ECUE Méthodologie de la Génétique Moléculaire

Mise en évidence et cribles basés sur des interactions protéiques

Cribles basés sur des critères d’expression différentielle

Mutagenèse insertionelle chez la drosophiletransgenèseVecteursMutagenèsePerte et gain de fonction

Cours sur le FRET Maïté Coppey : 12/10

Cours sur la PCR quantitativeThierry Grange19/10

TD : Claire Darzac

TD : Sandrine Caburet

TD : Alain Zider

Mise en évidence d’interactions protéiques par des méthodes biochimiques

Test d’interaction GSTCo-immunoprécipitation

Cribles permettant d’identifier des partenaires protéiquesCriblage d’une banque d’expression dans lambda GT11Clonage de molécules de surface par expression transitoireLe système double hybrideLe phage display

Protéomique et interaction protéique

GST X

plac

Culture de bactéries

Extraction protéique

Lysat bactérien

Analyse sur gel SDS page

M• marquage métabolique• produit de transcription traduction

rinçages

GST X

plac

Culture de bactéries

Extraction protéique

GST

plac

rinçages

Analyse sur gel SDS PAGE

M

X

Y

Ig

Mise en évidence Y•Coloration à l’argent•Anticorps anti Y•Marquage métabolique methionine35S•Cartographie peptidique par spectrométrie de masse

Co-immunoprécipitation

Extrait cellulaire

Anticorps anti X

Protéine A sépharoseDénaturation et analyse sur gel SDS page

Criblage d’une banque d’expression dans GT11

Criblage d’une banque d’expression dans GT11

banque de cDNAconstruite dans un vecteur d’expression eucaryote

Cellulescos

Expression transitoire

Incubation avec un premier anticorps isolement de l’ADN épisomal

Transfection dans des bactéries

Analyse des cDNA (séquençage)

étalement

Lex op

LexA

Gal4 AD

LacZ

DLA Apat PolyAProm.

ampiciline

trp2µOri coli

LexADLA gal4

DAT Proie PolyAProm.

ampiciline

leu2µOri coli

DAT Gal4VP16B42

Rapporteur PolyA

ampiciline

His2µOri coli

lacZmet

DLA

Apat

DAT

Proie

stratégie de contre sélection

5’ fluoroorotic acid

5’ fluorodexoxyuridine Thymidilate synthase

DNA synthesis

Mise en évidence d’une interaction Protéine ARN

(phage MS2)

Apat

ARN phage MS2

Transformation dans E.Coli (sup ambre)

Phage rescue

purification des phages et passage sur colonne d'affinité

Ré-infection de bactéries et isolement des plasmides

rinçages

élution

Co-Immunoprécipitation

RNA biotinylés Spliceosome humain

Analyse en gel bidimensionnel Identification parSpectrométrie de masse

Isolement du cDNA correspondant

Expression d’une protéine chimère 41-GFP

41-GFPAnti corps anti -U1-snRNP

Transfection dans des celllules HeLa