ETUDE DES MÉCANISMES DE RÉSISTANCE DES LYMPHOCYTES T AU TGF-b EXOGÈNE AU COURS DU LUPUS ÉRYTHÉMATEUX SYSTÉMIQUE

Raja REKIK1, Monia SMITI KHANFIR2, Imen ZAMALI3, Thara LARBI4, Salwa HAMZAOUI4, Ons KAMMOUN3, Skander Mrad4,

Habib HOUMAN2, Mohamed Ridha BARBOUCHE1,Mélika BEN AHMED1, 3

1 Laboratoire de transmission, de contrôle et immunobiologie des infections, Institut Pasteur de Tunis, Tunisie2 Service de Médecine Interne, Hôpital La Rabta, Tunisie

3 Laboratoire d’Immunologie Clinique, Institut Pasteur de Tunis, Tunisie4 Service de Médecine Interne, Hôpital Mongi Slim, Tunisie

Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune systémique, affectant plusieurs organes. Elle est caractérisée cliniquement par des

atteintes surtout cutanées ,articulaires et rénales et biologiquement par la présence de plusieurs auto-anticorps en particulier les anticorps anti-nucléaires.

Il s’agit d’une maladie multifactorielle dont l’étiopathogénie n’est que partiellement élucidée. Une des hypothèses évoquées est un défaut des mécanismes

régulateurs impliquant les cytokines anti-inflammatoires, particulièrement le TGF-β.

Dans une étude précédente, nous avons suggéré l’implication d’un défaut de réponse lymphocytaire au TGF-β dans la pathogénie du LES.

L’objectif de notre présent travail est d’évaluer le caractère intrinsèque ou extrinsèque de ce défaut et de préciser les mécanismes moléculaires sous-jacents.

TGF-β ou Transforming Growth Factor-β, est une cytokine

immunosuppressive majeure responsable du maintien de l’homéostasie

immunitaire à travers notamment l’implication de la voie Smad-

dépendante. Dans notre étude, on se propose décortiquer cette voie afin

de préciser les mécanismes moléculaires responsables de ce défaut par :

1- La quantification des transcrits des gènes cibles du TGF-β par PCR en

temps réel (Figure 1A).

2- La recherche du défaut de la voie de signalisation du TGF-β à travers la

quantification des récepteurs TGF-βRII (Figure 1B) et l’analyse de

phosphorylation de Smad3 par cytométrie en flux (Figure 1C).

Lymphocytes T CD3+

Stimulation 2h avec du TGF-β 10ng/ml

Extraction d’ARN via RNAeasy

Mini Kit (Qiagen)

Real time PCR primers et sondes de Smad7 et de

TTP

Transcription inverse

ARN

Marquage membranaire

Récepteur TGF-β LT CD3+

Anti- récepteur TGF-β RIIPE

Analyse par cytométrie en flux

EVALUATION LE NIVEAU

D’EXPRESSION DES

RÉCEPTEURS TGF-β RII

LT CD3+

Marquage cytoplasmique

Perméabilisation

Stimulation avec du TGF-β de 10mn à 30mn

ANALYSE PAR CYTOMERTIE EN

FLUX

3,2% 17,2% 24,3% 10,8%

0,1% 0,2% 0,4% 0,3%

Sujet sains

Lupique en activité

La transcription de Smad7, gène cible

de TGF-β, est significativement

diminuée dans le groupe de patients

lupiques en activité (Figure 2). Cette

diminution est particulièrement

observée chez les lupiques ayant un

SLEDAI > 8.

La quantification du récepteurs TGF-βRII

nous révèle l’absence d’anomalie

d’expression de ce dernier chez les

patients lupiques par rapport aux

témoins sains (Figure 3).

Figure 2. Transcription du gène cible du TGF-β

Figure 3. Expression membranaire du récepteurs TGF- βR II

1- Quantification des transcrits des gènes cibles du TGF-β

3- Etude de phosphorylation de Smad2/3

Nos résultats montrent que les lymphocytes T issus de patients lupiques en

phase d’activité présentent un défaut de phosphorylation de Smad2/3 après

stimulation par le TGF-β (Figure 4) expliquant l’absence de translocation de

ce complexe moléculaire dans le noyau et le défaut de transcription des

gènes cibles.

Figure 4. Etude de la phosphorylation des molécules Smad 2/3 après

stimulation par le TGF-β chez un patient et un témoin sain.

Nos résultats montrent la présence d’un défaut de transcription des gènes cibles du TGF-β chez les sujets lupiques en phase d’activité confirmant le caractère

extrinsèque de l’anomalie. L’étude de la voie de signalisation du TGF-β chez les patients lupiques montrent l’absence d’une anomalie d’expression du récepteur

TGF-βRII et la présence d’un défaut de phosphorylation de Smad2/3 au cours de la transduction du signal du TGF-β. L’identification des facteurs directement

responsables de ce défaut de signalisation du TGF-β chez les sujets en phase d’activité est en cours et ce, à travers notamment l’étude de l’implication de

l’expression incontrôlée des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-15 ou l’IL-22, deux cytokines surexprimées au cours du lupus.

INTRODUCTION

MATERIELS & METHODES RESULTATS & DISCUSSION

CONCLUSION & PERSPECTIVES

Dans la présente étude nous avons prélevé le sang périphérique de 30

patients lupiques et 29 témoins indemnes de toute maladie auto-immune, à

partir duquel nous avons isolé les lymphocytes T.

A

B

C

Figure 1. Méthodes d’étude de la signalisation du TGF-β

2- Quantification du récepteur TGF-βRII