Elodie Laine
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Analyse de l’Activation du Facteur Oedémateux de Bacillus anthracis par la Calmoduline, en vue de la Recherche d’Inhibiteurs
Elodie Laine
Dr. Thérèse MalliavinDr. Arnaud BlondelEcole doctorale iVIV, Université Pierre et Marie CurieUnité de Bioinformatique Structurale, Institut Pasteur (M. Nilges)
2
La bactérie Gram+ Bacillus anthracis est l’agent pathogène du charbon (anthrax).
3 formes de contamination cutanée (plaie) intestinale (ingestion) pulmonaire (inhalation)
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Contexte biologique
B. anthracis a la particularité de former des spores très résistantes, qui se propagent facilement dans l’air et dans l’eau (risque bioterroriste).
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Liddington et al. 2002
3Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
La virulence de B. anthracis est associée à :1 capsule + 2 toxines (PA-EF/LF)
Facteur oedémateux
Activationpar CaM
Productiond’AMPc
Translocation
PA : antigène protecteur LF : facteur létal EF : facteur oedémateux
4Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Le complexe EF-CaM
EF CaM EF-CaM+
Drum et al. 2002 (1K8T) Drum et al. 2002 (1K93)
Calmoduline Senseur du calcium 148 résidus, très flexible 2 lobes + 1 linker central
N-CaM
C-CaM
S1S2
S3
S4
5Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Architecture du complexe
Hel N-CaM
C-CaM
SC
SB
SACA
CB
6Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Questions biologiques :
Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM rôle des ions calcium mécanismes de l’interaction protéique organisation du réseau de résidus
Mobilité structurale de la protéine EF large transition conformationnelle relation avec la fonction enzymatique recherche rationnelle d’inhibiteurs de la toxine
Méthodes :Simulations de dynamique moléculaireDétermination de chemin de réactionCriblage virtuel & validation expérimentale
Problématiques
7
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium
II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques
III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Plan
8Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Plan
I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium
II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques
III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques
9
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Influence du calcium
S2 S1
S4 S3
Drum et al. 2002 (1K93)
Ulmer et al. 2003
Le niveau de calcium influence la stabilité, voire la formation, du complexe EF-CaM.
Affinité de la calmoduline pour le calcium
N-CaM
C-CaM
10Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
1k93-0Ca
Superposition de 4Ca-CaM + phase d’équilibration sous contraintes
0Ca 2Ca 4CaNombre de contre-ions 13 9 5
Dimensions de la boîte d’eau (Ǻ3) 123.9 x 81.9 x 99.2
Nombre de molécules d’eau (TIP3P) 24 632 24 642 24 652
Nombre total d’atomes 83 851 83 879 83 907
champ de force AMBER (ff99), thermostat de Berendsen, PME
Simulations de dynamique moléculaire (DM) - 15 ns
Simulations DM
1k93-2Ca 1k93-4Ca
11Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Analyse de convergence - méthodeLyman & Zuckerman 2006
Sur l’ensemble de la trajectoire 1) conformation tirée au hasard 2) retrait des conformations à
moins de r = 2.5 Å
structures de référence
Sur chaque moitié de trajectoireChaque conformation est associéeà la structure de référence la plus proche
groupes de référence
9001-150003001-9000
1ere moitié 2eme moitié
12
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Dérive conformationnelle
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Déviation par rapport à la structure initiale
Population des groupes de référence
La trajectoire 1k93-2Ca présente la plus petite dérive conformationnelle et un bon critère de convergence.
13
Plasticité de CaMAnalyse en composantes principales (ACP) des mouvements de CaM le long des trajectoires
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
14Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
+ Ca2+
Les mouvements de CaM sont plus collectifs et plus indépendants avec 0 ou 4 Ca2+. CaM agit comme un ressort qui maintient EF en conformation ouverte active.
Plasticité de CaM
- Ca2+
Mode ACP de plus forte amplitude
1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca
15Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Chattopadyaya et al. 1992Zhang et al. 1995
motif EF-hand
La calmoduline et le calciumPatchs hydophobes
Chatt. et al. 1992
Meador et al.1992
fermé ouvert
16
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Coordination du calcium par CaM
N-CaM C-CaMS1 S2 S3 S4
1k93-0Ca - - - -1k93-2Ca - - 5.7 5.61k93-4Ca 3.1 4.5 5.6 5.7
Nombre moyen d’atomes d’oxygène coordonnant les ions calcium
La coordination des ions calcium est incomplète dans N-CaM.
Asp 3
Asp 1
Asn 5
Tyr 7
Glu 12
Site canonique
(distance à l’ion Ca2+ < 2.8 Å)
17
N-CaM
S1 (°) S2 (°)
1k93-0Ca 33.4 ± 3.9 62.6 ± 6.5
1k93-2Ca 41.2 ± 2.3 60.2 ± 7.3
1k93-4Ca 43.7 ± 7.2 75.7 ± 7.7
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Changements conformationnels de CaM
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Ouverture des motifs EF-hands
θ
L’interaction avec EF requiert que C-CaM soit ouvert, chargé de calcium, et bloque N-CaM en conformation fermée.
θ
C-CaM
S3 (°) S4 (°)
1k93-0Ca 79.8 ± 3.8 94.8 ± 4.3
1k93-2Ca 74.4 ± 3.4 98.3 ± 3.8
1k93-4Ca 80.4 ± 2.7 101.0 ± 4.6
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
1K93 1XFX
Drum et al. 2002 Shen et al. 2005
(EF)Hel
S1
S2
Structures cristallographiques
(CaM)
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 18
(EF)Hel
(CaM)
S1S2
19
Changements conformationnels de CaMIntroduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Ouverture des motifs EF-hands
Mise en évidence d’une influence du réseau d’interactions entre EF et N-CaM sur l’ouverture des sites de fixation au calcium.
θ
θ
N-CaM
S1 (°) S2 (°)
1k93-0Ca 33.4 ± 3.9 62.6 ± 6.5
1k93-2Ca 41.2 ± 2.3 60.2 ± 7.3
1k93-4Ca 43.7 ± 7.2 75.7 ± 7.7
1xfx-4Ca 36.7 ± 4.1 55.3 ± 4.5
C-CaM
S3 (°) S4 (°)
1k93-0Ca 79.8 ± 3.8 94.8 ± 4.3
1k93-2Ca 74.4 ± 3.4 98.3 ± 3.8
1k93-4Ca 80.4 ± 2.7 101.0 ± 4.6
1xfx-4Ca 79.3 ± 2.9 95.4 ± 2.8
20Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Glu 12
Glu 12
Asn 5
Asp 3
Asn 5
Distances au calcium dans les sites
EF contraint directement S1 dans les deux systèmes 1k93 et 1xfx. Le réseau plus dense d’interactions entre EF et N-CaM dans 1xfx contraint indirectement S2.
S1 S2
21
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion P : pas de dissociationC : dissociation commençanteD : dissociationLeandro Martinez
«Locally enhanced sampling» : augmenter la probabilité de dissociation du calcium en utilisant plusieurs copies de l’ion.
Simulations LES
- CHARMM version 33b2 (200ps)- potentiel ligand-protéine réduit- fonction sigmoïdale diélectrique
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Copies1248
161820222426283032
S1PPPPCCC
4D7D
17D17D29D32D
S2PPPPPPCCC
1D4D8D
19D
S1PPPPCCCC
6D16D9D
22D32D
S2PPPPPPCCC
10D6D
29D32D
1k93 1xfx
22
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations
b. Plasticité de CaM
c. Affinitéde CaM pour le calcium
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Calculs d’énergie libreCycle thermodynamique de disparition du calcium
1xfx 1xfx
1k93 1k93
∆Gdiss(Ca2+/1xfx)
∆Gdiss(Ca2+/1k93)
Intégration thermodynamique
(application d’une contrainte harmonique sur l’ion Ca2+)
1k93 ∆G (kcal/mol)
S1 318.43 ± 0.54
S2 323.28 ± 0.67
+
+
23
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Conclusion
Stabilité de la forme EF-(2Ca-CaM) en accord avec les données expérimentales
Modèle de l’interaction EF-CaM exemple d’une conformation inhabituelle de CaM
Influence mutuelle EF-CaM / Ca2+-CaM modulation par EF de l’affinité de CaM pour le calcium
Données quantitatives de l’affinité de CaM pour le calciumcalculs d’énergie libre (FEP, TI)
24
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Plan
I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium
II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques
III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques
25
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Architecture du complexe
Hel N-CaM
C-CaM
SC
SB
SACA
CB
26Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Bahar et al. (1997), Fold. Des.
Modèle de réseau élastiqueRéseau élastique
Simulations DM (Pearson)
La méthode ENM prédit correctement les fluctuations thermiques (0.90 < R² < 0.99), mais ne permet pas de distinguer les différents niveaux de calcium.
Les Cα distants de moins de 9 Ǻ sont connectés par des ressorts.
Lindahl et al. (2006),Nucl. Acids Res.
27
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Corrélations dynamiques - méthodeLange & Grubmüller (2006), Proteins
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Coefficient de corrélation généralisée
Information mutuelle
Entropie de Shannon
Corrélations généralisées
Corrélations de Pearson
- mesure moins biaisée - rend compte des corrélations non linéaires
Classification hiérarchique
28
fortement corrélés (> 0.7)
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Corrélations dynamiquesFluctuations atomiques et groupes de résidus
100
non corrélés (< 0.5)moyennement corrélés (0.6 - 0.7)
1k93-0Ca
1k93-2Ca
1k93-4Ca
29
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
CB
CA
SASC
Hel
C
N
Définition de pseudo-domaines
Les corrélations LFA permettent de redéfinir des pseudo-domaines.
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Corrélations résiduelles de la méthode LFA
30
Srinivasan et al. (1998), J. Am. Chem. Soc.
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Influences énergétiques - méthode
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Méthode MMPBSA
Mécanique moléculaire Eint + Evdw + Eele
Interactions polaires de solvatation
Poisson - Boltzmann
Interactions non polairesde solvatation
Surface Accessible
Entropie conformationnelleModes Normaux
31
Hamacher et al. (2006), PloS Comput. Biol.
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Si Rang-Y (X') moins bon que Rangref(X'), alors Y influence la stabilité de X' au sein du complexe. (intensité = nb de rangs perdus)
Influences énergétiques - méthode
Rang de réference Rangref
Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X au reste du complexe.
Rang relatif Rang-Y
Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X‘ au complexe amputé du domaine Y.
Cartes de dépendances énergétiques
CACBSASCHelNCaMCCaM
Rangref
6723541
Rang-Hel
4613-52
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Influences énergétiques
1k93-0Ca
1k93-2Ca
1k93-4Ca
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Hiérarchie relative de stabilité des domaines au sein du complexe
1k93-2Ca : centrées, équilibrées1k93-0Ca : perte d’influences1k93-4Ca : plus diffuses
*
**
*
*
**
*
32
33Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique
b. Corrélationsdynamiques
c. Influences énergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
La stabilité du complexe dépend de la connexité du réseau de résidus.
Connexité du réseau de résidus1k93-2Ca1k93-0Ca 1k93-4Ca
Influences énergétiques & corrélations dynamiques
*
*
*
*
*
**
*
34Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
ConclusionIntroduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Architecture globale du complexemodèle de réseau élastique
Dynamique globale et localegroupes de résidus et domaines dynamiques
Connexité du réseau de résiduspropagation de l’information
Tests des modèles par l’expérienceprotéolyse, fluorescence, mutations
35
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Plan
I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium
II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques
III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques
36
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Transition conformationnelle de EFTranslation de 15 ÅRotation de 30°
Boucle SB désordonnée
Drum et al. 2002 (1K8T et 1K93)
Détermination de chemin de réaction
37Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Chemin : série de conformations qui ne sont séparées par aucune barrière énergétique.
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Chemin d’activation de EF - méthode
Fischer & Karplus (1992),Chem. Phys. Lett.
Arnaud Blondel
Cycle d’affinement : (i) réduction du nombre de conformations (ii) échantillonnage entre des paires de conformations, avec l’algorithme «Conjugate Peak Refinement» (CPR).
Premier jet : Simulations DM orientées
38Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Chemin de transition
39Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Analyse des mouvements de EF
Le chemin de transition de EF permet d’explorer des régions de l’espace conformationnel non atteignables par les simulations du complexe EF-CaM.
Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de EF le long du chemin
40Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemind’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Lee et al. (2004)Chem Biol.
Site catalytique933 Å3
122 Å3
223 Å3
SABC450 Ǻ3
102 Å3
Identification de la poche
ICM PocketFinder – Trotov & Abagyan (2004), Genome Inform.
Recherche systématique de poches
41Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
conf 1
conf 8
conf 28conf 47
Switch C
Switch B
Switch A
Identification de la poche
Stratégie : Sélectionner des molécules capables de se fixer sur la poche SABC dans la forme inactive de EF et de maintenir sa forme, bloquant ainsi l’activation.
42
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Abagyan et al. (1994), J. Comput. Chem.
Placement dufragment de base
Outils de criblage virtuel
FlexX
ICM
Rarey et al. (1996), J. Mol. Biol.
Configurationinitiale Rotation/Translation
aléatoire
E1 < E0 E0 E2 > E0
Rotation/Translationaléatoire
Application du critère de Metropolis
Reconstructionincrémentale
43
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Approche in silico / in vitro
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Criblage Virtuel Validation expérimentale
Chimiothèque Nationale 28 000 mol.
1. Elagage S < m -
3500 mol.meilleur 1%
Conformations intermédiaires comme contrôles négatifs.
Sélection des meilleurs ligands.
Tests enzymatiques
18 composés testés
30% inhibent totalement l’activité de EF à des concentrations de 10-100 µM.
44
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
CyaA
Inhibiteurs del’activité de EF(Ki ~ 2-3 µM)
activité enzymatique (1)
activité enzymatique (2)
Tests enzymatiques
Christophe Goncalves, Johanna KarstDaniel Ladant
EF
CaM
+ I
ATP
EF CaM+I ATP
FCH3-O
diClHBrCl
++++++
--+---
+++-++
(1) (2)
45
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Inhibition de CyaA
Boucle SC / queue C-term
Boucle SB /Boucle T300-K312
Boucle SA /Hélices F-G-H-H’
Comparaison des structures de EF et CyaA
Guo et al. 2005
SABC de EF : 16 résidus6 identiques, 5 similaires chez CyaA
46
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation
b. Identificationde la poche
c. Criblage virtuel et tests
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Inhibition de EF-CaMAnalyse des poches à la surface de EF le long des trajectoires DM du complexe EF-CaM
Poche résiduelle104-326 Å3
Site catalytique
47
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Conclusion
Modélisation d’une transition complexeconformations intermédiaires plausibles
Définition d’un site de liaison potentielstratégie innovante : cibler une poche allostérique
Identification d’inhibiteursnouvelle famille de composés, affinités de quelques µM
Caractérisation du mode de liaison des composésrésolution d’une structure co-cristallisée
48
Introduction
I. Stabilité del’interactionEF-CaM
II. Aspectsdynamiquesénergétiques
III. Recherched’inhibiteurs
Conclusion
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
Conclusion générale et perspectives Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM modèle de l’interaction EF-CaM influence mutuelle entre les interactions EF-CaM et Ca2+-CaM modèle de l’effet du calcium sur le réseau de résidus
Mobilité structurale de la protéine EF chemin plausible de transition conformationnelle modulation de l’activité enzymatique par effet allostérique identification d’une nouvelle famille d’inhibiteurs
Extrapolation à la toxine CyaA de B. pertussis caractéristiques différentes de EF mécanismes de l’activation par CaM déterminants de l’affinité des inhibiteurs
49Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
RemerciementsBenjamin BardiauxGiacomo Bastianelli
Aymeric BernardRenée Communal
Pak-Lee ChauClaire Colas
Nathalie DuclertJulia FormanDavid Giganti
Christophe GoncalvesTru Huynh
Leandro Martínez (Brésil)Olivier PerinEdithe Selwa
Edouard YeramianArnaud Blondel
Thérèse MalliavinMichael Nilges
Unité Biochimie des Interactions MacromoléculairesAlexandre Chenal
Johanna KarstDaniel Ladant
University of ChicagoWei-Jen Tang
CERMNAurélien Lesnard
Sylvain Rault
Claire DaneGilles Vergnaud
B I
S
Universidade Federal FluminenseJulliane Yoneda
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50
Equilibration 1k93-4CaDistances de coordination du calcium dans S1 et S2
* : contraintes de distance de 10 kcal/mol/Å2
51
Plasticité de EF
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Modes (1 et 2) PCA de EF
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52
Changements conformationnels de CaMExposition des patches hydrophobes
C CC
C
NNNN
C
C
N
N
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53
Réseau d’interactions EF-(N-CaM)
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
54
Matrice de Kirchhoff Fluctuations prédites
Réseau élastique et corrélation
Similarités entre matrices de corrélations
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55
Classification hiérarchique
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56
Corrélations généralisées - classificationClassification hiérarchique des résidus en fonction de leurs corrélations généralisées
57
Zhang & Wriggers (2006), Proteins
Dynamique locale - méthode
Analyse locale des traits caractéristiques
(LFA)
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Analyse en composantes principales
(ACP)
Information par mode(globale)
Réduction de dimensionalité(15 modes = 81-84 % fluct.)
Information par degré de liberté (locale)
Réduction de dimensionalité ?algorithme de clairsemage
Le formalisme LFA permet d’identifier des résidus « graines », autour desquels s’articulent des domaines dynamiques locaux.
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Dynamique locale Polarisation du site catalytique autour de deux spots.
Propagation du signal calcium le long de CaM.
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Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
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Test de Kolmogorov-Smirnov Test non paramétrique : pas d’hypothèse sur la nature des données
Tester si deux échantillons sont issus de la même distribution
H0 : les deux échantillons proviennent d’une même distributionH1 : les deux échantillons proviennent de distribution différentes
P-value = probabilité d’observer les échantillons sous l’hypothèse nulle.
Principe : comparaison des fonctions de répartition empiriques
F(x) = P(X<x) = 1/n ∑ δxi<x
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Contributions MMPBSAEnergies libres de liaison de référence 1k93-2Ca
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Contributions MMPBSADifférences d’énergies libres de liaison
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Caractéristiques du chemin
Historique de l’affinement Chemin final
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Similarités de formes – ROCS
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64
Structural interaction fingerprints
Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009
65
Robustesse de la poche