA: Acide ribonucléique ribosomal; ribosomal ribonucleic acid

AT: Nucleotides Adenine et thymine

ATCC: Collection de cultures types américaines; American type culture collection

B-ARISA: Analyse de régions intergéniques ribosomales bactériennes automatisée; Automated bacterial ribosomal intergenic spacer analysis

bp: Paire de base; Base pair

DGGE: Électrophorèse en gradient dénaturant; denaturing gel gradient electrophoresis

dNTP: désoxyribonucléotides; desoxyribonucleotides

Éch.: Échantillon

F-ARISA: Analyse de régions intergéniques ribosomales fongiques automatisée; Automated fungal ribosomal intergenic spacer analysis

FISH: Hybridation fluorescente in situ; Fluorescent in situ hybridization

FPAQ: Férédation des producteurs acéricoles du Québec

GC: Nucleotides guanine et cytosine; Guanine and cytosine nucleotides

ID: Identification

IGS: Région intergénique; intergenic spacer

ISA: Analyse d'espèce indicatrice; Indicator species analysis

ITS: Région intergénique transcrite; Internal transcribed spacer

XV111

MARISA: Analyse de régions intergéniques ribosomales automatisée multiplexe; Multiplex automated ribosomal intergenic spacer analysis

MBC: Concentration bactericide minimale; Minimal batericidal concentration

MBEC: Concentrations minimales d'éradication de biofilm; Minimal biofilm eradication concentration

MFA: Analyse de facteurs multiples; Multiple factor analysis

MRBP: Procédure de permutation multi-réponse bloquée; Blocked multiresponse permutation procedure

MRPP: Procédure de permutation multi-réponse; Multiresponse permutation procedure

NCBI: Centre national de l'information biotechnologique; National Center for Biotechnology Information

NMS: Positionnement multidimensionnel non-métrique; Nonmetric multidimensional scaling

OTU: Unité taxonomique opérationnelle; Operational taxonomie unit

PCR: Réaction de polymerisation en chaine; Polymerase chain reaction

qPCR: Réaction de polymerisation en chaine quantitative; Quantitative Polymerase Chain Reaction

QS: Quorum sensing

RAPD: Amplification aléatoire d'ADN polymorphique; Random Amplification of Polymorphic DNA

RDP: Projet base de donnée ribosomale; Ribosomal database project

rfu: Unité de fluorescence relative; Relative fluorescence unit

RISSC: Collection de séquences intergéniques ribosomales; Ribosomal Intergenic Spacer Sequence Collection

SCAR: Région amplifiée caractérisée par sa séquence; Sequence Characterized Amplified Region

SE: Erreur type; Standard Error

TGGE: Électrophorèse en gradient thermal;Thermal Gel Gradient Electrophoresis

T-RFLP: Polymorphisme de fragments de restriction terminaux; Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

XIX

UFC; CFU: Unités formatrices de colonie; colony forming units

U-PCR: Réaction de polymérisation en chaine non spécifique; Unspecific Polymerase Chain Reaction

UV/VIS: Ultraviolet et visible; Ultraviolet and visible

Introduction

Le sirop d'érable est issu de la concentration de la sève d'érable récoltée au printemps.

À ce moment de l'année, l'amidon emmagasiné dans les racines de l'arbre est hydrolyse

et transformé en saccharose. La sève devient ainsi chargée de sucre et est entraînée vers

le sommet lorsqu'elle est sur le point de geler. Le liquide emmagasiné dans les branches

par le gel redescend par gravité dès que la température atteint 0°C (Tyree 1984). Le

climat est propice à la coulée lorsqu'il y a alternance de gel la nuit et de dégel le jour,

comme c'est le cas dans le sud-est du Canada et le nord-est des États-Unis, où l'érable

est exploité. Une composante osmotique est également impliquée dans le processus de

coulée, mais sa contribution exacte reste à déterminer (Cirelli et al. 2008). La saison de

récolte s'étend sur quelques semaines jusqu'à ce que la coulée cesse, soit à la fin des

cycles de gel et de dégel ou à l'obstruction des entailles par la croissance microbienne

(Perkins et van den Berg 2009).

De nos jours, les producteurs de sirop d'érable doivent relever le défi de la qualité s'ils

veulent rencontrer les nonnes imposées par l'industrie et faire face à un marché encore

peu développé. L'établissement de quotas a obligé les acériculteurs à miser sur la qualité

pour accroître leurs revenus, puisqu'ils ne peuvent plus compter sur l'augmentation des

volumes (Beaunoyer 2005). Une inspection a récemment révélé que près de 50% des

sirops d'érable vendus au détail ne respectent pas les normes de qualité et de saveur

(Deglise 2005).

Selon ces normes, la valeur commerciale des sirops et leur employabilité sont pondérées

par leur grade de couleur. Le grade attribué peut représenter une variation de 13% de la

valeur d'un lot. En plus de la variation de la couleur, des défauts de goût légers ou

majeurs peuvent également pénaliser le producteur. En moyenne 27% des sirops classés

par la fédération des producteurs acéricoles québécois (FPAQ) comportent de tels

défauts (FPAQ 2010).

Le système de classification basé sur le pourcentage de transmitance de la lumière ne

fait pas l'unanimité puisqu'il ne tient pas compte des subtilités des flaveurs de l'érable.

D'ailleurs, les sirops les plus clairs ne sont pas les préférés des consommateurs (Belford

et al. 1991). Un nouveau système de classification basé sur l'intensité des flaveurs a

récemment été proposé par l'Institut international du sirop d'érable. Cependant, l'état

des connaissances concernant l'origine des flaveurs de l'érable reste modeste. Une

nouvelle nomenclature de caractérisation a été publiée par Agriculture et

Agroalimentaire Canada, connue sous le nom de roue des flaveurs. Cet outil a été conçu

dans l'optique d'une uniformisation des travaux futurs. Entre temps, l'apparition de

pratiques telle que la vente de sève d'érable à des transformateurs externes nécessite que

cette matière première puisse être évaluée facilement selon son potentiel à être

transformée en produit fini respectant les normes en vigueur.

La qualité des sirops est depuis longtemps associée à la contamination microbienne de la

sève d'érable (Naghski et Willits 1957). Quelques tentatives ont été entreprises pour

développer une méthode d'analyse de la sève d'érable apte à prédire la qualité des sirops

produits. Suite à ces recherches, il a été conclu que la charge microbienne ne suffit pas à

expliquer les défauts de saveur (Dumont 1999). Il est donc nécessaire d'évaluer l'impact

à la fois de la nature et de la diversité des microorganismes présents afin de déterminer

quels sont les facteurs impliqués dans le développement des flaveurs. Ceci permettrait la

mise au point de méthodes d'analyses plus fidèles et le développement de moyens de

contrôle de la production pour minimiser les volumes de perte.

Les études récentes portant sur la contamination à l'entaille, les tubulures de collecte et

la sève d'érable ont apporté de précieuses informations concernant la phylogénie de la

communauté microbienne. Un complément à ces recherches serait d'étudier la variabilité

de la structure et de la composition des communautés microbiennes de la sève d'érable

sur une plus grand échelle, en lien avec la qualité des sirops produits, afin d'appréhender

leur rôle dans le développement des flaveurs de l'érable. Par ailleurs, une approche

moléculaire pourrait permettre d'identifier les microorganismes non-cultivables. Compte

tenu que la sève d'érable n'est disponible que pendant quelques semaines par année et

que de grands volumes sont nécessaires pour produire une quantité suffisante de sirop

pour les différentes analyses, une étude de type exploratoire associée à des analyses

multivariées s'impose. Les connaissances acquises pourront servir de fondement pour de

futures études expérimentales visant à démontrer l'impact de certains microorganismes

sur la qualité de la sève et du sirop d'érable et permettant d'élaborer de nouvelles

stratégies de contrôle de la contamination microbienne de la sève.

Chapitre 1

Revue de littérature

1.1 Portrait socio-économique du secteur acéricole L'érable est principalement exploité au Québec, en Ontario, au Nouveau-Brunswick

ainsi que dans quelques états du Nord-Est des États-Unis (Figure 1.1). Le portrait de

l'industrie acéricole a beaucoup évolué au cours des dernières décennies. Grâce à la

science et à la technologie, sources d'innovation, le secteur a connu un essor important.

Les exploitations artisanales ont fait place à de véritables érablières industrielles, de

sorte que la production a doublé en vingt ans (Figure 1.2) et le nombre d'entailles est en

constante augmentation (Figure 1.3). Les techniques modernes de récolte et de

production telles que la collecte tubulaire et l'osmose inverse ont permis d'améliorer le

rendement et de rentabiliser la production de sirop d'érable. En 2010, l'acériculture au

Québec a produit à la ferme une valeur de sirop d'érable de près de 241 millions de

dollars.

Figure 1.1 Aire de répartition de l'exploitation commerciale de l'érable. Adapté de ministère de l'agriculture, de l'alimentation et des affaires rurales de l'Ontario.

I Québec l Autres provinces i États-Unis ■ Total

-a o

100%

90% -\

80%

70% -|

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

' \ /

\

r 160

- 140

- 120 1/1

91

> - 100 ai

TJ ai

TJ t / i

- 80 o

- 60 1 ro n

- 40 1 -

- 20

- 0

####&## f f f fwwfMMf Année

Figure 1.2 Évolution de la production acéricole selon les données de la FPAQ (2010).

•Production (Livres) •Entailles •Valeur ($) •Exportations ($)

300

250

200

150

100

50

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Année

Figure 1.3 Évolution de la production, du nombre d'entailles, de la valeur du sirop d'érable produit au Québec et des exportations canadiennes selon les données de la FPAQ (2010).

Le Québec est le premier producteur mondial de sirop d"érable et fournit chaque année

près de 75% de la production (Figure 1.2). Il compte plus de 13 500 producteurs

regroupés sur 7420 entreprises (FPAQ 2010). La filière acéricole québécoise a créé

l'équivalent de 12 096 emplois à temps plein directs, indirects et induits et a engendré une

richesse de 734 millions de dollars en 2009 (EcoRessources consultants 2010). Les

produits de l'érable sont vendus dans 52 pays à travers le monde et ont généré des

revenus d'exportation de 75,2 millions de dollars en 2009 (Figure 1.3). Les États-Unis,

l'Allemagne et le Japon sont les principaux acheteurs et ont chacun leurs préférences en

matière de catégories de sirops.

1.2 La fabrication moderne du sirop d'érable L'érable à sucre (Acer saccharum), et de façon plus marginale, l'érable rouge (Acer

rubrum) et l'érable argenté (Acer saccharium) sont entaillés à la fin de l'hiver.

L'acériculteur pratique des trous de 0,762 à 1,1 cm de diamètre par 5 à 6,5 cm de

profondeur dans l'écorce (Allard 1999). Les entailles à diamètre réduit épargnent

davantage l'arbre en lui infligeant une blessure minimale (Allard 1998). De plus, le

diamètre de l'arbre détermine le nombre d'entailles praticables sur celui-ci (Allard

1999). Un chalumeau est ensuite inséré dans le trou, puis relié à des tubulures

secondaires en polyethylene semi-rigide coloré, plutôt qu'à des chaudières. Ces

tubulures convergent vers des tuyaux maîtres qui amènent F eau d'érable vers une station

de pompage à vide (Sysvac). L'eau est ensuite acheminée, par une autre pompe, vers la

cabane à sucre. Elle y sera entreposée de quelques heures à quelques jours, le plus

souvent dans un réservoir situé à l'extérieur, avant d'être transformée en sirop et

produits dérivés.

Nombreux sont les acériculteurs qui concentrent la sève d'érable par osmose inverse.

Cette technique à l'origine destinée à dessaler l'eau de mer permet de concentrer la sève

d'érable environ quatre à cinq fois. Cette étape permet des économies d'énergie puisque

la sève doit bouillir moins longtemps pour atteindre la concentration finale de 66 °Brix.

Le concentré de sève obtenu revêt une couleur jaunâtre et est extrêmement périssable. Il

doit donc être bouilli le plus rapidement possible.

L'évaporation thermique se fait en semi-continu dans de grandes cuves en acier

inoxydable contrôlées par un système de chauffage à réglage automatique. Cette étape

est cruciale, parce que c'est à ce moment que se produisent les réactions chimiques

responsables du développement des flaveurs et de la couleur du sirop d'érable. Une fois

concentré, le sirop est filtré, puis transféré chaud dans les contenants pour la vente au

détail. Alternativement, il peut être vendu en barils à la FPAQ qui procédera alors à

différentes analyses pour s'assurer de la qualité et de l'authenticité du produit.

Le virage technologique qu'a pris l'industrie acéricole apporte son lot de nouveaux

problèmes, notamment l'assainissement des systèmes de tubulures. Les lignes de

tubulure peuvent s'affaisser et la sève y stagner (King et Morselli 1985). De plus, le

soleil peut réchauffer les tubulures à des températures avoisinant les températures

optimales de croissance des microorganismes (Morselli et Whalen 1979). L'écoulement

de la sève peu également être freiné par l'accumulation de matière organique qui résulte

de l'adhésion des microorganismes à la surface interne des tubulures (Frank et Willits

1961; King et Morselli 1983). Aucun produit bactéricide ou désinfectant n'est

actuellement homologué pour assainir l'entaille pendant la saison de coulée. Il est

cependant recommandé d'asperger d'alcool éthylique le voisinage immédiat de l'entaille

et de désinfecter la mèche pour prolonger la période d'asepsie (Allard 1999). Les

résultats liés à cette pratique sont cependant mitigés (Perkins et van den Berg 2009).

À la fin de la saison, un lavage des tubulures à 1'hypochlorite de sodium est

recommandé, de préférence avant la fonte des neiges, afin d'éviter de brûler la

végétation environnante (Auger et al. 2004). De plus, des résidus peuvent contaminer la

sève et se concentrer dans le sirop lui donnant un arrière-goût salé et une couleur plus

foncée si le système n'a pas été rincé adéquatement (Morselli et al. 1985). Des

recherches sont présentement en cours pour développer une méthode d'assainissement

plus efficace.

1.3 La qualité du sirop d'érable

Les normes canadiennes stipulent qu'un sirop doit contenir au minimum 66% de matière

sèche, ne doit pas fermenter, doit être limpide et de couleur uniforme, doit posséder une

saveur d'érable caractéristique de sa classe de couleur (tableau 1.1) et doit être exempt

d'odeur ou de goût désagréable. Cependant, une trace de goût de caramel, de bourgeon

ou de sève est tolérée pour les sirops de catégorie Canada n° 3 (Canada 2006). La FPAQ

qui met en marché la majorité des sirops en vrac produits au Québec classe également

les sirops en fonction des défauts présentés au tableau 1.2.

Tableau 1.1 Classification du sirop d'érable

Catégorie Classe de Classe (couramment Pourcentage de transmission couleur utilisée) de lumière

Canada n°l Extra clair AA 75% et plus Canada n°l Clair A De 60,5% à 74,9% Canada n°l Medium B De 44% à 60,4% Canada n°2 Ambré C De 27% à 43,9% Canada n°3' Foncé D Moins de 27% Toutes les couleurs mentionnées ci-haut peuvent être attribuées au sirop d'érable de

catégorie Canada n° 3 lorsque celui-ci répond uniquement aux exigences de cette catégorie Source : Règlement sur les produits de l'érable de la Loi sur les produits agricoles au Canada (C.R.C, ch. 289, annexe III)

Tableau 1.2 Classification des défauts du sirop d'érable selon la FPAQ

Code Type Description 1 Défaut d'origine naturelle ou

transformation relié à la Bois, brûlé

2 Microbiologique Moisissure, fermentation 3 Chimique Trace de résidus 4 Non identifié Ensemble de mauvais goûts ou odeurs

non identifiables 5 Défaut bourgeon Saveur de bourgeon 6 Défaut filant Texture filante

Source: Règlement des producteurs acéricoles sur les normes de qualité et le classement. (Décision 7360, a. 20, Annexe B)

La fabrication, qu'elle soit traditionnelle ou moderne, comporte de nombreux paramètres

intrinsèques et extrinsèques qui influencent la saveur et la couleur du sirop d'érable. Les

facteurs intrinsèques comprennent le métabolisme de l'arbre, la composition chimique

de la sève d'érable, le pH et la charge microbienne (Dumont et al. 1993a; Lagacé et al.

2002). Il est présumé que la composition microbienne a aussi un impact (Naghski et al.

1957b; Willits etal. 1961b; Dumont 1999).

10

Quant aux facteurs extrinsèques, ils comprennent les conditions climatiques (Lagacé

1999), l'aération, la lumière, les matériaux utilisés, le nettoyage (Morselli et al. 1985),

les conditions d'entreposage de la sève, les procédés de transformation (Dumont et al.

1993a) et la post-contamination. Ceci dit, la qualité de la matière première, la sève

d'érable, revêt une importance capitale en tant que premier maillon de la chaîne de

production du sirop d'érable.

1.4 La composition chimique de la sève d'érable La composition chimique de la sève varie au cours de la saison de récolte en fonction du

métabolisme de l'arbre et de la contamination microbienne, lesquels sont fortement

influencés par la température (Dumont 1994a). La sève ou l'eau d'érable porte bien son

nom puisqu'elle se compose d'environ 98% d'eau. Le saccharose représente de 96 à

99,99% de la matière sèche. Les autres composés détectés sont des sucres réducteurs,

des composés azotés, des composés phénoliques, des acides organiques et des minéraux

(Dumont et al. 1993a; Dumont 1994b; Morselli et al. 1996). Le tableau 1.3 fait état de

leurs différentes concentrations retrouvées dans la sève d'érable.

Tableau 1.3 Composition de la matière sèche de la sève d'érable

Composé % (p/p) Saccharose 96-99,99 Glucose 0-0,17 Fructose 0,25-10 Acide malique 0,15-1,60 Acide succinique 0,01-0,05 Acide fumarique 0,01-0,003 Composés phénoliques 0,4-0,5 Composés azotés 0,05-0,10 Acides aminés libres 0,01 Ca 0,25-0,40 K 0,25 Mg 0,025-0,03 Mn 0,025 P 0,025 Na 0,01 Fe 0,01

11

Les sucres réducteurs de la sève d'érable sont principalement du fructose et du glucose

dont la concentration varie de 0 à 0,025% de la matière sèche. Les enzymes des

microorganismes de la sève d'érable seraient responsables de l'hydrolyse du saccharose

en glucose et en fructose. Ces sucres sont particulièrement susceptibles à la

caramélisation et aux réactions de Maillard.

La présence et la nature des acides aminés dans la sève d'érable varient beaucoup d'une

sève à l'autre (Dumont 1994a). En plus du métabolisme de l'arbre, il est possible que les

microorganismes y jouent un rôle.

Les composés phénoliques seraient majoritairement dérivés de la lignine qui se

décomposerait suivant les conditions climatiques et l'action des microorganismes. Les

plus hautes concentrations de composés phénoliques sont observées en début et en fin de

saison. De plus, les profils varient considérablement d'un producteur à l'autre.

Les acides organiques, tout comme les acides aminés et les composés phénoliques,

varient entre les sèves. Cette variation est, elle aussi, attribuée au métabolisme des

microorganismes contaminants (Dumont 1994b). L'acide dominant est l'acide malique

qui peut représenter jusqu'à 99% des acides d'une sève (Morselli et al. 1996). Celui-ci

précipite sous forme de malate de calcium lors de 1'evaporation thermique et peut causer

de la turbidité s'il n'est pas complètement éliminé par filtration.

Le pH de la sève d'érable varie de 3,9 à 7,9. La flore de la sève n'est pas toujours

acidifiante, mais des baisses extrêmes de pH ont été observées et à partir de pH 6,8 et en

deçà, la sève d'érable a tendance à donner des sirops foncés au goût brûlé ou fortement

caramélisé. De même, un pH alcalin favoriserait les réactions de caramélisation lors de

l'évaporation (Dumont 1999; 2000).

Ces variations de la composition chimique de la sève d'érable témoignent de l'action

des microorganismes sur cette matière première. Les microorganismes modifient la sève

d'érable par leur métabolisme, mais également par la composition chimique de leur

propre biomasse.

12

1.5 La composition chimique du sirop d'érable Les études portant sur la composition chimique du sirop d'érable démontrent que sa

composition est extrêmement variable. Le tableau 1.4 résume l'étendue des valeurs

rapportées pour les principaux composés détectés dans le sirop d'érable (Stuckel et Low

1996; Perkins et van den Berg 2009). Il est important d'ajouter que de nombreux

composés du sirop d'érable demeurent à ce jour non identifiés (Potter et Fagerson 1992;

Kermasha et al. 1995; Abou-Zaid et al. 2008; Sabik et al. 2010; Li et Seeram 201 lb).

Les composés phénoliques forment une classe de composés qui revêt un intérêt

particulier pour le sirop d'érable. D'une part, parce que ces composés démontrent des

propriétés anti-oxydantes qui apportent une valeur ajoutée au produit d'un point de vue

nutritionnel (Theriault et al. 2006; Abou-Zaid et al. 2008) et, d'autre part, parce que ce

sont des composés aromatiques qui contribuent aux flaveurs du sirop (Underwood et

Filipic 1963; Filipic et Underwood 1964; Filipic et al. 1969; Sabik et al. 2010). La

quantité et les proportions de composés phénoliques varient en fonction du lieu de

production. Le moment de récolte de la sève influence également la quantité de

composés phénoliques, qui est plus élevée au début et en fin de saison (Kermasha et al.

1995).

13

Tableau 1.4 Composition chimique du sirop d'érable

Composé Étendue des valeurs rapportées Eau (%) 26,5-39,4 Saccharose (%) 42,3-75,6 Glucose (%) 0-9.6 Fructose (%) 0-6.8 Acide malique (%) 0.06-0.9 Acide succinique (%) 0-0.26 Acide fumarique (%) 0-0.13 Composés phénoliques (%) 0.0005-0.001 Vanilline (ppm) 0.73-4.09 Acide férulique (ppm) 1.61-2.8 Composés azotés (%) 0.001-0.077 Ca(ppm) 183-2800 K(ppm) 541-4031 Mg (ppm) 0-575 Mn (ppm) 0-252 P(ppm) 0.01-2335 Na (ppm) 0-492 Fe(ppm) 0-61 Zn (ppm) 0-527 Al (ppm) 0.01-18 B(ppm) 0.01-3 S (ppm) 0.01-100 Cu (ppm) 0-8 Tin (ppm) 0-33 Pb (ppm) 0-0.49 Cd (ppm) 0-0.09 Cl (ppm) 20-400 Thiamine (ppm) 1.3 Niacine (ppm) 0.16-1 Riboflavine (ppm) 0.046-0.6

14

1.6 Les flaveurs du sirop d'érable

Les flaveurs, c'est-à-dire la saveur et l'odeur du sirop d'érable sont à la fois complexes et

très variables (Sabik et al. 2010). Pour cette raison, certains auteurs comparent le sirop

d'érable au fromage ou au vin. La Figure 1.4 présente la roue des flaveurs de l'érable, un

vocabulaire descriptif précis et documenté des flaveurs de l'érable développé par le

gouvernement canadien et le Centre ACER inc. (Canada, 2004).

Figure 1.4 La roue des flaveurs de l'érable

15

De nombreux travaux ont cherché à isoler les composés responsables de ces flaveurs

caractéristiques (Underwood et Filipic 1963; Filipic et Underwood 1964; Underwood et

Filipic 1964; Filipic et al. 1965; Underwood et Filipic 1965; Filipic et al. 1969;

Underwood et al. 1969; Potter et Fagerson 1992; Kermasha et al. 1995; Sabik et al.

2010). Les principaux constituants impliqués incluent le 4-hydroxy-3-méthoxy-

benzaldehyde (vanilline), le 3-méthyl-2-hydroxycyclopenten-2-one (cyclotène), le 2,5-

diméthyl-4 hydroxy-2(2H)-furanone (furanéol), le 4,5-diméthyl-3-hydroxy-2(5H)-

furanone (sugar furanone) et le 2-méthoxy phénol (gaïacol) (Belford et al. 1991).

Les composés responsables des principales flaveurs se formeraient lors de la

transformation en sirop à partir de précurseurs présents dans la sève suivant différentes

réactions chimiques (Potter et Fagerson 1992). D'abord, la décomposition thermique des

sucres, dont le saccharose et le fructose, en conditions alcalines forme du cyclotène, du

furanéol et des composés dérivés. Ensuite, la réaction de Maillard qui résulte d'une

réaction entre le groupement carboxyle des sucres réducteurs et les groupements amines

des acides aminés est également responsable de la formation de composés aromatiques

et colorés. Leur nature contribue également au développement des flaveurs parce que

des composés différents seront formés pour différents acides aminés. Notamment, le

goût de bourgeon observé en fin de saison serait associé à l'augmentation des acides

aminés dans la sève de l'arbre précédant l'éclosion des bourgeons (Morselli et Feldheim

1988). Finalement, l'oxydation et l'hydrolyse alcaline des monomères de lignines

présents dans la sève seraient responsables de la formation de la vanilline et du

syringaldéhyde dans le sirop (Filipic et al. 1969; Potter et Fagerson 1992). La vanilline

serait le composé phénolique dérivé de la lignine le plus important pour la flaveur du

sirop d'érable (Filipic et al. 1969). Sa saveur serait détectable dès 0.69 ppm (Fazzalari

1978). L'acide férulique et le méthylcyclopetenolone ont également un seuil de

détection très faible (90 ppm pour l'acide férulique) (Fazzalari 1978).

16

1.7 La microbiologie acéricole La sève d'un arbre sain est presque stérile, mais se contamine à l'entaille et lors de son

passage dans les tubulures (Morselli et Whalen 1991). La composition chimique de la

sève d'érable en fait un milieu exceptionnel pour la croissance microbienne. La

contamination varie typiquement de IO2 à IO7 UFC/mL (Lagacé et al. 2002).

Les recommandations de lavage, citées précédemment, soulignent qu'il est important de

minimiser la présence des microorganismes dans la sève d'érable. Considérant la masse

microbienne globale en termes de comptes totaux aérobies mésophiles, son

augmentation a effectivement un impact généralement négatif sur la qualité finale du

sirop (Lagacé et al. 2002). Dans plusieurs cas cependant, de bons sirops ont été obtenus

avec des sèves contenant jusqu'à IO7 UFC/mL (Dumont 1999; Lagacé et al. 2002).

Lagacé et al. (2002) expliquent ce résultat par une transformation rapide où le sucre

n'aurait pas eu le temps d'être hydrolyse, tandis que Dumont (1999) souligne

l'importance de la nature et de l'activité des microorganismes. Par ailleurs, un sirop

provenant d'une sève stérile est insipide (Luc Lagacé, communication personnelle).

La microbiologie acéricole intéresse depuis longtemps les chercheurs. Déjà, au début du

20e siècle, des bactéries, levures et moisissures avaient été isolées de la sève d'érable

(Edson 1910). Le tableau 1.5 répertorie les espèces rapportées dans la sève d'érable. Il

s'agit de microorganismes généralement psychrophiles à mésophiles, aerobes stricts ou

anaerobes facultatifs.

17

Tableau 1.5 Microorganismes retrouvés dans la sève d'érable

Bactéries Gram- Source Référence Achromobacter

superficiale1

sceris' Actinobacillus

seminis Bordetella

avium Brenneria

alni Chryseobacterium

indoltheticum scophthalmum

Enterobacter aerogenes agglomérons amnigenus

Flavobacterium Solare1

Pedobacter cryoconitis

Pseudomonas

fluorescens

fulgida' geniculata2

graminis marginalis mephitica2

putida (striata, convexa) synxantha syringae

Rahnella aquatilis

Ralstonia eutropha taiwanensis

Shewanella (Pseudomonas) putrefaciens

Stenotrophomonas maltophilia

entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) eau (Edson et al. 1913)

biofilm (Rasolofo 2004)

biofilm (Rasolofo 2004)

entaille (Lagacé et al. 2004) entaille et eau (Lagacé et al. 2004) entaille (Lagacé et al. 2004) biofilm (Rasolofo 2004)

eau (Fabian et Buskirk 1935) eau (Willits et al. 1961b) biofilm (Rasolofo 2004) entaille et eau (Naghski et al. 1957b; Sheneman et Costilow 1958) entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) entaille (Lagacé et al. 2004) entaille (Lagacé et al. 2004) entaille, eau et (Edson et al. 1913; Naghski et al. 1957b; Sheneman et biofilm Costilow 1958; Lagacé et al. 2004; Lagacé et al. 2006b) eau et biofilm (Willits et al. 1961b; Morselli et Feldheim 1988; Rasolofo

2004; Lagacé et al. 2006b) entaille (Lagacé et al. 2004) entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958; Willits et al. 1961b) entaille (Lagacé et al. 2004) eau et biofilm (Rasolofo 2004) entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958; Willits et al. 1961b) biofilm (Rasolofo 2004) eau, entaille et (Lagacé et al. 2004; Lagacé et al. 2006b) biofilm eau (Lagacé et al. 2006b) biofilm (Rasolofo 2004) entaille (Lagacé et al. 2004) entaille (Lagacé et al. 2004) entaille (Lagacé et al. 2004)

entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958)

eau et biofilm (Rasolofo 2004)

Bactéries Gram+ Source Référence Agreia Arthrobacter

rhombi Bacillus

cereus circulons

Brachybacterium conglomeratum (Micrococcus

entaille (Lagacé et al. 2004)

entaille (Lagacé et al. 2004) entaille et eau (Edson et al. 1913; Sheneman et Costilow 1958) entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958; Lagacé et al. 2004) entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958)


18

conglomaratus) Brevibacterium

casei entaille (Lagacé et al. 2004) Cellulomonas

flavigena entaille (Lagacé et al. 2004) Curtobacterium

flaccumfaciens entaille (Lagacé et al. 2004) Frigoribacterium entaille (Lagacé et al. 2004) Microbacterium entaille (Lagacé et al. 2004) Micrococcus entaille et eau (Edson etal. 1913; Sheneman et Costilow 1958)

varions entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) luteus entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958; Lagacé et al. 2004) candidatus1 entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958)

Peanibacillus borealis entaille (Lagacé et al. 2004)

Plantibacter flavus entaille (Lagacé et al. 2004)

Rhodococcus erythropolis entaille (Lagacé et al. 2004)

Rothia dentocariosa entaille (Lagacé et al. 2004)

Sanguibacter suarezii entaille (Lagacé et al. 2004)

Sarcina entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Staphylococcus entaille (Lagacé et al. 2004)

warneri entaille (Lagacé et al. 2004) epidermidis entaille (Lagacé et al. 2004) caprae entaille (Lagacé et al. 2004)

Levures Source Référence Bulleromyces

albus entaille (Lagacé et al. 2005) Candida entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958)

curvata entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) famata entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958)

Cryptococcus entaille (Lagacé et al. 2005) albidus entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958; Lagacé et al. 2005) aquaticus entaille (Lagacé et al. 2005) heveanensis entaille (Lagacé et al. 2005) hungaricus entaille (Lagacé et al. 2005) laurentii entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) macerans entaille (Lagacé etal. 2005) magnus entaille (Lagacé et al. 2005) victoriae entaille (Lagacé et al. 2005) wieringae entaille (Lagacé et al. 2005)

Dioszegia changbaiensis entaille (Lagacé et al. 2005) crocea entaille (Lagacé et al. 2005)

Dothidea ribesia entaille (Lagacé et al. 2005)

Leucosporidium scottii entaille (Lagacé et al. 2005)

Mrakia frigida entaille (Lagacé et al. 2005)

Pichia misumaiensis entaille (Lagacé et al. 2005)

Rhodosporidium

19

lusitaniae Rhodotorula entaille (Lagacé et al. 2005)

fujisanensis glutinis entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) laryngis entaille (Lagacé et al. 2005) nothofagi entaille (Lagacé et al. 2005) slooffiae entaille (Lagacé et al. 2005)

Setosphaeria monoceras entaille (Lagacé et al. 2005)

Sporobolomyces roseus entaille (Lagacé et al. 2005) ruberrimus entaille (Lagacé et al. 2005)

Guehomyces (Trichosporon) pullulons entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958; Lagacé etal. 2005)

Udeniomyces pyricola entaille (Lagacé et al. 2005)

Zymoxenoglea eriophori entaille (Lagacé et al. 2005)

Moisissures Source Référence Alternaria entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Acremonium entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Aspergillus entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Cladosporium entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Coniothyrium entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Fusarium entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Pénicillium entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Phoma entaille et eau (Sheneman et Costilow 1958) Rhizoctonia k , . r- • i


www.bacterio.cict.fr) et n'a pas de synonyme connu. 2Ne devrait plus faire partie du genre Pseudomonas.

Quelques espèces microbiennes de la sève d'érable ont déjà été associées à un effet

spécifique et possèdent des caractéristiques biologiques pertinentes. Par exemple,

Enterobacter (Aerobacter) aerogenes est un agent de détérioration de la sève d'érable

menant à la production de sirops filants (Fabian et Buskirk 1935; Québec 1984).

Pseudomonas fluorescens donne une apparence verte à la sève par la production de

pigments fluorescents et des bacilles sont responsables de la sève « laiteuse ». La sève

« rouge » serait causée par des levures rouges et certaines bactéries (Thompson 2010).

De plus, les levures produisent généralement des invertases qui pourraient augmenter la

quantité de sucres réducteurs et mener à la production de sirops caramélisés, masquant

ainsi les saveurs fines de l'érable (Naghski et al. 1957b; Naghski et Willits 1957).

À l'inverse, des souches de Pseudomonas geniculata, P. fluorescens ainsi

qu'Enterobacter agglomérons (Flavobacterium rhenanum) peuvent contribuer au

développement de la saveur caractéristique de l'érable (Naghski et al. 1957b; Willits et

http://www.bacterio.cict.fr

20

al. 1961b). Cependant, la taxonomie de P. geniculata est aujourd'hui ambiguë et cette-

dernière ne devrait plus faire partie du genre Pseudomonas. Or, le plus proche parent

connu de P. geniculata est Stenotrophomonas maltophilia qui a récemment été retrouvé

dans le microbiote acéricole (Rasolofo 2004).

Pseudomonas est le seul genre bactérien commun à toutes les études de la littérature

ayant porté sur le microbiote acéricole et varie peu d'année en année, ce qui soutient

l'hypothèse que la microflore stable soit en partie responsable de la flaveur

caractéristique de l'érable (Lagacé et al. 2006b). Certains Pseudomonas possèdent entre

autres des enzymes capables de dégrader la lignine et de libérer les précurseurs de

flaveurs qu'elle contient tel l'acide vanillique (Ruzzi et al. 1997; Narbad et Gasson

1998).

Une seconde bactérie prédominante serait Rahnella aquatilis (Lagacé et al. 2006b). Elle

a déjà été associée à la production de gaïacol, responsable de la production d'une saveur

de fumée dans le lait au chocolat à température de réfrigération (Jensen et al. 2001).

Cette bactérie possède également une levansucrase qui catalyse la production de

polysaccharides et de glucose à partir du saccharose (Kang et al. 2004).

1.7.1 Les biofilms La majorité des microorganismes de l'environnement ne vivent pas à l'état planctonique

mais sous forme de biofilms, c'est-à-dire en communautés structurées adhérées à une

surface (Costerton et al. 1995). Le modèle structural actuel comprend des microcolonies

composées de cellules et de matrice extracellulaire parsemée de canaux servant au

transport des nutriments. La formation d'une telle cité comprend le transport d'un

microorganisme vers une surface, l'adhésion initiale, le bioattachement, la colonisation

et finalement l'agrégation et le détachement (Davey et O'Toole 2000).

Les microorganismes du microbiote acéricole ne font pas exception et forment des

biofilms sur la surface interne des tubulures de récolte (King et Morselli 1983; Rasolofo t **)

2004). Lagacé et al. (2006) ont rapporté des comptes aérobies totaux variant entre 10 et

107 UFC/cm2, un ordre de grandeur similaire à celui de la contamination planctonique de

21

la sève d'érable. En microscopie électronique, ils ont observé un biofilm mixte composé

principalement de bacilles et de quelques levures.

Les biofilms protègent les microorganismes et les rendent plus résistants aux

antibiotiques et aux produits de nettoyage. Les concentrations minimales d'éradication

de biofilm (MBEC) pour le peroxyde, F hypochlorite de sodium, l'ammonium

quaternaire et l'acide peracétique d'une souche provenant des tubulures de récolte sont

environ cinquante fois plus élevées que les concentrations bactéricides minimales

(MBC) (Lagacé 2006).

1.7.2 La diversité microbienne La diversité est une mesure importante en écologie microbienne, car elle représente la

structure d'une communauté. Elle est fonction du nombre d'espèces (richesse) et de

l'abondance relative de chacune (Felske et Osborn 2005). Cette diversité peut être

mesurée à tous les niveaux d'organisation biologique, d'un gène à une communauté,

selon l'unité taxonomique opérationnelle (OTU) désignée. Par exemple, un fragment

d'ADN commun peut être désigné pour regrouper les organismes, aussi bien qu'un

niveau hiérarchique de classification comme la classe, le genre ou l'espèce.

Dans le domaine acéricole, de récents travaux ont pu mettre en évidence la diversité des

grands groupes bactériens rencontrés (Lagacé et al. 2004; Lagacé et al. 2006b). Selon

une étude faite sur des isolats bactériens, l'indice de diversité de Shannon des

microorganismes à l'entaille serait maximal au milieu de la saison de coulée (Lagacé et

al. 2004). Selon une autre étude faite par une méthode culture-indépendante, l'indice de

diversité de Shannon de la sève et des biofilms des tubulures principales diminuerait à

mesure que la saison progresse, indiquant ainsi une dominance de certains groupes

(Lagacé et al. 2006b).

1.8 L'analyse des communautés microbiennes On estime que 90% des microorganismes de l'environnement ne peuvent être cultivés en

laboratoire compte tenu de l'état actuel des connaissances. Les méthodes dites cultures-

indépendantes permettent de contourner ce problème pour accéder à l'ensemble des

populations d'un environnement donné. Ces méthodes sont parfois qualifiées de

22

« métagénomiques », car elles ciblent l'ensemble des génomes d'une communauté

microbienne. En effet, le point de départ commun à ces méthodes est d'extraire

simultanément tout l'ADN des organismes d'un échantillon. À partir de cet ADN

communautaire, une variété de méthodes est disponible pour en étudier la composition.

Il est bien entendu que la description exhaustive de chacune de ces méthodes dépasse les

objectifs de cette thèse. C'est pourquoi ne seront introduites ici que les méthodes

d'intérêt pour l'étude présentée. Une description plus complète de ces méthodes et leur

application au secteur alimentaire est disponible dans la revue de littérature de Juste et

al. (2008).

Les méthodes de type « fingerprinting » où un profil ou empreinte d'une communauté

est généré par l'électrophorèse de marqueurs phylogénétiques amplifiés par PCR

figurent parmi les plus populaires, surtout depuis la disponibilité plus répandue

d'appareils d'électrophorèse capillaire servant au séquençage d'ADN. La Figure 1.5

illustre le principe de trois méthodes fréquemment utilisées en écologie microbienne.

La première de ces méthodes à avoir été développée est F électrophorèse en gradient

dénaturant ou « denaturing gel gradient electrophoresis » (DGGE). La technique

consiste à amplifier un marqueur phylogénétique par PCR, puis à séparer les gènes

homologues de taille semblable par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide

comportant un gradient de substances dénaturantes (Muyzer et al. 1993). La séparation

des fragments d'ADN est basée sur la mobilité électrophorétique des molécules

dénaturées qui est réduite comparée à celle des molécules de forme hélicale. La

dénaturation des molécules d'ADN est fonction de leur séquence et de leur contenu en

bases GC. Pour stabiliser les amplicons, une pince riche en GC est ajoutée à l'une des

amorces. Il existe une variante à cette méthode qui utilise un gradient de température,

soit l'électrophorèse en gradient thermique ou « thermal gradient gel electrophoresis »

(TGGE) (Muyzer et al. 1993).

Une seconde méthode, le « terminal restriction fragment length polymorphism » (T-

RFLP), consiste à digérer les amplicons de même taille par des enzymes de restriction.

Puisqu'une des amorces a été marquée d'un fluorophore, F électrophorèse capillaire du

digestat permet de séparer les fragments de restriction terminaux en fonction de leur

23

taille (Marsh 1999). Ainsi, les homologues sont séparés en fonction de la présence et de

la position de sites de restriction.

DGGE ARISA T-RFLP

Pince GC

* * '

♦

Marqueur _ J de poid

moléculaire

Fluorophore

* .

♦

Q Taille {pb)

• N OO ISO 200 SO 300 SU 400 |

Taille (pb) 0 M 100 190 200 250 10* » f

Figure 1.5 Principe des principales méthodes de profilage utilisées pour l'analyse des communautés microbiennes.

24

Une troisième méthode appelée « automated ribosomal intergenic spacer analysis »

(ARISA) consiste à amplifier une région intergénique de l'opéron ribosomal dont la

taille est intrinsèquement polymorphique (Fisher et Triplett 1999). L'utilisation d'une

amorce marquée d'un fluorophore et F électrophorèse capillaire permettent d'obtenir un

profil de fragments séparés en fonction de leur taille.

Historiquement, le gène de l'ADNr 16S est utilisé pour l'identification phylogénétique

des bactéries et l'ADNr 18S chez les eucaryotes (Woese 1987). Ces gènes sont une

horloge moléculaire qui témoigne de l'évolution des organismes. Ils sont composés de

régions conservées essentielles à la fonction du gène et de régions variables qui évoluent

au cours du temps. Les régions conservées permettent l'utilisation d'amorces

virtuellement universelles alors que les régions variables permettent l'identification

phylogénétique. Ces marqueurs ne sont cependant pas parfaits. En effet, l'opéron sur

lequel on retrouve ces gènes est présent en un nombre variable de copies, pouvant

comporter des séquences différentes, ce qui peut occasionner des biais. La connaissance

du nombre de copies pour un organisme donné est donc un pré-requis pour une

quantification absolue. Il en va de même pour les régions intergéniques (appelées IGS

chez les bactéries et ITS chez les levures) de ces opérons, qui sont parfois exploitées

pour leur polymorphisme de taille.

Lorsqu'une communauté microbienne se compose de quelques groupes dominants, il

peut être intéressant de mesurer la diversité génétique plutôt que phylogénétique afin de

déceler des différences plus subtiles. L'outil par excellence pour observer le

polymorphisme génomique est l'empreinte électrophorétique d'une amplification de

fragments d'ADN. L'amplification peut être aléatoire (RAPD), arbitraire (AP-PCR) ou

non-spécifique (U-PCR) (Rademaker et al. 2005). Ce typage peut être utilisé sur l'ADN

total d'une communauté pour en estimer la richesse et calculer des indices de diversité

comme celui de Shannon (H). Les bandes d'ADN obtenues sont alors désignées comme

OTU (Yang et al. 2004). Les méthodes de profilage sont aussi utiles pour développer

des marqueurs génétiques spécifiques, sans connaissance préalable des génomes (Pujol

et al. 2005). Un marqueur génétique est une séquence d'ADN connue, identifiable grâce

à un simple test et associé à une caractéristique détectable. En microbiologie, de tels

25

marqueurs peuvent être utiles pour différencier des souches pathogènes, pour repérer de

bons ferments ou pour tracer des agents de biocontrôle.

Une approche différente des méthodes de profilage, basée sur le séquençage, consiste à

construire une banque de clones à partir des fragments d'ADN amplifiés et à en

sequencer une portion représentative (Figure 1.6) (Rôling et Head 2005). Plus

récemment, une autre technique de séquençage, le pyroséquençage, est devenue plus

accessible et permet d'obtenir de courtes séquences contenues dans un échantillon sans

clonage préalable (Juste et al. 2008). Le tableau 1.6 détaille les principales

caractéristiques de chacune des méthodes d'analyse des communautés microbiennes.

L'utilisation conjointe de méthodes de profilage et de séquençage s'avère une stratégie

fructueuse. Par exemple, les banques de clones, avec une identification confirmée,

peuvent fournir des fragments standards culture-indépendants pour la DGGE ou encore

permettre de valider les résultats du T-RFLP dont l'identification n'est que présomptive.

26

Séquences

•Amplification avecdesamorcesciblant le gene de l'ADNr 16S

•Introduction des produits PCRdans un vecteur plasmidique à l'aide de la topoisomérase ooo •Transformation de cellules d'Escherichia coli compétentes

•Création d'une banque de clones

•Extraction plasmidique d'un nombre représentatif de clones

o o 0 o_ O

•Séquençage de l'insert de chacun des plasmides

<*.*.* cr oo i sx

•Alignement des séquences avec les références de la base de donnée pourdéterminerl'affiliation phyllogénétique

•Utilisation de logiciels d'analyse spécialisée comme DOTUR et SONS pour comparer des banques de clones.

Figure 1.6 Construction d'une banque de clones

27

Tableau 1.6 Caractéristiques des principales méthodes moléculaires culture-indépendantes utilisées pour l'analyse des communautés microbiennes

Méthode Sensibilité Rapidité Avantages Inconvénients

T-RFLP

DGGE/TGGE +

ARISA

Banques de clones

Pyro-séquençage

++

++++

+++++

Automatique Reproductible

Versatile Bases de données

Faible coût Possibilité ++

d'identification directe

Automatique +++ Reproductible

Bases de données Identification directe

+ Nouveaux organismes

Identification directe ++ Nouveaux

organismes

Digestion enzymatique Identification indirecte

Homoplasie1

Comparaison des gels

Identification indirecte

Onéreux Analyses

bioinformatiques complexes Onéreux Analyses

bioinformatiques complexes

Homoplasie : comigration de séquences hétérogènes

Les méthodes présentées jusqu'ici ont un inconvénient majeur; elles ne sont pas

quantitatives. Il existe une variante quantitative de l'ARISA, la qARISA (Ramette

2009), mais le nombre d'échantillons pouvant être traité simultanément diminue de

façon considérable. Il en va de même pour l'hybridation fluorescente in situ ou

« fluorescent in situ hybridization » (FISH) qui permet de quantifier des populations de

microorganisme sans extraction d'ADN (Juste et al. 2008). En revanche, la PCR

quantitative (qPCR) est une technique éprouvée pour quantifier les microorganismes

d'intérêt (Smith 2005). Il s'agît d'une réaction de polymérisation en chaine

conventionnelle à laquelle s'ajoute une réaction chimique permettant de faire un suivi en

temps réel de l'amplification. Les deux réactions chimiques les plus communes sont le

SYBR et les sondes TaqMan® qui se fixent respectivement à l'ADN double brin et à

une séquence précise. La Figure 1.7 illustre le principe de la quantification par la PCR

en temps réel à l'aide d'une courbe standard.

28

0,520003 Seuil

_

28

27

26

25

24

23

22

21

"ô 20 U

Cycle seuil

10 12 U 16 ia _ 22 2i _ 28

Nombre de cycles » » «

Nombre initial de copies du gène cible

Figure 1.7 Quantification par la PCR en temps réel

1.9 Les analyses multivariées Les méthodes moléculaires génèrent rapidement des masses de résultats qui sont encore

trop souvent sous ou mal exploités. L'analyse de ces résultats par des méthodes

statistiques et multivariées appropriées demeure un aspect souvent négligé par les

microbiologistes, mais non moins critique pour l'interprétation des résultats. Puisqu'il

29

n'existe pas deux écosystèmes ni même deux échantillons identiques, la reproductibilité

des expériences contrôlées est difficile, sinon impossible à obtenir en écologie

microbienne (McArthur 2006). C'est pourquoi les analyses multivariées, qui

s'intéressent à la distribution conjointe de plusieurs variables, sont de plus en plus

employées en écologie microbienne. Elles comprennent deux grandes familles, soit les

méthodes descriptives qui cherchent à structurer ainsi qu'à résumer l'information et les

méthodes explicatives qui cherchent à expliquer la variation d'une variable dépendante

par des variables indépendantes. La brève revue ci-dessous a pour but de présenter les

méthodes d'analyse multivariées descriptives les plus communes et de citer quelques

exemples de leur utilisation pour l'analyse des communautés microbiennes. Les

fondements mathématiques ainsi que les détails techniques de chacune des méthodes

peuvent être obtenus dans les ouvrages de référence tels que Legendre et Legendre

(1998), McCune et Grace (2002) et Pages et al. (1991).

Tout d'abord, il faut savoir que les résultats bruts issus des différentes méthodes

moléculaires doivent être préparés pour les analyses multivariées (Figure 1.8). Ce

processus parfois fastidieux est nécessaire pour transformer les données brutes en une

matrice de données numériques appropriée aux analyses multivariées. Certains aspects

de cette préparation, comme le choix d'une transformation mathématique, vont affecter

les résultats, ce qui occasionne une boucle dans laquelle il est facile de se perdre. Il

devient donc important de justifier ces choix par le contexte méthodologique ou

biologique. Par exemple, une transformation peut-être appliquée afin d'homogénéiser les

variances puisque les analyses multivariées sont plus performantes ainsi (Ramette 2007).

Une transformation de Hellinger peut être appliquée aux données de communautés qui

contiennent beaucoup de zéros, les rendant ainsi plus appropriées pour l'analyse par des

méthodes linéaires (Legendre et Gallagher 2001). Une transformation de rang peut aussi

être appliquée lorsque des observations aberrantes sont présentes afin de diminuer leur

impact. Une partie de l'information est perdue par cette transformation, mais cette perte

est parfois négligeable par rapport au besoin de normaliser les distributions (McCune et

Grace 2002). Ultimement, une échelle binaire qui indique simplement la présence ou

l'absence des espèces est parfois utilisée lorsque l'intérêt est focusé sur la composition

de la communauté microbienne.

30

Les données issues d'analyses descriptives des communautés microbiennes peuvent

ensuite être représentées de façon appropriée par des techniques complémentaires, soit

l'ordination et l'analyse de groupement. Les techniques d'ordination permettent de

mettre en évidence les différences continues, c'est-à-dire les gradients, alors que les

analyses de groupement et de comparaison de groupes mettent en évidence les

discontinuités entre les objets (Legendre et Legendre 1998).

L'analyse en composante principale (ACP) est sans contredit la technique d'ordination

la plus utilisée (Ramette 2007). Elle permet de résumer l'information contenue dans une

matrice de plusieurs variables. Elle consiste à transformer des variables corrélées en

nouvelles variables indépendantes les unes des autres, appelées composantes principales.

Ces dernières sont une combinaison linéaire des variables originales. L'ACP est une

approche dite géométrique, car elle représente les variables dans un nouvel espace selon

les directions d'inertie maximale et aussi statistique, car elle recherche les axes

orthogonaux expliquant au mieux la variance des données. D'un certain point de vue,

elle permet de séparer la structure du bruit (Figure 1.9). Les résultats de F ACP sont

généralement représentés par un biplot dont les axes sont les composantes principales et

la variance expliquée par ceux-ci est fournie en pourcentage. Les objets sont représentés

par des points alors que les variables sont illustrées par des flèches dont les coordonnées

représentent la corrélation avec les composantes principales. L'angle entre les

différentes flèches représente la corrélation entre les différentes variables. Les exemples

d'utilisation de F ACP pour illustrer des données de profils microbiens sont multiples

(Wang et al. 2004; Arteau et al. 2010; Van Hoorde et al. 2010). Cependant, cette

approche est parfois remise en question puisqu'elle n'est pas toujours adaptée aux types

de relations ou aux distributions des données qui sont retrouvées en écologie (McCune et

Grace 2002; Ramette 2007).

31

Etapes

Données brutes

T-RFLP, ARISA

Profils PCR

0 90 KO 190 ZOO 2 » 300 390

4 Alignement des pics

Édition

Consensus des répétitions

: ! i l . _ j

f

^ , II. Variables

"li-naie \ * -ns s.-pU_5-pli L-pU-C-plS P c * A r « l 435 C5 3*6.65

,-ï.*-2i-p21

« M É A M M

B M t A i - l S S5»C46 M U 4 WM.71

Conversion en OTU

* A r e i 9 1144.73 au) sn.i*

Banque de clones

Séquences

ssemblage et alignement des séquences

m 1 D I I ft« -nmanwss ■rj XO ZO 30 40

iac-pii-(cz u. 50-plZ-»? Une-" — 5 0 - p l 2 - « O n e . " ' 30-pi2-«l_ « » _ " 3 0 - D _ 2 - « 7 U«C> ™"

: S I A W - CAA TC 76CKAA««A "CA. 7 AA IASTÇCÏCM rClASC"SAA77 6 : K > i / « & . 'A .V * « « . : "

S A M 4 V , " BCKAAMi, CA A.S 4-, * • . -3 » 3G ——iV7 'OcaOAA—A "CA ~ ~AA AAA - ;

Comparaison phylogénétique et retrait des chimères

.Il ■ll l l l l l l l IMII» «-C__tC1-T-T-T-l

■inao*icTotïc-«

Matrice de similarité

0 . » 0.8) 0.71 0.55 '

i o.er en O.tl

1 0.55 0.5S

1 0.1

Espèces

SITE UTOl UT02 UT03

Figure 1.8 Processus de préparation des données pour les analyses multivariées

32

b)

s? m _.

IM

U _! (0

S o a E o u

1 -

0.8 - ♦

0.6 -

♦

x«*

0.4 -

0.2 -

A^*>-

^ X j

1 1 U i

1 -0.5

♦

-0.2 -

-0.4 -

-0.6 -

-0.8 -

-1 -

♦

0.5

^ x k

1

Composante principale Cj (50%)

Figure 1.9 Analyse en composante principale, a) séparation de la structure et du bruit (traduit de Husson et Josse (2010)). b) illustration du résultat d'une ACP

Une technique d'ordination plus appropriée pour les analyses en écologie microbienne

est le « non-metric multidimensional scaling » (NMS) soit le positionnement

multidimensionnel non-métrique (McCune et Grace 2002). Elle ordonne d'abord les

distances selon leur rang et ainsi ne présume aucune corrélation linéaire entre les

variables. Un algorithme de positionnement multidimensionnel débute par une matrice

de proximité entre les objets et leur assigne une position dans un espace comportant un

nombre réduit de dimensions, défini itérativement, afin d'obtenir la solution comportant

un stress minimal. Le terme « stress » est une mesure de la différence entre le

33

positionement final et la matrice de proximité initiale. Dans une ordination NMS, la

distance entre deux objets (points) correspond à une mesure de similarité et non à une

mesure de distance euclidienne entre ceux-ci. Bien que plus difficile d'application et

d'interprétation que F ACP, le NMS a été utilisé pour illustrer les résultats de la DGGE,

du T-RFLP et de F ARISA (Casamayor et al. 2002; Culman et al. 2008; Lear et al. 2008;

Dimitroglou et al. 2009; Lee et al. 2010).

L'analyse de groupement est traditionnellement la plus utilisée des approches en

écologie microbienne puisque les microbiologistes utilisent également cette approche

pour illustrer l'évolution et la phylogénie des microorganismes sous forme de

dendrogrammes (Ramette 2007). L'analyse de groupement comprend plusieurs

méthodes comportant chacunes leurs particularités, dont la classification hiérarchique et

le partitionnement par la méthode des K centroïdes (K-means). D'une part, la

classification hiérarchique par la méthode de Ward est particulièrement recommandée

pour les analyses de profils électrophorétiques puisque l'homogénéité à l'intérieur des

groupes est maximisée (Legendre et Legendre 1998; Blackwood et al. 2003). D'autre

part, le partitionnement par la méthode des K centroïdes répartit les échantillons dans

des groupes pour lesquels chaque échantillon appartient au groupe dont la moyenne est

la plus proche de celui-ci. Cette méthode est particulièrement appropriée pour l'analyse

de larges ensembles de données (Ramette 2007).

Que les groupes soient définis à priori ou selon les résultats d'une analyse de

groupement, plusieurs méthodes multivariées sont disponibles pour les étudier. Pour

comparer les groupes d'objets via des données de communauté, la procédure de

permutation multi-réponse (MRPP) ou une méthode similaire telle que l'analyse de

similarité (ANOSIM) devrait être le choix par défaut (McCune et Grace 2002). Ces deux

méthodes non-paramétriques testent l'hypothèse d'une différence nulle entre deux ou

plusieurs groupes d'objets. Elles fournissent une mesure d'agrément intra-groupe (A

pour la MRPP et R pour FANOSIM) qui témoigne de « l'effet groupe » observé et une

valeur p associée. Les valeurs A et R varient entre -1 et 1. Une valeur positive indique

une différence entre les groupes. Pour la MRPP, une valeur A d'environ 0,3 est

considérée élevée en écologie communautaire (McCune et Grace 2002) alors que pour

34

l'ANOSIM, une valeur de 0,5 est considérée comme significative. L'ANOSIM a, entre

autres, été utilisée pour comparer des profils T-RFLP (Luna et al. 2006), ARISA (Arteau

et al. 2010) et DGGE (Demba Diallo et al. 2004; Van der Gucht et al. 2005). Pour sa

part, la MRPP a récemment été utilisée pour complementer l'ordination par NMS de

profils T-RFLP (Falk et Wuertz 2010). Finalement, l'analyse d'espèce indicatrice (ISA)

est une méthode expressément conçue pour déterminer quelles populations sont

caractéristiques d'un groupe donné (Dufrêne et Legendre 1997). Elle fournit une valeur

indicatrice (0 à 100) et une valeur/? basée sur la fidélité de l'occurrence ainsi que sur

l'abondance relative des espèces. Une espèce indicatrice parfaite aurait une valeur

indicatrice de 100.

Les techniques d'ordination et de l'analyse de groupement permettent de représenter la

similarité entre les objets en se basant sur les multiples variables mesurées. Ces

techniques d'exploration révèlent la configuration de larges ensembles de données mais

n'expliquent pas directement pourquoi une configuration particulière existe. Une

manière intuitive de traiter cet aspect est de superposer des données issues du contexte

environmental aux résultats des techniques d'ordination ou de l'analyse de groupement

(Ramette 2007) des communautés microbiennes ou vice-versa. Cette « superposition »

est en fait une régression linéaire des variables supplémentaires sur les axes

d'ordination, une fonction intégrée dans plusieurs logiciels statistiques (McCune et

Mefford 2006; Oksanen 2007).

Une technique d'ordination émergente en écologie microbienne (Haller et al. 2011;

Jassey et al. 2011), l'analyse de facteurs multiples (MFA), permet une analyse plus

directe de la relation entre les données microbiologiques et environmentales car elle

permet de combiner plusieurs ensembles et types de données dans une même analyse

tout en leur accordant une importance égale (Pages et al. 1991). La MFA s'effectue en

deux étapes. Premièrement, une ACP est effectuée sur chaque ensemble de données où

chaque élément est ensuite normalisé en divisant par la racine carré de la première

valeur propre (eigenvalue) obtenue. Deuxièmement, une ACP est pratiquée sur la

matrice conjointe des ensembles de données ainsi normalisés (Abdi et Valentin 2007).

Cette analyse exploratrice basée sur FACP permet donc d'observer simultanément la

35

configuration des objets selon plusieurs facteurs (biologiques, chimiques, sensoriels, par

exemple) et s'interprète de manière similaire. Le package FactoMineR pour le logiciel R

(Husson et al. 2009) fournit également des possibilités de résultats supplémentaires

inhérentes à la MFA comme un biplot représentant la contribution des différents groupes

de variables aux facteurs de la MFA. Cette représentation a, entre autres, été suggérée

pour superposer des connaissances biologiques (voies métaboliques) à des données de

micropuces pour étudier le cancer (de Tayrac et al. 2009). Dans le domaine alimentaire,

la MFA a été utilisée pour l'analyse sensorielle des vins (Pages 2005).

1.10 But La recherche présentée avait pour but de caractériser le microbiote de la sève d'érable et

d'évaluer son impact quantitatif et qualitatif sur la qualité du sirop d'érable.

1.11 Hypothèse Les membres stables du microbiote de la sève d'érable, c'est-à-dire les microorganismes

qui se retrouvent à tous les sites de récolte et tout au long de la période de coulée, sont

liés aux propriétés de la sève et contribuent ainsi au développement des propriétés

caractéristiques du sirop d'érable tel que la couleur et la flaveur.

1.12 Objectifs Afin de répondre au but et à l'hypothèse, les objectifs suivants ont été fixés :

Objectif 1 : Développer une méthode de profilage communautaire par PCR pour décrire

la variabilité génétique du microbiote de la sève d'érable afin d'établir la présence ou

l'absence de facteurs génétiques stables.

Objectif 2 : Au moyen de banques de clones d'ADNr 16S, identifier les bactéries

présentes dans un sous-ensemble d'échantillons représentatifs dans le but de décrire la

variation de la composition et de la structure du microbiote.

Objectif 3 : Développer un protocole ARISA multiplexe pour repérer les

microorganismes fongiques et bactériens qui sont présents de façon stable dans la sève

d'érable.

36

Objectif 4 : Au moyen d'analyses multivariées, décrire les relations entre l'abondance

relative des microorganismes déterminée par MARISA et la composition

physicochimique de la sève d'érable.

Objectif 5 : Valider le statut de contaminant stable ou occasionnel des principaux

microorganismes fongiques et bactériens par quantification des principales populations

de la sève d'érable au moyen de la qPCR.

Objectif 6 : Au moyen d'analyses statistiques et multivariées, déterminer les variations

physicochimiques et sensorielles du sirop d'érable associées aux principales populations

microbiennes.

Chapitre 2

Diversité saisonnière et régionale du microbiote de la sève d'érable révélée par profilage PCR communautaire et banques de clones du gène de l'ARN ribosomal 16S

Seasonal and regional diversity of maple sap microbiota revealed using community PCR fingerprinting and 16S rRNA gene clone libraries

2.1 Résumé Une technique de profilage communautaire basée sur l'électrophorèse capillaire de

produits PCR a été développée afin d'étudier les caractéristiques des communautés

microbiennes de la sève d'érable provenant de 19 érablières au Québec au cours d'une

saison de coulée. L'identification présomptive des fragments d'ADN amplifiés a été

attribuée par correspondance à des profils d'isolats bactériens. Les communautés

microbiennes ont ensuite été comparées par l'analyse des séquences de gènes provenant

d'une sélection représentative de 13 banques de clones du gène de l'ARNr 16S. Les

résultats des deux méthodes indiquent que tous les sites de production et les temps

d'échantillonnage ont des membres de leur microbiote en commun, mais que des

attributs distinctifs existent également. Les changements au cours de la saison de coulée

en abondance relative des populations prédominantes indiquent une tendance commune.

Pseudomonas (64%) et Rahnella (8%) étaient les deux genres les plus abondamment et

les plus fréquemment représentés parmi les 2,239 séquences analysées. Des séquences

correspondant à Janthinobacterium, Leuconostoc, Lactococcus, Weissella,

Epilitonimonas et Sphingomonas ont également été retrouvées de façon occasionnelle

dans la sève d'érable. Les microorganismes retrouvés dans la sève d'érable

appartiennent à seulement quatre classes phylogénétiques tandis qu'une grande variation

des séquences du genre Pseudomonas a été rencontrée. La prédominance du genre

Pseudomonas est suggérée comme étant un attribut typique du microbiote acéricole à

travers les érablières du Québec et au cours de la saison de coulée.

38

2.2 Abstract An arbitrary primed community PCR fingerprinting technique based on capillary

electrophoresis was developed to study maple sap microbial community characteristics

among 19 production sites in Québec over the tapping season. Presumptive fragment

identification was made with corresponding fingerprint profiles of bacterial isolate

cultures. Maple sap microbial communities were subsequently compared using a

representative subset of 13 16S rRNA gene clone libraries followed by gene sequence

analysis. Results from both methods indicate that all maple sap production sites and flow

periods share common microbiota members, but distinctive features exist as well.

Changes over the season in relative abundance of predominant populations show

evidence of a common pattern. Pseudomonas (64%) and Rahnella (8%) were the most

abundantly and frequently represented genera of the 2,239 sequences analyzed.

Janthinobacterium, Leuconostoc, Lactococcus, Weissella, Epilitonimonas and

Sphingomonas are revealed as occasional contaminants in maple sap. Maple sap

microbiota show a low level of deep diversity along with a high variation of similar 16S

rRNA gene sequences within the Pseudomonas genus. Predominance oi Pseudomonas is

suggested as a typical feature of maple sap microbiota across geographical regions,

production sites, and sap flow periods.

39

2.3 Introduction Sap collected from maple trees (Acer saccharum) during spring has traditionally been

used to produce maple syrup in the province of Québec. Sap inside the xylem of a

healthy maple tree is virtually sterile but is contaminated during tapping by bacteria,

yeast and molds (Morselli and Whalen 1991; Lagacé et al. 2002). In contrast to other

aqueous environments, maple sap is rich in sucrose and other nutrients, making it a

perfect growth medium for psychrophilic microorganisms that can exceed 107 CFU/mL

by the end of the season (Lagacé et al. 2002; Lagacé et al. 2004). Complex microbial

communities also form biofilms inside the tubing collection system that alter sap

properties as it is collected. Microbial contamination of maple sap is considered a source

of quality variation for maple syrup (Naghski et al. 1957a; Morselli and Whalen 1991;

Lagacé et al. 2002). The microbial community of maple sap could be important for

flavor development (Naghski et al. 1957a). However, its exact role has not been

elucidated yet. The latest hypothesis on this topic states that stable members of the

maple sap microbiota contribute to characteristic maple product properties (Lagacé et al.

2006b) such as flavor and color. Dark color and off-flavors such as burnt or sour are

often associated with an increased microbial load, but exceptions occur (Lagacé et al.

2002). These defects could be the result of unstable microbial communities that induce

sucrose inversion or sap acidification. The first step to confirm this hypothesis is to

demonstrate the existence of such a stable microbiota that would be similar across maple

sap collection sites. The predominant bacteria previously found over two consecutive

seasons in maple sap and biofilms in one experimental site have been identified as

belonging to the genera Pseudomonas and Rahnella (Lagacé et al. 2006b). A

comprehensive characterization of maple sap microbiota on a large scale is still needed

in order to discriminate between common and non-stable or occasional members that

may contribute to regional differences in product characteristics. Such knowledge is

essential to determining the role that these community members play in maple product

quality in order to develop new contamination control strategies.

So far, culture-independent techniques such as denaturing gradient gel electrophoresis

(DGGE) have advanced our understanding of maple sap tubing biofilm communities

(Lagacé et al. 2006b). Other culture-independent techniques used to study microbial

40

communities include 16S ribosomal RNA gene clone library analysis, a powerful

approach to identify community members and measure relative abundance (Rôling and

Head 2005). Additionally, new sequence analysis tools such as DOTUR and SONS are

available for comparing community structure and membership (Schloss and Handelsman

2005; 2006). Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) is a PCR

fingerprinting technique that can be adapted to environmental samples, with the

advantage of treating large numbers of samples in parallel (Yan et al. 2007; Winget and

Wommack 2008). Moreover, it involves non-specific targets that require no prior

knowledge of DNA sequences (Winget and Wommack 2008). The downside of the

method is that reference organisms must be analyzed with the same method to affiliate

an organism to a phylogenetic group. Nonetheless, it can be useful to compare a large

number of samples and select a representative subset before engaging in more laborious

experiments such as clone libraries.

To assess maple sap stable microbiota on a genetic level and to identify stable and non

stable members, a new community PCR fingerprinting technique and 16S rRNA gene

clone libraries were used as a combined approach. This study monitors the genetic

variation across 19 production sites in six geographical regions at five sampling points

over the sap flow period. To our knowledge, this is the first large scale study on maple

sap microbial communities. Furthermore, a representative subset of 13 samples was used

to compare microbial community composition, diversity, structure and membership.

41

2.4 Material and methods

2.4.1 Maple sap samples Maple sap osmosis concentrates (4X, corresponding to around 8 °Brix) were obtained

from 19 Québec production sites at 0%, 25%, 50%, 75% and 100% of cumulative sap

flow during the 2005 spring season. Sap collection systems were not sanitized during the

course of the sap flow season. Concentrated maple sap samples were immediately frozen

(-20°C) after sampling until analysis.

2.4.2 Microbial counts and isolate selection Bacterial counts were performed as previously described (Lagacé et al. 2006b). Fungal

counts were obtained on acidified potato dextrose agar (Difco) incubated for 5 days at

23°C. Morphologically different isolates were selected on plate count or tryptic soy agar

incubated at 7°C for 3 to 10 days.

2.4.3 DNA extraction Maple sap osmosis concentrates (500 mL) were centrifuged for 50 min at 4°C, 12,000 x

g. Pellets were frozen at -80°C until DNA extraction. Maple sap biomass pellets were

thawed on ice and suspended in 400 uL of buffer containing 12% sucrose, 25 mM Tris-

HC1, pH 8.0 and 16 mg lysozyme (Boehringer Mannheim, Laval, QC, Canada) and

subsequently handled following a protocol previously used to extract DNA from maple

sap (Lagacé et al. 2006b). Bacterial isolate DNA was extracted with the DNeasy Blood

and Tissue Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) according to the protocol provided

for Gram-positive bacteria. Twenty-five microliters of DNA were treated with 1 pL

RNase (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN, USA) and the concentration of

purified DNA was determined using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer

(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA).

2.4.4 PCR fingerprinting Two long degenerate primers (L: 5'-6-FAM-ATYTGYGGBTRYGCSCGSCTSCTSCC-

3' and A: 5'-6-FAM-CTSGTSAAYGGBGCSATGGCSACSAC-3') were designed to

amplify unspecific PCR fragments from maple sap samples and isolate cultures. DNA

samples (100 ng each) and negative controls were deposited into a 96-well PCR plate.

42

Each PCR contained 1.25 U Taq DNA polymerase (Biolab, Dorval, QC, Canada), IX

supplied polymerase buffer, 100 pmol primer and 40 nmol total dNTP in a 50 uL total

reaction volume. PCR amplifications were performed in a Tgradient thermocycler

(Biometra, Goettingen, Germany) with a program consisting of an initial 2-min

dénaturation step at 94°C, then 10 cycles of 30 sec at 94°C, a 30-sec annealing step with

a touchdown from 60°C to 50°C (-l°C/cycle), a 2-min elongation step at 72°C, followed

by 30 additional cycles of 30 sec at 94°C, a 30-sec annealing step at 50°C, a 2-min

elongation step at 72°C and a final 5-min elongation step at 72°C.

PCR products were then purified with an Omega-30K 96-well plate (Pall Corporation,

Mississauga, ON, Canada) as follows: ten microliters of PCR product were loaded with

50 pL Tris buffer (10 mM pH 7.4), centrifuged for 5 min at 3,000 * g, then washed with

200 uL buffer. The purified product was washed and eluted with 30 uL buffer. The

loading mix for electrophoresis, consisting of 2 uL purified PCR product with 0.3 uL

MapMarker 1000 (Bioventures, Murfreesboro, TN, USA) and 10 pL formamide, was

denatured at 95°C for 5 min. Each replicate PCR plate was purified and electrophoresed

on a 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Sequencer output files were analyzed using GeneMapper® v3.7 software (Applied

Biosystems) with the following settings: analysis range = 250-1000 bp, bin size = 1.3

bp, peak half width = 3, polynomial degree = 3, peak detection window =11, baseline =

35 rfu, and using the light smoothing option. Peak height values were then imported to a

spreadsheet (Microsoft® Excel®) for transformation. To account for method variation, a

mean consensus profile was constructed for each sample (see Figure 2.1 for example of

replicate PCR fingerprint profiles). To eliminate artifacts while accounting for potential

binning errors, average peak height in at least two replicates was reported in the

consensus profiles.

43

Background noise Fluorescence

Figure 2.1 Heat map and Ward dendrogram of PCR fingerprint replicates obtained with primers L and A for 50% sap flow samples. Samples are color coded and lettered by production site. The figure was generated with JMP 7 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

44

Consensus fingerprint data were transformed with the Hellinger transformation, which

corresponds to the square root of relative peak heights (Legendre and Gallagher 2001;

Blackwood et al. 2003), and per sample data were normalized to a mean of 0 and a

standard deviation of 1. The statistical software JMP 7 (SAS Institute, Cary, NC, USA)

was used to perform clustering and principal component analysis to find natural groups

of samples. Two-way analysis of similarity (ANOSIM) was performed with PAST

software (http://folk.uio.no/ohammer/past/) to test the null hypothesis of no difference

between regions and sap flow periods. ANOSIM reports the level of dissimilarity

between sample groups where R values >0.5 and/7 values <0.05 are significant.

2.4.5 16S rRNA gene amplification Primers 27F (5*-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') and 788R (5'-

GGACTACCAGGGTATCTAA-3') were used to amplify the 16S rRNA gene. PCR

consisted of 1.5 U Taq DNA polymerase (Biolab), IX supplied polymerase buffer, 10

pmol of each primer, 40 nmol total dNTP and 100 ng genomic DNA in a 50 pL total

reaction volume. PCR was performed in a Tgradient thermocycler (Biometra). The

program comprised an initial 1-min dénaturation step at 94°C followed by 33 cycles of

30 sec at 94°C, a 30-sec annealing step at 53°C, a 1-min 30 sec elongation step at 72°C

and a final 5-min elongation step at 72°C. Bacterial isolate PCR products were purified

with Exosap-it® (Biolynx, ON, CA), which degrades excess primers and nucleotides.

2.4.6 Clone library construction Negative control reactions were performed for every amplification set. Three PCRs

were performed on each DNA sample as previously described. Products were then

purified with a QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) and pooled. Purified products

were cloned into the pCR®2.1 -TOPO® vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A total

of 192 colonies were randomly selected and plasmid DNA was purified with a

Montage™ Plasmid MiniprepHTS Kit (Milipore, Billerica, MA, USA).

2.4.7 DNA sequencing Purified PCR products or plasmid inserts were sequenced bidirectionally with the 27F

and 788R primers using an ABI PRISM® dGTP BigDye™ Terminator v.3.0 Ready

Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and a 3100 Genetic Analyzer

http://folk.uio.no/ohammer/past/

45

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sequence traces were edited manually

using Sequencing Analysis 5.1.1 (Applied Biosystems), then assembled using the Contig

Assembly Program (CAP) in BioEdit Sequence Alignment Editor version 7.0.5.2. (Hall

1999).

2.4.8 Alignment and phylogenetic analysis Phylogenetic affiliation of each sequence was attributed using BLASTN

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and the Ribosomal Database Project (RDP) classifier

(http://rdp.cme.msu.edu/). A suite of tools available at the Greengenes website

(http://greengenes.lbl.gov) was used to analyze the set of sequences. First, sequences

were screened for chimeras using the Bellerophon tool and standard settings (Huber et

al. 2004). A total of 26 putative chimeric sequences were removed from the dataset

(Tableau 2.1). The NAST alignment tool (DeSantis et al. 2006) was then used to align

the sequences according to a core set of alignment templates and the distance matrix tool

was used to determine 16S rRNA gene sequence similarities.

Tableau 2.1 Summary of the 16S rDNA sequences retrieved for each library

Number of sequences Clone library Number of chimeras left for analysis B-100 4 169 C-0 3 171 C-50 0 171 C-100 2 186 D-0 4 156 D-50 1 156 D-100 3 176 E-0 0 187 E-50 0 187 E-100 2 130 F-0 2 181 F-50 2 182 F-100 3 187 Total 26 2239

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://rdp.cme.msu.edu/

http://greengenes.lbl.gov

46

2.4.9 Operational taxonomie units (OTUs) determination and community analysis The resulting distance matrix was used as input to DOTUR (Schloss and Handelsman

2005). Similarity cutoffs of 97% and 99% were used to determine OTUso.03 and

OTUso.oi, respectively. A neighbor-joining tree of a representative sequence of each

OTUo.03 was constructed using MEGA4 (Tamura et al. 2007). Shannon diversity indices

and Chaol richness estimates were calculated by DOTUR to assess microbial diversity

and richness. The SONS package (Schloss and Handelsman 2006) was used to calculate

Jabund and 0 similarity indices and standard errors to compare community membership

and structure.

2.4.10 Nucleotide sequence accession numbers Clone library and pure culture 16S rRNA gene sequences are available in GenBank

under accession numbers FJ933491 to FJ935729 and GU068618 to GU068661.

2.5 Results

2.5.1 Microbial counts As expected, total aerobic counts increased over the tapping season to reach an average

of 6.7 log CFU/mL (Figure 2.2). All average counts were similar between geographical

regions, except for the average anaerobe count that was higher at 0% sap flow in the

Lower St. Lawrence region (data not shown).

47

6.5

6

5.5

u _ > S

(U DJO

— 4 5 > <

3.5

25 50 75 % cumulative sap flow

100

Total aerobic counts

Anaerobic counts

Pseudomonas counts

Psych rophilic counts

Fungi counts

Figure 2.2 Average microbial counts of 19 production sites in Québec for the 2005 season. Sampling points are evenly distributed in terms of sap flow percentage.

2.5.2 Community PCR fingerprints of maple sap The microbial community genetic pool of maple sap samples from 19 production sites in six regions of Québec at five periods over the tapping season was captured by community PCR fingerprinting.' In an effort to find a phylogenetic affiliation for relevant peaks representing DNA fragments, 44 morphologically different bacterial isolates from maple sap were typed using the same fingerprinting method (Figure 2.3). Individual profiles yielded variable peak numbers and few peaks were shared across genera. Thus, it is presumed that most peaks present in community profiles are genus or species specific, but the number of peaks does not reflect microbial richness.

48

o o o o o o o o o o o o o o o o O

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Figure 2.3 Phylogenetic affiliation and typing of 44 maple sap isolates. The left axis is a neighbor-joining tree (1000 bootstrap replicates) composed of partial 16S rRNA gene sequences from each isolate. Distance units represent number of base substitutions per site. There were a total of 714 positions in the final dataset. Blast results for closest cultured strains are identified in the table. The image on the right represents the joint consensus PCR fingerprint profiles obtained with primers L and A for each isolate.

49

In all, 87 out of 95 maple sap DNA samples were positive for both primers, i.e., they had

detectable DNA fragments from 250 to 1000 bp. A total of 636 possible peak positions

were analysed of which 41.2% were presumptively identified. No peak was shared by all

samples. However, five peaks (0.7%) were found across all production sites and 152

peaks (22.3%), including these five, were found throughout the sap flow season.

Among the five peaks found across all production sites, peaks L10, LI25 and A63 were

present in both Pseudomonas and Rahnella isolate profiles. Peak L324 was present in

one Pseudomonas isolate (75-pl5_P4) and peak L300 was not found among isolate

profiles. Peaks L69, LI42 and A41 were found in 17, 17 and 18 production site profiles

respectively as well as in several isolate profiles of the genus Pseudomonas only. Peaks

associated only with Rahnella isolates were individually found in 14 production sites at

most, but altogether they were present at all 19 production sites. Similarly,

Janthinobacterium, Chryseobacterium and Epilitonimonas associated peaks were found

in 13, 9 and 5 production sites, respectively. Sample consensus profiles with some of the

presumptively identified peaks are shown in Figure 2.4.

To explore gene pool variation among microbial communities, PCR profiles were

classified using Ward's method, which is known to be a suitable clustering method to

find natural groups (Blackwood et al. 2003) (Figure 2.5). Collection site was the most

significant clustering criterion observed, as profiles from the same production site were

generally grouped together. However, some 0% and 25% sap flow samples clustered

apart. Samples from Chaudière-Appalaches and Estrie clustered more closely than

samples from other regions. To confirm that these observations were not caused by the

clustering method, principal component analysis (Figure 2.6) was used as an alternative

method. Score plots show no separate cluster, although 0% and 25% flow samples as

well as Chaudière-Appalaches samples are mostly positive for principal component 3.

As a third method, two-way ANOSIM confirms that profiles were not significantly

influenced by geographical region (R = -0.049, p = 0.827) or sap flow period (R =

0.0446, p = 0.188).

50

B-100 C-0 C-50 C-100 D-0 D-50 D-100 E-0 E-50 E-100 F-0 F-50 F-IOO

L 516 Pseudomonas —""■►

L324 Pseudomonas—"""► I L311 R a h n e l l a - ^ M

L300—>

L 2 6 3 — ^ L254 Stenotrophomonas—"^

L213

L198 Pseudomonas

L174

L142 Pseudomonas

L125 Pseudomonas. Rahnella—***^

L\04 Rahnella—*>

L86 Chryseobacterium—^

L69 Pseudomonas—^

L53—>•

L38 Planlibacter—^.

L17 Janlhinobacterium L10 Pseudomonas. Rahnella'

Figure 2.4 Examples of PCR fingerprint consensus profiles obtained with primer L. Columns correspond to results from producers B, C, D, E and F at 0%, 50% or 100% of sap flow period. Presumptive phylogenetic affiliations of peaks based on maple sap bacterial isolate profiles are identified on the left.

51

Primer L JL

Figure 2.5 Heat map and Ward dendrogram of combined consensus PCR fingerprints obtained with primers L and A. Samples are colored by geographical region and labeled with a letter for the production site followed by flow period in % sap flow. The figure was generated with JMP 7 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

52

-10

10

E 8 o

-10 -

% flow geographical region period ■ Lower St-Lawrenœ ■ 0 +■ Center of Québec ■ 25 X Chaudière-Appalaches . 5 0 D Estne

X + A • 75 O Lauren tid es- Lanaud—es

D + . 100 ^ Mauricie

x ° * M — ■**

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M — ■** > n + x ' ■

X

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X

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+ ^ +

' I -20 -10 0 i ' i

10 20 ■ i ' i '

-20 -10 ( 1 f I f

10 I 20

Principal component 1 Principal component 2

Figure 2.6 Principal component analysis of combined PCR fingerprints from primers L and A. Sample are colored according to % flow period and marked by geographical region. Eigenvalues are 48.78 (7%), 36.87 (5%) and 30.22 (4%) for principal component (Axis) 1, 2 and 3 respectively. The figure was generated with JMP 7 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

53

2.5.3 Maple sap 16S rRNA gene clone libraries To complement the PCR-based community fingerprints, 13 clone libraries were

constructed with partial 16S rRNA gene amplification of sap samples. Four production

sites at the 0%, 50% and 100% sap flow periods were selected to evaluate variation

between geographical sites over the season. An additional 100% sample from a fifth

production site was added to assess inter-site variation within a region. A total of 2,239

sequences was retained after removal of chimeras and grouped into operational

taxonomie units (OTU) using the furthest neighbor method in DOTUR. Species-level

OTU is generally defined as containing sequences that are >97% identical because it is

the historically accepted level for species definition when the complete 16S rRNA

sequence is taken into account (Gevers et al. 2005; Schloss et al. 2005). However, for

environments with low deep diversity, a more stringent analysis using a 99% identity

cutoff can allow a better understanding of the microbial community. Therefore, both

similarity thresholds of 97% (OTU003) and 99% (OTU001) were applied and yielded 85

OTUS003 and 167 OTUsooi, respectively.

The phylogenetic architecture and relative abundance of OTUso.03 are shown in Figure

2.7 and Figure 2.8. The largest OTU003, belonging to the Gammaproteobacteria class

and the Pseudomonas genus, contained 1,427 sequences (64% of the total). The second

largest OTU0.03 also belonged to the Gammaproteobacteria class, but was affiliated with

the Rahnella genus and contained only 173 sequences (8%). Other common OTUso.03

belonged to the genus Janthinobacterium, Chryseobacterium, Epilitonimonas and

Sphingomonas. Some less frequent but significantly abundant OTUso.o3were members of

the lactic acid bacteria group belonging to the genera Leuconostoc, Lactococcus and

Weissella.

54

B-100 C-0 C-SO C-IOO D-0 D-50 D-lOO E-0 E-50 E-IOO F-0 F-50 F-lOO

- ■ = _

0.05

<

- Sphmg<amonas

^. Alphaproteobactena

Acltnobacteria

Rahnella

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I >- Betaproteobactena

— Janthmobactermm Bacteria

^ ( lostridta

Bacili

( hryseobactenum

>■ Flavobaclena —Epilithonimonas

Hacteroldetes

>- Sphmgobadena

Figure 2.7 Phylogenetic architecture and relative abundance of OTUso 03 of five maple sap producers. The left axis is a neighbor-joining tree (1000 bootstrap replicates) composed of representative sequences from each of the 85 OTUsoo3- Distance units represent the number of base substitutions per site. There were a total of 562 positions in the final dataset. Relative abundance of OTUso.03 in each sample in the heat plot is indicated by a colorscale value in percent. Columns correspond to clone library results from producers B, C, D, E and F at 0%, 50% or 100% of sap flow period. Phylogenetic classes and genera are identified on the right.

55

100

ai o c ro ■o c 3 _ ro > I _

i Actinobacteria i Alphaproteobacteria i Sac//// i Bacteroidetes i Betaproteobactena i Clostridia i Flavobacteria i Gammaproteobacteria 86.5 87.8 74.9 91.7 i Sphingobacteria 0.6 1.2 1.6 0.0

Figure 2.8 Relative abundance of phylogenetic classes found in each clone library, sorted by the sap flow period. Production sites are labeled by letter.

56

A total of 38 OTUS003 (74 OTUsooi) contained only one sequence each. Overall, 1,834

(82%) sequences were 100% identical to at least one other sequence and 405 (18%)

sequences were unique. Only 17 of the 85 identified OTUsoo3 were identified at all sap

flow periods, although they represent 90% of the total of 2,239 sequences. Unique

OTUsoo3 were identified for each sap flow period, and were most abundant at the

beginning of the season (26) and minimal at mid-season (8).

Tableau 2.2 Pairwise comparison of maple sap microbial communities by flow period

OTU 0.03

Chaol shared richness (OTUs)

abund abund e BSE

0%-100% 45 0.94 0.10 0.85 0.02

0%-50% 48 0.90 0.15 0.99 <0.01

50%-100% 22 0.90 0.10 0.89 0.02

OTU 0.01

0%-100% 68 0.83 0.08 0.33 0.03

0%-50% 63 0.84 0.08 0.43 0.04

50%-100% 176 0.97 0.07 0.83 0.03

The indices calculated by SONS were used to further describe the relationships between

microbial communities while taking into account species coverage and undetected

species. The Jabund value estimates the community membership overlap of two samples,

with probability between 0 and 1 that a randomly selected OTU in one community is

present in the other (Schloss and Handelsman 2006). The Jabund value and its standard

error reported suggest that community membership at 97% similarity was similar among

all sap flow periods tested (Tableau 2.2). However, the Jabund index is lower at 99%

similarity, showing that differences are detected especially between the community of

the 0% sap flow and those of the other periods.

Community structure was further characterized by taking into account OTUs abundance

using the similarity indices 0 (Tableau 2.2). Values range from 0 (completely dissimilar

community structure) to 1 (identical community structure) (Schloss and Handelsman

2006). OTUsooi indicate differences in community structure between all flow periods

57

whereas OTUS003 indicate a difference only for the 100% flow period. These results

suggest that shifts in bacterial community structure were largely a result of changing

abundance patterns of organisms, rather than the appearance of novel organisms.

Tableau 2.3 Variation in community membership and structure among five production sites

OTUo.03 Chaol shared

richness (OTUs) Jabund Jabund OC 0 0SE

E-F 59 1.00 0.06 0.82 0.03

E-C 27 0.85 0.13 0.93 0.01

E-D 21 0.84 0.13 0.94 0.01

E-B 21 0.86 0.12 0.92 0.02

F-C 50 0.94 0.20 0.85 0.03

F-D 26 0.94 0.21 0.87 0.03

F-B1 25 0.93 0.23 0.80 0.05

C-D 23 0.78 0.20 0.96 0.01

C-B 25 0.90 0.13 0.94 0.02

D-B 21 0.87 0.13 0.97 0.02

OTUo.01

E-F 100 0.99 0.10 0.31 0.04

E-C 92 0.81 0.10 0.48 0.05

E-D 46 0.75 0.09 0.60 0.04

E-B 26 0.69 0.10 0.41 0.04

F-C 31 0.93 0.10 0.21 0.03

F-D 37 0.90 0.12 0.34 0.04

F-B1 30 0.89 0.11 0.52 0.07

C-D 44 0.68 0.12 0.72 0.04

C-B 22 0.79 0.10 0.51 0.06

D-B 38 0.74 0.09 0.63 0.06

Producing sites F and B belong to the same geographical region.

Of the 85 OTUsoo3 identified, 7 OTUs<io3 (81% of all sequences) were present at all

production sites, whereas 49 OTUso.o3 (4% of all sequences) were specific to one

production site. Microbial communities were compared pairwise using SONS (Tableau

2.3). The J und value and its standard error suggest that community memberships for

58

OTU so .03 were quite similar. However, greater differences were detected for OTUsooi-

With respect to community structure, although all sites showed only small differences at

97% similarity, a drastic decrease in 0 values is seen at 99% similarity (Tableau 2.3).

The Shannon diversity index was used as an estimate of the relative diversity captured

by each sampling period for each production site. Results indicate no common pattern in

diversity change over the season (data not shown). However, the Shannon index is

highest for the 100% sap flow samples, suggesting highest diversity at the end of the

flow season.

Sequences (32 out of 44) from the isolates are identical to sequences (321) from 10

different OTUs(ooi) which total 66.7% of the 2239 sequences retrieved. Furthermore, 12

isolate 16S rRNA gene sequences have no identical sequence in the clone libraries,

meaning that these isolates represent a rare fraction of the microbiota.

2.6 Discussion Maple syrup producers are already advised to sanitize their tapping equipment to

minimize microbial contamination of tap holes (Allard 1999). Nevertheless, maple sap

microbial contamination remains a critical issue for maple syrup quality. Each year, on

average 11% of maple syrups are rejected because of flavor defects and 20% are

classified with slight off-flavors (FPAQ 2008). Some causes of defects are cleaning

agent residue, excess of defoaming agents and microbial spoilage of sap. For instance,

Enterobacter (Aerobacter) aerogenes causes ropiness in maple syrup, and is the only

reported case of a spoilage agent in maple sap (Fabian and Buskirk 1935). Up until now,

no study has extensively explored the microbial communities and their potential role in

maple sap and syrup quality. This study focused on giving a comprehensive portrait of

maple sap microbial communities representative of the Québec industry. Results show

evidence of stable microbial community members in maple sap along with a pattern in

the evolution of their relative abundance over the season.

A new community PCR fingerprinting method using RAPD with a combination of

previously reported modifications such as the use of degenerate primers, long primers,

59

touchdown PCR (Sakallah et al. 1995; Gillings and Holley 1997; Trevino-Castellano et

al. 2003; Yan et al. 2007) and capillary electrophoresis combined with fluorescent

primers (Corley-Smith et al. 1997) was used to survey the genetic variation in maple sap

microbial communities from six geographical regions of Québec at five different flow

periods evenly distributed over the season by sap volume percentage. This new method

was rapid, avoiding digestion time needed by other community fingerprinting methods

such as terminal restriction fragment length polymorphisms (T-RFLP). The profiles

were reproducible, and did not give a higher number of classification errors than T-

RFLP (Blackwood et al. 2003). The number of classification errors for replicate PCR

profiles (one out of 38 possible grouping errors, see Figure 2.1) was comparable to T-

RFLP (two out of 32 possible grouping errors) (Blackwood et al. 2003). Maple sap

community fingerprint clustering and PCA agreed with clone library OTUo.oi structure

analysis, indicating a more important difference between 0% and other flow periods.

This confirms that the method is useful to fingerprint communities composed of closely

related species sharing high 16S rRNA sequence similarity. Moreover, PCR fingerprints

of maple sap isolates demonstrate a high level of genetic diversity even for isolates with

similar partial 16S rRNA gene sequences. Although fragments cannot directly be used to

identify members of a community, they can be presumptively attributed to isolates typed

with the same fingerprinting method. Alternatively, they can be cloned and used as

genetic markers (Yan et al. 2007).

To complete the PCR fingerprinting results, this study analyzed the microbial

communities identified in a subset of 13 representative samples with 16S rRNA gene

clone libraries with two OTU cutoff values (97% and 99% similarity). The

predominance of Pseudomonas in the Lower St-Lawrence, Mauricie, Estrie and Center

of Québec regions suggests that this is not a unique feature for only one region of

Québec (Lagacé et al. 2004; Lagacé et al. 2006b). Furthermore, the presence of

Rahnella, first reported by a previous DGGE study in only the Center of Québec region

(Lagacé et al. 2006b), was also found in each of the five production sites analyzed.

For the first time, the 16S rRNA gene clone libraries revealed the presence of

Janthinobacterium, Leuconostoc, Lactococcus, Weissella, Epilitonimonas and

60

Sphingomonas in maple sap. These new findings could be attributed to the increased

resolution of the method compared to DGGE or conventional cultivation methods, but

also to the large-scale sampling. Distinctive microbiota members that occur sporadically

may not have enough support to be used as geographical biomarkers, but these potential

contaminants may be correlated with other types of flavor defects. Among others, lactic

acid bacteria were occasional but relatively abundant contaminants that could be

responsible for sap acidification, which is sometimes associated with flavor defects

(Dumont 1999). Janthinobacterium is also known as a psychrotrophic food spoilage

agent (Jay et al. 2005) that can form biofilms (Pantanella et al. 2007) and some strains

of Janthinobacterium lividum can utilise sucrose as the sole source of carbon (Shivaji et

al. 1991). The genus Ralstonia, although it was previously reported as an important

contaminant of maple tree tap holes (Lagacé et al. 2004), was not found in maple sap

sampled with clone libraries, suggesting that it is only an occasional contaminant when

taking into account multiple production sites.

2.6.1 Maple sap microbial community membership This study demonstrates that maple sap microbial communities share common members.

All production sites are contaminated by at least 104 CFU/mL oi Pseudomonas by the

end of the season, and all PCR fingerprints contained presumptive Pseudomonas peaks.

One peak common to all 19 production sites was presumptively attributed to a single

Pseudomonas isolate whose 16S rRNA gene sequence corresponded to the most

abundant OTU003 (and OTUo.oi)- This OTU003, along with 6 others, was found in the

five production sites analyzed with clone libraries. They are affiliated with

Pseudomonas, Rahnella, Janthinobacterium, Sphingomonas, Chryseobacterium and

Frigoribacterium. Peaks associated with Rahnella isolates were also found in the 19

production site PCR fingerprints. One common peak (L300) could not be presumptively

attributed to an isolate, perhaps because only a few isolates of Janthinobacterium and

Chryseobacterium and no isolates of Sphingomonas and Frigoribacterium were

recovered for typing.

Other evidence supporting shared membership of maple sap communities is the Jabund

values that are extremely high, even for OTUsO.01. ANOSIM and principal component

61

analysis of PCR fingerprint data also reflect the close membership of the communities as

no significant dissimilarity was found and no separate cluster of samples was formed.

Such a strong common membership between maple sap communities, across all

producing regions of Québec is most certainly not random. It could mean that there are

common selection factors determining the major members of the microbiota in maple

sap. For instance, the ability to adhere and form biofilms inside the polyethylene

collection tubing system is a selective advantage oi Pseudomonas (Lagacé et al. 2006a),

an extremely versatile microorganism that can flourish in nearly all moist environments

(Grice et al. 2008). Moreover, microorganisms adapted to grow at low temperature and

able to resist freeze and thaw cycles required for maple sap to flow are more likely to be

selected in this environment. Producers also store unprocessed sap in closed tanks which

could favor microorganisms capable of growth in the absence of oxygen, such as the

enteric bacterium Rahnella that produces acid from sucrose (El-Hendawy et al. 2003).

The flow period comparison indicated that the 0% flow period is the most different in

term of membership. This may reflect a common source of initial contamination,

perhaps containing microorganisms that are not able to grow in maple sap. The origin of

contamination in maple sap has not yet been studied, but it has been hypothesized that

bacterial contamination most likely comes from the surrounding environment (Morselli

and Whalen 1991; Lagacé et al. 2004). A study using culture methods to survey bacteria

in maple tap holes found some degree of analogy with forest soil microbial communities

(Lagacé et al. 2004). Lamarche et al. (2007) showed that forest floor bacterial

community composition varies across the southern boreal landscape of Québec as a

function of stand type, stand age and geological parent material. Given that sugar bushes

all have the same dominant stand type (Acer saccharum), it is possible that common

contaminants of maple sap are also a common feature of the surrounding soils. However,

the maple sap microbial community has only a low level of deep diversity compared to

other environmental samples, such as soil, which can harbor more that 20 bacterial

divisions (Dunbar et al. 2002). In maple sap, members of only four divisions were

recovered: Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes. Interestingly,

these are the same divisions as those reported for human skin microbiota, where

Pseudomonas and Janthinobacterium are also predominant members (Grice et al. 2008).

62

2.6.2 Maple sap microbial community structure Community structure, reflected by relative abundance, evolves over the flow period.

Structural changes occur mostly in the second half of the season, as higher Pseudomonas

than anaerobe counts occur at mid-season but similar counts occur at the end.

Meanwhile, Pseudomonas relative abundance decreases towards 100% sap flow, as

Rahnella and other lactic acid bacteria increase. However, even greater structural change

occurs between 0% and 50% sap flow for OTUo.oi- Interestingly, the relative abundance

of several Pseudomonas OTUsooi drops between the 0% and 50% flow period sampling

points. This is probably why structural changes are not reflected by microbial counts for

those sampling points. Also, the higher diversity for 100% sap flow samples is

consistent with a decrease of the relative abundance of the predominant OTU toward the

end of the season, as it is generally minimal at 50% and maximal at 100% sap flow

volume, although this may differ among sampling sites. For instance, Lagacé et al.

(2006b) found less DGGE band diversity at the end of the season. Our findings indicate

that structural differences occur among production sites, underlining the importance of

sampling different regions.

This overall microbial community variation pattern was not expected and could be

partially responsible for certain observed seasonal changes in maple syrup quality, such

as darkening color. In fact, Pseudomonas spp. use an intracellular phosphorylase instead

of an extracellular invertase enzyme, meaning that they do not hydrolyse sucrose to

glucose and fructose (Latour and Lemanceau 1997) which further react in the Maillard

reaction during the heating process, leading to dark pigment production. Future work

could validate the hypothesis that, when present in sufficient amounts in maple sap,

Pseudomonas may prevent darkening of maple syrup by inhibiting or competing with

invertase producing microorganisms.

In conclusion, predominance of Pseudomonas is suggested as a general characteristic of

the maple sap microbial community across geographical regions, production sites, and

sap flow periods. It has been hypothesised that a stable microbiota present in the

biofilms could be associated with the development of characteristic maple syrup color

and flavor (Lagacé et al. 2006b). Pseudomonas would undoubtedly contribute to this

63

stable microbiota (Lagacé et al. 2004; Lagacé et al. 2006b). Rahnella could also be

considered a stable member of the maple sap microbiota, although it was not always a

predominant member. Additionally, the variation in relative abundance observed within

the microbial population might be associated with maple sap composition changes in

sugars, organic acids and phenolic compounds that in turn may affect syrup quality.

Further work is necessary to validate the association between particular microbiota

members and flavor development. Quantitative real time PCR associated with

corresponding syrup quality data could be useful to answer the ultimate question: which

organisms are beneficial and which are detrimental to maple sap and syrup quality?

2.7 Acknowledgements This work was supported by the NSERC Canada Research Chair awarded to D. Roy and

an NSERC Strategic Project grant awarded to D. Roy, G. LaPointe and L. Lagacé. The

authors acknowledge the support of the Centre ACER Research Fund (St-Norbert

d'Arthabaska, Québec, Canada).

We are grateful to C. Charron and R. Desruisseaux for their technical help. We thank

Éric Rasolofo (Laval University) for providing some pure cultures isolated from maple

sap biofilm.

Chapitre 3

Corrélation de la composition de la sève d'érable avec les communautés bactériennes et fongiques déterminées par MARISA

Correlation of maple sap composition with bacterial and fungal communities determined by multiplex automated ribosomal intergenic spacer analysis (MARISA)

3.1 Résumé Lors de la récolte, la sève d'érable est contaminée par des bactéries, levures et

moisissures qui colonisent ensuite le système de collecte tubulaire. Le microbiote

bactérien a davantage été caractérisé que le microbiote fongique, mais l'impact de ces

deux composantes sur la qualité demeure indéterminé. Cette étude se concentre sur

l'identification des membres bactériens et fongiques et l'analyse de la corrélation de la

composition du microbiote avec les propriétés de la sève d'érable. Une analyse de

régions intergéniques ribosomales automatisée multiplexe (MARISA) a été développée

afin d'obtenir une identification présomptive des membres bactériens et fongiques

d'échantillons d'eau d'érable récoltés sur 19 sites de production, à trois reprises au cours

de la période de coulée. Les résultats indiquent que la communauté fongique de la sève

d'érable est principalement composée de levures apparentées à Mrakia spp., Mrakiella

spp., Guehomyces pullulans, Cryptococcus victoriae et Williopsis saturnus. Les pics

correspondant à Mrakia, Mrakiella et Guehomyces ont été identifiés dans les

échantillons de tous les sites de production et celles-ci peuvent être considérées comme

des membres stables du microbiote acéricole fongique. Une analyse multivariée basée

sur les profils MARISA et la composition chimique de la sève montre des correlations

entre Candida sake, Janthinobacterium lividum, Williopsis sp., Leuconostoc

mesenteroides, Mrakia sp., Rhodococcus spp., Pseudomonas tolaasii, G. pullulans et la

composition de la sève à différentes périodes de coulée. Cette étude apporte de

66

nouveaux éléments concernant le lien entre la communauté microbienne et la qualité de

la sève d'érable.

3.2 Abstract During collection, maple sap is contaminated by bacteria and fungi that subsequently

colonize the tubing system. The bacterial microbiota has been more characterized than

the fungal microbiota, but the impact of both components on maple sap quality remains

unclear. This study focused on identifying bacterial and fungal members of maple sap

and correlating microbiota composition with maple sap properties. A multiplex

automated ribosomal intergenic spacer analysis (MARISA) method was developed to

presumptively identify bacterial and fungal members of maple sap samples collected

from 19 production sites during the tapping period. Results indicate that the fungal

community of maple sap is mainly composed of yeast related to Mrakia spp., Mrakiella

spp., Guehomyces pullulans, Cryptococcus victoriae and Williopsis saturnus. Mrakia,

Mrakiella and Guehomyces peaks were identified in samples of all production sites and

can be considered dominant and stable members of the fungal microbiota of maple sap.

A multivariate analysis based on MARISA profiles and maple sap chemical composition

data showed correlations between Candida sake, Janthinobacterium lividum, Williopsis

sp., Leuconostoc mesenteroides, Mrakia sp., Rhodococcus spp., Pseudomonas tolaasii,

G. pullulans and maple sap composition at different flow periods. This study provides

new insights on the relationship between microbial community and maple sap quality.

67

3.3 Introduction Maple sap is an abundant resource in the Province of Québec. It is collected during the

spring season when the temperatures span the freezing point, allowing the sap to flow,

which is then used to produce maple syrup and other maple products. Maple sap is

mainly composed of water (95-99%), sucrose (1-5%), and other constituents including

reducing sugars, organic acids and phenolic compounds present in variable amounts

(Morselli et al. 1996; Perkins and van den Berg 2009).

Initially practically sterile inside the tree (Morselli and Whalen 1991), maple sap harbors

an increasing number of microorganisms as the flow season progresses and the

temperatures get milder (Lagacé et al. 2002; Lagacé et al. 2004). Bacteria, yeast and

molds compose the microbiota and mixed biofilms colonize the sap collection system

tubing (Lagacé 2006). Growth of microorganisms can modify several sap constituents,

which in turn may affect the maple syrup quality. Conversion of sucrose to invert sugars

by microbial invertase is the main problem because invert sugars react with free amino

acids during the boiling process producing Maillard reactions. The reaction products

cause undesirable dark pigmentation and burnt flavor in maple syrup (Naghski et al.

1957a; Morselli and Whalen 1991).

The bacterial microbiota of maple sap has recently been studied, indicating that

Pseudomonas spp. are predominant and stable bacterial members that can be found in

each production site throughout the tapping season (Filteau et al. 2010). The other main

groups of bacteria in maple sap belonged to Rahnella, Janthinobacterium, Leuconostoc,

Epilithonimonas, Chryseobacterium and Sphingomonas genera, but their occurrence

could not be confirmed for every site. In contrast, information available on the fungal

microbiota of maple sap is scarce and could be regarded as outdated because studies

were conducted before modern sap collection methods were introduced (Edson et al.

1913; Sheneman et Costilow 1958). Only one recent study identified yeasts isolated

from maple sap (Lagacé et al. 2005). The most frequently encountered species were

Cryptococcus victoriae, Guehomyces (Trichosporon) pullulans and Sporobolomyces

roseus. However, cultivation conditions are known to bias the fungal qualitative and

quantitative community structure (Pitkâranta et al. 2008).

68

The fungal microbiota role in maple sap quality could be as important as the role of the

bacterial microbiota. Indeed, yeasts and molds are efficient fermentative agents that

could alter maple sap composition as it is collected. For instance, a pioneer study

investigated the individual effect of several bacterial and fungal isolates in maple sap

and found that isolates of Pseudomonas geniculata and Enterobacter agglomérons

(Flavobacterium rhenanum) could enhance maple flavor while yeast isolates enhanced

burnt flavor (Naghski et al. 1957a). To our knowledge, the relationship between maple

sap composition and its complex bacterial and fungal microbiota has never been studied.

Knowledge of those relationships would further help understand how microorganisms

interact and modulate maple sap quality. So far, the maple sap fungal microbiota has

never been studied with culture-independent methods, which could reveal the presence

of significant uncultivable microorganisms. Therefore, an accurate portrait of maple sap

fungal community diversity and stability is needed.

The molecular era has enabled community analysis of virtually any environment with

fingerprinting methods based on ribosomal opérons, thus by-passing the need for culture

methods. In the past decade, semi-automated techniques such as terminal restriction

fragment length analysis (T-RFLP) and automated ribosomal intergenic spacer analysis

(ARISA) have been developed to assess soil microbial diversity (Ranjard et al. 2001;

Blackwood et al. 2003). T-RFLP is usually based on the amplification of the 16S rRNA

gene with a subsequent enzymatic restriction step while ARISA is based on the

amplification of the intergenic region between the 16S and the 23S rRNA genes (IGS

region). For fungi, the target of choice is the internal transcribed region (ITS) between

the small subunit and the large subunit including the 5.8S rRNA gene. A multiplex T-

RFLP reaction has even been developed to simultaneously study bacterial and fungal

communities of soil samples (Singh et al. 2006), hence increasing the information for

the same amount of material and effort. However, ARISA would be more effective in

detecting the presence of bacteria accounting for less than 5% of total amplified product

(Danovaro et al. 2006) and involves no time-consuming enzymatic restrictions because

of the inherent variation in length of the target region. Despite these advantages, few

applications of ARISA to food matrices have been published (Cardinale et al. 2004;

Ikeda et al. 2007; Arteau et al. 2010).

69

The aim of this study was to simultaneously analyze the bacterial and fungal microbiota

composition of maple sap samples collected from 19 production sites during the sap

flow period by developing a multiplex ARISA (MARISA) method. Clone libraries,

ARISA on bacterial isolates and database analysis were also performed to presumptively

identify fungal and bacterial predominant members. Finally, MARISA profiles and

corresponding sap chemical properties were subjected to multivariate analysis to bring a

better understanding of the impact of maple sap microbial community changes on maple

sap composition.

3.4 Materials and methods

3.4.1 Maple sap samples Concentrated maple sap samples (4X, corresponding to around 8 °Brix), microbial

counts and DNA extractions were obtained from a previous study (Filteau et al. 2010).

Samples were from 19 Québec production sites collected 0%, 50% and 100% of

cumulative sap flow during the 2005 spring season for a total of 57 samples.

3.4.2 Chemical analysis The pH of maple sap concentrates was determined using a PHM82 combined electrode

(Radiometer Copenhagen). Concentrations of simple sugars and organic acids were

measured with a high performance liquid chromatography system (Waters, Milford,

MA) using protocols previously described (Dumont et al. 1993b). Phenolic compounds

were analyzed using protocols of Kermasha et al. (1995), Deslauriers (2000) and

Dumont et al. (1993b). The percentage of total soluble solids (°Brix) was measured with

a digital refractometer AR200 (Reichert Scientific Instruments, Buffalo, N.Y., U.S.A)

compensated at 20°C. Sap chemical composition values were normalized to 66 °Brix

which is the final sugar concentration of maple syrup in Canada.

3.4.3 ARISA and MARISA A previously published ARISA protocol was adapted to analyze maple sap DNA

samples (Arteau et al. 2010). Two primer pairs were used to amplify bacterial and

fungal intergenic ribosomal fragments from maple sap DNA samples. Primers 2234C

(5'-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3') and 3126T (5'-

70

ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3') were used to amplify the polymorphic ITS1-

5.8S-ITS2 region of fungal genomic DNA. For bacterial organisms, primers S-D-Bact-

1522-b-S20 (5'-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3') and L-D-Bact-132-a-A-18 (5'-

CCGGGTTTCCCCATTCGG-3') were used to amplify the IGS region (Ranjard et al.

2001). Primers 2234C and S-D-Bact-1522-b-S20 were respectively labeled at their 5'

end with 6FAM and HEX fluorochromes. Each PCR contained 100 ng DNA, 2.5 U Taq

DNA polymerase (Biolab, Dorval, QC, Canada), IX supplied polymerase buffer, 40

nmol total dNTP in a 50 pL total reaction volume. Initially, 15 pmol of each primer was

used for both individual and multiplex PCR, but amplification in multiplex reaction was

weak, especially for bacterial amplicons. Therefore a total amount of 60 pmol primer

was used and the following ratios were tested; 1:1, 1:2 and 5:7 of fungal and bacterial

primers, respectively. Optimized conditions retained for MARISA were 10 pmol of each

fungal primer and 20 pmol of each bacterial primer. PCR amplifications were performed

in triplicate along with a negative control in a Tgradient thermocycler (Biometra,

Goettingen, Germany) with a program consisting of an initial 3-min denaturing step at

94°C, then 25 cycles of 1 min at 94°C, a 30-sec annealing step at 55°C, a 1-min

elongation step at 72°C, followed by a final 5-min elongation step at 72°C. PCR

products were then purified with the QIAquick PCR purification kit (QIAGEN,

Missisauga, ON, Canada) according to the manufacturer's centrifugation protocol and

eluted in 20 pL. Purified PCR product concentration was determined using a Nanodrop

ND-1000 spectophotometer (Nanodrop technologies, Inc. Wilmington, DE, USA).

Subsequently, 20 ng of purified PCR product were loaded with 9.6 pL formamide and

0.4 pL ROX labelled MapMarker 1000 (Bioventures, Murfreesboro, TN, USA) and

electrophoresed on a 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA,

USA).

Sequencer output files were analyzed using GeneMapper® v3.7 software (Applied

Biosystems) with the following settings: analysis range = 150-1000 bp, bin size = 1.2

bp, peak half width = 2, polynomial degree = 3, peak detection window = 1 1 , blue

baseline = 20 rfu, green baseline = 30 rfu and using the light smoothing option. Peak

height values and sizes were then imported to a spreadsheet (Microsoft® Excel®) for

transformation. To account for peak height variation, a mean consensus profile was

71

constructed for each sample. Figure 3.1 shows example of triplicate profiles. Average

peak height of reproducible amplicons (present in at least two replicates) was reported in

the consensus profiles. Consensus fingerprint peak height data was transformed with the

Hellinger transformation, which corresponds to the square root of relative peak heights

(Legendre and Gallagher 2001; Blackwood et al. 2003).

Fragment length (bp)

Figure 3.1 Example of replicate MARISA profiles. PCR, purification and capillary electrophoresis were performed independently for each replicate.

3.4.4 Fungal ITS1-5.8S-ITS2 clone libraries and sequencing Unlabelled primers 2234C and 3126T were used to amplify the ITS1-5.8S-ITS2 region

of samples 100-pl 1 and 50-pl2. PCR was carried out as for ARISA in triplicate for each

DNA sample including a negative control. Products were then purified with a QIAquick

PCR Purification Kit (QIAGEN) and pooled. Purified products were cloned into the

pCR®2.1-TOPO® vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A total of 96 colonies for

each library were randomly selected and plasmid DNA was purified with a Montage™

72

Plasmid MiniprepHTS Kit (Millipore, Billerica, MA, USA). Plasmid inserts were

screened for sequence length variation and representative clones were sequenced

bidirectionally with Ml3 primers and with the 2234C and 3126T unlabelled primers

using an ABI PRISM® dGTP BigDye™ Terminator v.3.0 Ready Reaction Cycle

Sequencing Kit (Applied Biosystems) and a 3100 Genetic Analyzer (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA). Sequence traces were edited and assembled using

Geneious Pro 4.8.4 (Biomatters Ltd, Auckland, NZ). Affiliation of each sequence was

attributed using BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

3.4.5 Identification of peaks DNA of 15 representative maple sap bacterial isolates obtained from a previous study

(Filteau et al. 2010) and plasmids of 26 representative fungal clones were used as

template for ARISA. To avoid overscaling fluorescence, only 2 ng of purified PCR

product was used for capillary electrophoresis. Experiments were repeated three times to

ensure sizing accuracy. Additionally, the Ribosomal Intergenic Spacer Sequence

Collection (RISSC) database (http://egg.umh.es/rissc/) was used to attribute presumptive

identification of bacterial peaks. Peak sizes minus -150 bp, corresponding to S-D-Bact-

1522-b-S-20 primer and about 130 bp of the 23S rRNA gene (Ranjard et al. 2001) were

compared to intergenic spacer lengths (IGS). Only previously reported bacteria in maple

sap were considered for presumptive identification with the RISSC database.

3.4.6 Nucleotide sequence accession numbers Clone sequences are available in GenBank under accession numbers HQ267062 to

HQ267087.

3.4.7 Multivariate and statistical analysis The software PC-ORD (MjM Software, Gleneden Beach, Oregon, USA) was used to

perform multivariate analysis. To test significance of flow period and production site, a

blocked multiresponse permutation procedure (MRBP, Euclidean distance) was used.

Subsequently, nonmetric multidimentional scaling (NMS) was used, as it is an

ordination method well suited for community ecology avoiding the assumption of linear

relationship among variables (McCune and Grace 2002). Principal component analysis

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://egg.umh.es/rissc/

73

(PCA) was used to ordinate normalized chemical properties of sap samples because it is

an ideal technique for data with approximately linear relationships among variables

(McCune and Grace 2002). An indirect gradient analysis approach was used to assess

relationships between maple sap chemical composition and microbial community data

(Ramette 2007). Joint plots show the correlation of the MARISA data (vectors) to the

principal components. For a given species (or peak), the line forms the hypotenuse of a

right triangle with the two other sides being r2 values between the species and each of the

two axes (McCune and Grace 2002). The statistical software JMP 7 (SAS Institute,

Cary, NC, USA) was used to perform a blocked ANOVA to compare means of chemical

property values between flow periods. When significant, it was followed by a Tukey-

Kramer HSD test.

3.5 Results

3.5.1 Comparison of ARISA and MARISA profiles To validate the optimized MARISA protocol, it was compared to the traditional ARISA

protocol for three maple sap DNA samples (in triplicate for each sample). Results show

that nearly all peaks were amplified by both methods, although individual peak height

could vary (Figure 3.2). The overall reproducibility of the method was improved with

the multiplex protocol as the mean coefficient of variation of total peak heights was 18%

and 11% for fungal and bacterial MARISA peaks, respectively, compared to 20% and

46% for bacterial and fungal ARISA peaks, respectively.

74

600 Frag ment length (bp)

Figure 3.2 Comparison of ARISA and MARISA amplification profiles of maple sap DNA. Example of a) individual fungal ARISA, b) multiplex ARISA, c) individual bacterial ARISA.

3.5.2 MARISA peak identification Overall, MARISA profiles showed 41 different reproducible fungal peaks, i.e. present in

at least two replicates of a given sample, ranging from 360 to 713 bp, and 134 bacterial

peaks ranging from 185 to 806 bp (corresponding to IGS of 35 to 656 bp). Predominant

peaks were presumptively identified by three approaches; fungal clone libraries, ARISA

of maple sap bacterial isolates and RISSC database analysis. A total of 26 representative

clones were sequenced and their amplicon size confirmed by ARISA. They were

attributed to 11 different fungal peaks including the five most frequently encountered

(Tableau 3.1). Representative maple sap bacterial isolate DNA was used as template for

ARISA to identify the main bacterial peaks. Peak numbers ranged from zero

(Chryseobacterium piscium) to six (Janthinobacterium lividum) per isolate (Tableau

3.2). Additionally, peaks were presumptively attributed to Leuconostoc mesenteroides,

Lactotoccus lactis, Lactobacillus reuteri, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tolaasii,

Pseudomonas fragi, Pseudomonas stutzeri and Rhodococcus spp. using RISSC database

analysis.

75

Tableau 3.1 Identification of fungal peaks

Sequence ID Blastn closest strain and GenBank accession % Sequence number identity length

Peak size MARISA peak ID

100-pll-H12 Candida sake AJ549822 98.6 429 428 F55 50-pl2-B9 Cryptococcus victoriae AF444447 99.8 508 510 F73 50-pl2-E8 Cryptococcus victoriae AF444469 100.0 508 510 F73 50-pl2-G12 Bulleromyces albus AF444662 100.0 531 534 F76 100-pll-H8 Cadophora melinii DQ404351 100.0 572 573 F83 50-pl2-H7 Cadophora melinii DQ404351 99.8 571 573 F83 50-pl2-A5 Williopsis saturnus EF194844 86.4 594 596 F90 50-pl2-E3 Cadophora malorum GU212430 99.5 601 598 F91 100-pll-C5 Rhodotorula sp. EU872492 99.6 596 600 F92 100-pll-D5 Guehomyces pullulans ABO 18034 100.0 608 611 F94 100-pll-F8 Guehomyces pullulans ABO 18034 100.0 608 611 F94 50-pl2-F12 Guehomyces pullulans ABO 18034 99.8 608 611 F94 100-pll-F7 Guehomyces pullulans AF444417 99.5 610 611 F94 50-pl2-G10 Rhodotorula arctica AB478857 99.1 613 618 F95 100-pll-B12 Mrakia sp. AY038834 99.9 627 631 F101 100-pll-H4 Mrakia sp. AM922288 99.6 627 631 F101 100-pll-Cl Mrakia sp. AM922288 99.8 627 631 F101 100-pll-C9 Mrakia sp. AM922288 99.8 627 631 F101 100-pll-E3 Mrakia sp. AM922288 100.0 628 631 F101 100-pll-Hl Mrakia sp. AM922288 99.7 627 631 F101 50-pl2-Al Mrakia sp. AY038829 99.8 627 631 F101 50-pl2-F2 Mrakia gelida AF 144485 98.7 630 631 F101 50-pl2-D2 Mrakia gelida AF144485 98.1 626 631 F101 50-pl2-A3 Mrakia gelida AF 144485 99.1 628 631 F101 50-pl2-F10 Mrakiella niccombsii AY029346 99.8 635 637 F103 100-pll-G8 Mrakiella aquaticus AF410469 98.4 634 637 F103

76

Tableau 3.2 Maple sap isolates used for identification of bacterial peaks Isolate Closest cultured strains and accession no. Similarity (%) Fragment size

100-pl2_6 P. fluorescens AF336352 100 668 100-p8_B 1 P. marginalis DQ232743 100 665 75-pl5_P2 P. a«tart/c„AM933518 100 674 100-p8_C5 P. lu r idaEUmm 99 670-681 0-pl2_4 P. brenneri EU 169172 100 654-667

0-pl2_3 P. collierea AM42W16 100 672-753 100-p8_A2 P. fluorescens EF552157 100 668 75-pl5_P4 P. gessardii AF074384 100 669 100-pl2_4 P. putida EU554430 99 670

100-p8_Cl Rahnella aquatilis DQ862542 99 590-607-721 100-p8_D8 Rahnella aquatilis FJ811859 99 607-612-723-730 100-p8_D2 Rahnella aquatilis AY253919 98 598-728 100-p8_G2 Stenotrophomonas maltophilia AJ011332 99 679

100-p8_9 Janthinobacterium lividum EU642885 100 648-654-656-658-670-675 100-p8_E7 Chryseobacterium piscium DQ862541 99 -

After compilation of the three identification methods, almost all dominant peaks, i.e.

frequent and abundant peaks, could be presumptively attributed to at least one organism

(Figure 3.3). Pseudomonas fluorescens, Mrakia spp, Mrakiella spp. and G. pullulans

were the most stable, as their corresponding peaks were found throughout the flow

season, and were present at all production sites. The most frequent fungal peak,

attributed to Mrakia spp., was reproducibly present in 55 of the 57 samples analysed,

while the P. fluorescens peak was found in 50 samples. A peak corresponding to a

Rahnella isolate ranked 5th in frequency, but only 10th in relative abundance. It was

found in 17 production sites (37 of 57 samples), mostly in 50% and 100% sap flow

samples (data not shown). The J. lividum isolate had five (out of six) peaks ranking high

in relative abundance (7th to 18th rank, Figure 3.3), although three of these peaks could

also be attributed to Pseudomonas isolates. Other frequent peaks corresponded to the

genera Cryptococcus, Pseudomonas, Lactobacillus, Leuconostoc, Stenotrophomonas,

Ralstonia and Williopsis. Two bacterial (B229 and B183) and one fungal (F81) frequent

peaks could not be attributed.

77

iWMopsis sp AStenotrophomonaslRalstonia

A P synngae A B183 (unknown)

A P. synngae A Leuconostoc mesenteroides

A P antartica/ Janminobacterium tvidum A Janthinobacterium lividum

• F81 (unknown) A P. marginats

A Janthinobacterium tvidum AB229 (unknown)

A Lactobacillus reuteri A P stutzen

A Rahnella sp A P. colterea

A P. kjrida/P putda I Janthinobacterium lividum A P. brenneri/ Janthinobacterium lividum

AP.Iurida ^Cryptococcus victoriae

• Mrakiella spp • Guehomyces pullulans

• Mrakia spp. A P fluorescens

Bacteria • Yeast

APgessardi

Frequency (rank)

Figure 3.3 Dominance curve plot of the 25 predominant MARISA peaks (out of 175 peaks) in 57 sap samples. Peaks are ordered and evenly spaced from most frequent (left) to less frequent (right) and from most abundant (bottom) to less abundant (top). Peaks identified with clones or isolates are indicated in black and peaks identified with the RISSC database are indicated in blue.

3.5.3 MARISA profile analysis The MRBP method was used to test the null hypothesis that no difference in microbial

profiles exists between the three flow periods and 19 production sites. This method

calculates the agreement test statistic A (A = \ - (observed delta/expected delta)) and a

p-value. When all items within groups are identical (small within-group distance gives a

low observed delta), A = 1 and when heterogeneity within groups equals expectation by

chance, A = 0. Values of A below 0 indicate that heterogeneity exceeds that expected by

chance, so that grouping is not significant (large within-group distance gives a high

observed delta). An A value of 0.3 is considered fairly high in community ecology,

meaning that differences between biological groups are not due to chance (McCune and

Grace 2002). The MRBP results indicate that MARISA profiles were similar between

0% and 50% sap flow periods groups (A = 0.04, p O.0001) and even slightly more

similar between 50% and 100% groups (A = 0.02, p <0.0001). Overall, the difference

between flow period groups was fairly small (A = 0.04, p O.00001). When using fungal

78

peak data only to examine similarity between flow periods, the result was comparable (A

= 0.05, p = 0.00001) to when using bacterial peak data ((A = 0.04, p O.00001). In

contrast, a considerable effect of production site was found (A = 0.16,/? <0.00001). This

difference is notably higher for fungal peak data (A = 0.25, p <0.00001) than bacterial

peak data (A = 0.14,p O.OOOOl).

MARISA profile differences were visualized using the non-parametric NMS ordination

method (Figure 3.4). Samples represented in species space (MARISA peak data) do not

form distinct groups, although the 0% flow period samples are located in the upper left

quadrant, while 50% and 100% samples are mostly located in the center of both axes,

which represent a gradient of species. Figure 3.4 shows that Pseudomonas marginalis,

Cadophora malorum, Pseudomons lurida and the unidentified fungal peak F81 are

mostly found in 0% sap flow samples while Pseudomonas gessardii, P. fluorescens and

P. stutzeri were most abundant in 50% and 100% sap flow samples.

79

5 03 S o

t 03

O 03

s> 03

03 e/3

CD

Sapflc >w period: ▲ o%1 • 50% ■|100%| >w period: ▲ o%1 • ■|100%|

■

/

X

A

_N

\ / ^ * ~"*

A

80< A

A A

_ k *

Je •

A

i

A ▲ â ■ y

/■• ■

CM

1 ■

A #

■ ■

• • •

▲

•

■ J

40« •

A

■ \ • y ■

<

■ A

0< ■

•

> 40 Axis 1 80

F81, P. lurida, I

P. fluorescens, P. stutzeh

Figure 3.4 NMS plot based on Bray-Curtis similarities of the Hellinger transformed MARISA data. Correlation of axis with the original data matrix are r2 = 0.29 and 0.24 for axis 1 and 2 respectively. Ellipses group 75% of samples. Presumptive identification of peaks correlated (r2 >0.25) with the axis are shown along the arrows. Stress of the plot = 0.19,/? = 0.004.

3.5.4 Maple sap composition and correlations with microbial communities Maple sap composition (pH, sugars, organic acids, phenolic compounds, bacterial and

fungal viable counts) were measured for each sample and means were compared

between sampling periods (Tableau 3.3). Most components varied significantly over the

80

flow season, especially between 50% and 100% flow periods. Microbial counts

increased during the season resulting in sucrose hydrolysis, release of monosaccharides

and organic acids. Hence, multivariate analysis was performed separately for each

sampling period.

Tableau 3.3 Tukey-Kramer HSD mean comparison of maple sap concentrate composition

Sap property' 0% sap flow 50% sap flow 100% sap flow pH 7.69 A2 7.67 A 7.36 B Sucrose (% w/w) 63.31 A 64.29 A 59.26 B Glucose (% w/w) 0.12 A 0.28 A 0.97 B Fructose (% w/w) 0.08 A 0.20 A 0.85 B Galactose (% w/w) 0.58 A 0.96 B 1.17 C Maltotriose (% w/w) 0.07 A 0.17 A 0.79 B Malic acid (% w/w) 0.45 A 0.67 B 0.68 B Oxaloacetic acid (% w/w) <0.01 A 0.03 B 0.06 C Fumaric acid (% w/w) <0.01 A 0.01 B 0.02 C Vanillin (% w/w) 1.36 A 1.02 B 0.77 B Coniferol (% w/w) 0.07 - 0.05 - 0.02 -Syringaldehyde (% w/w) 1.28 A 0.98 B 0.65 C Bacterial counts (log CFU/mL) 5.02 A 6.11 B 6.75 c Fungi counts (log CFU/mL) 3.98 A 4.52 B 5.19 c

Chemical composition expressed in % w/w is normalized to 66 °Bx Different letters indicate a significant difference between means of a property atp = 0.05

Principal component analysis was used to ordinate chemical variation of maple sap

samples for each flow period (Figs. 3.5 to 3.7). Chemical parameters are plotted as

vectors, their length and angle reflects the direction and strength of relationships of the

variables with the principal components. Principal components 1 and 2 describe between

60.3% and 72.6% of total variance among sap samples. Component 1 mainly reflects

variability in sucrose content and component 2 mainly reflects variability in pH. Other

trends in sap properties such as content in invert sugars, organic acids and phenolic

compounds fluctuate between sampling periods as they are not consistently correlated

with an axis and consequently with each other. For example, in 0% sap flow samples

(Figure 3.5), malic acid is negatively correlated with sucrose (opposite vector direction)

while in 50% sap samples (Figure 3.6), these parameters are not correlated

(perpendicular vector direction).

81

80

CM

C . CD c o Q . E o O

40

Gala Malic

Fructose, Glucose, Fu a

B150

C. sake Sucrose

F 66 J. lividum

Vanillin nïïerol

Syringaldehyde

40 Component 1 80

Figure 3.5 Joint plot of PCA on correlations between chemical properties (blue vectors) of 0% sap flow period samples (green dots) and MARISA peak data (black vectors). Randomization test (999 permutations) indicates that the first 2 axes are significant. Variance represented is 44.4% and 22.0% for axis 1 and 2 respectively. Black vectors indicate the importance of MARISA peaks with coefficients of determination r2 >0.30.

82

150

E o O

Syringaldehyde

Vanill

Fumari Oxaloaœticaci

B226, B163.B160

Fructosi plucose

Maltotriose

Sucrose

Galactose

b)

Malic acid Coniferol

L. meter Mraki

Rhodococcuss Syringaldehyd

Maltotriose? Fumaricac

B226. B163, B161, B16I Oxaloaceticacld

Glucose, Fructose

Vanillin*

teroides, B148 nn Galactose

Sucrose

c)

L. mesenteroidesf B113, B148 Galactose * /

Rtmdococcusspp Mrakia spp.

Maltotriose Syringaldehyde

P. tolaasii, Williopsis 3pT"

Vanillin

40 80 Component 1 Component2

Figure 3.6 Joint plot of PCA on correlations between chemical properties (blue vectors) of 50% sap flow period samples (orange dots) and MARISA peak data (black vectors). According to the randomization test, the first 3 components are significant. Variance represented is 38.1%, 22.2% and 15.8% for axis 1, 2 and 3 respectively, a) PCA components 1 and 2, b) PCA components 1 and 3, C) PCA components 2 and 3. Black vectors indicate the correlations of MARISA peaks with coefficients of determination r >0.30.

83

80

CM C ■D C o Q. E o O

40

0'

Fumaric acid

Oxaloacetica

G. pullulans

^Vanillin

.pH

rSyringaldehyde

"Sucrose

"Malic acid

ConiferoF

• Galactose

40 Component 1 80

Figure 3.7 Joint plot of PCA on correlations between chemical properties (blue vectors) of 100% sap flow period samples (purple dots) and MARISA peak data (black vectors). Randomization test indicates that the first 2 axes are significant. Variance represented is 53.7% and 18.9% for axis 1 and 2 respectively. Black vectors indicate the correlation of MARISA peaks with coefficients of determination r2 >0.30.

Likewise, correlations with MARISA profile data are different for each flow period

(only the correlations with r2 >0.3 are shown). At the beginning of the season, the

presumptively identified peak belonging to Candida sake was correlated (same vector

direction) with invert sugars, maltotriose and organic acids while J. lividum was

correlated with phenolic compounds (Figure 3.5). Halfway through the tapping season,

more correlations were observed (Figure 3.6) as the third principal component

84

contributed to explaining almost 16% of the variance. MARISA peaks corresponding to

P. tolaasii and to Williopsis saturnus were correlated with reducing sugars (Figure

3.6A). Peaks corresponding to Mrakia spp., L. mesenteroides and Rhodococcus spp.

were correlated with coniferol and malic acid (Figures 3.6B and C). At the end of the

season, the peak attributed to G.pullulans was correlated with glucose, fructose and

maltotriose (Figure 3.7).

3.6 Discussion Microorganisms in maple sap have been considered a problem because they can stop sap

flow or even clog the tubing system. However, the presence of a stable population of

microorganisms such as P. fluorescens in maple sap gives rise to the question about the

impact of these microorganisms on maple sap composition and syrup quality. The high

concentration factor (-40 L of sap are required to produce 1 L of syrup) and the wide

range of flavor compounds found in maple syrup support the hypothesis that stable

members of the maple sap microbiota contribute to characteristic maple syrup properties

such as color and flavor. This study focused on identifying the stable fungal members of

maple sap microbiota, as well as correlating the microbial diversity to variation of maple

sap composition over the collecting season. For this purpose, a new multiplex automated

ribosomal intergenic spacer analysis technique targeting both bacterial and fungal

organisms was developed. Results demonstrate the presence of several stable fungal

members and multivariate analysis shows different correlations between maple sap

composition and microbial community members for each flow period.

3.6.1 MARISA method In food microbiology, when large numbers of samples are required for describing

microbial community patterns, automated fingerprinting methods such as T-RFLP and

ARISA are preferred (Juste et al. 2008). However, food matrices are rich environments

that often harbor complex microbiota composed of phylogenetically distant

microorganisms such as bacteria and fungi. Therefore, multiple taxon analysis, i.e.

several parallel reactions and consequently a large amount of DNA, is often required to

obtain a complete picture. Maple sap collected early in the season was less contaminated

and extraction yielded less DNA. For these reasons, a new multiplex ARISA protocol

85

was developed. Results confirm that MARISA and ARISA are comparable in terms of

reproducibility and sensibility. Also, as reported previously for ARISA on aquatic

samples (Danovaro et al. 2006), MARISA enabled distinction of closely related maple

sap Pseudomonas spp. isolates. Given these advantages, the MARISA method has a high

potential of application in food microbiology, especially for food matrices rich in closely

related Pseudomonas species such as maple sap in which this genus was the most

abundantly and frequently represented in the 16S rRNA gene sequences analyzed

(Filteau et al. 2010).

However, like any other PCR based method, MARISA is subject to systematic biases

(Kanagawa 2003; Juste et al. 2008). For example, the Chryseobacterium soli isolate did

not yield any detectable amplicon. This could be explained by the fact that over 8% of

bacterial strains sequenced so far do not yield a PCR fragment using ARISA primers

because their ribosomal genes are not organized as an operon (Kovacs et al. 2010). Also,

to adapt the protocol, PCR optimization was required and bacterial primer

concentrations were doubled compared to fungal primer concentrations to amplify the

maximum number of peaks with both primer sets. The poor signal obtained at first

probably resulted from the higher number of peaks amplified by bacterial primers,

primer specificity (Polz and Cavanaugh 1998), rrn operon copy number heterogeneity

(Crosby and Criddle 2003), and differences in starting template concentration in the

sample (fungi counts were at least one log below bacterial counts, Tableau 3.3).

3.6.2 Maple sap bacterial community The bacterial community of maple sap has previously been investigated with community

fingerprinting profiles and 16S rRNA gene clone libraries (Filteau et al. 2010). Results

have shown a common membership along with a variation pattern in relative abundance

of closely related sequences of Pseudomonas 16S rRNA genes, especially between 0%

and 50% flow periods. The MARISA method was sensitive enough to further refine

these trends. Firstly because two gradients of Pseudomonas species are responsible for

most of the variation in relative abundance and secondly because clusters of samples

from all flow periods overlap, thus confirming the common membership. The MRBP

analysis further shows that differences between samples originate from sampling sites

86

rather than flow periods, which is in agreement with previous results (Filteau et al.

2010). Moreover, the predominance and stability of P. fluorescens was confirmed for

this sample set demonstrating the robustness of the MARISA method and lending

further credence to correlations observed with chemical data.

As for Rahnella, an associated peak was frequently found, but not at every sampling site.

The relative abundance of this peak was also lower than that for other frequently found

peaks. As a different primer set was used for MARISA and clone libraries in the

previous study (Filteau et al. 2010), it is likely that this lower relative abundance results

from a true ecological difference between species rather than a primer efficiency bias.

Therefore, it remains unclear whether Rahnella is a stable member or not. Hence, a more

sensitive quantitative method such as real-time PCR would be useful to clarify its status

in the maple sap community.

Additionally, the ranking in relative abundance and frequency of Pseudomonas spp.,

Janthinobacterium, Leuconostoc and Stenotrophomonas/Ralstonia was further defined,

revealing these microorganisms as the most important occasional contaminants.

However, not all peaks could be identified and some peaks accounted for more than one

organism, thus reducing the resolution. Increasing IGS database content and creation of

an ITS database would obviously be a useful tool for future MARISA profile

interpretation.

3.6.3 Maple sap fungal community One of the main focuses of this study was to establish which fungal organisms are

consistently found in maple sap and thus can be termed stable members. The notion of

stability in the case of the maple sap microbiota is of particular interest as it would be

the stable members that are partly responsible for the general quality of maple syrup, its

color and empyreumatic flavor for example. Meanwhile, occasional contaminants could

be responsible for its typicity and for certain types of less frequent off-flavors and

texture defects. For instance, the bacteria Enterobacter (Aerobacter) aerogenes was

found to be responsible for an occasional ropy texture in maple sap but has not been

reported as a frequent contaminant (Lagacé et al. 2004; Lagacé et al. 2006b; Filteau et

al. 2010).

87

The multiplex method allowed us to discern the variations in fungal communities

through the flow season and between 19 production sites. MRBP analysis showed

similar results for the fungal community as for the bacterial community, but with

stronger dissimilarities between production sites. This indicates that fungi, and in a

lesser measure, bacteria, could act as significant contributors to maple syrup typicity as

the production site is the main determinant of typicity (Clément et al. 2010).

Paradoxically, the present results indicate that three types of yeast, namely Mrakia sp.,

Mrakiella spp. and G. pullulans can be considered a stable feature of the maple sap

microbial community because they were found at all sampling sites and throughout the

flow season. This contrasts with the fact that only one bacterium, P. fluorescens, can be

considered a stable member and underlines the potential importance of the fungal

microbiota in maple syrup flavor development.

The Mrakia and Mrakiella genera are closely related on the phylogenetic and

physiognomic level. They are generally isolated from cold climates. Mrakia has also

been reported in indoor dust from buildings during the winter season (Pitkâranta et al.

2008). They are defined as obligate psychrophilic yeasts as they do not grow at

temperatures above 20°C, their optimal growth temperature being 12-15°C (Thomas-

Hall et al. 2010). Some strains can even grow at -7°C (Raspor and Zupan 2006). This

ability would clearly be a competitive advantage because maple sap is collected when

the temperature spans the freezing point. Psychrophilic yeasts are considered a reservoir

of cold-active enzymes, Mrakia and Mrakiella can notably assimilate glucose and

sucrose (Thomas-Hall et al. 2010). G. pullulans is commonly found in nature and is part

of the normal microbiota of humans. Some strains isolated from soil can biodegrade

lignin (Slâvikovâ et al. 2002).

Other yeasts identified belong to the genera Cryptococcus, Cadophora, Rodotorula,

Williopsis, Candida and Bulleromyces. Although some of these yeast have been isolated

from maple sap before (Sheneman and Costilow 1958; Lagacé et al. 2005), Mrakiella,

Cadophora and Williopsis have not. The fact that a frequent and abundant member such

as Mrakiella has not been previously found in maple sap underlines the importance of

culture-independent methods. Another point of interest is the fact that no mold

88

sequences were found in the clone libraries, when several isolates of molds have been

identified in maple sap (Sheneman and Costilow 1958). This could be the result of bias

introduced by cultivation or by DNA extraction. The peak F81 has also not been

attributed to a sequence, but a Pénicillium roqueforti strain yielded an amplicon of the

corresponding size in a study using the same ARISA protocol (Arteau et al. 2010). The

fact that peak F81 was most abundant in 0% flow period samples while clone libraries

were constructed from 50% and 100% flow period samples could explain why

sequences corresponding to this amplicon size were not recovered.

Along with peak F81, a gradient of Cadophora malorum was found throughout the

tapping season, perhaps as a response to environmental factors such as the increasing

temperature and changes in sap composition. C. malorum is a plant pathogen that has

been found to cause wood decay notably in Antarctica (Di Marco et al. 2004; Blanchette

et al. 2010). It is possible that this species is found mostly at the beginning of the season

because it could colonize the bark of the tree, but not the collection system tubing which

by the end of the season appears to be the main microbial contamination reservoir of

maple sap. Also, Cryptococcus and, Rhodotorula were found as predominant

basidiomycetous yeasts on tree bark (Bhadra et al. 2008), indicating that despite the

effort of producers to sterilize tapholes with denatured alcohol (Perkins and van den

Berg 2009), fungal contamination from the tree bark may occur.

3.6.4 Correlations between microbial communities and maple sap composition Changes observed in maple sap composition can directly result from tree metabolism

and microbial activity and indirectly from environmental conditions such as air

temperature. Hydrolysis of sucrose to glucose and fructose is generally attributed to

microbial activity (Perkins and van den Berg 2009). Changes in sugar composition

(except for galactose) are observed between the middle and the end of the season, when

microorganisms reach 106 CFU/mL. It could mean that below this contamination level,

the impact of microorganisms on maple sap sugar composition is negligible.

It is presumed that for a given sampling period, tree metabolism and environmental

conditions are similar for all production sites. Therefore, the correlations observed

89

would result only from microbial community differences. On one hand, correlations

could be seen because those specific microorganisms may cause changes in maple sap

composition. For example, the fact that P. tolaasii can produce acid from glucose (Holt

et al. 1994) could explain why it is negatively correlated with pH at 50% sap flow. On

the other hand, correlations could be attributable to the sap composition that is favorable

to those organisms. For instance, vanillin could be the substrate of J. lividum, a strictly

aerobic psychrophile with an oxidative metabolism that can occasionally cause food

spoilage (Hess et al. 1990; Holt et al. 1994).

Interestingly, relationships (r2 >0.3) between peaks and chemical gradients (principal

components) were never observed over more than one flow period. This is probably due

to the fact that the environmental conditions and the overall sap composition changes

significantly between flow periods, allowing for different microorganisms to

successively occupy an ecological niche. For example, C. sake and G. pullulans are both

correlated with reducing sugars but at different flow periods. G. pullulans was found as

a late-colonizing yeast of birch spring sap exudates, displacing other yeasts such as

Cryptococcus, Rhodotorula and Candida (Golubev et al. 2002). Notably, G. pullulans

peak intensity was higher in 100% sap flow samples while Cryptococcus and Candida

were more abundant in 0% sap flow samples (data not shown). C. sake was reported

predominant on leaves of a subantartic grass during the spring season, where leaves are

subject to freeze and thaw cycles, although its optimal growth temperature is between 20

and 25°C (Hurst et al. 1984). G. pullulans is also characterized by low survival of

alternating freezing and thawing but has a higher growth rate and a lower optimal

growth temperature (Golubev et al. 2002). Therefore, C. sake and G. pullulans could

occupy the same niche in maple sap and have a significant influence on maple syrup

produced from sap collected early or late in the season, respectively. However, C. sake

is a fermentative microorganism while G. pullulans is generally not. This is reflected by

the fact that C. sake is correlated with organic acids in addition to reducing sugars.

Therefore, their impact on maple syrup properties might differ.

Another interesting point is that P. fluorescens and Mrakiella were not found to be

correlated with the variables measured at any flow period. It is possible that the stability

90

of the distribution and dominance of these microorganisms reflect their ability to adapt

rapidly to the changing temperature, but also that their main substrate would not

significantly change over the season. Inversely, they would not have a significant impact

on the sap properties measured in this study, meaning that their main substrate in maple

sap is unknown. P. fluorescens is known for its ability to degrade lignin-related

compounds (Vicuna et al. 1988; Gasson et al. 1998) and a wide range of phenolic

compounds, mainly derived from lignin, are present in maple sap (Kermasha et al.

1995).

3.7 Conclusion Stability of dominant maple sap bacterial community members has been recently

observed for the first time through the flow period and over two consecutive seasons for

one production site (Lagacé et al. 2006b). Now it appears that this stability is a common

feature of maple sap collected in the province of Québec, for both bacterial and fungal

members, supporting the hypothesis that stable microorganisms contribute to maple

syrup characteristic properties such as color and flavor. Stable members have been

identified as P. fluorescens, Mrakia, Mrakiella and G. pullulans. Moreover, it is

suggested that the fungal microbial community of maple sap may be a significant

component of maple syrup typicity, with regards to the production site. Furthermore,

observed correlations between both bacterial and fungal community members such as J.

lividum, L. mesenteroides, P. tolaasii, Rhodococus spp., C. sake, Williopsis sp., Mrakia

sp. and G. pullulans and maple sap composition pinpoint that these organisms could be

related to maple sap quality variation. Of course, the correlations found here are limited

to this descriptive study and further work supported by inferential statistics would be

necessary for generalization of these conclusions. Additional experiments including

quantitative measurement of specific populations in maple sap and corresponding maple

syrup physicochemical and sensorial data will determine whether these trends remain

consistent and further define the role of these microorganisms. These new findings about

the role of maple sap microbiota in maple syrup quality and typicity suggest that maple

syrup may deserve a controled origin appellation.

91

3.8 Acknowledgements This work was supported by the NSERC Canada Research Chair awarded to D. Roy and

an NSERC Strategic Project grant awarded to D. Roy, G. LaPointe and L. Lagacé. The

authors acknowledge the support of the Centre ACER Research Fund (St-Norbert

d'Arthabaska, Québec, Canada). We are grateful to C. Charron and R. Desruisseaux for

their technical help.

Chapitre 4

Les contaminants prédominants de la sève d'érable sont corrélés aux propriétés physicochimiques et sensorielles du sirop d'érable

Maple sap predominant microbial contaminants are correlated with the physicochemical and sensorial properties of maple syrup 4.1 Résumé

Le procédé de transformation de la sève et la contamination microbienne de

celle-ci sont des aspects importants qui affectent la qualité du sirop d'érable. Dans la

présente étude, deux ensembles d'échantillons de 2005 et 2008 ont été utilisés pour

évaluer la variation de la qualité du sirop d'érable et sa relation avec les populations

microbiennes tout en tenant compte du procédé de transformation, du site et de la

période de récolte. L'abondance des bactéries (le groupe Pseudomonas fluorescens et

deux sous-groupes, Rahnella spp., Janthinobacterium spp., Leuconostoc mesenteroides)

et levures (Mrakia spp., Mrakiella spp., Guehomyces pullulans) prédominantes dans la

sève d'érable a été mesurée par la PCR quantitative. Les propriétés du sirop d'érable on

été analysées par des méthodes physicochimiques et sensorielles. Les résultats indiquent

que P. fluorescens, Mrakia spp., Mrakiella spp. G. pullulans and Rahnella spp. sont des

contaminants stables de la sève d'érable puisqu'ils ont été retrouvés à chaque site de

production et à toutes les périodes de coulée. L'analyse de facteurs multiples rapporte un

lien entre l'abondance relative du groupe P. fluorescens et Mrakia spp. dans la sève

d'érable et les flaveurs d'érable et de vanille. Ce résultat supporte la contribution de ces

microorganismes ou d'un consortium de contaminants prédominants aux propriétés

caractéristiques du sirop d'érable.

94

4.2 Abstract Maple sap processing and microbial contamination are significant aspects that affect

maple syrup quality. In this study, two sample sets from 2005 and 2008 were used to

assess the maple syrup quality variation and its relationship to microbial populations,

with respect to processing, production site and harvesting period. The abundance of

maple sap predominant bacteria (Pseudomonas fluorescens group and two subgroups,

Rahnella spp., Janthinobacterium spp., Leuconostoc mesenteroides) and yeast (Mrakia

spp., Mrakiella spp., Guehomyces pullulans) was assessed by quantitative PCR. Maple

syrup properties were analyzed by physicochemical and sensorial methods. Results

indicate that P. fluorescens, Mrakia spp., Mrakiella spp. G. pullulans and Rahnella spp.

are stable contaminants of maple sap, as they were found for every production site

throughout the flow period. Multiple factor analysis reports a link between the relative

abundance oi P. fluorescens group and Mrakia spp. in maple sap with maple and vanilla

odor as well as flavor of maple syrup. This evidence supports the contribution of these

microorganisms or a consortium of predominant microbial contaminants to the

characteristic properties of maple syrup.

95

4.3 Introduction Maple syrup quality, specifically its commercial value, is currently defined by its color

and flavor intensity. Dark color and off-flavors have been attributed to microbial

spoilage of sap prior to processing (Morselli and Whalen 1991; Morselli et al. 1996;

Lagacé et al. 2002). Indeed, the majority of maple sap samples have been shown to

contain less than 10 CFU/ml when obtained aseptically from healthy trees (Morselli and

Whalen 1991). When outside the tree, maple sap provides a rich nutrient medium for

microorganisms that can exceed 107 CFU/mL by the end of the sap flow season (Lagacé

et al. 2002; Lagacé et al. 2004; Lagacé et al. 2006b). Furthermore, plastic tubing

surfaces of modem sap collection systems allow formation of microbial biofilms

(Lagacé et al. 2006b) which can also clog the collection system and cause sap flow to

stop prematurely (Perkins and van den Berg 2009). However, highly contaminated saps

do not always turn into defective syrups (Dumont 1999; Lagacé et al. 2002). Pioneer

studies even found that sap fermentation can enhance the characteristic maple flavor

(Naghski et al. 1957a; Willits et al. 1961a). Predominant microbial contaminants can

contribute to the maple syrup characteristic properties while occasional contaminants

can affect typicity or add to defects (Lagacé et al. 2006b; Filteau et al. 2010; 2011).

Recent studies using culture-independent methods showed that Pseudomonas sp.,

Mrakia spp., Mrakiella spp. and Guehomyces pullulans were major members of maple

sap microbiota while Cryptococcus victoriae, Rahnella spp., Janthinobacterium lividum

and Leuconostoc mesenteroides were occasional contaminants (Lagacé et al. 2006b;

Filteau et al. 2010; 2011). Moreover, the relative abundance of certain microorganisms

such as J. lividum, L. mesenteroides, G. pullulans and Mrakia spp. were correlated with

maple sap composition at different harvesting periods (Filteau et al. 2011).

The contribution of predominant contaminants in maple sap to syrup quality, especially

its flavors, remains poorly understood. Bacteria and yeast are associated with sucrose

hydrolysis into reducing sugars by Maillard reactions during processing of maple sap.

These reactions are responsible for dark colored maple syrups. Only a fraction of the

numerous (over 200) volatile flavor compounds detected in maple syrup have been

identified so far (Potter and Fagerson 1992; Sabik et al. 2010). Therefore, sensory

96

analyses remain the decisive way to assess maple syrup quality. Also, maple syrup

flavor variations have been attributed to the processing method, time of season with

regards to microbial contamination and region of production (Perkins and van den Berg

2009). However, further characterization is required in order to associate flavor variation

with these factors.

A specific quantification method targeting predominant microbial contaminants is

needed to assess the potential impact of these microorganisms on maple syrup

properties. Quantitative PCR (qPCR) is an accurate culture-independent quantification

method that has been successfully applied to quantify both bacteria and yeast in food

matrices (Makino et al. 2010; Hierro et al. 2007; Rasolofo et al. 2010).

The aim of this study was to assess the correlation between the abundance of maple sap

predominant contaminants and maple syrup properties that could support the hypothesis

that these members of the maple microbiota play a role in the development of maple

syrup properties. Therefore, specific quantification assays of maple sap bacterial

contaminants such as Pseudomonas fluorescens, Rahnella spp., Janthinobacterium spp.,

L. mesenteroides, and yeasts such as Mrakia spp., Mrakiella spp. and G. pullulans were

developed. Relationships between microbial relative abundance and maple syrup

physicochemical and sensorial properties variations across harvesting seasons and

production sites were evaluated using multiple factor analysis (MFA). MFA is an

emerging method in microbial ecology (Lamentowicz et al. 2010; Haller et al. 2011;

Jassey et al. 2011) well suited for analysis of multiple large datasets (de Tayrac et al.

2009). The method, based on the principal component analysis (PCA) technique, allows

simultaneous ordination of multiple groups of variables defined on the same objects

(Pages et al. 1991). It was used to get an integrative picture and seek common structure

among the microbial, physicochemical and sensorial datasets.

97

4.4 Material and methods

4.4.1 Maple sap and syrup samples A first set of maple sap osmosis concentrates (4X, ~8 °Brix) and corresponding syrups

were obtained from 19 Québec production sites located in six regions (Lower St-

Lawrence, Mauricie, Estrie, Center of Québec, Chaudière-Appalaches and Laurentides-

Lanaudières) at 0%, 25%, 50%, 75% and 100% of cumulative sap flow during the 2005

tapping season (N = 95). A second set of maple sap concentrates (N = 22, 2 samples

missing) and corresponding producer syrups (N = 24) were obtained in 2008 by

sampling all production batches (6 to 9 batches expressed in cumulative sap flow %)

coming from three different sites. Sap concentrates and syrups were immediately frozen

(-20°C) after sampling until analysis. Microbial counts for the 2005 samples were

obtained from a previous study (Filteau et al. 2010).

4.4.2 Laboratory syrups To control for the effect of the variation in the transformation process by the producers,

syrups were produced with a laboratory scale standardized procedure from sap osmosis

concentrates of 0, 50 and 100% cumulative sap flow periods of 2005 (N = 57). The

protocol consisted of boiling the concentrated sap on a gas stove to reach a concentration

of 20 °Brix and then boiling the solution in a smaller container to reach the final

concentration of 66 °Brix.

4.4.3 Physicochemical analysis The pH was determined using a PHM82 combined electrode (Radiometer Copenhagen).

The percentage of total solids was measured with a digital refractometer AR200

(Reichert Scientific Instruments, Buffalo, N.Y., U.S.A) and expressed in °Brix

compensated at 20°C. Concentrations of simple sugars and organic acids were measured

with a high performance liquid chromatography system (Waters, Milford, MA) using

previously described protocols (Lagacé et al. 2002, Dumont et al. 1993b). Phenolic

compounds were analyzed using published protocols (Dumont et al. 1993b; Kermasha et

al. 1995; Deslauriers 2000). Sugar and acid percentages were expressed in

weight/weight while phenolic compounds were expressed in ug/g or ppm. Syrup

98

viscosity was determined with a digital rheometer Brookfield model DV-II (Stought,

MA) with a no. 18 spindle at 12 rpm. Syrup color intensity was determined at 560 nm

using a UV/VIS spectrophotometer Lambda 14 (Perkin Elmer) with pure glycerol as

reference. Color intensity is expressed as percent light transmittance. Data were

normalized to 66 °Brix.

4.4.4 Sensory analysis Both laboratory and producer syrup samples coming from 0, 50 and 100% sap flow

periods of year 2005 (N = 114) and year 2008 producer syrups (N = 24) were submitted

to five trained taste panelists for sensory evaluation. Tasters were trained to refer to

categories from the flavor wheel of maple products (http://agr.gc.ca/maple_wheel). They

were asked to grade the intensity of the most common odor and taste categories (maple,

vanilla, plant ligneous, empyreumatic, confectionary) on a scale from 0 to 7. They were

also asked to give a global note, on a scale of 1 to 4, 1 corresponding to a strong off-

flavor, 2 to a light off-flavor, 3 to a regular syrup and 4 to a syrup with a strong maple

flavor. Averages were calculated from the scores of the five panelists.

4.4.5 DNA extraction DNA from maple sap concentrate was extracted using the DNeasy Blood and Tissue Kit

(Qiagen, Mississauga, ON, Canada), according to the protocol provided for Gram-

positive bacteria. Columns were eluted twice to ensure maximum DNA recovery. One

hundred microliters of DNA were treated with 1 pL RNase (Roche Applied Sciences,

Indianapolis, IN, USA). Concentration of purified DNA was determined using a

NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington,

DE, USA). DNA was diluted to a final concentration of 2-20 ng per microliter.

4.4.6 PCR amplification and sequencing Maple sap isolate internal recA sequences were amplified with the conserved primers

recAF (5'-TCSGGYAARACCACSCTGAC-3') and recAR (5'-

RTACCAGGCRCCGGACTTCT-3') (Hilario et al. 2004) (Tableau 4.1). For Rahnella, a

sequence characterized amplified region (SCAR marker) was recovered from a

community PCR fingerprint (Filteau et al. 2010) and sequenced. Specific primers A149-

http://agr.gc.ca/maple_wheel

99

439F (5'-CGATGGAGCCTTTCCCGTAT-3') and A149-439R (5'-

CTGCTGATCCGTGGTAAATCC-3') were designed to amplify a 376 bp region in

Rahnella isolates. PCR reactions consisted of 2 U of Taq DNA polymerase (Biolab,

Dorval, Qc), IX supplied Thermopol buffer, 25 pmol of each primers, 40 nmol total

dNTP, 100 ng of genomic DNA, in a 50 uL total reaction volume. PCR amplifications

were carried out in a Tgradient thermocycler (Biometra, Goettingen, Germany) with the

program consisting of an initial 2 min dénaturation step at 94°C then 35 cycles of 30 sec

dénaturation step at 94°C, 30 sec annealing step at 55°C, a 45 sec polymerization step at

72°C and a final 5 min elongation step at 72°C. PCR products were purified with

ExoSAP-IT® (USB Corporation, Cleveland, USA). Purified products were sequenced

on both strands. Sequencing was made with the ABI PRISM® dGTP BigDye™

Terminator v.3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster

City, CA, USA) and an Applied Biosystems 3100 Genetic Analyzer (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA). The sequence assembly was performed using the

CAP contig assembly program within BioEdit Sequence Alignment Editor version

7.0.5.2. (Hall 1999). Maple sap isolates gene sequences are available in GenBank under

accession numbers JN190888 to JN190922.

Tableau 4.1 Sequences used for specific primer design.

Assays Sequences used for alignment Accession number

Specific to

P. fluorescens group (recA)

100-p8_A2 75-pl5_P4 75-pl5_T4 75-pl5_T2 100-p8 Bl 100-p8_Fl 100-p8Jjl 100-p8_C5 100-p8_H4 75-pl5_Tl 100-pl2 6 75-pl5_p3 100-p8 B3 0-pl2_l 75-pl5 PI 0-pl2_4 0-pl2 3 0-pl2_5 100-pl2J 75-pl5_P2

JN190888 Isolates related to : P. JN190889 fluorescens, P. fluorescens JN 190890 biovar C, P. veronii, P. lurida, JN 190891 P. extremaustralis, P. JN 190892 collierea, JN 190893 Reference sequence JN 190894 (genebank): P. synxantha, P. JN 190895 marginalis JN 190896 JN 190897 JN 190898 JN 190903 JN 190899 JN 190901 JN 190900 JN 190904 JN 190902 JN 190905 JN 190906 JN 190907

100

P. fluorescens subgroup 1 (recA)

P. fluorescens subgroup 2 (recA)

Rahnella (SCAR A149)

Janthinobacterium (recA)

L. mesentoroides (recA)

Mrakia (ITS1-5.8S-I.TS2)

100-p8_A2 75-pl5_P4 75-pl5_T4 75-pl5_T2 0-pl2_5

0-pl2_l 75-pl5 PI 0-pl2 4

100-p8_D2 100-p8 F2 100-p8_F3 100-p8 H2 100-p8_D8 100-p8 D7

100-pl2-9 Janthinobacterium sp. Marseille

JN 190888 JN 190889 JN 190890 JN 190891 JN 190905

JN 190901 JN 190900 JN 190904

JN190916 JN190917 JN190918 JN190919 JN 190920 JN 190921

JN190914 NC009659

L. mesenteroides (isolate from centre ACER inc.) JN 190915 L. mesenteroides strain: NRIC 1541 AB354944 L. mesenteroides subsp. dextranicum strain NCDO 529T AJ621685 L. mesenteroides subsp. dextranicum strain NCDO 525T AJ621686 L. mesenteroides subsp. cremoris strain LMG 6909T AJ621687 L. mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 CP000414

Mrakiasp. CBS 8918 AY038834.1 Mrakia sp. CBS 8910 AY038827.1 Mrakia sp. CBS 8912 AY038829.1 Mrakia sp. YSAR9 AM922288.1 Mrakia gelida strain CBS5272 AF144485.1 Mrakiastokesii strain CBS 10622 EU149810.I M. stokesii strain CBS5917 AF144486.1 Mrakia nivalis strain CBS5266 AF144484.1 Mrakia frigida strain CBS5688 AF144482.1 Mrakia sp. CBS 8907 AY038836.1 Mrakia sp. CBS 8909 AY038828.1 Mrakia sp. CBS 8921 AY038826.1 Mrakia sp. CBS 8919 AY038835.1 50-pl2-D2 HQ267076 100-pll-Cl HQ267079 50-pl2-Al HQ267081 100-pll-Hl HQ267078 100-plIB 12 HQ267080 100-pll-H4 HQ267082 100-pll-C9 HQ267077 50-pl2-A3 HQ267084 100-pll-E3 HQ267083 50-pl2-F2 HQ267085

Isolates related to : P. fluorescens, P. fluorescens biovar C Reference sequence (gencbank): P. fluorescens

Isolates related to : P. collierea Reference sequence (gencbank): P. fluorescens SBW25, P. marginalis

Isolates related to : R. aquatilis, Rahnella sp.

Isolate related to: J. lividum Reference sequence: Janthinobacterium sp. Marseille

L. mesenteroides

Mrakia spp.

Mrakiella (ITS1-5.8S-ITS2)

G. pullulans (ITS1-5.8S-ITS2)

100-pll-G8 50-pl2-F10 Cryptococcus niccombsii Cryptococcus aquaticus C. aquaticus strain H1 C. aquaticus strain H2 M aquatica strain DBVPG 4994 M. aquatica strain DBVPG 4990

100-pl 1-D5 100-pl1-F8 50-pl2-F12 100-pl 1-F7 G. pullulans strain CBS 2532

HQ267086 HQ267087 AY029346.1 AF410469.1 AY052487.1 AY05 2488.1 GQ911548.1 GQ911547.1

HQ267071 HQ267072 HQ267073 HQ267074 AF444417

Mrakiella spp.

G pullulans

101

4.4.7 Quantitative PCR (qPCR) Specific primers were designed to monitor target organisms (Tableau 4.2) identified as

predominant in maple sap (Filteau et al. 2010; 2011) and based on preliminary results

(annexe 2). Specific bacterial qPCR primers and probes were selected from the

consensus sequences of maple sap isolates and NCBI GenBank reference sequences

(Tableau 4.1) using Primer Express 2.0. The recA gene was used as the target region

whenever possible as it is a single-copy gene for most eubacteria (Lin et al. 2006). For

Rahnella, a sequence amplified characterized region (SCAR) was targeted because the

rec A gene sequence could not be obtained for all isolates. Specific fungal qPCR primers

were designed within ribosomal intergenic spacer fragments (ITS1-5.8S-ITS2 region)

previously obtained (Filteau et al. 2011) and NCBI GenBank reference sequences

(Tableau 4.1). qPCR primers were synthesized by Integrated DNA Technologies

(Coralville, I A). To estimate qPCR efficiencies of primer sets, PCR products were 10-

fold serially diluted in sterile water and the calibration curve slope was used in the

following equation: E = io(~1/slope) (Tableau 4.3). The specificity of the primers was

verified by NCBI primer tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) and by

qPCR assays using bacterial isolates or fungal clone DNA.

qPCR was performed with the ABI PRISM® 7500 system (Applied Biosystems). PCR

products were amplified according to the following protocol: initial hold for 10 min at

95 °C, followed by 40 two-step cycles at 95 °C for 15 sec and 60 °C for 60 s. qPCR

were performed in a -10 uL volume including 5 pL 2x master mix and 4.5 pL or 5 uL

DNA for TaqMan® and SYBRgreen assays respectively. Primer and probe sequences

and concentrations are given in Tableau 4.2. For SYBR green reactions, after

amplification, dissociation curve analysis was performed by increasing the temperature

by 1 °C every 20 sec from 65 °C to 94 °C, to confirm primer specificity. qPCR was done

in triplicate for each sample (N = 28 for 2005, N = 22 for 2008). In each run, negative

controls without DNA for each primer set were included. The concentration of genomic

DNA from sap samples and specific PCR products were determined using a NanoDrop

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

102

ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies). A 10-fold serial dilution series

of specific PCR products was used to construct the standard curves (Tableau 4.3).

Tableau 4.2 Target, primers and type of qPCR assay

Target organisms Locus Master

mix Primers Qty Each

(nmol) Probe

Qty (nmol)

Total bacteria 16S rDNA TaqMan®

F Bact 1369 R Prokl492 1800 (Suzuki et al. 2000) 250 16S

rDNA (Suzuki 2000)

P. fluorescens group recA SYBR Green 300

P./7uorescens subgroup 1 recA TaqMan®

Pfluo-2S5F TGTTACCGGTGATTTTACGCAG

Pfluo-409R 900

OTUl-332f TCGATCTCGGCCTTCGGCAC

C 250

P. fluorescens subgroup 2

CATGCTGGTGCGCTCCA OTU4-222r P. fluorescens subgroup 2 recA TaqMan® 900 CAGCCCTGGTACCCAAGGC

TGAAATC 250

Rahnella SCAR A149-

439 TaqMan®

OTU5-193F CCACCAGCACAGCAAAATCA

OTU5-263R CGCAAACCGGTCAGTTCAG

900 OTU5-220

CATCGCAAACATCAGCAGG CCAAG

250

Janthinobacterium

OTU10-171F SYBR AATCGTCGGGTAAAACCACG Green OTU 10-23 IR

CCGCCCAGTTTTTGCATTT

300

L. mesenteroides

Leuco-229F SYBR GGATACAGGCGAACAGGGATT Green Leuco-331R

GGCACGAGGTACTAATGCAGC

300

G. pullulans ITS

Guehomyces-3&8F SYBR TGAGCGCTGCTGCTTTGTT Green Guehomyces-49%R

CGCATTGCTGCAACTGTCC

300

Mrakia ITS

Mrakia-92F SYBR CATACACCTGTGCACCGTTTG Green M&M-236R

GCGAGAACCAAGAGATCCGTT

300

Mrakiella ITS

Mrakiella-SiF SYBR CCCTGTGAATCGTTTGGCTT Green M&M-236R

GCGAGAACCAAGAGATCCGTT

300

103

Tableau 4.3 qPCR standard curves parameters

Target organism R: intercept SE slope SE Efficiency

(%)

Range

(copy nb)

Total bacteria 0.997 42.8456 0.1569 -3.5511 0.0278 91.25 102-108

P. fluorescens group 0.999 36.6074 0.0806 -3.3774 0.0154 97.74 103-107

P. fluorescens

subgroup 1 0.998 35.3837 0.1185 -3.2722 0.0242 102.12 102-107

P. fluorescens

subgroup 2 0.998 35.5474 0.1076 -3.3144 0.0231 100.32 102-107

Rahnella 0.999 40.1841 0.0853 -3.7255 0.0159 85.53 102-108

Janthinobacterium 0.999 36.3064 0.0723 -3.2943 0.0142 99.69 103-107

L. mesenteroides 0.999 35.5415 0.0475 -3.3331 0.0097 99.53 10°-107

G. pullulans 0.999 35.5469 0.0531 -3.3684 0.0113 98.10 10°-107

Mrakia 0.999 35.9994 0.0616 -3.3872 0.0135 97.35 10°-107

Mrakiella 0.997 35.8962 0.1027 -3.3594 0.0219 98.46 10°-107

Gene copy numbers were calculated as in Rasolofo et al. (2010). Total qPCR bacterial

cell counts were approximated using an adjustment of 16S rRNA gene copies per cell as

bacteria found in maple sap have an average of 4.28 copies per genome (rrnDB website

http://ribosome.mmg.msu.edu/rrndb/index.php, (Lee et al., 2009). Relative abundance of

specific counts was used to avoid co-linearity issues, i.e. to distinguish the specific count

variation from the total microbial variation. It was calculated by dividing the target copy

number by the adjusted 16S rRNA gene copy number. Statistical analyses were

performed with JMP 7 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA). MFA was performed on

ranked transformed data with the R software 2.12.1 (R Development core team 2008)

using the FactoMineR package (Husson et al. 2009).

4.5 Results

4.5.1 Microbial contaminant quantification The qPCR count of P. fluorescens group, P. fluorescens subgroups and Rahnella

increased throughout the 2005 season (Figure 4.1). Janthinobacterium, L.

mesenteroides, Mrakia, Mrakiella and G. pullulans qPCR counts were highest at the

50% flow period. Total bacteria and specific qPCR counts as well as their calculated

http://ribosome.mmg.msu.edu/rrndb/index.php

104

relative abundance did not differ significantly between geographical regions at the 100%

flow period in 2005 (Figure 4.2).

9

7 -

6 -

8 Ol c oi 4 BO

10% 150% 1100%

o

a:

_ J o 1— DÛ __ 3

_ s

o DO

X I _J

o 0

_ i 1/1 o c b l •-0

o c

C c « <u OJ o o c: • 1/1 o 6! ï -, o o

E o

Figure 4.1 qPCR counts of maple sap predominant contaminants according to flow period in 2005. Tukey-Kramer HSD test indicates that 0% flow period samples are significantly different (p <0.05) from 50% flow period samples for each contaminant measured. The difference between the 50% and the 100% flow period samples is significant (p <0.05) for the P. fluorescens group only.

105

9

6

â 5

o OJ

<v 4 DO ao o

_ j

3 -

Lower St-Lawrence Center of Québec Chaudière-Appalaches Estrie Laurentides-Lanaudières Mauricie

o _. DÛ

Q. O

_ o

4j C -c

fc 3 C

-S 6 i ~

2 V) CuO 0 0 o _ "3 OJ

*--i __ _ ce O c a. OJ

*--i 3 t/1

-a o

c 13

eu <-0 v i c <U

o 0) "g c

•S S o

Vl f/1

"g c ~ J

■ ^ i 0) QJ o <X

3 ■fc,

a;

O 3 a:

»

<u Jx a

Figure 4.2 Total bacteria and specific qPCR count means per geographical region at the 100% flow period in 2005. Means were not significantly different (Kruskal-Wallis test, p >0.05).

Specific qPCR assays of P. fluorescens group, P. fluorescens subgroup 2, Rahnella,

Mrakia and G. pullulans were positive for all samples (Tableau 4.4 and Figure 4.3). P.

fluorescens subgroup 1 assays were negative for five 2008 samples, Janthinobacterium

for one 2008 sample, and Mrakiella for one 2005 sample. Also, Janthinobacterium, L.

mesenteroides and Mrakiella gave few cycle thresholds falling outside the standard

curve. Counts were thus extrapolated from the standard curves for use in multivariate

analyses.

In 2005, maximum psychrophilic plate counts were observed at the 100% flow period

for 13 out of 19 production sites. Minimum psychrophilic counts were found at the 0%

sap flow period for 18 sites (Tableau 4.5). Total 16S rRNA gene copy numbers ranged

from 7.1 to 8.9 log per mL at the end of the 2005 harvest season. A paired t-test showed

106

that the 16S rRNA copy numbers for total bacteria were significantly higher (p <0.0001,

N = 28) than 2005 psychrophilic plate counts by a mean difference of 1.3 log, but counts

were correlated (r2 = 0.70, p O.0001). In 2008, the maximum 16S rRNA gene copy

numbers for each production site was reached before the 100% sap flow period while the

minimum was found between 0 and 80% of sap flow. The 16S rRNA gene copy means

in sap were not significantly different between 2005 and 2008 (Wilcoxon test).

107

Tableau 4.4 qPCR gene copy number of 2005 samples P. P. P. L.

Total Janthino- G. Site period fluorescens fluorescens fluorescens Rahnella mesenter- Mrakia Mrakiella

bacteria bacterium pullulans group subgroup 1 subgroup 2 oides

8.60E+07 3.30E+06 4.60E+05 2.80E+05 I.60E+05 1.50E-05 6.49E+04 I.95E+03 I.17E+04 4.33E-H13

3.50E+08 2.30E+07 4.50E+O6 1.80E+O6 3.40E+06 3.50E+O5 5.06E+06 1.02E+06 1.15E+06 4.51E+06

3.20E+05 2.50E+04 3.30E+O3 5.00E+03 3.90E+03 2.10E+O2 5.85E+0O 9.17E+03 9.32E+03 2.70E+03

2.30E+07 1.20E+06 1.90E+05 2.20E+05 6.30E+O4 7.00E+04 5.36E+03 1.82E+04 6.48E+03 1.11E+04

8.50E+08 3.70E+07 4.90E+06 3.30E+O6 9.00E+06 2.50E+O5 6.35E+01 3.65E+06 1.52E+06 4.47E+06

9.90E+05 7.60E+04 1.50E+O4 1.30E+O4 2.00E+03 1.90E+03 4.75E+00 1.20E+03 1.49E+03 2.09E+03

1.20E+O8 6.40E+06 8.50E+05 8.90E+05 3.20E+06 9.90E+04 1.75E+03 5.89E+06 5.82E+06 2.39E+06

8.80E+06 5.0OE+O5 7.80E+04 1.10E+05 2.00E+04 7.40E+03 6.68E+01 2.09E+05 3.96E+04 1.45E+04

3.70E+O7 1.40E+06 3.90E+05 2.60E+05 9.80E+04 2.0OE+O5 2.90E+04 4.81E+04 2.68E+05 5.13E+04

1.70E+08 1.10E+07 1.70E+06 1.50E+06 8.90E+05 2.80E+O5 9.45E+04 6.29E+06 4.37E+06 2.07E+06

8.20E+04 6.00E+03 9.50E+02 8.20E+02 8.60E+02 2.80E+02 5.19E+00 4.38E+02 7.26E+02 3.38E+02

7.40E+06 7.70E+05 3.10E+05 1.30E+O4 7.20E+03 4.50E+O5 2.06E+04 1.34E+03 3.35E+04 4.69E+03

6.00E+07 6.20E+06 2.80E+06 1.50E+05 1.40E+05 3.60E+04 2.77E+01 1.67E+05 6.17E+05 1.39E+05

4.10E+07 3.50E+06 1.00E+06 2.70E+05 2.90E+05 6.80E+05 1.63E+04 2.10E+05 7.96E+05 0

2.50E+08 1.30E+07 2.40E+06 9.50E+05 2.30E+05 1.20E+04 5.28E+04 2.97E+06 8.76E+06 9.84E+06

1.30E+08 8.60E+06 1.00E+06 8.80E+05 4.00E+05 1.50E+06 2.39E+04 2.98E+05 7.15E+05 4.06E+05

4.00E+08 2.10E+07 3.30E+06 2.80E+06 2.40E+06 4.70E+02 1.22E+00 1.02E+05 2.61E+05 1.66E+05

1.60E+08 6.20E+06 1.60E+06 3.0OE+O5 1.10E+06 5.10E+04 8.31E+02 1.68E+06 8.10E+05 3.49E+06

2.10E+08 1.50E+07 4.20E+O6 5.80E+05 3.50E+05 2.90E+O4 1.22E+02 1.24E+07 4.44E+06 1.12E+06

1.60E+08 8.00E+06 2.00E+06 7.20E+05 2.80E+O5 4.00E+05 7.21E+02 2.10E+05 4.60E+05 4.94E+04

6.80E+08 4.60E+07 1.10E+07 2.40E+06 8.20E+05 5.90E+04 1.80E+02 9.11E+06 5.54E+06 6.44E+06

2.40E+08 2.10E+07 4.20E+O5 1.30E+06 1.50E+04 6.00E+04 1.14E+08 1.03E+05 4.00E+06 3.62E+06

8.70E+07 6.40E+06 1.10E+O5 5.50E+04 4.70E+04 7.00E+04 7.43E+05 3.41E+04 5.38E+05 3.41E+05

4.40E+08 4.40E+07 9.80E+06 3.20E+06 5.20E+06 1.50E+06 4.10E+03 1.30E+06 1.00E+06 4.74E+05

1.70E+08 1.30E+07 1.20E+06 1.10E+06 4.90E+04 2.40E+04 6.44E+03 2.40E+06 1.93E+06 4.19E+06

1.50E+O7 1.80E+06 8.10E+04 1.30E+05 1.90E+04 9.00E+04 1.30E+03 1.39E+04 1.83E+05 4.52E+05

5.40E+07 6.90E+06 1.00E+06 5.90E+05 4.40E+05 1.20E+06 4.82E+04 1.04E+05 3.78E+05 9.46E+04

9.40E+07 6.40E+06 2.20E+05 5.30E+05 2.10E+05 3.20E+05 2.16E+06 1.75E+05 4.29E+05 1.71E+06

B 50 B 100 C 0 c 50 c 100 D 0 D 100 E 0 E 50 E 100 F 0 F 50 F 100 G 100 H 100 1 50 1 100 J 100 K 100 M 100 N 100 P 100 0 100 R 100 S 100 T 100 U 100 V 100

108

Tableau 4.5 Sap concentrate psychrophilic plate counts

Production 2005 sap flow period site 0%* 25% 50% 75% 100%

B ^> 5.11 5.72 6.51 6.57 * 6.98 C 6.02 ^ 5.61 6.34 5.86 * 7.55 D ^> 5.59 5.90 6.07 6.00 O 7.02 E ^ 5.51 5.86 6.17 6.55 O 6.99 F 1> 4.22 5.57 6.55 6.52 T> 6.80 G ^> 5.57 5.60 + 6.35 6.33 5.93 H ^> 5.08 5.46 6.33 6.67 <T 7.14 I ^> 5.90 5.96 6.26 * 7.40 7.10 J # 4.46 5.76 4.94 5.76 T> 6.40 K V 5.37 5.63 6.12 6.07 0 7.40 M ^> 6.40 6.67 6.63 0 6.91 6.47 N ^ 5.16 5.85 6.26 6.39 T> 7.19 P ^> 4.81 5.23 6.03 6.23 T> 6.79 Q * 4.05 5.71 5.66 5.49 /y 6.95 R ^> 3.71 5.64 6.25 6.25 1> 7.04 S 0 5.11 5.27 5.92 6.53 T> 6.84 T ^ 4.00 5.09 5.97 T> 6.31 5.67 U ^ 4.24 4.74 5.88 * 6.38 6.27 V * 5.09 5.76 5.85 1> 6.05 5.81

*Results are expressed as Log CFU / mL. Up and down arrows indicate maximum and minimum counts for each site, respectively.

a)

109

Site

b) SiteX

20 40 60 % of cum ulative sap flow

Site Y

80 100

SiteZ

20 40 60 80 % of cumulative sap flow

0 20 40 60 80 % of cumulative sap flow

0 20 40 60 80 % of cum ulative sap flow

100

* ~" P.Huorescens group ♦

— Rahnella 1 P. fluorescenssubgroup 1

Mrakia ' ~ L . mesenteroides

' Janthinobacterium — P. lluorescenssubgroup 2 — G. pullulans

■ " " Mrakiella

Figure 4.3 Gene copy counts of maple sap samples throughout the 2008 harvesting season, a) Ajusted 16S gene copy number, b) Specific target results for each production site

110

4.5.2 Maple syrup physicochemical and sensorial properties Producer and laboratory syrup values for pH, sucrose, vanillin, vanilla odor, plant

ligneous taste, plant ligneous odor and transmittance significantly decreased over the

harvesting period while glucose, fructose, galactose, maltotriose, oxaloacetic acid,

fumaric acid, coniferol, empyreumatic taste, confectionary odor and confectionary taste

significantly increased (2005 producer syrup values are shown in Tableau 4.6). Global

sensory analysis and maple taste were highest at the 50% flow period. Syringaldehyde

and vanilla taste changes were not significant for producer syrups but they were for

laboratory syrups. Physicochemical and sensorial properties of producer and laboratory

syrups did not differ significantly between geographical regions, except for vanillin in

producer syrups and coniferol and syringaldehyde in laboratory syrups (data not shown).

Although variations throughout the harvest season were similar for producer and

laboratory syrups, several physicochemical and sensorial properties were significantly

different in a matched paired test (Table 4.5). Sensorial profiles of 2008 syrups varied

between production sites as well as between flow periods (Figure 4.4).

_ _ _ _ _ _ _

5 ï 84-1 _ -o tfl

| 2 1

0 6

5 01

S4

_ _ _ _ _ _ _ _

■Global ■Vanilla HI Confectionery tfl Plant ligneous HEmpyreumatic ■ Maple

- _ IL li 1* _

i _ l_l_ _ hlL _Ji 20 25 50 60

% sap flow 87.5 100

Figure 4.4 Global sensorial and odor profiles of 2008 producer maple syrups. Similar results were obtained for flavor profiles.

I l l

Tableau 4.6 Average physicochemical and sensorial property values of producer syrups.

Characteristics1 2005 flow period

0% 50% 100%

Mean difference between Producer syrup and Laboratory syrup2

Global appreciation* 2.23 2.63 2.35 -0.25*** Maple odor*/taste* 0.74/0.88 1.04/1.31 0.57/0.80 -0.29***/-0.38*** Vanilla odor*/taste 0.87/1.04 0.72/0.86 0.53/0.63 -0.40***/-0.42*** Confectionary odor*/taste* 1.37/1.92 2.07/2.95 2.85/3.44 0.19/0.17

Plant ligneous odor*/taste* 3.59/3.53 1.54/1.54 1.61/1.05 0.31/0.19

Empyreumatic odor*/taste* 1.48/1.41 2.21/2.13 2.96/3.32 0.19/-0.001

pH* 8.15 7.90 7.32 0.32*** Sucrose (%)* 63.81 63.15 61.25 n go***

Glucose (%)* 0.06 0.14 0.48 -0.25*** Fructose (%)* 0.03 0.08 0.40 -0.004 Maltotriose (%)* 0.07 0.13 0.49 -0 11***

Galactose (%)* 0.49 0.95 1.20 0.02 Vanillin (%)* 1.37 0.75 0.45 -1.56*** Coniferol (%)* 0.68 1.34 1.93 -0.10 Syringaldehyde (%) 1.64 1.38 1.71 -0.61*** Oxaloacetic acid (%) * <0.01 0.04 0.05 0.003

Malic acid (%) * 0.42 0.45 0.54 -0.11*** Fumaric acid (%)* <0.01 <0.01 0.01 -0.005*** Viscosity 186.74 176.37 169.74 21.89*** Transmittance (%) * 70.39 61.05 41.16 -6.66***

* indicates a significant Kruskal-Wallis test atp <0.05, N=57 ***** indicates a significant Wilcoxon Signed-Rank test difference atp <0.0001, N=57

112

4.5.3 Relationship between microbial contamination and maple syrup properties To evaluate the impact of the predominant maple sap microbiota members on maple

syrup quality without any bias from the transformation process or the metabolic changes

linked to the harvesting period, results of laboratory syrups from the end of the 2005

season (100% flow period) were used to analyze qPCR results, physicochemical and

sensorial properties. The 100% flow period was preferred because it usually shows the

maximum microbial load and high variance in syrup quality and was therefore the period

most likely to reflect the microbial impact on maple syrup quality. A second set of

samples from 2008 was also analyzed to test the robustness of the relationships observed

between the qPCR results and the sensory analysis.

For multiple factor analysis, variables were grouped in categories (odors, flavors, acids,

sugars, aromatic compounds, physical properties, bacteria and yeasts). The MFA results

can be interpreted as results from a principal component analysis: coordinates of a

sample are its values for the common factor (axis) (Figure 4.5) and the coordinates of a

variable are its correlations with these factors (Figure 4.6). As a complementary

analysis, k-means hierarchical clustering was performed after the MFA on the resulting

first three factors and is projected on the first factorial map (Figure 4.5). The result is an

integrative graphical output; the factorial axes illustrate the main continuous gradients,

while the dendrogram illustrates discontinuous factors (classes). MFA also yields a

representation of groups of variables (Figure 4.7) where their proximity indicates a

common structure for the first two factors.

113

(a)

to E CD C

0 2

Factor 1 (45.04%)

- 4 - 3 - 2 - 1 0 1 2 3

Factor 1(26.87%)

Figure 4.5 Ordination plot of samples from the multiple factor analysis based on microbial relative abundance in maple sap (calculated with gene copy number) and maple syrup physicochemical and sensorial properties. K-means clustering was performed after the MFA and is projected on the MFA ordination space. Number of clusters was defined automatically, a) 100% flow period samples of 2005. b) 2008 samples. Letters indicate the production site and numbers indicate the harvesting day of April 2008.

114

(a)

o> CO

o 03

LL

un 6

Maltot Maltot Fr ructose

o o

Oxalacatic acid i.ose.Total barfteria îose.Glucosi "

i n d

OMaplel " fmaplAMra/t/a.Globbl

Pfjuprgscens grou| OVànilla

FVanillal

k. Transmittance Malic acid

» J Transmittsmce

Viscosity

-1.0 —\ \ r -0.5 0.0 0.5

Factor 1(45.04%)

—r 1.0

(b)

_

o o

O

O

d

_ d

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

Factor 1(26.87%) Figure 4.6 Vector map of variables from the multiple factor analysis, a) Variables for samples from the 2005 season. For clarity purposes, only variables with cos2 >0.5 are shown. Results from the producer syrups were included as supplementary variables, i.e. they do not influence the MFA results. They are represented by broken line vectors and blue labels, b) Variables for samples from the 2008 season. All variables are shown. F = taste and O = odor.

115

(a) P J

00

o ro

oo d

d

d

CN

d

o d

Physical DPoperties

Physical properties

Aromatics

Yeasts

° ^o r s Bacteria

Flavors* . •

A_ i Acids

Acids Flavors i .Sugars

A Aromatics

▲Sugars k Odors

0.0 0.2 i

0.4 —r 0.6

—r 0.8

—r 1.0

Factor 1(45.04%)

( b ) p -

oo -d

ro IT) o CO

CN 1—

o <) t ro

LL

o

CN -

d

o -d

Bacteria ▲

Odors

Flavors A

Period A

Yeasts Site

i

0.0 —r 0.2

—r 0.4

—r 0.6 0.8

—r 1.0

Factor 1 (26.87 %)

Figure 4.7 MFA group representation. Each group of variables is projected on the factor map created by the MFA. Active groups (black) and supplementary groups (blue) are plotted, a) 100% flow samples from 2005 b) samples collected throughout the 2008 flow period. Supplementary qualitative variables "period" and "site" are also shown.

116

MFA results for the 100% flow period 2005 samples indicate that the first two factors

account for nearly 57% of the total variation (Figure 4.5a). Samples clustered in two

groups well discriminated by the first factor. Looking at the corresponding vector map

(Figure 4.6a), the cluster la syrups can be described as rich in reducing sugars, fumaric

and oxaloacetic acids and are dominated by empyreumatic and confectionery attributes

while their sap is highly contaminated. In contrast, cluster 2a sap samples are

characterized by high relative abundance of the P. fluorescens group and Mrakia along

with high pH, sucrose, malic acid and vanillin content in syrups. These syrups are light

colored and their odor and flavor are globally optimal, dominated by maple and vanilla.

The representation of groups of variables (Figure 4.7a) shows that all groups contribute

to the first factor, but that the second factor is mostly due to physical properties. Thus

the first factor corresponds to a direction having a strong inertia for the groups, in other

words, many variables of each group are related to this factor. Laboratory and producer

syrups can also be distinguished. The physical properties are the group of variables that

has the most different structure between the two syrup sample sets. The bacteria group

has a structure similar to the sugars, acids, flavors and odors, while the yeast group has a

structure closer to the aromatic compounds.

For the 2008 samples, only 46% of the variance was explained by the first two factors

(Figure 4.5b). The samples are grouped in three clusters. Cluster lb is separated from the

others mostly by the first factor and is composed exclusively of samples from production

site Z. Clusters 2b and 3b are separated by the second component, which is related to the

harvesting period (Figure 4.7b). The vector map (Figure 4.6b) shows that cluster lb

syrup lacks maple and vanilla attributes and saps have low relative abundance of

Mrakia, Mrakiella and P. fluorescens group. On the other hand, cluster 2b samples have

a high global appreciation, maple and vanilla attributes and their sap microbiota is

characterized by high relative abundance of Mrakia, Mrakiella and P. fluorescens group

and subgroup 1. Cluster 3b syrups have plant ligneous attributes and lack empyreumatic

ones. Their sap microbiota has a low level of total bacteria but higher relative abundance

of Rahnella, Leuconostoc and P. fluorescens group and subgroup 2. The representation

117

of groups of variables (Figure 4.7b) shows that flavors and odors have a structure more

similar to the bacteria group of variables than to the yeast group.

4.6 Discussion Maple sap microbial contamination may cause syrup defects such as dark color, strong

empyreumatic flavor and slimy texture (Fabian and Buskirk 1935; Morselli and Whalen

1991). However, some microbial contamination could be desirable. Pioneer studies

found bacterial strains that enhanced maple flavor (Naghski et al. 1957a; Willits et al.

1961a).

In a previous study, it was shown that some microbial contaminants were correlated with

maple sap properties at different periods over the harvesting season, potentially affecting

maple syrup quality (Filteau et al. 2011). The present study reports consistent

relationships between the relative abundance of P. fluorescens group and Mrakia in

maple sap, as determined by qPCR, and desirable attributes of maple syrup.

Specific qPCR assays were developed to measure the abundance of the most frequently

found microorganisms in maple sap (Filteau et al. 2010; 2011). As the number of copies

per genome of the rrn operon varies greatly between organisms, detection could have

been biased in previous studies (Crosby and Criddle 2003). Specific bacterial qPCR

assays were thus designed using single copy targets such as the recA gene (Lin et al.

2006). For example, in the present study, the ranking in relative abundance found with

calculated gene copy number was similar to results obtained from clone libraries and

MARISA in our previous study (Filteau et al. 2011). However, the relative abundance

calculated for the P. fluorescens group (-6-7%) was around 10 times lower than what

was previously found with clone libraries (-60-70%) (Filteau et al. 2010; 2011). This

result suggests that the maple sap microbiota is potentially far more diverse than

previously suspected.

For the targeted yeast, single copy targets were not available as reference from maple

sap. Also, attempts to measure total fungal contamination were made based on published

protocols (Kabir et al. 2003; Manter and Vivanco 2007). However primer dimer

formation and low sensitivity prevented accurate quantification that may be due to

118

differences in laboratory equipment and reagents. Therefore, the relative abundance of

specific yeasts was calculated using the 16S rRNA gene copy number which was

considered representative of the total contamination, based on plate count results

(bacterial plate counts were always superior to fungal plate counts). For yeast,

significant correlation was found between 16S gene copy numbers and fungal counts in

the samples from the 2005 season.

Although microbial contamination generally increased over the tapping season, plate and

qPCR counts indicate fluctuations in microbial contamination throughout the flow

period and from site to site. Atypically, site Z already had more than 108 adjusted 16S

rDNA copies/mL when the season started. This could be attributable to the 20 year-old

main collection lines present in the system because older collection tubing could carry

over more microorganisms from season to season. Sites X and Y, which had collection

systems aged 10 and 8 years at the time had lower starting gene counts. However, those

sites that are located next to each other had a difference of two log 16S adjusted gene

copies/mL for samples collected the same day. This illustrates that microbial

contamination is linked to microenvironmental conditions and to sap flow rates which

vary between sites and harvesting years. Nevertheless, P. fluorescens group and Mrakia

remained on average the two most abundant contaminants in both 2005 and 2008

sampling sets. This reflects their ability to rapidly adapt to changing environmental

conditions, making them the most stable contaminants of maple sap. This stability

supports the hypothesis that they are implicated in the development of characteristic

maple flavors.

The Rahnella group counts were positive in every sample of both the 2005 and 2008

harvesting seasons. Therefore it could be considered a stable contaminant. Its low

relative abundance and the high genetic diversity found between isolates could explain

why this genus was not reported in all samples in the previous studies using clone

libraries and MARISA (Filteau et al. 2010; 2011).

The maple syrup grading system is currently based on the % of light transmittance; the

most valued being the lightest in color, the absence of off-flavors and presence of

119

characteristic flavors. In agreement with previous consumer studies (Belford et al.,

1991), the trained panelists generally preferred the 50% flow period samples which were

the strongest in maple flavor, but not the lightest in color. In fact, the early season light

colored syrup often had a plant ligneous off-flavor and received a lower global

appreciation score, as in cluster 3b. As for the 100% flow period syrups, some of them,

as in Cluster la, had a strong confectionary or empyreumatic flavor, masking the

delicate maple flavor. In fact, MFA results underscore the existence of a main sensorial

gradient and validate splitting this gradient into three distinct flavor categories of syrups;

plant ligneous, maple/vanilla and empyreumatic. The plant ligneous category can be tied

to the early harvesting period, the empyreumatic category is encountered later and the

maple/vanilla category is associated with mid and late harvesting periods.

Comparison of the physicochemical and sensorial properties of producer and laboratory

syrups indicates that the process type had a non-negligible impact on the final syrup

quality, the physical attributes being the most affected. Laboratory syrups were generally

better tasting and lighter in color than the corresponding producer syrup. This could be

explained by the fact that laboratory syrups were produced in small scale batches

whereas syrups are produced in a continuous flow by producers. Therefore, laboratory

syrups were probably heated for a shorter period of time, allowing a greater amount of

volatile compounds to remain in the syrup. The differences observed for maple odor and

flavor support the hypothesis that compounds contributing to the characteristic maple

flavor are developed during processing and from precursor compounds present in sap.

Also, it is consistent with current knowledge about maple flavor origin, which would be

produced either by thermal decomposition of sugars (sucrose and glucose) under

alkaline conditions, Maillard reactions as well as oxidation and hydrolysis of lignin

monomers (Potter and Fagerson 1992). Even though heating conditions were less severe

for the laboratory than for the producer syrups, Maillard reactions involving fructose

occurred in both, leading to empyreumatic flavors. Therefore, the sap composition in

reducing sugars and free amino acids would be a critical quality control point to avoid

undesirable strong empyreumatic off-flavors.

120

The MFA results showed that although there was a distance between the laboratory and

producer syrup measures, both sets had similar structure with respect to the microbial

groups of variables. Thus, the microbial impact is strong enough to be observed despite

the variation attributable to the transformation process. This also suggests that part of the

microbial impact on maple syrup properties is not tied to processing techniques.

In 2005, P. fluorescens and Mrakia were strongly linked to maple and vanilla attributes

for 100% flow period samples. Similar observations were made with 2008 samples for

three producers, throughout the harvesting period. Therefore it can be concluded that the

microbial impact of P. fluorescens and Mrakia on sensorial properties are time stable

features independent of other production factors. As for the P. fluorescens subgroups,

Rahnella, Janthinobacterium, G. pullulans and Mrakiella, their contribution to MFA

first factors was less important (cos2 >0.5). They could be more susceptible to the

environmental conditions changing with the harvesting period or season. This agrees

with previous results that showed correlations with maple sap composition at 0% sap

flow for Janthinobacterium, at 50% sap flow fori., mesenteroides and at 100% sap flow

for G. pullulans (Filteau et al. 2011).

P. fluorescens was not correlated with maple sap composition in the previous study,

perhaps because some potential substrates were not included in the measurements that

were carried out. Results obtained here support this hypothesis as the strongest

relationships observed were not with chemical composition of syrup, but with sensorial

properties. As many of the maple syrup flavor components remain unidentified (Potter

and Fagerson 1992, Sabik et al. 2010), further work in this area is necessary to

understand the impact of these microorganisms on maple sap chemistry.

The total 16S rRNA gene copy counts were positively related to empyreumatic flavors

and negatively to pH, sucrose and % light transmittance. This result was expected as the

increase in microbial contamination over the season has been associated with sucrose

hydrolysis in glucose and fructose which further leads to Maillard reactions during the

maple syrup processing that contribute to the burnt flavor and dark color. However, the

relative abundance of the P. fluorescens group is consistently opposite to the

121

empyreumatic flavor. P. fluorescens does not possess extracellular invertase enzymes

(Latour and Lemanceau 1997). It can utilize sucrose, but it is possible that another

preferred substrate is available in maple sap. P. fluorescens are good competitors in

moist environments, for instance, they can secrete fluorescent siderophores that trap

iron, making it a limited resource for other microorganisms (Paulsen et al. 2005). P.

fluorescens bacteria are also able to rapidly form biofilms inside the collection system

(Lagacé et al. 2006b). These abilities could explain why their relative abundance is

associated with favorable maple syrup properties, because they would limit the growth

of other contaminants. Therefore, the stable presence oi P. fluorescens, which are known

biocontrol and plant-promoting growth bacteria (Silby et al. 2009) would be a desirable

feature of the maple sap microbiota.

Among the yeasts, the relationship between the relative abundance oi Mrakia and maple

syrup properties was the strongest. The Mrakia genus is a relatively recently described

one and very few studies have been dedicated to it. In this study, it was found in

association with Mrakiella and Guehomyces, two closely related genera that have similar

optimal growth conditions (Hurst et al. 1984; Thomas-Hall et al. 2010).

Janthinobacterium, L. mesenteroides, Mrakia, Mrakiella and G. pullulans qPCR counts

were all highest at the 50% flow period, when the maple flavor is also at its highest.

Thus, high maple flavored syrup is obtained at an optimum contamination level.

Results point to a gradual process in flavor development throughout the season, the plant

ligneous flavors would give way to vanilla flavor which is replaced by maple flavor. A

degradation process of lignin by microorganisms, most probably P. fluorescens and

Mrakia, leading to liberation of lignin monomers in sap could be proposed. Also, in

early 2008 samples, Rahnella which can produce gai'acol (Jensen et al. 2001), a

substance found in plant ligneous type syrups (Sabik et al. 2010), was associated with

plant ligneous attributes.

In conclusion, quantification of specific contamination allowed us to assess the impact

of the predominant contaminants in maple sap on maple syrup quality. Although

microbial contamination can cause spoilage of maple sap, there is accumulating

122

descriptive evidence that the most stable part of the maple sap microbiota, namely P.

fluorescens group bacteria and Mrakia yeasts, positively contribute to maple syrup

attributes such as maple and vanilla flavors. The next challenge will be to

experimentally demonstrate such a positive impact and study its underlying mechanism.

This will require testing the effect of specific populations or consortia in a model maple

sap collecting system. Confirmation of these findings could represent a breakthrough for

maple sap contamination control and sanitation strategies and could be a key to the

natural production of value added products such as highly flavored maple syrup.

4.7 Acknowledgements

This work was supported by NSERC in the form of a Canada Research Chair awarded to

D. Roy and a NSERC Strategic Project grant awarded to D. Roy, G. LaPointe and L.

Lagacé. The authors acknowledge the support of the Centre ACER Research Fund (St-

Norbert d'Arthabaska, Québec, Canada) and their expert technical assistance.

Chapitre 5

Discussion et conclusion générale La problématique contemporaine de l'industrie acéricole réside dans la qualité de ses

produits qui varie considérablement. Avant tout, il faut comprendre que cette variation

est le résultat d'un assemblage complexe de facteurs biologiques et environnementaux

(Figure 5.1). La description de l'influence qualitative et quantitative du microbiote de la

sève d'érable sur la qualité du sirop d'érable était au cœur des objectifs de cette thèse

(Figure 5.1 A). Chacun des éléments depuis le microbiote jusqu'au sirop d'érable ont été

pris en compte sur un ensemble d'échantillons provenant de six régions de la province

de Québec récoltés tout au long de la saison de coulée 2005 et quelques échantillons de

la saison 2008. La variation spatiotemporelle des communautés microbiennes, de la

composition de la sève ainsi que des propriétés physicochimiques et sensorielles du

sirop a été caractérisée. Le site de production a été identifié comme étant le facteur le

plus important pour expliquer la variation de la composition du microbiote alors que la

période de récolte influence surtout la structure des communautés microbiennes. Cinq

populations stables ont été identifiées dans la sève d'érable (Pseudomonas fluorescens,

Rahnella spp., Mrakia spp., Mrakiella spp. et Guehomyces pullulans) par des méthodes

moléculaires. De plus, l'association entre l'abondance relative de plusieurs contaminants

et les propriétés de la sève et du sirop d'érable a été révélée par les analyses

multivariées. Notamment, l'abondance relative de P. fluorescens et Mrakia spp. a été

corrélée positivement aux flaveurs d'érable et de vanille par la MFA. Éventuellement, la

compréhension de cette influence permettra de poursuivre la recherche pour développer

des stratégies de modulation du microbiote (Figure 5.1B) ou de gestion des systèmes de

collecte (Figure 5.1C) dans le but de contrôler les propriétés des produits de l'érable.

124

-O-

Humain

Érable (génétique,

métabolisme)

Environnement 1 ^ ^ (climat, sol, e tc . ) ! ^ ^

Système de collecte

Analyses moléculaires

culture-indépendantes

Microbiote (composition, abondance)

Sève d'érable

Fabrication de sirop en

laboratoire

Analyses Physicochimiques

et sensorielles

Analyses Physicochimiques

et microbiologiques

Transformation

Sirop d'érable

Figure 5.1 Schéma de concepts illustrant les facteurs qui influencent la qualité du sirop d'érable et les éléments analysés au cours du projet. La flèche A représente le but de la thèse qui était de décrire le microbiote de la sève et son influence sur la qualité du sirop. Les flèches B et C représentent les voies possibles pour moduler le microbiote et mettre les connaissances acquises à profit.

125

5.1 Comparaison des méthodes moléculaires Au cours des travaux menées pour cette thèse, 12 échantillons de sève (site C à F, 0, 50

et 100% de la saison de coulée 2005) ont été soumis à plusieurs méthodes moléculaires,

soit une méthode de profilage PCR communautaire, une banque de clones d'ADNr 16S,

une MARISA et de la qPCR. Chacune de ces méthodes comporte des spécificités qui

leur ont valu d'être choisies pour répondre à chacun des objectifs. Bien que le but

premier de ces travaux ne soit pas la comparaison de méthodes, cette thèse ne saurait

être complète sans une comparaison de l'ensemble de ces résultats. Par ailleurs,

certaines analyses ont été associées soit à des données physicochimiques de la sève, soit

à des données physicochimiques et sensorielles du sirop (annexe 3), mais aucune analyse

n'a pris en compte tous ces résultats à la fois. La présente section a donc pour objectif de

discuter de l'analyse comparative et simultanée des résultats des différentes méthodes

moléculaires utilisées pour l'analyse des populations microbiennes de la sève d'érable.

La comparaison de l'abondance relative des principales bactéries présentes dans la sève

d'érable révèle des résultats différents pour chaque méthode moléculaire (Tableau 5.1).

Ceci s'explique par la différence de spécificité des méthodes puisqu'elles ciblent

chacune un gène différent. Elles sont également soumises à des biais différents. Les

banques de clones ainsi que la MARISA sont soumises à un biais d'amplification PCR.

Le nombre de copies du gène par génome est aussi un biais pour ces deux méthodes. La

MARISA est également biaisée du fait qu'il peut y avoir plus d'un pic par

microorganisme et un pic peut représenter plusieurs microorganismes à la fois

(homoplasie). Le biais PCR peut aussi être plus important pour la MARISA, car les

fragments ont des tailles différentes. Ainsi, la qPCR s'avère la méthode la plus fiable,

mais est beaucoup plus spécifique et l'information obtenue ne concerne que les espèces

ciblées contrairement aux banques de clones et à la MARISA qui représentent

l'ensemble présumé de la population. Les résultats montrent que la qPCR donne une

valeur généralement dix fois plus faible que la MARISA et les banques de clones

d'ADNr 16S. Ainsi, la diversité calculée pour les résultats des banques de clones et de la

MARISA sous-estime la diversité réelle présente dans la sève d'érable.

126

Tableau 5.1 Comparaison de l'abondance relative (%) des principaux contaminants

bactériens déterminée par différentes méthodes moléculaires

Ech. P. fluorescens Rahnella Janthinobacterium L. mesenteroides

< G

_

_ _

< --1 y .

o _ _ < _

_ _ _

_ _ _

< _ < _

_ _

C-0 2.34 9.94 1.04 4.68 7.01 1.23 1.17 4.76 0.07 0.00 0.00 0.00

C-50 7.05 39.12 0.82 14.04 2.76 0.31 2.34 2.98 1.15 4.09 0.00 0.02

C-l 00 3.23 22.15 0.57 13.44 1.41 1.05 1.08 0.00 0.03 21.51 0.00 0.00

D-0 7.05 4.36 1.51 0 0.00 0.20 1.28 6.70 0.19 0.00 0.00 0.00

D-50 4.62 11.56 0.80 4.49 4.55 0.27 3.85 0.00 0.30 0.00 0.00 0.02

D-100 7.39 7.22 0.72 22.73 20.28 2.67 6.25 0.00 0.08 0.00 0.00 0.00

1-0 4.28 5.96 0.89 2.14 0.00 0.22 0.53 0.00 0.08 0.00 0.00 0.00

E-50 12.3 8.45 1.04 2.14 7.42 0.26 0.53 5.55 0.54 0.00 0.00 0.08

E-100 4.62 16.32 0.99 6.15 4.80 0.51 3.08 4.44 0.16 3.08 0.00 0.05

F-0 2.21 25.37 1.17 0.55 0.00 1.05 0.00 41.21 0.34 0.55 0.00 0.01

F-50 65.38 86.51 4.16 1.65 2.11 0.10 0.00 2.22 6.12 0.00 0.00 0.28

F-100 56.68 60.69 4.58 8.02 2.00 0.23 0.53 0.00 0.06 0.00 0.00 0.00

moyenne 14.76 24.80 1.52 6.67 4.36 0.68 1.72 5.66 0.76 2.44 0.00 0.04 'OTUlo.oi 2Fragment B201 + B202 correspondant aux isolats 100-p8_A2 et 75-pl5_P4 qui ont une séquence du gène d'ARNr 16S identique à OTUl0.oi 3P. fluorescens sous-groupe 1, basé sur les séquences recA des isolats identiques à l'OTUlooi 4Somme des fragments B169, B233 et B237 correspondants aux isolats de R. aquatilis et Rahnella sp. 'Somme des fragments B186 et B192 correspondants à l'isolât de Janthinobacterium lividum

Une analyse du regroupement des échantillons, suite à une classification hiérarchique

(Figure 5.2), indique que les différences d'abondance relative observées au Tableau 5.1

affectent moins les analyses de similarité globale. En effet, la topologie des

dendrogrammes, c'est-à-dire l'organisation des ramifications, est comparable pour toutes

les méthodes à l'exception de la qPCR. On dénote un certain regroupement des

échantillons récoltés en début de saison tandis que les échantillons de milieu et de fin de

saison se regroupent davantage par site de production. La topologie du dendrogramme

des OTUso oi se rapproche davantage de celle des méthodes de profilage que de celle des

OTUsoo3 Dans le cas de la qPCR, les échantillons sont plus nettement regroupés par

période d'échantillonnage. Cette méthode comprend une quantification de la population

127

bactérienne totale, ce qui explique en partie cette différence. Ainsi, la méthode qPCR

cible les microorganismes permettant de bien différencier la période de coulée.

2> ; = >

_>J Profilage PCR communautaire

;_? Banques de clones (OTUs003)

E-

c-F ' E-

E c-C D-

D D"

__h _3

; = ► MARISA

E ■ D F • c-E" c-D-

C D E F-

F

_J

QPCR

Période de récolte 0% 50% 100%

Banques de clones (OTUSQ.OI)

Figure 5.2 Comparaison de la classification hiérarchique avec la méthode de Ward des différentes méthodes moléculaires. Les embranchements sont espacés également pour faciliter les comparaisons. Les lettres réfèrent aux sites de production.

Puisque les résultats obtenus par les méthodes moléculaires diffèrent, quelle méthode

permet la plus grande discrimination entre les sites de production et laquelle représente

le mieux l'impact sur la sève et le sirop? Afin de répondre à cette question, une MFA

comprenant les résultats des banques de clones (OTU0.03), de la MARISA (résultats

128

séparés pour les amorces bactériennes (B-ARISA) et fongiques (F-ARISA)), de la qPCR

et les résultats physicochimiques et sensoriels a été faite (Figure 5.2). Le logiciel

FactoMineR impose un maximum de 255 variables, par conséquent les résultats des

profils PCR communautaire et les OTUo.oi ont été omis.

-

3

o a

I—

00 ©

©

©

r 4 ©

© ©

B-ARISA OTUo.03

▲ F-ARISA _ A

qPCR Bactéries

Analyse sensorielle

Sève

qPCR Levures

A

Période Site Sirop m

Analyse sensorielle Sirop

0.0 r

0.2 —r 0.4

- r -

0.6 0.8 1.0

Facteur 1(25.56%)

Figure 5.3 Résultats de la MFA (analyse de facteurs multiples) pour les groupes de variables actives, qui sont prises en compte pour la MFA (en rouge) et supplémentaires, qui sont superposées aux résultats de la MFA (en bleu). Cercle : données des sirops des producteurs. Carré : données des sirops de laboratoires. Triangle : données caractérisant les sèves.

Selon les résultats, le facteur 1 est principalement attribuable aux propriétés

physicochimiques et sensorielles des sirops, tant de laboratoire que des producteurs. Le

facteur 2 est principalement attribuable aux OTU003 et à la MARISA. Selon ce schéma,

129

la composition de la sève d'érable possède une structure semblable à celle des bactéries

quantifiées par qPCR. Cette méthode donne également les résultats se rapprochant le

plus des propriétés du sirop d'érable. Il semble logique que les résultats de la qPCR

soient les plus rapprochés des résultats physicochimiques et sensoriels puisqu'ils ciblent

seulement les contaminants stables ou abondants, donc ceux potentiellement les plus

impliqués dans le développement des propriétés du sirop. Ce raffinement élimine en

quelque sorte le bruit de fond attribuable aux espèces rares, qui accompagne la MARISA

et les banques de clones d'ADNr 16S. Par ailleurs, la qPCR comporte une mesure de la

quantité totale de bactéries et reflète donc à la fois l'effet quantitatif et qualitatif. Cette

analyse integrative vient donc renforcer les résultats obtenus au chapitre 4 en ce qui

concerne le rapprochement entre les populations bactériennes ciblées et les propriétés du

sirop, mais elle positionne également les propriétés de la sève ainsi que les autres

méthodes moléculaires.

Quant à la période et au site d'échantillonnage, l'abondance relative des levures

mesurée par qPCR est le groupe de variables dont la structure serait la plus similaire. Ce

résultat concorde avec les résultats du chapitre 3 qui indiquent que la F-ARISA

partitionne mieux les échantillons par site que la B-ARISA (voir aussi l'annexe 1).

Cependant, l'écart entre la qPCR des levures et la F-ARISA est inattendu. De plus, le

groupe qPCR levure ainsi que le site et la période de récolte sont peu associés aux

premiers facteurs de la MFA. Il est possible que ces variables soient plus éloignées

suivant les facteurs subséquents. Une façon de vérifier la validité de cette association est

de faire une MRBP pour chacun des ensembles de données de ces quatre producteurs

(Tableau 5.2)

130

Tableau 5.2 MRBP de chacune des méthodes moléculaires sur 12 échantillons 2005

Ensemble de données

Profil PCR communautaire 0.121 0.006

OTUo.03 0.218 0.020

OTUo.oi 0.203 0.030

F-ARISA 0.119 0.005

B-ARISA 0.087 0.003

qPCR levures 0.017 0.314

qPCR bactéries 0.108 0.129

Selon les résultats de la MRBP, la qPCR levures est l'ensemble de données qui sépare le

moins les échantillons en fonction du site. Une absence de structure commune pour les

deux facteurs principaux de la MFA explique donc la proximité entre le groupe qPCR

levure et le site. Ce résultat est cohérent parce que les trois levures ciblées par la qPCR

sont communes à tous les sites échantillonnés. De même, la qPCR bactéries cible

principalement des bactéries stables et n'est pas significative en MRBP, ce qui concorde

avec la MFA qui indique que les résultats de la qPCR bactérie ne sont pas structurés par

site. La MRBP indique également que les banques de clones séparent mieux les

échantillons en fonction du site que les autres méthodes. Les différences entre les sites

proviennent surtout des contaminants occasionnels rares qui correspondent au bruit de

fond cité précédemment. Ainsi, selon l'objectif de l'étude, ce qui est considéré comme

du bruit de fond ici, les espèces rares, pourrait être le signal recherché par une autre

étude visant à soutenir la notion de terroir par exemple. Dans ce contexte, l'utilisation

des banques de clones d'ADNr 16S serait pertinente. Toutefois, puisque la F-ARISA

obtient un résultat supérieur à la B-ARISA et que le pyroséquençage est plus sensible

que les banques de clones, le pyroséquençage d'ADNr 18S constituerait l'approche la

plus performante pour distinguer les échantillons par site de production.

L'utilisation de méthodes de pointe telles que la qPCR a permis d'atteindre les objectif 5

et 6 du projet qui étaient de valider le statut de contaminant stable ou occasionnel des

131

principaux microorganismes de la sève et de déterminer les variations physicochimiques

et sensorielles du sirop d'érable associées à ceux-ci. Cependant, l'utilisation préalable de

méthodes d'analyse des populations générales telles que la MARISA et les banques de

clones a été indispensable pour identifier et déterminer les cibles adéquates.

L'exploitation de la complémentarité de ces méthodes a donc été une approche optimale.

D'autres méthodes complémentaires telles la cytométrie de flux auraient peut-être

apporté une perspective différente aux résultats. En effet, en marquant l'ADN avec le

4',6'-diamino-2-phenylindole (DAPI), un fluorophore colorant les régions riches en AT,

il est possible de séparer et récolter les cellules microbiennes en fonction de leur taille et

de leur contenu en ADN par cytométrie de flux. Des sous-populations d'intérêt peuvent

ensuite être étudiées par des méthodes moléculaires (Mou et al. 2005).

5.2 Le système de récolte acéricole, un écosystème à part

5.2.1 Origine de la contamination Le système de récolte acéricole est un écosystème unique, créé par l'homme mais

alimenté par la nature. En récoltant la sève, des microorganismes qui en d'autres temps

ne pourraient y accéder, y trouvent une niche accueillante. En effet, seulement quelques

microorganismes répertoriés à ce jour dans la sève sont reconnus comme

phytopathogènes (P. syringae, Rhodococcus, Leifsonia) (Setubal et al. 2005). La

majorité des microorganismes retrouvés sont plutôt ubiquitaires, ils proviennent

potentiellement du sol (Lagacé et al. 2004), de la phyllosphère ou même de l'homme.

Quelque soit la source de contamination, les tubulures laissées en place abritent une

quantité importante de microorganismes jusqu'à l'automne (Lagacé et al. 2011) et donc

potentiellement jusqu'à la saison suivante. Ainsi, l'âge des tubulures pourrait être relié

au niveau élevé de contamination initiale de la sève d'érable observé chez le producteur

Z en 2008. De plus, l'utilisation récurrente des tubulures pourrait contribuer à la stabilité

observée du microbiote pour un même site (Lagacé et al. 2006b). Ainsi, une solution

pour un producteur dont la qualité de la sève est problématique d'année en année serait

de remplacer complètement le système de tubulures.

132

5.2.2 Composition du microbiote Selon les connaissances actuelles, les communautés microbiennes de la sève se

composent principalement de bactéries à Gram négatif (92%) aérobies strictes (85%) et

de levures en nombre moins important. Avant le début de cette étude, plusieurs

contaminants du système de collecte de la sève d'érable avaient été identifiés (Tableau

1.5). De nombreux autres contaminants viennent maintenant s'ajouter à cette liste

(Tableau 5.3). Ce sont pour la plupart des contaminants rares, retrouvés dans peu

d'échantillons et en faible proportion. Certains sont des contaminants occasionnels,

retrouvés dans une minorité d'échantillons, mais parfois en proportions plus

importantes. D'autres sont des contaminants prédominants, c'est-à-dire présents dans la

majorité des échantillons et en proportions plus appréciables. Une nouvelle levure

répertoriée, Mrakiella, est même un membre stable du microbiote, retrouvé en

proportions dominantes dans quasi tous les échantillons. L'étendue de l'échantillonnage

a probablement contribué à la détection de ces microorganismes dans la sève d'érable.

Cependant, ces nouveaux résultats sont principalement attribuables aux outils

moléculaires culture-indépendants qui ont une sensibilité élevée et qui permettent de

soustraire les pressions de la culture en laboratoire. Ainsi, Mrakiella et

Janthinobacterium, pourtant deux contaminants fréquents, n'avaient pas été isolés lors

d'études précédentes, probablement en raison de leur température optimale basse et de

leur rythme de croissance plus lent.

Parmi les nouveaux résultats figurent également plusieurs bactéries lactiques capables de

fermentation et de production de flaveurs (Han et al. 2007). Leur présence occasionnelle

pourrait expliquer les flaveurs lactées identifiées dans la roue des flaveurs de l'érable

(Canada, 2004).

La connaissance approfondie de la composition du microbiote de la sève d'érable

apporte aussi un élément important pour la valorisation de ce produit; l'absence ou la

faible probabilité de retrouver naturellement des agents pathogènes résistants à la

pasteurisation puisque non-répertoriés à ce jour dans les travaux sur le sujet. En effet, le

microbiote est surtout composé de psychrophiles qui ne sont pas reconnus pour résister à

la pasteurisation. Ceci ouvre donc la porte à la possibilité de développer des produits à

base de sève d'érable pasteurisée.

133

Tableau 5.3 Microorganismes nouvellement répertoriés dans la sève d'érable dans cette étude

Bactéries Statut comme contaminant de la sève d'érable

Carnobacterium Rare Brevundimonas Rare Clostridium Rare Devosia Rare Duganella Rare Dyadobacter Rare Epilitonimonas Occasionnel Erwinia Rare Hafnia Rare Humicoccus Rare Hymenobacter Rare Janthinobacterium Prédominant Klebsiella Rare Lactobacillus Rare Lactococcus Occasionnel Leifsonia Rare Leuconostoc Prédominant Chitinophaga Rare Massilia Rare Ochrobacterium Rare Pantoea Rare Parkia Rare Propionicimonas Rare Pigmentiphaga Rare Pse udochrobactrum Rare Proteiniphilum Rare Serratia Rare Sodalis Rare Sphingobacterium Rare Sphingomonas Occasionnel Subtercola Rare Variovorax Rare Weissella Occasionnel

Levures

Mrakiella Williopsis (Apparenté à) Cadophora

Stable Occasionnel Rare

134

5.2.3 Structure et stabilité Une certaine stabilité du microbiote d'année en année pour un même site avait déjà été

observée (Lagacé et al. 2006b). Il a été démontré ici que la composition du microbiote

de chaque site est relativement constante au cours d'une saison, mais que sa structure

varie selon la période de récolte. La variation de l'abondance relative de certaines

espèces parentes de P. fluorescens explique en grande partie le changement de structure

observé entre le début et la fin de la période de coulée. Ce changement résulte

probablement de la hausse des températures et de l'activation concomitante du

métabolisme de l'arbre qui favorisent une sous-population de microorganismes.

Souvent, les membres les plus abondants d'une communauté microbienne ne sont pas les

joueurs clés, mais représentent les espèces les plus tolérantes vis-à-vis un large éventail

de paramètres environnementaux (Bombach et al. 2010). C'est pourquoi la notion de

stabilité a d'abord été considérée plutôt que l'abondance de chacune des populations. Il a

été démontré qu'il existe des populations stables i.e. présentes dans tous les systèmes de

récolte acéricoles à un moment ou un autre de la saison, soit P. fluorescens, Rahnella,

Mrakia, G. pullulans et Mrakiella. Les microorganismes se retrouvant à tous les sites et

tout au long de la période de récolte de la sève d'érable, sont susceptibles de participer

aux processus menant aux propriétés caractéristiques du sirop d'érable même s'ils sont

peu abondants. Il n'y a pas d'ambigtiité en ce qui concerne P. fluorescens, Mrakia,

Mrakiella et G. pullulans, car ils sont à la fois des membres stables du microbiote et

parmi les plus abondants. Par contre, la qPCR montre que Rahnella n'est pas toujours un

membre abondant, mais qu'il est toujours présent. Ce microorganisme avait déjà été

identifié comme un membre important du microbiote acéricole (Lagacé et al. 2006b). Sa

capacité à produire du gaïacol (Jensen et al. 2001), substance retrouvée dans les sirops à

caractère « plante ligneux » (Sabik et al. 2010) devrait être considérée lors de travaux

futurs.

Ces cinq populations se retrouvent tout au long de la période de coulée dans la sève des

19 érablières échantillonnées en 2005 et aussi dans la sève de trois autres érablières en

2008. Guehomyces, Mrakia et Mrakiella sont des microorganismes phylogénétiquement

proches (Thomas-Hall et al. 2010) qui ont aussi pu être isolés conjointement d'un

135

glacier européen (Branda et al. 2010). Il est envisageable que ces levures soient en

compétition pour la même niche écologique au sein des biofilms qui tapissent les

tubulures de récolte de la sève d'érable. Or, P. fluorescens et Rahnella possèdent des

caractéristiques physiologiques bien distinctes. Une hypothèse plausible serait que les

membres stables du microbiote acéricole participent à un consortium microbien, c'est-à-

dire à une collaboration temporaire où chaque microorganisme contribue par un élément

génétique distinct à compléter un processus métabolique. Puisqu'une sève stérile produit

du sirop insipide et sans saveur (Lagacé 2006), il est possible que la résultante de cet

objectif commun soit un précurseur de la saveur d'érable.

5.3 L'impact du microbiote, une réponse multivariée

Les résultats des échantillons récoltés en 2005 montrent qu'il existe une quantité

optimale de microorganismes dans la sève pour une saveur maximale du sirop et que

cette valeur est généralement atteinte en milieu de saison (Figure 5.4). Une hypothèse

pour expliquer cet effet est qu'au-delà d'un certain degré de contamination, le

métabolisme des populations change et son impact sur la qualité de la sève et du sirop

également. Il est connu que plusieurs mécanismes de communication microbienne

appelés « quorum sensing » (QS) ont une réponse seuil-dépendante caractéristique. Les

cellules ne répondent pas proportionnellement au signal chimique, mais diffèrent plutôt

la réponse jusqu'à ce qu'un seuil critique du signal soit détecté (Wintermute et Silver

2010). Le QS régule notamment les voies métaboliques menant à la formation de

biofilms chez plusieurs bactéries dont certaines souches de P. fluorescens (Wei et Zang

2006). King et Morselli (1985) ont d'ailleurs observé que la tubulure de récolte de la

sève est propice à la formation de biofilms par P. fluorescens et que celle-ci n'est

détectable que lorsque la contamination est élevée. Ainsi, il est possible que le QS soit

également responsable de la régulation d'un mécanisme qui est lié à la disparition de la

flaveur « plante-ligneux » retrouvée dans les sirops du début de la période de récolte. Il

n'est pas exclu que la faculté de certains Pseudomonas à dégrader la lignine et à libérer

les précurseurs de flaveurs tel l'acide vanillique (Ruzzi et ai. 1997; Narbad et Gasson

1998) soient l'un de ces mécanismes. A l'inverse, une contamination importante est

136

souvent liée à la présence de sucres réducteurs dans la sève. Ceux-ci participent aux

réactions de Maillard lors de la transformation en sirop et il en résulte des flaveurs

empyreumatiques qui masquent les flaveurs d'érable et de vanille. Si les populations qui

participent à la production des flaveurs d'érables diffèrent de celles qui libèrent les

sucres réducteurs dans la sève, alors le ratio optimal entre ces populations peut être

modulé pour la production d'un sirop de qualité optimale.

Période - o% x 50% ♦ 100%

r2 = 0.345, p<0.0001 r2 = 0.683 si 5 éch. aberrants exclus

4.5 5 5.5 6 6.5 7

Comptes bactériens (UFC/mL)

Figure 5.4 Modélisation de l'effet quantitatif de la contamination bactérienne de la sève d'érable sur l'analyse sensorielle du sirop de laboratoire

Bien que l'effet « dose-réponse » soit évident, comme dans d'autres études, on remarque

des échantillons pour lesquels la composante quantitative de la contamination

bactérienne ne suffit pas à expliquer les résultats de l'analyse sensorielle (Dumont 1999;

Lagacé et al. 2002). Puisqu'ici les sirops ont été fabriqués selon une méthode

standardisée, il est exclu que le procédé de transformation en soit la cause. L'aspect

137

qualitatif, c'est-à-dire la composition des communautés microbiennes de la sève est donc

un effet à considérer.

Des échantillons ayant des microbiotes différents ont-ils une relation de type « dose-

réponse » quantitative différente? La réponse réside dans l'intégration des résultats

moléculaires, physicochimiques et microbiologiques. La Figure 5.5 montre

qu'effectivement, certains groupes d'échantillons aux microbiotes génétiquement

similaires (formés à partir d'une analyse de groupement par la méthode de Ward sur les

profils PCR communautaires) ont un effet quantitatif significativement différent sur la

quantité des sucres réducteurs de la sève et du sirop d'érable. À noter que le mécanisme

de libération des sucres réducteurs dans la sève par les microorganismes est connu

depuis longtemps et suggère le sens de cette relation cause à effet, mais il n'est pas exclu

que ces variables soient interdépendantes.

Quels microorganismes caractérisent ces groupes? Une ISA à partir des profils MARISA

(Tableau 5.4) teste si les fragments sont statistiquement plus abondants et fréquents pour

chaque groupe. Une espèce indicatrice parfaite pour un groupe donné serait présente

uniquement dans les profils de ce groupe et aurait une valeur indicatrice égale à 100. Les

résultats révèlent que Candida sake et R. aquatilis sont des espèces indicatrices du

groupe 1. Cryptococcus victoriae est indicatrice du groupe 2 alors que P. syringae et une

espèce apparentée à Williopsis sont indicatrices du groupe 3. Aucune espèce indicatrice

n'a été significativement révélée par l'analyse pour le groupe 4. En fait, en comparant

l'abondance relative des espèces mesurées par la qPCR il s'avère que ce groupe

comporte une abondance relative supérieure de bactéries du groupe P. fluorescens (p =

0.09). Ce résultat marginalement significatif est attribuable au nombre réduit

d'échantillons analysés en qPCR (N = 28). Au minimum, 47 échantillons auraient été

nécessaires pour obtenir une différence significative (p - 0.05). Les bactéries du groupe

P. fluorescens regroupent plusieurs espèces phylogénétiquement proches, mais qui

correspondent à des fragments MARISA distincts. Ces fragments pris séparément n'ont

pas donné de résultat significatif en ISA, par conséquent P. fluorescens ne figure pas au

tableau 5.4.

138

Sèves Sirops de laboratoire Groupe

Comptes bactériens UFC/mL Comptes bactériens UFC/mL

Figure 5.5 Courbes polynomials (p <0.01) correspondant à l'effet des comptes bactériens de chacun des groupes de profils PCR communautaires sur les sucres réducteurs de la sève et du sirop de laboratoire.

139

Tableau 5.4 Analyse des espèces indicatrices

Fragment Identification Groupe Valeur P (MARISA) présomptive (profil PCR

communautaire) indicatrice

F55 Candida sake 1 60.6 0.0004

B237 Rahnella aquatilis 1 59.2 0.0004

F73 Cryptococcus victoriae 2 40.1 0.0218

B222 P. syringae 3 82.6 0.0002

F90 Williopsis sp. 3 37.3 0.0188

Seul les meilleurs fragments indicateurs identifiés sont rapportés pour chaque groupe.

Ainsi, à contamination bactérienne égale (mais >106 UFC/mL), un échantillon de sève

dont le microbiote est caractérisé par la présence de C. sake et Rahnella, deux

microorganismes fermentaires, aura une quantité de sucres réducteurs plus élevée qu'un

échantillon dont le microbiote est caractérisé par une proportion plus élevée de P.

fluorescens. Ces résultats montrent donc que des microbiotes composés d'un assemblage

de populations différentes ont un comportement différent à partir d'une quantité critique,

soit environ IO6 UFC/mL. Cette quantité critique coïncide étrangement avec la quantité

optimale de contamination bactérienne observée à la Figure 5.4. Pour les études

ultérieures portant sur l'effet de différentes populations sur la sève, il serait avisé

d'exclure les sèves qui n'ont pas atteint ce seuil de contamination.

Outre cet impact différentiel modélisé pour des groupes de communautés microbiennes

génétiquement similaires, les relations entre l'abondance relative de populations

spécifiques et les propriétés de la sève et des sirops ont été investigués. Des liens avec la

composition de la sève impliquant C. sake et J. lividum ont été mis en évidence pour les

échantillons récoltés en début de saison, Williopsis sp., Leuconostoc mesenteroides,

Mrakia sp., Rhodococcus spp. et Pseudomonas tolaasii en milieu de saison ainsi que G.

pullulans en fin de saison. De plus, il a été mis en évidence par la MFA pour deux

échantillonnages indépendants que P. fluorescens et Mrakia sont corrélés aux attributs

de vanille et d'érable du sirop. Une analyse complémentaire montre que la corrélation

entre P. fluorescens et la saveur d'érable n'est pas significative pour les sirops de

140

laboratoire, alors qu'elle est significative pour les sirops des producteurs (Tableau 5.5).

Cette différence suggère que l'impact de P. fluorescens sur la saveur d'érable est lié au

procédé de transformation, plus précisément aux températures de conservation et de

transformation de la sève. En effet, les sèves transformées en laboratoire ont d'abord été

congelées, puis ont été bouillies en « batch » tandis que les sèves transformées par les

producteurs ont été directement transformées en semi-continu.

Tableau 5.5 Correlation entre l'abondance relative de P. fluorescens et Mrakia et les attributs sensoriels du sirop d'érable

Groupe taxonomique Variable Sirop de laboratoire

Spearman p Prob >|p|

Sirop des producteurs

Spearman p Prob >|p|

Groupe P. fluorescens

Mrakia spp.

Analyse sensorielle 0.4707 0.0420 0.4567 0.0493

Odeur de vanille 0.7270 0.0004 0.1923 0.4303

Saveur de vanille 0.5031 0.0281 0.2761 0.2525

Odeur d'érable 0.3945 0.0946 0.3778 0.1108

Saveur d'érable 0.3752 0.1135 0.5984 0.0068

Analyse sensorielle 0.3691 0.1199 0.1661 0.4968

Odeur de vanille 0.5415 0.0166 0.2561 0.2899

Saveur de vanille 0.3446 0.1486 0.1784 0.4648

Odeur d'érable 0.2034 0.4035 0.1064 0.6646

Saveur d'érable 0.3972 0.0922 0.4007 0.0891

Additionnellement, l'abondance relative de P. fluorescens est corrélée négativement à la

contamination bactérienne totale. Une hypothèse pour expliquer le mécanisme à

l'origine de cette observation est que P. fluorescens en occupant l'espace à priori, réduit

l'attachement des autres microorganismes aux tubulures. Il contribuerait ainsi à

maintenir une population totale plus faible et à préserver la qualité de la sève d'érable.

5.4 Limites de l'étude Compte tenu que les microorganismes abritent le même espace, y forment des biofilms

et partagent les ressources, compte tenu de la communication inter-espèce, des stratégies

de compétition, etc., il est impossible d'ignorer la codépendance de la réponse de ces

141

variables biologiques. Les analyses multivariées sont donc incontournables pour

analyser les associations complexes qui unissent les populations microbiennes, mais

elles ne permettent aucune inference par rapport à la causalité des relations observées.

Bien que certaines analyses d'ordination contrainte comme la « redundancy analysis »

(RDA) puissent établir des corrélations entre des variables réponses et des variables

explicatrices (Ramette 2007), l'interdépendance entre le microbiote et la composition de

la sève exclut ce type d'analyses. En fait, seule une expérience avec des paramètres

contrôlés permettrait réellement de démontrer l'effet d'une population en particulier.

Malheureusement plusieurs considérations pratiques limitent les initiatives de recherche

expérimentale; la sève d'érable n'est disponible que quelques semaines par année, un

effet significatif ne sera pas nécessairement mesurable directement dans la sève et la

production de sirop demande de grands volumes de sève.

5.5 Perspectives

5.5.1 La gestion du système de collecte de la sève d'érable Au fil du temps, de nombreuses mesures visant à contrer l'activité microbienne dans la

sève d'érable ont été tentées. À l'époque de la collecte par chaudières, des couvercles

étaient utilisés pour empêcher les débris de tomber dans la sève et d'introduire ainsi des

microorganismes. Plus tard, des pastilles de paraformaldehyde ont été utilisées pour

aseptiser les entailles. Cette mesure étant devenue illégale, les producteurs se sont

tournés vers d'autres moyens, comme la stérilisation de la sève par les rayons

ultraviolets, l'assainissement des équipements et la filtration de la sève (Chapeskie

2005).

À la lumière des nouvelles informations sur la composition du microbiote acéricole,

certains éléments de gestion du système de collecte peuvent être envisagés (Figure

5.1C). Par exemple, l'utilisation d'équipements aseptisés pourrait être combinée au port

de gants pour l'entaillage dans le but de réduire la contamination initiale. Encore, le

contrôle des conditions d'entreposage, comme le refroidissement des cuves de collecte

et l'aération de la sève pourraient limiter la croissance des microorganismes fermentaires

comme les levures qui peuvent altérer la sève entreposée (Chapeskie 2005). La filtration

142

sélective de la sève d'érable pourrait également représenter un moyen de contrôle des

levures qui sont plus volumineuses que les bactéries. Puisque trois des membres stables

du microbiote acéricole sont des levures, l'impact d'une telle pratique sur les flaveurs du

sirop devrait être évalué. À ce jour, aucune étude n'a évalué l'effet de cette pratique

pourtant déjà largement répandue en Ontario (Chapeskie 2005).

5.5.2 La modulation du microbiote La modulation du microbiote acéricole pour contrôler la qualité microbiologique de la

sève est une perspective qui a motivé le développement de ce projet, mais est-elle

possible? Compte tenu des multiples sources de contamination environnementales

potentielles et de l'influence du climat, peut-on espérer moduler de manière stable la

communauté microbienne qui colonise tout le système de collecte de la sève d'érable? Il

faut l'espérer, et surtout le valider. Les objectifs futurs utilisant la modulation du

microbiote sont divers; limiter la contamination totale et ainsi réduire la teneur en sucres

réducteurs de la sève; optimiser les propriétés organoleptiques du sirop d'érable;

augmenter naturellement le contenu en molécules à valeur ajoutée du sirop d'érable.

La présence récurrente dans la sève de P. fluorescens et R. aquatilis évoque une

possibilité de biocontrôle, car ceux-ci sont déjà reconnus en tant qu'agent de biocontrôle

dans d'autres contextes (Pujol et al. 2005; Calvo et al. 2007). Puisque le groupe P.

fluorescens semble avoir un impact supérieur sur les propriétés désirables du sirop

d'érable aux sous-groupes ciblés au chapitre 4, il est probable que la fonction impliquée

soit commune à plusieurs souches ou espèces. Ainsi, une étude ciblant spécifiquement

les populations du groupe P. fluorescens pourrait permettre de déceler la présence d'une

entité plus fortement corrélée que la moyenne. Une méthode de type T-RFLP combinée

à des amorces spécifiques au groupe P. fluorescens, telles que celles développées au

chapitre précédent, pourrait être envisagée. Une telle étude devrait être accompagnée

d'analyses plus poussées des profils phénoliques et autres composés potentiellement

responsables des flaveurs (Bail 2007). Au stade actuel des connaissances, une étude

similaire sur Mrakia serait plus difficile à mettre en œuvre étant donné le peu

d'information physiologique et génétique disponible à son sujet.

143

Pour valider les corrélations, des études expérimentales seront nécessaires. Les

paramètres de laboratoire ne peuvent reproduire les conditions environnementales et la

complexité de l'habitat que constitue le système de collecte. Une inoculation des

tubulures est envisageable, mais nécessiterait beaucoup de moyens pour ne tester que

peu de souches. Une façon ingénieuse de contourner ce problème, serait d'adapter le

concept de microcosme in situ utilisé en écologie environnementale (Bombach et al.

2010). Ce type d'expérience figure parmi les seuls à obtenir une reproductibilité et un

contrôle en écologie microbienne (McArthur 2006). Par exemple, de petites matrices

comme des billes poreuses, pré-colonisées par des souches de P. fluorescens, pourraient

être introduites dans un réservoir ou une chaudière de collecte de la sève. Un contrôle

non-inoculé permettrait d'effectuer des statistiques inférentielles afin de déterminer

quels aspects de la communauté microbienne autochtone sont influencés par le

traitement. Une autre approche serait de sélectionner suffisamment d'échantillons de

sève ayant produit des sirops dont des propriétés ont été mesurées à priori, appartenant à

chaque classe de qualité. Les corrélations observées entre les microorganismes et les

propriétés de la sève et du sirop au cours de cette thèse pourraient ainsi être corroborés

par tests de statistiques inférentielles sur l'abondance relative des microorganismes

mesurée par la qPCR. De plus, un effort de clonage et d'isolement devrait être consacré

à l'identification des amplicons MARISA inconnus, soit prédominants ou corrélés aux

propriétés de la sève, afin de cibler également ces microorganismes.

5.5.3 La typicité en gage de qualité Une perspective qui découle des résultats présentés, mais qui n'implique pas la

modulation du microbiote concerne la classification du sirop d'érable. De prime à bord,

l'optimisation de la qualité du sirop d'érable semble être un objectif plutôt simpliste,

compte tenu du système de classification en vigueur. Or, c'est en observant la roue des

flaveurs que toute la complexité des flaveurs de l'érable est révélée. En réalité,

seulement quelques catégories de flaveurs principales sont assez fréquemment

rencontrées pour être étudiées quantitativement. De plus, l'intensité de chacune des

flaveurs dominantes est présente sous forme de gradient.

144

Puisque la fabrication du sirop d'érable comporte plusieurs éléments similaires à la

fabrication du vin, il serait peut-être adéquat d'adopter un système de classification du

sirop fondé sur la typicité du produit, plutôt que sur une notion arbitraire comme la

couleur. L'analyse spectroscopique de sèves et de sirops a montré que le site de

production est le facteur principalement lié à la typicité (Clément et al. 2010). La

composition globale du microbiote acéricole est également spécifique au site de

production, particulièrement les populations fongiques. De plus, la stabilité des

communautés microbiennes dans le temps pourrait contribuer au maintien de la typicité.

Un système de classification misant sur la typicité des produits comme les appellations

d'origine contrôlée pourrait apporter une valeur ajoutée aux produits de l'érable

québécois. Les résultats présentés ici ne couvrent que les principales régions

productrices de sirop d'érable du Québec. Une étude plus élargie apporterait sans aucun

doute davantage de connaissances et permettrait d'établir des caractéristiques propres

aux sirops du Québec dont le climat est, d'un point de vue microbiologique,

substantiellement différent de celui des autres régions de production de l'érable, soit

l'Ontario, le Nouveau-Brunswick et des États-Unis.

5.6 Conclusion générale Les travaux ont permis d'identifier les principaux contaminants bactériens et fongiques

de la sève d'érable et d'obtenir certains isolats bactériens représentatifs. La variation de

la composition et de la structure du microbiote en cours de saison et ce à l'échelle

provinciale a été caractérisée. Les travaux ont également contribué au développement de

nouvelles méthodes pour l'étude des communautés microbiennes. Notamment le

profilage PCR communautaire reflète la variation génomique de populations complexes.

Sa simplicité et rapidité d'exécution en ont fait un outil idéal pour cette étude à large

spectre et pour sélectionner les échantillons représentatifs pour les 13 banques de clones

d'ADNr 16S séquencées. De plus, une nouvelle méthode multiplexe, la MARISA a été

développée et des essais qPCR spécifiques pour quantifier les contaminants

prédominants de la sève d'érable ont été mis au point. Finalement, l'utilisation

d'analyses multivariées a permis de mettre en évidence les tendances et les liens entre

les populations microbiennes et les caractéristiques de la sève et du sirop d'érable.

145

Tous les résultats obtenus convergent pour supporter l'hypothèse de départ. D'une part il

y a des populations microbiennes stables dans la sève d'érable (P. fluorescens, Rahnella,

Mrakia, Mrakiella et G. pullulans) et, d'autre part, il y a une corrélation entre

l'abondance relative des populations de P. fluorescens et Mrakia et les attributs de

vanille et d'érable du sirop. De plus, des contaminants occasionnels tels que L.

mesenteroides et Janthinobacterium sont liés à des propriétés physicochimiques de la

sève à différents moments de la période de récolte et contribuent ainsi probablement à la

typicité du produit. Ces conclusions ne sont bien sûr limitées qu'aux échantillons de

l'étude de par la nature descriptive de l'approche. Pour préciser ces conclusions, en plus

des méthodes moléculaires ciblées comme la T-RFLP spécifique, les acides aminés et

les composés phénoliques nouvellement identifiés dans la sève et le sirop (Legault et al.

2010; Li et Seeram 2010; 201 la; 201 lb) devraient être inclus dans les analyses futures.

La stratégie de microcosme in situ mentionnée précédemment, les nouveaux outils

d'analyse de la sève comme les méthodes spectrométriques et le développement récent

d'un évaporateur modèle pour la fabrication de sirop à l'échelle pilote représentent des

perspectives de recherche intéressantes.

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Annexe 1

Affiche présentée au congrès « Annual NAMSC-IMSI-OMSPA Meetings» à Stratford, ON en octobre 2010.

Résumé Au cours de la récolte, l'eau d'érable est contaminée par des bactéries, des levures et des

moisissures qui colonisent le système de récole tubulaire. Le microbiote bactérien formé

a récemment été étudié, mais les populations fongiques ne sont pas bien caractérisées et

leur impact sur la qualité de l'eau d'érable demeure flou. La présente étude identifie les

microorganismes fongiques et décrit leur distribution parmis 19 sites de production

localisés dans six régions du Québec, au début, au milieu et à la fin de la période de

récolte. Une méthode culture-indépendante nommée MARISA a été développée et

utilisée en conjonction avec des banques de clones pour identifier les principaux

contaminants fongiques. Les résultats indiquent que la communauté fongique est

composée principalement de levures apparentées aux genres Mrakia, Mrakiella,

Guehomyces, Cryptococcus and Williopsis. De plus, Mrakia, Mrakiella et Guehomyces

peuvent être considérés comme des membres stables du microbiote puisqu'ils ont été

retrouvés dans tous les sites de production et du début à la fin de la période de récolte.

Finalement, le site de production a été identifié comme étant le facteur pricipal de

diversité. Ces résultats apportent de nouvelles connaissances à propos de la

microbiologie acéricole et de son impact potentiel sur la qualité de la sève et de la

typicité du sirop d'érable.

160

Abstract

Upon being tapped, maple sap is contaminated by bacteria and fungi that further

colonize the tubing of the collection system. The bacterial microbiota formed has

recently been studied, but the fungal microbiota is not well characterized and their

impact on maple sap quality remains unclear. This study focused on identifying fungal

members and describing their distribution among 19 production sites located in 6

regions of Québec, at three flow periods. A culture-independent method named

multiplex automated ribosomal intergenic spacer analysis (MARISA) was developed

and used in conjunction with clone libraries to identify predominant microbiota

members. Results indicate that the fungal community of maple sap is mainly composed

of yeast related to Mrakia, Mrakiella, Guehomyces, Cryptococcus and Williopsis.

Moreover, Mrakia, Mrakiella and Guehomyces can be considered stable members as

they were found across the 19 production sites sampled and throughout the tapping

season. Finally, the production site was identified as the main diversity factor. These

results bring significant new insights about maple sap microbiology and its potential

impact on maple sap quality and syrup typicity.

161

c y Yeast communities of maple sap, a discriminating feature

El UNIVERSITÉ

LAVAL

Marie Filteau1, Luc Lagacé

2, Gisèle LaPointe

1 and Denis Roy1

' i W M d w rtutracejoaues etaP>meTBfoi_oonneii(IHWl. D*»rteme« dnScient** deii'iTiencief de T_roon. u-ive-i te uv» Givey* QC.CJ-ia<_ 'Centre de '*t**rctie. * développe*-*-* « (_ t■>-airrt*FC-.TOof »_■ _ » • : _ * ne (ACER) St-Norb-t (_Vthiù_U_. GOP « 0 . QC.Cana<_

Email: den_roy0fua _ « i ci

Introduction DJ Results Wu Results M a p l e sap is a rich g r o w t h m e d i u m f o r mic roo rgan isms . As

t h e harvest ing season progresses and t h e t e m p e r a t u r e

gets mi lder , bac te r ia , yeast and m o l d s f o r m b io f i lms ins ide

t h e t ub i ng co l lec t ion system.*

Mic rob ia l c o m m u n i t i e s - formed can a l te r m a p l e sap

compos i t i on a n d qual i ty . The bacter ia l m i c r o b i o t a has

recen t l y been s t u d i e r f but l i t t l e is k n o w n a b o u t t h e fungal

m e m b e r s of th is ecosystem.

- * -Tb ta l aerobic counts - • - Anaerobic counts - _ - Pseudomonas counts ■**■ Psychrophilic counts - • - F u n g i counts

Fig. 1 . Maple sap microbial contamination increases throughout harvesting season.*

1 . I d e n t i f i c a t i o n o f f u n g a l c o n t a m i n a n t s :

A t o t a l of 4 1 dis t inc t peaks, each po ten t i a l l y co r respond ing

t o a t y p e o f yeast or m o l d w e r e uncove red in m a p l e sap

fungal prof i les . Cloning a n d sequenc ing of PCR p r o d u c t s

a l l owed i den t i f i ca t ion of 11 peaks (Table 1).

A i m s o f t h i s s t u d y :

Ident i fy map le sap funga l c o n t a m i n a n t s w i t h a

cu l tu re - independent approach.

2. M o n i t o r fungal c o m m u n i t y var ia t i on over t h e

harvest ing season and be tween p r o d u c t i o n sites.

3. Assess t h e i m p o r t a n c e o f factors con t r i bu t i ng t o

d iscr iminate fungal commun i t i es .

cooopftco w m loo o m sn

W A o ( « M v n u M.4 594 SM

Catopiiorii m a t j r w * 99 5 U l S M

Khoobtonto sp. 99.» S M 600

_UFftarn>«s<H«MOM: 100.0 H t 611

* r i o a c r » u « orctsu 99.1 613 61S

Mrafcosp 100.0 628 631

M r o k a gthtto 9 9 1 621

Klrokarho _cco—_J I 9 9 1 63S

M r M o r * > a 9 _ * t _ M . 4 U 4 |

2. Funealcommunitv variation:

Relat ive a b u n d a n c e var ia t i on main l y occu r red b e t w e e n

harvest ing per iods whi le presence-absence va r i a t i on

was most ly observed be tween p r o d u c t i o n sites (Fig.2).

Material and Methods Li—

E x p e r i m e n t a l d e s i g n :

March Apr* _ ^ P . _ >

Harvesting period (20O5|

Culture-independent method:

c - _ _ _ _ x mi TT. muai

Mult ip lex automated r ibosomal intergenic spacer analysis (MARISA)

Fig 2. Example of fungal profiles variat ion over harvesting season ( left) and across product ion sites (right).

Identification of fungal peaks: Cloning Sequencing

V J_

"

■ Candida sake m Cryptococcus victoriae

■ Cadophora melinii ■ Williopsis sp.

■ Cadophora moforum ■ Guehomyces p u t u h n s

■ Rhodotorula a t t ka a Mrakia spp.

■ Mrokieta spp. ■ Other

Fig 3. Relative abundance of fungal peaks throughout t he harvesting season

3. Discriminating factors:

Accord ing t o a d isc r im inan t analysis, t h e m o s t i m p o r t a n t

va r i a t i on f ac to r o f t h e f unga l c o m m u n i t y compos i t i on w a s

t h e p r o d u c t i o n si te , followed by t h e flow p e r i o d and t h e n

t h e geographica l reg ion .

Based on t h e funga l pro f i l e data, t h e harves t ing per iod

was pred ic ted w i t h o u t misclassi f icat ion The harvest ing

t i m e w a s pred ic ted w i t h a 5% error ra te and t he

geograph ica l reg ion was p r e d i c t e d w i t h a 9 % er ro r ra te

(F ig .4 } .

-Bis St L i . CT» •CeiXre-d-Q uébec ■CwudiSf-e-AoM ac"_s

Circles -ecesent "wx' region e_i mated

Figure 4. Regional discriminant analysis canonical plot of maple sap samples based on fungal profi les.

Discussion IL > Only yeast sequences w e r e recovered f r o m maple sap,

a l t h o u g h n o t all peaks have been i den t i f ied .

1 M a p l e sap yeasts are ei ther :

* • Cold adap ted microorgan isms ( M r a k i a and Mrak ie l l a )

•Ve ry c o m m o n in na tu re {Guehomyces)

• Associated w i t h h u m a n n o r m a l mic rob io ta (Guehomyces)

- A p l a n t pathogen ( C a d o p h o r a m a l o r u m )

• Present on t ree bark (Cryptococcus and fthodoforu/o)

• Fermen ta t i ve (Candida sake)

■ M r a k i a , M r a k i e l l a and Guehomyces can b e considered

stab le m e m b e r s o f t h e m a p l e sap m i c r o b i o t a . There fo re ,

t h e y cou ld be imp l i ca ted in d e v e l o p m e n t of character is t ic

m a p l e a t t r i bu tes a long w i t h t h e stab le bac ter ia l m e m b e r ,

Pseudomonas .

• Thei r re la t i ve a b u n d a n c e var ia t i on over t he t app ing

season c o u l d b e r e l a t e d t o var ia t ion o f map le sap

c o m p o s i t i o n and chang ing env i ronmen ta l cond i t ions .

• O t h e r yeasts are occasional con tam inan ts t h a t cou ld b e

respons ib le f o r m a p l e sy rup t yp i c i t y and f o r ce r ta in off-

f lavors . For examp le , Wil l iopsis is k n o w n t o produce f r u i t y

f lavors .

■ Thei r var iab le occu r rence a m o n g p r o d u c t i o n sites cou ld

resu l t f r o m d i f fe ren t c o n t a m i n a t i o n sources re la ted t o

ster i l i za t ion pract ices.

• Fungal mic rob io ta prof i les show d isc r im ina t ing fea tu res

t h a t cou ld s u p p o r t va lue a d d e d c la ims for map le sy rup o f

con t ro l l ed or ig in . However , t h e re la t ionsh ip b e t w e e n

t hese var ia t ions and sy rup qua l i t y m u s t be f u r t h e r

exp lo red .

Annexe 2

Preliminary analysis for qPCR target selection

s s 2 o

s « 3 o

ii _ 3 S S C c

(D -? ? (O rt * ^ ^

S * S o

E D

- I- i - i - »-O O O O

_ _ _ ■*» o «o £ >. >. <N f- •»

^ c Q» a p p P " » - O O Ë F F F F Û - O U O L U U J O O O

0TU1

Maple taste

Maple odor

Van illa taste

Van illa odor

OTU2

OTU6

OTU36

OTU4

Plant ligneous taste

Plant ligneouse odor

OTU5

Confectionary taste

Confertionaryodor

Emp y reumati c taste

Emp y reumati c o dor

OTU27

OTU 10

OTU45

Organoleptic properties OTU1

r P

OTU2

r P

OTU4

r p

OTU5

r P

OTU6

r P

OTU10

r P

OTU 27

r P

OTU36

r p

OTU45

r p

Confectionary odor -0 32 0.2805 -0 40 0 1737 -0 39 0.1911 0 51 0.0745 -0 33 0 2641 0.45 01200 0 57 0 0422 -024 0.4252 0.48 0.0943

Con fectionany taste -0 18 0 5592 -025 0.4128 -0.43 0.1434 0 37 0.2177 -0 41 0.1622 0 63 00209 042 0.1502 -0 33 0.2672 0 65 00156

Empyreumaticodor -0.25 0.4018 -0.42 0.1491 -0.48 0.0971 0 6 ! 0 0259 -0 57 0 0434 0 58 0 0389 0.67 0 0118 -0.53 0.0654 0 72 00059

Empyreumatictaste -0.15 0.6319 -0 57 0 0429 -0 48 0.1008 0 52 0 0227 -0 55 0 0500 044 0.1299 :, so 0 0287 -0 50 0.0811 0 60 0 0288

Maple odor 0 67 00115 0 02 09462 -0 42 0.1577 -012 0.6985 -0.18 0.5527 -0 23 0.4418 -0.30 03216 -0.10 0.7332 - 039 0.1862

Maple taste 0 56 0 0484 0 16 0.6103 -0.30 0.3213 -0 02 0.9387 -0.10 0.7381 -0 01 0.9676 -0.29 0.3440 -0.02 0.9573 -0.21 0.4925

Plant ligneous odor -0.38 0.1968 0 35 0.2408 Q 7 g 00014 -0.43 0.1423 0 ~2 00059 -038 01981 -0.29 0.3298 0 63 0 0217 -0 35 02428

Plant ligneous taste -0 41 0.1696 0 39 0.1869 0.81 0 0007 -0.44 0.1283 0 76 0 0026 -0 35 02384 -023 0.4584 0 67 0 0118 -0.31 0.3060

Vanillaodor -0.05 0.8836 0 20 0.5090 -012 0.7020 -0.24 0.4356 042 0.1541 -0.30 0.3178 -0.44 0.1307 0 53 0.0596 -0 56 00460

Vanilla taste -0.18 0.5534 0 18 0.5543 0.05 0 8783 -0 25 04131 0 2 5 0.4022 -0.23 0 4571 -0.02 0.9568 0.42 0.1488 -0.36 02292

Clustering of the correlations between the relative abundance of selected OTUsooi from 16S rRNA gene clone libraries and maple syrup organoleptic characteristics. Correlation coefficient and/? values are reported in the accompanying table.

164

P. synxantha P. poae P. lurida P. trivialis 0TU2 P. Ilbaniensis

•P. costantinii •P. reactans

N P fulgida P. orientalis P. cedrella

- P tolaasii -P. panacis TP. veronii

4 OTU 1 I P. brennerii IP. gessardii 'p. proteolytica

— P. fluorescens |—P. fluorescens

-P. marginalis -P. riiodesiae j P. collierea J"OTU6 |LoTU4 rP. aurantiaca 1-P. aureofaciens TP Uni

H P. borealis l p . frederiksbergensis I P. nigulae *P. mandetii

f-P. corrugata

H P. chlororaphis P. tremae P. meliae

-P. ficuserectae -P. viridifiava rP. savastanoi

P. cannabina P. congelans P. synngae P. avellanae

£ P. abietaniphila P. graminis P. gingen

i- P. jessenii J -P . entomophila

^ ■ P . pul/da t p . pui/da

i — Rahnella aquatilis genosp. 1 l i— Rahnella genosp. 2 t rOTUS

^Rahnella genosp. 3 i OTU 45 I Achromobacter xylosoxidans

r Janthinobacterium agaricidamnosum L0TUIO 1 Janthinobacterium lividum .OTU 36 I Rhodococcus erythropolis

1 0TU27 - I i—Pedobactercryoconitis

*—I r- Pedobacter hartonius ^ - Sphingobacterium sp.

— Pedobacter westerhofensis

gi|4433345| gi|21726937| gi|34494539| gi|21726939| 0-p12_2406 gi|3047379| gi|20146542| gi|15705389| gi|21726938| gi|3142686| gi|3142690| gi|1907110| gi|56789958| gi|3142689| 5O-p15_2308 gi|8778106| gi|3309635| gi|27901527| gi|10567496| gi|1907102| gi|1907103J gi |3142688| gi|166408585| 0-p15_2205 0-p7_404 gi|18076613| gi|18076614| gi|14517354| gi|4138313| gi|12406960| gi|3309634| gi|3065756| gi|4433326| gi|1907097| gi|21726934| gi|4165388| gl|19071011 gi|10567522| gi|89001390| gi|21726935| gi|21726936| gi|4433327| gi|1224102| gi|4138390| gi|1841469| gi|15705393| gi|3212001| gi|59859795| gi|453512| gi|531253| gi|2290395| gi|2290272| 100-p7_2202 gi|2290396| 100-p12_306 gi|173700| gipi9846772| 100-p8_501 gi |219846773| 0-p8_510 gi|854411| 100-p12_408 gi|19310051| gi|125858413| gi|3970887| gi|1258584111

t l 0.15 I A.. -*—y ^ c

Phylogenetic relationship between representative sequence from selected OTUso.oi and reference sequences. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method. Tree is inferred from 1000 bootstrap replicates. Units represent the number of base substitutions per site. All positions containing gaps and missing data were eliminated from the dataset (Complete deletion option). There were a total of 583 positions in the final dataset.

Annexe 3

Overview of 2005 sample characteristics

Ward's two-way clustering classification of maple samples and characteristics. Values were standardized so that the color intensity refers to variation from the mean. Sap (underlined) or syrup characteristics are presented in red to green scale covering -3 to 3 standard deviations. Letters refer to production site.

Étude du microbiote de la sève d'érable et de son impact sur la ...

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