Etude de l'adaptation des organismes Etude de l'adaptation des organismes marins en environnement variablemarins en environnement variable

Arnaud Tanguy, Didier Jollivet

Station Biologique de Roscoff, UMR CNRS 7144, Adaptation et Diversité en Milieu Marin, Equipe Ecologie et Génétique des Populations Marines

Mécanismes physiologiques et génétiques de la réponse Mécanismes physiologiques et génétiques de la réponse aux stress chez l’huître creuse aux stress chez l’huître creuse Crassostrea gigasCrassostrea gigas

Dario Moraga, Marie Thérèse Thébault, Philippe Soudant Christophe Lambert

Laboratoire des Sciences de l’Environnement Marin (LEMAR)Institut Universitaire Européen de la Mer (IUEM) UMR CNRS 6539, Université de Bretagne Occidentale 29280 Plouzané.

Equipe 3 de l’UMR 6539Réponses des organismes et des populations à la variabilité environnementaleThème 2 Réponses aux stress et adaptation

…

MoléculeGène Cellule

OrganismeIndividu

PopulationGroupes fonctionnels

CommunautésPeuplements

Expression de gèneGénotoxicité

Protéines de stress

CroissanceReproduction

PolymorphismeDynamique de

population

Abondance et diversité spécifiques, écologie

Réponse au stress

Différents niveaux d’intégration et d’étude de la réponse des organismes face au stress

Signification ECOLOGIQUE

Signification TOXICOLOGIQUE

Approche génétique intégrée de la réponse au stress

Sélection / Adaptation ?

Paramètres biologiques (Fécondité,

génotoxicité, etc.)

Intégration des réponses:corrélation phénotypes / génotypes

au niveau populationnel

Analyse de l’expression des

gènes

Analyse du polymorphisme des

gènes candidats

Recherche de gènes candidats en réponse au stress environnementaux

Approche génétique intégrée de la réponse au stress

Les sources de stress oxydatif

Caractéristiques des fluides

Température élevée (300-350°C)

Acides (pH 2.5 à pH 4.5)

Métaux (Fe, Zn, Cu…)

Gaz dissous (H2S, H2, CO2, CH4)

Anoxie

Radiations ionisantes

Gradients abrupts

Température

Concentrations en oxygène

Concentrations en composés réduits

(H2S, H2, CO2, CH4)

Milieu hydrothermal

Milieu côtier

Polluants anthropiques

Température

Eutrophisation (MO)

État actuel des connaissances sur le stress oxydatif chez les mollusques marins

Très nombreuses études en écotoxicologie utilisant essentiellement

- les mesures d’activités d’enzymes anti-oxydantes (SOD, catalases, …)

- le dosage des ROS et du GSH comme biomarqueurs de stress

Peu d’études au niveau moléculaire (absence d’organisme modèle, peu d’outils moléculaires relatifs au stress oxydant)

Les modèles biologiques étudiés

Mollusques

Annélides

Bathymodiolus azoricus Mytilus edulis Crassostrea gigas

Alvinella pompejana

Paralvinella grasslei

Paralvinella sulfincola

Approches moléculaires employées:transcriptomie différentielle

Approche spécifiqueBanques SSH

Approches globales:Banque cDNA

ARNm

Control samples

Stressed samples

Substraction of common genes

Up-regulated genes

Down-regulated genes

tissues

ARNm ARNm

• Métaux lourds• Pesticides• Hydrocarbures• Salinité• Température• Hypoxie• Infections bactériennes

Tous convergent vers une production de radicaux libres

Infectionspathologies

xénobiotiqueshypoxie

Stress abiotiques

XR

n

a

y

Identification des différentes voies de régulation et de

détoxication du stress oxydatif

Analyses des profils transcriptomiques: recherche des gènes communs ou spécifiques de

plusieurs stress

Modèle Crassostrea gigas

Approches moléculaires employées:transcriptomie différentielle

Gènes sur-exprimés (24 jours)Cytoskeleton, structure, matrix

Respiratory chain

Nucleic acids regulation

DetoxificationAmino acids metabolism

Energetic metabolism

Protein regulation

Cellular communication, immune system,

receptor

Stress protein

Reproduction

Lipids metabolismDevelopment, differenciation

Ribosomal protein

Unknown functions

ESTs

Cytochromes P4501A1SODHSP70Gluthatione peroxydaseGlutamine synthetaseDelta-9-desaturaseArginine kinaseGlycogen phosphorylaseAnhydrase carbonique

BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de l’hypoxie

Gènes inhibés (24 jours)

Gènes inhibés (7-10 jours)

Gènes sur-exprimés (7-10 jours)

Temps d’exposition (jours)

Expre

ssio

n r

ela

tive

Metallothionein 4

Protéine de stressProtection cellulaire

Fonction anti-oxydanteManteau

Delta-9 désaturase

Peroxiredoxine 6

0

1

2

3

0 3 7 10 14 17 21 24

*

*

**

*

0

1

2

3

0 3 7 10 14 17 21 24

0

2

4

6

8

0 3 7 10 14 17 21 24

*

*

*

*

* **

*

*

Métabolisme lipidique: maintien de la structure

membranaire

Enzyme antioxydant

Manteau

Glande digestive

BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de l’hypoxie

hypoxienormoxie

* Forte variabilité inter-individuelle de l’expression des gènes

•Expression tissu-specifique

* Expression régulée au cours du temps

Phase IOxydation par les monooxygénases

Récepteurs

Phase IIConjugaison à des

composés endogènesD

om

mag

es

AD

N

Phase IIIElimination active

métabolites hydrosolubles

H

Hydrocarbures (H)

métabolites réactifs

BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures

déto

xica

tion

des

hydr

ocar

bure

s

régu

latio

n de

s lip

ides

prot

éine

s de

stre

sscy

tosq

uele

tte

chai

ne re

spira

toire

régu

latio

n de

s ac

ides

nucl

éiqu

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gula

tion

des

prot

éine

s

com

mun

icat

ion

cellu

laire

mét

abol

ism

e én

ergé

tique

prot

éine

s rib

osom

ales

EST

induit 7 joursinhibé 7 jours

induit 21 joursinhibé 21 jours0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50258 gènes

potentiellement régulés par les hydrocarbures *

10 gènes codant pour des enzymes impliquées dans

la biotransformation

Cytochromes P4501A1 et 3A4Cytochrome b5

Monoamine oxidase A (MAO A)Monooxygenase à flavine 2 (FMO-2)4 Glutathione S-transferases (GST)Sulfotransferase 1C1

BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures

0.2 kb

M 0 3 7 11 15 21 jours

T0 7 15 21

T0 7 15 21

CYP1A1

Phase I

Induction

*

**

jours

jours

GST pi

GST sigma

GST omega

GST mu

T0 7 15 21

Phase II

RT-PCR Multiplex

jours

Induction des GSTs mu et omegaInhibition de la GST sigma

BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures

Hémoglobines

0

1

10

100

1000

20° C Branchie 15°C Branchie 20° C Corps 15°C Corps

exp

ress

ion

HemL3Hem B1

  Hem IC Hem A2C

Gènes du stress oxydant

0

1

10

100

1000

20°C Branchie 15° C Branchie 20°C Corps 15°C Corps

Temperature - Tissue

exp

ress

ion

PRXSOD GST Sigma

Gène du métabolisme mitochondrial

0

1

10

100

1000

20°C Branchie 15°C Branchie 20°C Corps 15°C Corps

Temperature-Tissue

exp

ress

ion

MDH

AAT

Succinate

Aconitase

Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant

À 15°C Sur expression: Hem IC (Intracellulaire)

A 20°C sur expression: Hem L3 (Linker)Hem B1 (Extracellulaire)

À 15°C: sur expressionBranchie: MDH, AAT, SDHCorps: Aconitase

À 15°C: sur expressionBranchie-manteau: GST sigmaBranchie: PRX, SOD

Réduction de la disponibilité d’O2

HémoglobinesExtracellulaires

B1 et A2CCapture et

transport d’O2

PO2

HémoglobinesIntracellulaires

ICRéservoir d’O2

LinkerL3

Structure HbProtection

contre le ROS

Augmentation de Température

SOD ?Transfert Bidirectionnel ?

20° C

15° C

20° C

Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant

Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant

Augmentation de la Température 20°C

Stress Oxydatif

Altération de la stabilité membranaire

(peroxydation lipidique)

SODGSTPRX

ROSRHS

Enzymes de protection

AconitaseAAT

MDH

Protéines métaboliques

Métabolisme anaérobie?

Alvinella pompejana sequencing project

4,000 contigs9,000 singlets

Annotated; 95%

No annotation5%

160%

2 and more8%

No Pfam-A32%

With definition87%

No definition13%

With EC74%

No EC26%

With GeneOntology

86%

No GeneOntology

14%

6,600 with homolog proteins (51%)

blastX49% with no homologs !!!(long ORFs with biased composition)

Banques cDNA construites en 2005-2007:

ESTs (cDNA libraries):

* 9000 unigenes chez Crassostrea gigas* 3500 unigenes chez Mytilus galloprovincialis* 1800 unigenes chez Ruditapes decussatus* 2500 unigenes chez Bathymodiolus azoricus

* 2000 unigenes chez Paralvinella grasslei* 9000 unigenes on Alvinella pompejana* 300 unigenes on Lepetodrillus elevatus

Puce ADN disponibles ou en construction :

* « gigas » micro-array (1500 spots) dédiée au stress: utilisée pour des analyses comparatives en milieu anthropisé.

* « gigas » micro-array (9000 spots) C. gigas: collaboration avec le Marine Genomics Europe Program and Aquafirst (IFREMER-INRA)

* Autres microarrays: en construction : moules, palourdes, annélides

Marine GenomicEurope Network

Alvinella Consortium

Projets de recherche en coursTranscriptomie comparée

Temps

[Gène X]PCR quantitative

Catalogues de gènes régulés au cours des processus de réponse aux stress (biotiques, abiotiques, anthropiques,…) mais aussi liés aux

différents stades de développement

Développement de micro-array

Intensité du stresset/ou

Etude qualitative et quantitative des régulations

BIOLOGIE FONCTIONNELLE

TRANSCRIPTOMIE:Régulation de

l’expression des gènes PHYSIOLOGIE:* activité d ’enzymes régulées

par le stress

* Couplagesgénotype/phénotype

(polymorphisme d’expression ou de séquence)

* croissance* fitness* détoxication

Etude des convergences des réponses au stress sur une échelle évolutive

Gradient et nature du stress oxydant

Projets de recherche en cours

Projets de recherche en cours

TRANSCRIPTOMIE:Régulation de l’expression des gènes

Identification des différentes voies de régulation et de

détoxication du stress oxydatif

Comparaison inter-espèce(taxons) et/ou inter-stress des profils

transcriptomiques: recherche de signatures de régulation communes

ou spécifiques

Stress DEspèce 4

Stress BEspèce 2Stress A

Espèce 1

Espèce 3

X w

n

a

Stress C

Gène A

Gène D

Gène J

Gène E

Gène K

Gène G

Gène H

Gène F

Gène C

Gène L

Gène I

Gène BEtude des co-régulations

entre gènes

Identification de network de gènes =

Signatures moléculaires de réponse au stress

Projets de recherche en cours

TRANSCRIPTOMIE:Régulation de l’expression des gènes

Relation génotype-expression de gènes.

Ex de Bathymodiolus

PGM bas

6

6,5

7

7,5

8

8,5

100/100 100/95+95/95 105/100 + 105/105+105/95

del

ta C

t H

SP

70

PGM haut

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

100/100 100/90+90/90

110/100+110/90

100/86+110/86

delta

Ct

HS

P70

Relation entre génotypes allozymiques et expression des ARNm

Analyse canonique de redondance: mise en évidence de relation entre

le génotype allozymique, l’expression des ARNm, le niveau de protéines de

stress (?) et le temps (d’exposition et de récupération).

HSP70

Ferritine GF2a, yolk, GF2b / MDH haut et bas ; ferritine GF1 / LAP GPI ;

anhydrase carbonique / MDH haut GPI ; MT / PGM haut

Projets de recherche en cours

* Couplages génotype/phénotype(polymorphisme d’expression ou de séquence)

Projets de recherche en cours

Expression et polymorphisme des

gènes Activité protéique

variant1 Variant 2

Transformation dans E.coli BL21DE3

Culture en milieu liquide en présence de gammes

de stress

DO

Temps

Activation de MT15 ’UTR

1er cas: présence de faibles concentrations en métaux

- 60pb- 90pbMT1

MBF

5 ’UTR

- 170pbMT2

Activation de MT15 ’UTR

2ième cas: présence de fortes concentrations en métaux

- 60pb- 90pbMT1

MBF

5 ’UTR

- 170pbMT2 Activation de MT2

1: TTT GGG GTC AAG2: TTT GGG CCC AAG

Dans quel cadre ?

* OUEST-genopole® (projet fédérateur Mer-Agro-Santé): Génome, adaptation et environnement. Projet 5: Réponse au stress oxydatif chez l’huître Crassostrea gigas en environnement variable : expression et activité d’enzymes antioxydantes

* ANR Genanimal (Cgphysiogen) CNRS IFREMER UniversitésBases moléculaires des fonctions physiologiques chez Crassostrea gigas : interaction hôte/pathogène/environnement

* Programme Européen « Marine Genomics Europe »Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins.

* Coopération franco-chilienne et franco-canadienne

Dans quel cadre ?

* PRIR « AMETHYST » (2005-2007) : Adaptation Multigénique et Evolution des Taxons HYdrothermaux aux conditions ‘extrêmes’ de température et d’anoxie : recherche de Signatures moléculaires convergentes au niveau du Transcriptome

* Programme GIS « Alvinella » (2005-2008) Etude de l’adaptation des Alvinellides aux conditions de stress thermique et oxydatif de l’environnement hydrothermal profond

* Programme Européen « Marine Genomics Europe »:Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins: comparatif hydrothermal-côtier.