Développement par génie tissulaire d'un modèle d'étude in ...

KRISTINE CUFFLEY

DÉVELOPPEMENT PAR GÉNIE TISSULAIRE D 'UN MODÈLE D'ÉTUDE IN VITRO DES VOIES DE SIGNALISATION DES CELLULES SOUCHES DU FOLLICULE

PILEUX

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

F ACUL TÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LA VAL

QUÉBEC

2005

© Kristine Cuffley, 2005

RÉSUMÉ

Au LOEX, un modèle de folliculogénèse a été caractérisé. Ce modèle consiste à

incorporer des follicules pileux immatures de souris dans les peaux reconstruites par génie

tissulaire. À l'aide des peaux reconstruites, nous avons comparé l'influence des cellules

dermiques sur la différenciation des cellules souches des follicules pileux. La maturation in

vitro des follicules pileux immatures sur les fibroblastes murins et humains a mené à

l'apparition d'inclusions intradermiques. Cependant, les études de caractérisation ont révélé

la présence de marqueurs de différenciation épidermique dans les kystes dérivants des

follicules pileux immatures cultivés sur fibroblastes humains, contrairement à ceux cultivés

sur fibroblastes murins. Ces derniers ont plutôt des caractéristiques histologiques qui

ressemblent davantage aux cellules retrouvées au niveau de la gaine folliculaire externe du

follicule pileux. Un dérèglement de la voie de signalisation Wnt pourrait expliquer ces

phénomènes, puisque la p-caténine et le facteur Lef-l ne sont pas activés dans ces peaux

reconstruites.

II ©Kri tine Cuffley LOEX

AVANT-PROPOS

Tout d ' abord, j ' aimerais remerCIer le Dr. Lucie Germain de m ' avoir donné

l ' opportunité de travailler au LOEX. Cette expérience très enrichissante m ' a permis d 'élargir

mes connaissances en milieu de laboratoire.

Puis, un merci tout particulier à Danielle Larouche, qui m ' a fait confiance en me

permettant de travailler sur une étude connexe à son projet de thèse, qui fut un projet de

recherche très intéressant et stimulant. Merci Danielle pour les nombreux conseils, le partage

de tes connaissances dans ce domaine qui était pour moi inconnu, et un énorme merci pour

m ' avoir si bien orienté tout au long de ma maîtrise. Mon cheminement personnel n ' aurait pas

été le même sans ton aide et supervision.

Également, je tiens à remercier Israël Martel et Claudia Fugère pour leurs assistances

et leurs bons conseils techniques. Ils n'ont jamais hésité à m'aider et à me consacrer de leur

temps. Merci à Claudie Paquet qui m'a donné d'excellents conseils et Anne-Marie Moisan

pour son aide avec les animaux.

Finalement, je remercie toute l'équipe du LOEX pour le support, tant moral que

technique, que vous m ' avez donné. Merci d ' avoir répondu à toutes mes questions avec

patience et toujours avec un sourire.

III © Kristine Cuftley LOEX

T ABLES DES MATIÈRES

Résumé .................................................................................................................................... II

Avant-propos .......................................................................................................................... III

Tables des matières ................................................................................................................ I V

Listes des figures et tableaux................................................................................................. VI

Liste des abréviations ............................................................................................................ VII Chapitre 1 Introduction générale ................................................................ 1

1.1 La peau ..................................................................................................................... 2 1.1.1 L'épiderme ......... ... .... ... .... ... .... ... ... ....... .............. ... ... ....................... ..... ..... .. . 3

1.1.1.1 Les kératinocytes ......... ............................................................ ... ... .. .. ...... .... 3 1.1.1.1.1 La couche basale ........... .. ........... ......... ......................... .... .. .... ....... ... ..... 4 1.1.1.1.2 La couche épineuse ............................................ .. ....................... .... ...... 4 1. 1.1.1.3 La couche granuleuse .......................................... ................... .. ...... .... .. . 4 1.1.1.1.4 La couche cornée ................................................................ ..... .. ..... ....... 5

1.1.1.2 Les mélanocytes : cellules pigmentaires .. .................................................. . 5 1.1 .1.3 Les cellules de Merkel : cellules sensorielles .............................. ............ .... 6 1.1.1.4 Les cellules de Langerhans: cellules immunitaires .................... .... ...... .. .... 7

1.1.2 La jonction dermo-épidermique ........ .. ........................ .. ..... ...... .... .. ..... .... .. ... 7 1.1.3 Le derme ............. ..................................... ... .... ... ... ..... ................... ... ...... .... ... 7 1.1.4 L'hypoderme ..... ........ ................................ ................ .............. ...... ....... .... .. .. 8

1.2 Les annexes cutanées .............................................................................................. 9 1.2.1 Les glandes sudoripares ..................................................................... .. ......... 9 1.2.2 Les glandes sébacées .... ... .. ................................................................... .. ... ... 9 1.2.3 Les follicules pileux .................. .. .......... .. ........ .. .................... .. .... ...... .. ......... 9

1.2.3.1 Embryologie des follicules pileux ................................................... .. ....... . 1 0 1.2.3 .2 Structure des follicules pileux ........................................................ .. .. .. .... . 11 1.2.3.3 Répartition et cycle de croissance des poils .............................. ................ 13

1.3 La voie de signalisation Wnt ................................................................................ 15 1.3.1 La p-caténine ...... .................. .......................................................... ... ..... .... 15 1.3.2 Régulation de la voie Wnt .......... .. .................. .. .................................... .. .. .. 16 1.3.3 La famille Lef-1/Tcf ........................................... .. ..................... ... ........ ...... 18

1.4 Les cellules souches cutanées ............................................................................... 20

1.5 La différenciation épidermique: de la cellule souche au cornéocyte ............... 23

1.6 Particularités de la peau murine .......................................................................... 25

1.7 La peau reconstruite ............................................................................................. 25

1.8 Hypothèse et objectifs ....................................................................................... 27

IV ©Kristine Cuftley LOEX

Chapitre 2 Matériels et méthodes ............................................................... 29

2.1 Extraction des kératinocytes et des follicules pileux immatures ...................... 30

2.2 Culture cellulaire ................................................................................................... 31

2.3 Méthode d'auto-assemblage ................................................................................. 32

2.4 Analyses histologiques .......................................................................................... 33

2.5 Détection de la phosphatase alcaline endogène .................................................. 33

2.6 Immunohistochimie .............................................................................................. 34 2.6.1 Immunofluorescence ....................................................................... ..... .... .. 34 2.6.2 Immunoperoxydase .................... .......................................................... .. .... 35

2.7 Analyses moléculaires ........................................................................................... 35 2.7.1 Extraction des protéines ...................... ........................... ..................... ..... ... 35 2.7.2 Immunobuvardage ................................................................................... ... 37 2.7.3 Rétention en gel (Electrophoretic mobility shift assay : EMSA) ................ 37

Chapitre 3 Rés ultats .................................................................................... 41

3.1 Apparence macroscopique de la peau reconstruite in vitro .............................. 42

3.2. Histologie des peaux reconstruites ....................................................................... 42

3.3 Immunomarquage des peaux reconstruites ........................................................ 44 3.3.1 Analyse de la prolifération cellulaire .......................................................... 44 3.3.2 Détection de la membrane basilaire de la peau .......................................... 45 3.3.3 Analyse de la différenciation épidermique ................................................. 48 3.3.4 Analyse de la différenciation folliculaire ................................................... 50 3.3.5 Détection de la phosphatase alcaline endogène .......................................... 51 3.3.6 Analyse de la voie de signalisation Wnt. .................................................... 52

3.3.6.1 Détection par immunofluorescence ........................................................... 52 3.3.6.2 Détection par gel de rétention (EMSA) ..................................................... 55

Chapitre 4 Discussion et Conclusion ......................................................... 59

4.1 Discussion ............................................................................................................... 60 4.1.1 Le génie tissulaire ....................................................................................... 60 4.1.2 Les peaux reconstruites par la méthode d'auto-assemblage ....................... 60 4.1.3 Caractérisation des peaux reconstruites ........... ........................................... 61

4.2 Conclusion .............................................................................................................. 64

4.3 Perspectives futures .............................................................................................. 64

Bibliographie ...................................................................................................................... 66

v © Kristine Cuffley LOEX

LISTES DES FIGURES ET TABLEAUX

Chapitre 1 Figure 1-1: La peau .................................................. ..................................................... ........ .. .. 3 Figure 1-2: Un mélanocyte ....... ...................................... ............................................... ..... ... ... . 6 Figure 1-3: Une cellule de Merkel ............................................................... ................ ....... .... .. 6 Figure 1-4: La morphogenèse du follicule pileux ........................................................ .. ......... 11 Figure 1-5: Le follicule pileux ............................................................................... ....... .. .. ... .... 13 Figure 1-6: Le cycle du poil ........................................ .... ............ .. .................................. .... .... 14 Figure 1-7: Organisation structurale de la p-caténine ...................................................... .. .. . 16 Figure 1-8: La voie de signalisation Wnt .................................... .. .............. ................. .......... . 18 Figure 1-9: Organisation structurale de la famille Lef-1ITcf .............. ................................... 20 Figure 1-10: Schématisation des différentes lignées cellulaires dérivant d'une cellule souche

dupoil ............... ..................... ............ .................................. ............................... ......... .... 21 Figure 1-11: Schématisation du processus de différenciation épidermique à partir d'une

cellule souche ............................................................................... .. ................................. 22 Figure 1-12: Concept de niche des cellules souches ...................................................... ..... .... 22 Figure 1-13: La différenciation épidermique ..... .......................................................... ....... .... 25

Chapitre 2 Figure 2-1: Follicules pileux immatures ................................................... ................. ........ .. .. . 31 Figure 2-2: Extraction des kératinocytes et des follicules pileux immatures et production des

peaux reconstruites ......................................................................................................... . 31 Tableau 1: Description des anticorps utilisés ................................................................... .. .... 39

Chapitre 3 Figure 3-1: Peaux reconstruite in vitro: Apparence macroscopique ...................................... 42 Figure 3-2: Histologie comparative des peaux reconstruites ...................... ........................... 44 Figure 3-3: Analyse de la prolifération cellulaire: Ki67 ............................................. .. .... .... 45 Figure 3-4: Détection de la membrane basilaire: Laminine 5 et collagène IV ............ ........... 50 Figure 3-5: Analyse de la différenciation épidermique: Loricrine ........................................ 49 Figure 3-6: Analyse de la kinase DLK .......................................................................... ....... ... 50 Figure 3-7: Analyse de la différenciation folliculaire: K6IRS1 ............................................. 51 Figure 3-8: Détection de la phosphatase alcaline endogène .................................................. 52 Figure 3-9: Analyse de la voie de signalisation Wnt (p-caténine et Lef1): expression dans la

peau de souris ....................... ........................................................................................... 53 Figure 3-10: Analyse de la voie de signalisation Wnt (p-caténine et Lef-1): expression dans

la peau reconstruite .......................................... ............................................................ ... 54 Figure 3-11: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux de souris âgées de 7 jours .... .. 56 Figure 3-12: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux reconstruites ........................... 58

Chapitre 4 Figure 4-1: Modèle suggérant que les différents niveaux d'expression des BMPs contrôlent

l'expression du complexe Lef11p-caténine au cours de la différenciation des lignées cellulaires dérivant des cellules souches du follicule pileux ........................................... 63

VI ©Kristine Cuftley LOEX

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADN AIL APC ARD ARNm ~-TrCP BMP BrDU Brg-l BSA CBP DAB DLK DME EDA EGF EMSA FGF Fh FITC Fm FPls GSK-3 HDAC HMG IL IRS K Km Lef-l/TCF LOEX LRC MAPK MMPs OCT ORS PAGE PBS SDS TGF TOPGAL

Acide désoxyribonucléique Air-liquide Adenomatous polyposis coli Armadil!o repeat domain Acide ribonucléique messager f3- Transducin repeat containing protein Bone morphogenic protein Bromo-2' -deoxy-uridine Brahma-related gene 1 Bovine serum albumine Creb binding protein Diaminobenzidine Dual-leucine zipper bearing kinase Modification Dulbecco-Vogt du milieu Eagle Ectodysp lasin Epidermal growth factor Electrophoretic mobility shift assays Fibroblast growth factor Derme reconstruit à partir de fibroblastes humains Fluorescéine isothiocyanate Derme reconstruit à partir de fibroblastes murins Follicules pileux immatures Glycogene synthase kinase-3 Histones déacetylase High mobility group Interleukine Inner root sheath Kératine Kératinocytes murins Lymphoid enhancer factor-l /T-cel! factor Laboratoire d' Organogénèse Expérimentale Label retaining cel! Mitogen activated protein kinase Métalloprotéinases matricielles Optimal cutting temperature Outer root sheath Polyacrylamide gel electrophoresis Phosphate buffered saline Sodium dodecy 1 sulfate Transforming growth factor TCF-Optimal promo ter-f3-galactosidase

VII ©Kristine Cuffley LOEX

Chapitre 1 Introduction générale

1.1 LA PEAU

La peau est un organe vivant et non une simple enveloppe inerte. C'est l'organe dont

la masse et la surface sont les plus importantes, mesurant près de 2 m2 et pesant près de 4 kg

chez l'adulte (Janes et al. , 2002).

La peau possède plusieurs rôles indispensables à notre survie. Ses récepteurs nerveux

renseignent sur l'environnement extérieur en captant des informations tactiles, de pression,

de température et de douleur. Elle prévient les chocs et protège les tissus et organes plus

fragiles qui se trouvent en profondeur. La peau agit comme barrière biologique en assurant

une protection contre l' entrée de micro-organismes tout en prévenant la déshydratation du

corps (Chuong et al. , 2002). Elle intervient aussi dans la thermorégulation par la dilatation

des vaisseaux sanguins cutanés et l'excrétion de la sueur par les glandes sudoripares (Fuchs

and Coulombe, 1992). Son pigment composé de mélanine est une protection efficace contre

les rayons ultra-violets solaires. La peau synthétise également la vitamine D lorsqu'elle est

exposée aux rayons ultra-violets du soleil (Bikle, 2004). La destruction de la peau soit par

une brûlure ou tout autre traumatisme engendre des conséquences qui peuvent parfois être

mortelles pour un individu (Marieb, 1993).

La peau comprend trois couches superposées soit l'épiderme, composé

majoritairement de cellules épithéliales, le derme, un tissu conjonctif et l'hypoderme, un tissu

adipeux (Figure 1-1).

2 © Kri tine Cuftley Lü X

Derme

Il pod~rtne

Figure 1-1: La peau

Schéma adapté de Geras, 1990 (Geras, 1990)

1.1.1 L'épiderme

L'épiderme est la couche épithéliale de surface en contact avec l'environnement

extérieur. C'est un épithélium pavimenteux stratifié kératinisé comprenant différents types

cellulaires: les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules de Merkel et les cellules de

Langerhans. L'épiderme ne contient aucun vaisseau sanguin ni lymphatique, mais renferme

de nombreuses terminaisons nerveuses libres (Marieb, 1993).

1.1.1.1 Les kératinocytes

Les kératinocytes sont les principales cellules de l'épiderme. Les kératinocytes

synthétisent la kératine, une protéine fibreuse et insoluble dans l' eau, qui procure aux cellules

épidermiques leur qualité de protection. D'un point de vue biochimique, on distingue les

kératines de type l (kératines acides) et les kératines de type II (kératines basiques). Les

kératines sont des hétérodimères formés entre une kératine de type l et une kératine de type

II. Ces hétérodimères se polymérisent en filament intermédiaire. Toutes les cellules

épithéliales contiennent des filaments intermédiaires de kératine. Au niveau de l'épiderme, la

K5 et la K14 se retrouvent dans les cellules basales et les KI et KIO dans les couches

suprabasales. De plus, certaines kératines sont spécifiques à certaines régions cutanées, par

3 ©Kristine Cuftley LOEX

exemple la K9, qui est spécifique aux kératinocytes des paumes et de la plante des pieds

(Coulombe and Omary, 2002). Les kératinocytes font preuve d'une évolution morphologique

continue. Cette évolution se fait de la profondeur de l ' épiderme vers sa superficie et permet

de distinguer sur une coupe d'épiderme quatre couches de kératinocytes distinctes: la couche

basale, la couche épineuse, la couche granuleuse et la couche cornée (Kanitakis, 2002)

(Figure 1-13).

1.1.1.1.1 La couche basale

La couche basale, aussi nommée couche germinative, est la couche la plus profonde

de l' épiderme. Elle est constituée d'une seule épaisseur de cellules en contact avec la

membrane basale qui délimite la jonction dermo-épidermique. C ' est dans cette couche qu ' ont

lieu les mitoses cellulaires des cellules épidermiques. En fait, seules les cellules de la couche

basale ont la capacité de faire la synthèse d'ADN ainsi que de procéder en mitose (Fuchs,

1990). Lorsque le processus de différenciation terminale s'entame, les kératinocytes de la

couche basale transitent vers les couches supérieures de l'épiderme pour finalement

desquamer dans l'environnement. Le renouvellement infini des cellules épidermiques est

accompli grâce aux cellules souches situées dans les poils de la peau velue et au fond des

crêtes épidermiques de la peau glabre (Alonso and Fuchs, 2003b).

1.1.1.1.2 La couche épineuse

La couche épineuse est formée de plusieurs assises de cellules polyédriques à épines,

caractérisées par de nombreux prolongements (ponts intercellulaires). Ces prolongements

joignent les cellules à épines voisines à l'aide des desmosomes qui jouent un rôle important

dans le maintien de la cohésion cellulaire et de la résistance aux tractions. Au niveau de la

couche épineuse, les cellules sont de forme aplatie , mais le noyau et les organites

cytoplasmiques sont intacts (Kanitakis, 2002).

1.1.1.1.3 La couche granuleuse

La couche granuleuse est caractérisée par des cellules très aplaties, où certains

noyaux démontrent des signes de dégénération et où des grains de kératohyaline et de

kératinosomes sont visibles dans le cytoplasme des cellules. Les kératinosomes sécrètent un

complexe glycophospholipidique rendant la peau imperméable (Stevens, 1997), permettant

4 © Kristine Cuftley LOEX

ainsi à la couche granuleuse de jouer un rôle important dans la fonction de barrière de la

peau.

1.1.1.1.4 La couche cornée

La couche la plus superficielle de l'épiderme soit la couche cornée, est formée de

plusieurs strates de kératinocytes qui prennent maintenant le nom de cornéocyte. Ces cellules

sont complètement aplaties, le noyau et les organites cytoplasmiques ont totalement disparus

et le cytoplasme est rempli de kératines (Stevens, 1997). Les cornéocytes sont reliés entre

eux, dans la partie profonde de la couche cornée, par des desmosomes ou

cornéodesmosomes, qui assurent la solidité du système. La solidité et l'étanchéité de la

couche cornée assurent l ' essentiel de la fonction barrière cutanée. Les cornéocytes empêchent

notamment la pénétration dans l'épiderme des micro-organismes de l' environnement, mais

ils s'opposent aussi à la fuite transépidermique d'eau. Les cornéocytes sont continuellement

éliminés par desquamation (Milstone, 2004).

1.1.1.2 Les mélanocytes : cellules pigmentaires

Pendant l'embryogenèse, les mélanocytes proviennent du neuroectoderme et migrent

à partir de la crête neurale (Sieber-Blum and Grim, 2004). Ils représentent 5 à 10 % des

cellules de l'épiderme et sont dispersés entre les kératinocytes de la couche basale (Figure 1-

2). Au niveau des mélanocytes, les filaments intermédiaires et les desmosomes sont absents,

mais par contre, ils sont très riches en organites cellulaires. L'appareil de Golgi est

particulièrement développé car c'est à partir de celui-ci que naissent les vésicules qui forment

les mélanosomes (Marks and Seabra, 2001). Les mélanosomes assurent la synthèse de la

mélanine où la tyrosinase joue un rôle déterminant. Les mélanocytes ont de multiples

prolongements cytoplasmiques leur permettant d'entrer en contact avec les kératinocytes et

d'y transférer les mélanosomes contenant les granules de mélanine, responsables de la

photoprotection. Les mélanosomes se logent au dessus des noyaux afin de protéger l'ADN

des rayons ultra-violets. Les mélanocytes s'associent également aux follicules pileux en

formation où leur fonction est de pigmenter les poils et les cheveux (Boissy, 2003).

5 ©Kri ,tine Cuftley LOEX

1.1.1.3

Figure 1-2: Un mélanocyte

Schéma tiré de Geras, 1990 (Geras, 1990).

Les cellules de M erkel : cellules sensorielles

Les cellules de Merkel dérivent de la crête neurale (Sieber-Blum and Grim, 2004) et

jouent un rôle de mécanoréception. Elles se dispersent entre les kératinocytes basaux et se

prolongent jusque dans la couche germinative (Figure 1-3). Les cellules de Merkel sont des

cellules neuro-endocrines qui sont généralement en contact avec une terminaison nerveuse

libre. Elles expriment des marqueurs de cellules neuronales (notamment la chromogranine A)

et des marqueurs de cellules épithéliales (comme les kératines K8, K18, K19 et K20) (Moll,

1994). Les cellules de Merkel auraient également des fonctions inductives et trophiques sur

les terminaisons nerveuses de l'épiderme et sur les annexes cutanées tels les poils (Halata et

al., 2003).

Figure 1-3: Une cellule de Merkel

Schéma tiré de Geras, 1990 (Geras, 1990).

6 ©Kristine Cuffley/LOEX

1.1.1.4 Les cellules de Langerhans: cellules immunitaires

Les cellules de Langerhans sont un autre type cellulaire présent dans l'épiderme. Ces

cellules proviennent de la moelle osseuse et elles sont disséminées au sein des autres cellules

de l'épiderme quoique plus fréquemment situé au niveau de la couche épineuse. Ce sont des

cellules dendritiques qui internalisent les antigènes par phagocytose ou endocytose. Les

cellules de Langerhans migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques où elles présentent

les antigènes aux lymphocytes qui amorcent la réponse immunitaire. Les cellules de

Langerhans participent à l' immunisation contre des antigènes appliqués localement sur la

peau (Kanitakis, 2002).

1.1.2 La jonction dermo-épidermique

La jonction dermo-épidermique aussi appelée membrane basilaire, est une barrière

sélective qui contrôle des échanges moléculaires et cellulaires entre le derme et l'épiderme

(Nishiyama et al., 2000). Ses principales composantes sont le collagène de type IV, les

héparane-sulfates et les laminines 5 et 6 (Marinkovich et al., 1993). La membrane basale joue

un rôle fondamental dans la régulation des kératinocytes en participant entre autres, à la

modulation de leur polarité, de leur prolifération, de leur migration et de leur différenciation.

En plus de ces fonctions, cette jonction est primordiale durant la guérison des plaies, la

morphogenèse et le développement de la peau (Burgeson and Christiano, 1997). La

membrane basilaire, reliant l'épiderme au derme, est organisée de façon à empêcher leur

séparation par des forces de cisaillements. Les kératinocytes de la couche basale sont ancrés à

la jonction dermo-épidermique par des hémidesmosomes et s'unissent entre eux par des

desmosomes (Burgeson and Christiano, 1997). Le système de crêtes épidermiques

interpapillaires ajouté à la forme sinueuse de la membrane plasmique des cellules basales et

de la membrane basilaire sous-jacente augmentent la cohésion entre le derme et l'épiderme.

La membrane basilaire permet également aux nutriments provenant du derme d'atteindre

l'épiderme, celui-ci étant avasculaire (Burgeson and Christiano, 1997).

1.1.3 Le derme

Le derme est le tissu de soutien sur lequel repose l'épiderme. C'est un tissu conjonctif

dont le type cellulaire principal est le fibroblaste. Ce dernier sécrète la matrice extracellulaire

qui est composée principalement de fibres de collagènes associées à des glycoaminoglycans,

7 © Klistine Cuffley LOEX

des fibres élastiques et des fibres de réticulines (Kanitakis, 2002). Les fibroblastes sécrètent

également des protéinases capables de dégrader et de remodeler la matrice extracellulaire

telles les métalloprotéinases matricielles (MMPs).

Les fibroblastes dermiques représentent une population hétérogène de cellules qui

sont définies selon leur localisation dans le derme. Les fibroblastes sont situés soit dans le

derme papillaire, la zone qui enrobe les crêtes épidermiques, soit dans le derme réticulaire, la

partie la plus profonde qui représente la majeure partie du derme. À ce niveau, les fibres

élastiques et de collagènes sécrétées par les fibroblastes , s'orientent parallèlement à la

jonction dermo-épidermique alors que dans le derme papillaire, les fibres de collagènes

s'entrecroisent pour former un réseau irrégulier et peu dense (Sorrell and CapIan, 2004). Une

troisième population fibroblastique est associée aux follicules pileux. Ces cellules forment la

région de la papille dermique qui se situe dans le bulbe du follicule pileux (Reynolds and

Jahoda, 1991) (Figure 1-5).

Le derme est traversé de nombreux vaisseaux sanguins qui jouent un rôle primordial

dans la thermorégulation ainsi que dans l'apport des nutriments à l'épiderme. De nombreuses

terminaisons nerveuses retrouvées dans le derme sont impliquées, quant à elles, dans la

perception des stimuli venus de l'environnement extérieur. Les annexes cutanées telles les

poils, les glandes sébacées et les glandes sudoripares sont également retrouvées dans le

derme. Plusieurs autres types cellulaires se retrouvent dans la matrice extracellulaire du

derme dont les macrophages, les mastocytes et les lymphocytes (Kanitakis, 2002; Sorrell and

CapIan, 2004). Les fibres de collagènes du derme assurent la résistance de la peau tandis que

les fibres élastiques lui confèrent son élasticité.

1.1.4 L'hypoderme

L'hypoderme est principalement composé de tissu adipeux. Il est situé sous le derme

et repose sur le tissu musculaire. L'hypoderme est parcouru par des vaisseaux sanguins ainsi

que les glandes sudoripares et les racines des poils les plus longs (Stevens, 1997). En raison

de sa composition abondante en adipocytes remplis de lipides, l'hypoderme est également en

mesure d'absorber les chocs et d'isoler les tissus plus profonds de l'organisme en les

protégeant des changements de température (Kanitakis, 2002). Il est particulièrement

important dans les zones devant supporter des impacts fréquents telles que les fesses ou les

talons. Il représente aussi une réserve de nutriments.

8 © Kristine Cuffley LOEX

1.2 LES ANNEXES CUTANEES

La peau contient un grand nombre de structures spécialisées comme les follicules

pileux, les ongles et les glandes sébacées et sudoripares (Kanitakis, 2002). Chacune de ces

annexes dérive de l'épiderme embryonnaire et joue un rôle important dans le maintien de

l'homéostasie de l ' organisme (Marieb, 1993).

1.2.1 Les glandes sudoripares

Les glandes sudoripares sont des glandes exocrines qui s'ouvrent à la surface de la

peau par un pore. Elles sécrètent la sueur qui élimine les toxines et rafraîchit l'épiderme en

s'évaporant, ce qui participe à la régulation de la température corporelle. La partie sécrétrice

de la glande sudoripare qui s'enroule dans le derme profond est entourée de cellules myo

épithéliales (Kanitakis, 2002).

1.2.2 Les glandes sébacées

Les glandes sébacées sécrètent le sébum huileux qui lubrifie la peau et les poils et qui

empêche le dessèchement de la surface cutanée. Ce sont des glandes holocrines. Sur la plus

grande partie du corps, ces glandes se présentent comme des diverticules des follicules

pileux, bourgeonnant à partir du versant latéral de la gaine épithéliale externe (Kanitakis,

2002).

1.2.3 Les follicules pileux

Alors que le follicule pileux est depuis toujours l'objet d'attentions, de croyances et de

traditions très variées, celui qu'on a considéré autrefois comme "une espèce de plante qui

croît sur la tête de l'homme" est resté trop longtemps un oublié de la science. Aujourd'hui ces

temps sont révolus, le follicule pileux est entré dans les laboratoires et, jour après jour, au

terme d'aventures parfois très longues, les découvertes et les inventions fascinantes sur le

follicule pileux se succèdent.

Chez les animaux, les poils jouent un rôle vital dans le maintien de la température

corporelle ainsi que dans la perception tactile. Chez l'homme, ces fonctions sont moins

importantes. Par contre, le follicule pileux demeure important puisqu'il est un réservoir de

cellules souches cutanées. Celles-ci permettrent entre autres la cicatrisation spontanée des

brûlures du deuxième degré.


1.2.3.1 Embryologie des follicules pileux

Chaque follicule pileux se forme par un bourgeonnement de l ' épiderme

embryonnaire. Ce bourgeonnement requiert une série d ' interactions moléculaires entre

l ' épiderme embryonnaire et les cellules mésenchymateuses sous-jacentes (Figure 1-4)

(Hardy, 1992; Pispa and Thesleff, 2003). Plusieurs molécules induisent des signaux

spécifiques aux cellules de l ' épiderme embryonnaire ainsi qu'aux cellules mésenchymateuses

dont Sonic hedgehog, Wnt, les BMPs 2 et 4 (Bone morphogenic protein 2 and 4), FGF 10

(Fibroblast growth factor 10) et EDA (Ectodysplasin) pour en nommer quelques unes

(Millar, 2002; Schmidt-Ullrich and Paus, 2005).

Lors de la spécification des annexes cutanées, le premier signal morphogénétique

provient des cellules mésenchymateuses et cause un épaississement de l'épiderme résultant

en la formation de la placode épidermique. À ce stade, les cellules formant la placode

subissent des changements morphologiques notamment, elles deviennent plus allongées que

les cellules avoisinantes (Hardy, 1992; Pispa and Thesleff, 2003). Ce premier signal est

primordial pour la formation du follicule pileux. Chez la souris par exemple, le tissu

mésenchymateux peut stimuler la formation d'annexes cutanées à partir de cellules

épithéliales, notamment le développement de plumes chez le poulet ou d'écailles chez le

lézard. Les fibroblastes contenus dans le derme peuvent induire la formation des annexes

cutanées à des endroits précis tandis que l'épiderme répond en formant le type d ' annexe

adéquat à l'espèce (Garber et al., 1968). La voie de signalisation Wnt joue un rôle primordial

lors de l'initiation du premier signal. Noggin et EDA pour leur part sont impliqués dans la

prolifération des cellules épithéliales formant la placode (Millar, 2002; Reddy et al. , 2001;

Schmidt-Ullrich and Paus, 2005).

Suite au premier signal du mésenchyme, un signal épidermique provenant des

cellules de la placode induit une condensation de cellules mésenchymateuses qui mène à la

formation d'un amas cellulaire dans le mésenchyme. Cette étape est régulée principalement

par Sonic hedgehog (Millar, 2002; Schmidt-Ullrich and Paus, 2005). Cet amas cellulaire

lance un deuxième signal dermique, et en réponse, les cellules de la placode épidermique

prolifèrent et croissent vers l'intérieur du mésenchyme, pour éventuellement entourer l'amas

de cellules mésenchymateuses formant ainsi les cellules de la matrice germinative. Les

cellules mésenchymateuses qui se retrouvent entourées par les cellules de la matrice

germinative forment une structure spécialisée appelée la papille folliculaire (papille

10 ©Kri tine Cuft1ey LOEX

dermique). Cette papille est richement vascularisée et innervée et est indispensable pour le

renouvellement du poil. Elle assure sa nutrition et contrôle la croissance et la différenciation

des kératinocytes formant le follicule pileux.

Les cellules de la matrice germinative pour leur part, se divisent par mitose et

donnent naissance à des cellules qui se remplissent de kératines et qui formeront le poil,

permettant ainsi l ' allongement du poil. Suite à des signaux additionnels provenant des

fibroblastes de la papille dermique, les précurseurs de la matrice sont stimulés à proliférer.

Les nouvelles cellules ainsi générées migrent vers le haut et se différencient en deux couches

concentriques distinctes, soit la tige du poil et la gaine follicullaire interne (IRS, inner root

sheath ). Au fur et à mesure que la matrice produit de nouvelles cellules, la partie la plus

ancienne du poil est poussée vers le haut, les kératinocytes deviennent de plus en plus

différenciées et meurent. C'est alors que le follicule pileux émerge à la surface tel qu'on le

voit (Hardy, 1992). Les molécules BMP-2, BMP-4 ainsi que GATA-3 sont impliqués dans

ces étapes de différenciation (Kobielak et al., 2003; Yuhki et al., 2004).

. . . . . . .. . .. . . . ..

1 1er ignal dermique

1.2.3.2

~4. ... ... .- :.: -.-. .. ..

2 Fomlati n de la placode

-:. ~ -:.-. ...... .

1er signal épidermique: onden alion de cellule

mé. ench mat u. t:

-' .' 4 2ierne ignal 5 Pr li fénltion

derm ique: et di flë ren lation formati n de la de ccll uh.: papille dennique de la matri e

germinati e

Figure 1-4: La morphogenèse du follicule pileux

Schéma adapté de Reddy 2001 (Reddy et al., 2001).

Structure des follicules pileux

Le type de poils produits est souvent associé à une structure particulière du follicule

pileux. Par exemple, les follicules du cuir chevelu sont longs et droits, tandis que ceux des

poils fins et veloutés du corps (duvet) sont courts et recourbés. La localisation et le nombre

de ponts disulfures entre les kératines déterminent la forme du cheveu; crépu, frisé, bouclé ou

raide. La mélanine est responsable de la couleur du poil tandis que les kératines lui confèrent

sa résistance.

Il ©Kri ,tine Cuffley LOEX

La coupe longitudinale du follicule pileux se subdivise en plusieurs sections (Figure

1-5). On retrouve d'abord l'infundibulum qui est en continuité avec l ' épiderme

interfolliculaire. Puis vient la portion de l'isthme représentant le début de l'ouverture de la

glande sébacée. Suit le renflement, situé à l'endroit où s'insère le muscle arrecteur du poil,

dans lequel se retrouvent les cellules souches du follicule pileux (DasGupta and Fuchs,

1999). Finalement, la racine du poil se termine par le bulbe pileux qui contient une forte

concentration de mélanocytes, les cellules prolifératrices de la matrice et la papille dermique

(Luelmo-Aguilar and Santandreu, 2004) (Figure 1-5).

Le poil est une structure kératinisée produite par le follicule pileux. Le poil est

composé d 'une tige qui est la partie visible à la surface du tégument et d'une racine qui est la

partie logée dans le derme dont l'extrémité est formée du bulbe pileux où se retrouve la

papille dermique (Figure 1-5).

La tige du poil est formée de trois cylindres concentriques de cellules kératinisées très

organisées. Au centre se trouve la moelle, formée de grosses cellules partiellement séparées

par des espaces remplis d'air. La moelle est entourée d'une couche plus volumineuse, le

cortex, riche en mélanine. Par la suite, il y a la cuticule qui est la couche la plus

abondamment kératinisée. La cuticule a comme fonction de renforcer le poil et de permettre

aux cellules des couches internes de rester compactes (Marieb, 1993). La tige du poil est

formée d'un mélange de kératinocytes et de lipides (stérols, céramides et acides gras)

d'origine membranaire qui lui confèrent son caractère hydrophobe.

La racine du poil comporte également trois compartiments analogues à ceux de la

tige. Les cellules de la racine prolifèrent et se différencient activement et sont à l'origine des

cellules de la moelle, du cortex et de la cuticule.

Le follicule pileux comporte deux gaines. La gaine folliculaire externe (ORS outer

root sheath) et la gaine folliculaire interne (IRS inner root sheath) (Figure 1-5). Ces deux

gaines s'amincissent à mesure qu'elles se rapprochent de la base du bulbe pileux, de telle

façon qu'une seule strate de cellules constitue les gaines. La gaine folliculaire externe est en

continuité avec l'épiderme, malS ses cellules diffèrent biochimiquement et

morphologiquement des kératinocytes épidermiques (Rogers, 2004). La gaine folliculaire

interne est composée de trois assises cellulaires concentriques, soient la couche de Henlé, la

couche de Huxley et la cuticule de la gaine folliculaire interne, qui accompagnent le poil dans

sa croissance jusqu'au point d'attache du canal sébacé (Hardy, 1992). La couche de Henlé,

12 ©KI;. tine Cuftley LOEX

contiguë à la gaine folliculaire externe, est formée d'une seule couche de cellules compactes.

La couche de Huxley, la couche intermédiaire, est formée de cellules volumineuses contenant

des granules de trichohyaline et la dernière couche, la cuticule de la gaine folliculaire interne,

est composée de cellules aplaties fortement kératinisées qui se chevauchent (Kobielak et al. ,

2003).

l ulll dlbUlum[

1 Ibm [

. lIul _ ::. rmlorJlhc.

alp lllillii'e

11~ ... • d (j: f~.IH 1" pi l U1

Figure 1-5: Le follicule pileux

Schéma adapté de Geras, 1990 (Geras, 1990).

1.2.3.3 Répartition et cycle de croissance des poils

L'importance et la topographie de la pilosité dépendent des interactions entre

l ' épiderme embryonnaire et les cellules mésenchymateuses, des facteurs héréditaires et des

hormones androgènes. Seules les paumes, les plantes et les dermo-muqueuses buccales et

13 ©Kri tine Cuffley Lü EX

génitales sont dépourvues de tout poil. La couleur, la taille et la répartition des poils varient

en fonction de la race, de l'âge, du sexe et de la région du corps.

À la différence des kératinocytes de la peau pour lesquels la division cellulaire au

niveau de la couche basale est régulière et continue, la durée de vie du follicule pileux se

caractérise par un cycle de 3 phases : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène

(Figure 1-6) (Hardy, 1992; Paus and Cotsarelis, 1999). Plusieurs études suggèrent que les

fibroblastes de la papille dermique induisent les cellules souches multipotentes situées dans le

renflement à se diviser lors de l'initiation du cycle folliculaire (Lavker et al. , 1993; Oshima et

al. , 2001). La phase anagène se caractérise par une intense activité mitotique dans le bulbe et

au cours de laquelle le poil croît de façon continue. Des évidences suggèrent que la phase

anagène est interrompue par des messages qui mettent fin à l ' activité mitotique des cellules

du bulbe (Fuchs et al., 2001). Le follicule pileux entre alors dans sa phase catagène,

caractérisée par une dégénérescence des kératinocytes du bulbe et des gaines folliculaires

jusqu' au renflement. Le bulbe se sépare physiquement de la papille dermique et les deux

composants communiquent que par quelques tissus. Cette involution est suivie par la phase

télogène où le follicule est à l'état de repos. Lors de la nouvelle phase anagène la poussée

d'un nouveau poil mènera à la chute de l'ancien poil (Stenn and Paus, 2001).

Le cycle du poil

Formation du

) AOU Ua poil

= .. ï.d< l'aRden poil

Figure 1-6: Le cycle du poil

Schéma adapté de Fuchs, 2001 (Fuchs et al., 2001).

14 ©Kri tine Cuffley LOEX

Plusieurs marqueurs de différenciation sont spécifiques à certains compartiments du

follicule pileux tels la trychohyaline (retrouvée dans la couche de Huxley) et les kératines

(notamment la K17 retrouvée dans la gaine folliculaire externe et la K6IRS 1 retrouvée dans

la gaine folliculaire interne (Langbein et al. , 2002)).

1.3 LA VOIE DE SIGNALISATION WNT

La voie de signalisation Wnt/Wingless Joue un rôle important au cours du

développement embryonnaire en modulant l'expression de signaux intercellulaires qui

contrôlent la croissance, la migration, la différenciation et la polarisation cellulaire (He,

2003; Miller, 2002). Elle a été particulièrement décrite lors des études du développement

chez la drosophile, mais ses constituants sont très conservés chez les vertébrés. La plupart des

recherches sur les molécules impliquées dans la voie Wnt ont combiné des approches

génétiques et moléculaires. Plusieurs molécules ont été mutées afin d'observer leur fonction.

Ainsi, la protéine p-caténine fut identifiée comme un élément central de la voie Wnt

(Huelsken et al., 2001). Une activation anormale de cette voie par mutation de l'un ou l' autre

de ses composants joue également un rôle important dans un grand nombre de cancers

humains (van Es et al., 2003).

1.3.1 La p-caténine

La p-caténine fut d'abord décrite chez l'homme comme une composante des

complexes d'adhésions cellulaires qui connectent les cadhérines au cytosquelette d' actine via

l'a-caténine (Ozawa et al., 1989). La p-caténine peut aussi se lier à la E-cadhérine au niveau

des jonctions adhérentes. Le complexe E-cadhérine/p-caténine joue un rôle crucial dans

l'adhésion des cellules normales, contribuant à leur différenciation, leur polarité et leur

motilité. Une perte de l'intégrité de ce complexe a été corrélée au développement de

carcinomes épithéliaux (Nelson and Nusse, 2004).

Le rôle de la p-caténine dans la signalisation Wnt fut découvert lors d'études

comparatives des voies de signalisation chez la drosophile (Pei fer et al., 1993). Puis, plus

tardivement, un rôle analogue dans la signalisation fut mis en évidence dans les cellules

humaines. En effet, Peifer et al. ont montré que lorsque la p-caténine est transloquée au

noyau suite à l'activation de la voie Wnt, elle joue un rôle de régulateur de la transcription

(Behrens et al., 1996; Peïfer, 1993; Peifer et al. , 1994) (Figure 1-8).

15 ©KJistine Cuffley/ LOEX

La ~-caténine est composée de trois domaines: un domaine N-terminal de 149 acides

aminés possédant de multiples sites de phosphorylation par la glycogène synthase kinase-3

(GSK-3), un domaine central comprenant 12 ARD (Armadillo Repeat Domain) de 42 acides

aminés chacun et un domaine C-terminal de 108 acides aminés ayant une fonction de

signalisation par sa capacité à activer la transcription (Akiyama, 2000) (Figure 1-7). Dans le

domaine central, il existe des sites de liaison à la protéine APC (Adenomatous polyposis coli),

à l'axin, à la E-cadhérine et au facteur de transcription Lef-1 /Tcf (lymphoid enhancer factor-

1 fT-cel! factor).

.te de phosphorylation p()ur la .. K-3

t Domain de

Figure 1-7: Organisation structurale de la f3-caténine

Schéma adapté de Akiyama, 2000 (Akiyama, 2000).

L'état et l'activité de la ~-caténine sont des éléments régulateurs centraux de la voie

Wnt. Il existe en fait trois réservoirs de ~-caténine dans la cellule: un dans lequel la ~

caténine est associée aux jonctions adhérentes dont l'interaction avec les cadhérines se fait en

fonction de l'état de phosphorylation des tyrosines de la ~-caténine. En général, l'activation

des tyrosines kinases résulte en une diminution de l'adhésion cellule-cellule au niveau des

cadhérines et en une augmentation du niveau cytoplasmique de la ~-caténine (Nelson and

Nusse, 2004). Un autre réservoir cytoplasmique de ~-caténine est associé à APC. En absence

de l'activation de la voie Wnt, ~-caténine liée à APC est rapidement dégradée. Le dernier

réservoir correspond au noyau dans lequel la ~-caténine est impliquée dans la transcription de

gènes (van Es et al., 2003).

1.3.2 Régulation de la voie Wnt

Tel que décrit auparavant, la voie Wnt joue un rôle primordial lors de la formation du

follicule pileux pendant le développement embryonnaire. Ce développement est modulé entre

autres, par l'échange de signaux entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses au

niveau de la placode épidermique en formation (Kishimoto et al., 2000) et la voie Wnt est

impliquée dans la régulation de ces échanges (Millar, 2002; Schmidt-Ullrich and Paus, 2005).

16 ©Krlstine Cuftley LOEX

Lorsque la p-caténine est mutée au nIveau du domaine C-terminal, sa fonction de

signalisation par sa capacité à activer la transcription est inhibée (DasGupta et al. , 2002).

Dans ce cas, le complexe nucléaire Lef-l /p-caténine ne peut pas activer les gènes de la

folliculogénèse adéquatement, la formation de la placode est donc bloquée. Ainsi, la

translocation de la p-caténine dans le noyau des cellules de l'épiderme favorise la

folliculogénèse, alors qu'une p-caténine mutée favorise plutôt la différenciation épidermique

(DasGupta et al., 2002).

Les études génétiques ont mené à l'identification de plusieurs autres protéines

impliquées dans la voie de signalisation Wnt (Akiyama, 2000; He, 2003; van Es et al. , 2003).

La voie de signalisation Wnt peut être vue sous deux formes: un état stimulé et un état non

stimulé (Figure 1-8). Dans le premier cas, l'activation de la voie Wnt est initiée par la liaison

d'une glycoprotéine sécrétée de la famille Wnt à l'un des 10 récepteurs à sept domaines

transmembranaires codés par les gènes Frizzled (He, 2003; van Es et al., 2003). L'activation

de ce récepteur entraîne la phosphorylation de la protéine Dishevelled qui, à son tour, inhibe

l'activité de la GSK-3 (Akiyama, 2000). Dans le deuxième cas, soit en l'absence de

stimulation des récepteurs de type Frizzled par les Wnts, le réservoir de la p-caténine

cytoplasmique est épuisé par l'action d'un complexe multiprotéique incluant les protéines

APC, l'axin (une protéine adaptatrice) et la GSK-3. Cette dernière phosphoryle la p-caténine

sur ses sérines 33 et 37 permettant le recrutement de P-TrCP (f3 transducin repeat containing

protein), une protéine (composant de l'ubiquitine ligase E3) initiatrice du processus

d'ubiquitination et de dégradation de la p-caténine par le protéasome 26 S (van Es et al.,

2003; van Noort and Clevers, 2002). La p-caténine est ainsi maintenue à une faible

concentration dans le cytoplasme empêchant ainsi sa translocation au noyau. Dans les

cellules dont la voie Wnt est activée, l'inhibition de GSK-3 par Dishevelled permet

l'accumulation de la p-caténine dans le cytoplasme. Cette accumulation mène à la

translocation de la p-caténine dans le noyau où elle interagit avec les membres de la famille

Lef-l/Tcf, qui sont des facteurs de transcription, activant ainsi des gènes cibles, notamment

certains gènes caractéristiques de la différenciation des follicules pileux (Huelsken et al.,

2001; Zhou et al., 1995). Le discernement des mécanismes moléculaires impliqués dans la

voie de signalisation Wnt est important pour la compréhension des mécanismes qui régissent

la différenciation cellulaire des cellules souches des poils.

17 ©KJlstine Cuffley LOEX

• •

ans le si nal \\,'ot

- ---------- ---

en. cibl . , 'nt Înat f

~vec le ~jgnal \l rnt

cÎht . , lit actif:

Figure }-8: La voie de signalisation Wnt

Schéma adapté de Miller 2002 (Miller, 2002).

1.3.3 La famille Lef-l/Tef

Les facteurs de transcription Lef-1/Tcf sont les effecteurs terminaux de la voie Wnt

(Eastman and Grosschedl, 1999; Waterman, 2004). La famille Lef-1/Tcf comprend quatre

différentes protéines soit Lef-1 , Tcf-1, Tcf-3 et Tcf-4 (Figure 1-9). Les protéines Lef-1 et

Tcf-1 furent originellement identifiées comme facteurs régulateurs de la différenciation des

lymphocytes B et T. Ces protéines possèdent toutes le domaine HMG (high mobility group)

qui reconnaît une séquence consensus fortement conservée dans différents gènes soit la

séquence 5'-CTTTGWW-3' (où W équivaut soit à A ou à T) (Zhou et al., 1995). Ce domaine

HMG agit comme facteur de transcription architectural qui induit un coude dans le brin

d'ADN ce qui facilite l'interaction avec d'autres facteurs. Le deuxième élément hautement

conservé est la région N-terminale, soit celle qui lie la p-caténine. Il est important de préciser

que la ~-caténine n'a pas de domaine de liaison à l'ADN mais a plutôt un puissant domaine

d'activation de la transcription (Waterman, 2004). Le domaine d'activation des facteurs de

18 ©Klistine Cuffley LOEX

transcription Lef-1 /Tcf a une faible capacité d'activation de la transcription. Cependant, ces

facteurs ont un excellent domaine de liaison et de courbure de l'ADN. Ainsi, lorsque la ~

caténine se lie aux protéines du groupe Lef-1 /Tcf, un puissant complexe de transcription est

formé (Waterman, 2004). Lorsque la ~-caténine se lie à Lef-1 /Tcf, il y a recrutement entre

autres, de CBP (creb binding protein) , une histone acétylase, et de Brg1 (Brahma-related

gene 1), un remodeleur de chromatine (van Noort and Clevers, 2002) au niveau des gènes

spécifiques afin d'activer leur transcription. Lorsque la ~-caténine est absente, le co

répresseur Groucho s'associe au complexe Lef-1 /Tcf et a une action inhibitrice sur la

transcription. Le co-répresseur Groucho interagit entre autres, avec des histones déacetylase

(HDAC) ce qui induit une condensation de la chromatine (Bienz, 1998).

Le facteur de transcription Lef-l est principalement exprimé au niveau des cellules du

bulbe du follicule pileux (DasGupta and Fuchs, 1999; Zhou et al., 1995). L'expression de

Lef-1 serait induite par la protéine Noggin via l'inhibition des BMPs (Jamora et al. , 2003).

Suite à l'activation de la voie de signalisation Wnt, la ~-caténine se lie au facteur de

transcription Lef-1 dans les cellules matricielles du follicule pileux, ce qui permet une

activation des gènes spécifiques aux kératines dures des poils. En effet, les gènes des

kératines dures des poils possèdent une séquence reconnue spécifiquement par le domaine

HMG des facteurs Lef-1/Tcf permettant ainsi la transcription des gènes (Zhou et al. , 1995).

Le rôle de Lef-1 a été identifié suite à des études de mutation du gène codant pour sa

protéine. Une mutation dans le domaine N-terminal de Lef-1 qui lie la ~-caténine résulte en

une suppression de la différenciation folliculaire et favorise plutôt une différenciation des

sébocytes (Merrill et al., 2001). Alternativement, il y a une diminution considérable du

pelage et une perte complète des vibrisses chez les souris dont le gène codant pour Lef-1 a

été invalidé (van Genderen et al., 1994). Le facteur de transcription Tcf-3 pour sa part

s'exprime principalement au niveau des cellules souches du renflement (DasGupta and

Fuchs, 1999; Merrill et al., 2001) où il aurait un rôle de répresseur de la transcription des

gènes de différenciation folliculaire. Chez les souris exprimant le gène rapporteur TOPGAL

(Tcf-op timal-promo ter- f3-galactosidase) dans lequel le gène de l' enzyme ~-galactosidase est

sous le contrôle d'un promoteur minimal activé par tous les membres de la famille tcfllef,

l'expression du gène de la ~-galactosidase est seulement activée dans les cellules du

renflement qui expriment Tcf-3, et ce, au début de chaque nouveau cycle du poil (DasGupta

and Fuchs, 1999). Tcf-3 participerait aussi à la différenciation terminale de la gaine

19 © Krlstine Cuffley LOEX

folliculaire externe et jouerait un rôle déterminant dans la spécification du destin des

différentes lignées générées par les cellules souches du renflement (Menill et al. , 2001 ). Domaine de liai son Domaine de liaison

a la p-caténin aHMG HMG N~S

lEF-1 (L EF 1)

67 297 384 B dnLEF-1

2~7 384

TCF-1 (TCF7)

C

TCF·3 (TCF7L1)

TCF-4 B (TCF7L2)

C

Figure 1-9: Organisation structurale de la famille Lef-1lTcf

Schéma adapté de Waterman 2004 (Waterman, 2004).

1.4 LES CELLULES SOUCHES CUTANEES

E

E

lE

Les cellules souches cutanées sont à la base de la régénération de la peau. Leur étude

suscite un grand intérêt autant dans le domaine du génie tissulaire que dans celui de la

thérapie génique. Les cellules souches participent également à la réparation des tissus lors de

blessures.

Afm d'étudier les cellules souches de façon approfondie, différents marqueurs et

techniques d' identification ont été décrits dans la littérature. Une des caractéristiques qui a

permis d' identifier les cellules souches dans la peau a été leur cycle cellulaire long. C'est lors

d' injections répétées à la thymidine tritiée e H-thymidine) ou de bromo-2 ' -deoxy-uridine

(BrdU) à la souris, que les cellules souches cutanées furent identifiées (Cotsarelis et al. ,

1990). Le principe de cette technique est d' administrer des injections répétées de BrdU à des

souris sur une période au cours de laquelle toutes les cellules, y compris les cellules souches

(qui se divisent peu souvent), ont le temps de se diviser. Le BrdU est un analogue de base qui

s' incorpore aux brins d 'ADN en phase de réplication, permettant ainsi de marquer l' ensemble

des cellules ayant traversé la phase S du cycle cellulaire. À chaque division, les cellules

perdent une quantité de marquage au BrdU par dilution. Ainsi, après une période d'attente (4-

20 ©Kristine Cuft1ey LOEX

6 semaines chez la souris), seulement les cellules qui se sont divisées moins souvent, soit les

cellules souches, contiennent le marquage et sont appelées pour cette raison en anglais label

retaining ceUs ou LRC. Cette technique a pennis d'identifier entre autres, que les «LRC» de

la peau velue se confinent à la région du renflement du follicule pileux (Cotsarelis et al. ,

1990). Plusieurs études suggèrent que les cellules souches du renflement sont multipotentes

(Oshima et al. , 2001). Elles ont ainsi la capacité de se différencier en plusieurs types

cellulaires dont les kératinocytes de l ' épiderme, les cellules du follicule pileux et les

sébocytes des glandes sébacées. Lors d 'une plaie cutanée, les cellules souches du renflement

migrent vers l ' épidenne blessé et contribuent à sa guérison (Figure 1-10) (Alonso and Fuchs,

2003b; Laplante et al. , 2001). L ' emplacement des cellules souches dans le follicule pileux

assure ainsi leur protection contre les blessures superficielles de l ' épiderme (Lavker and Sun,

2000).

JtPld rmf

l'nIfklll~.'

\'oks d ,JU'ftftIlC rlu. dim • • • d « ·lIu .... ", •• c' d . ",.n."""1

Figure 1-10: Schématisation des différentes lignées cellulaires dérivant d'une cellule souche du poil

Schéma adapté de Alonso 2003(Alonso and Fuchs, 2003b).

Le principe de la division asymétrique propose qu'une cellule souche, suite à sa

mitose, donne naissance à 2 cellule-filles: une d'entre elles garde les caractéristiques d'une

cellule souche tandis que l'autre devient une cellule amplificatrice transitoire. Cette dernière

subit plusieurs cycles de multiplication et ses descendantes entament le processus de

différenciation terminale (Alonso and Fuchs, 2003a; Cotsarelis et al., 1999) (Figure 1-11). En

plus de leur cycle cellulaire long, d'autres particularités sont traditionnellement associées aux

cellules souches: (i) une capacité illimitée de se renouveler, (ii) la prolifération sous

21 ©Klistine Cuffley Lü X

l'influence de stimuli, par exemples pour les cellules souches cutanées: les conditions de

culture in vitro, l'induction d'un nouveau cycle du poil ou une blessure, (iii) un potentiel

élevé de prolifération in vitro , (iv) une morphologie peu différenciée (gros noyaux, peu

d' organites intracellulaires), (v) une faible activité mitotique in situ, ce qui permettrait aux

cellules souches de conserver leur génome intact et de minimiser les mutations possibles

(Lavker and Sun, 2000; Lyle et al. , 1999; Watt, 1998).

A

souche am plificatrices transitoires

Cellules différenciées

1 Couche cornée Bïfiii&~~ Couche

~~~~"""~~~.J1,~~~~_ 1 granuleuse

Couche épineuse: eIIuJn différenciées

Couche basale: cUu les southes

et ttlJuln amplifiu 'rices l ran.sltolres

Figure 1-11: Schématisation du processus de différenciation épidermique à partir d'une cellule souche

Schéma adapté de Alonso 2003 (Alonso and Fuchs, 2003a).

Le concept de niche fut élaboré pour expliquer la spécification du caractère souche

d'une cellule (Spradling et al. , 2001; Tumbar et al., 2004) (Figure 1-12). Cette niche serait

formée par exemple, des cellules souches elles-mêmes, des cellules voisines (cellules

engagées dans la différenciation et/ou cellules de soutien), de facteurs solubles tels les

facteurs de croissance et de matrice extracellulaire. L'ensemble de ces différents facteurs

contrôlerait la prolifération, la migration et la différenciation des cellules souches (Ohlstein et

al. , 2004).

soutien

10léculc d'adhé,_ion

E M

basale

Figure 1-12: Concept de niche des cellules souches

Schéma adapté de Spradling 2001 (Spradling et al., 2001).

22 © Kristine Cuffley/ LOEX

1.5 LA DIFFÉRENCIATION ÉPIDERMIQUE: DE LA CELLULE SOUCHE AU CORNÉOCYTE

Les coméocytes superficiels de l'épiderme sont constamment éliminés par les stress

mécaniques auxquels la peau est soumise. Ils sont remplacés continuellement à partir des

kératinocytes générés par les couches inférieures qui eux, subissent des modifications

biochimiques et structurales dont la plus importante est l'agrégation des filaments de

kératines et leur liaison de façon covalente avec différentes protéines d'assemblages. (Figure

1-13). La différenciation d'un kératinocyte à partir des cellules basales de l' épiderme

jusqu'au coméocyte mort prend environ 28 jours chez l'humain (Stevens, 1997). Ce type de

tissu a donc besoin d'une population de cellules souches qui assurent le renouvellement

constant de l'épiderme.

La couche basale est composée principalement de kératinocytes cuboïdaux ancrés à la

membrane basale sous-jacente par les hémidesmosomes et liés entre eux par des

desmosomes. Ces connexions assurent la cohésion entre les kératinocytes et augmentent la

stabilité mécanique de l'épiderme. Les cellules basales de l'épiderme renferment, au niveau

de leur cytoplasme, des filaments intermédiaires de kératines, en particulier les types 5 et 14.

L'expression de la K19 a également été identifiée dans les cellules souches de couche basale

(Michel et al., 1996). Étant donné leur forte activité mitotique, l'antigène de prolifération

cellulaire Ki67 est présent au niveau des cellules de la couche basale (Gerdes et al., 1983).

De nombreux facteurs sont impliqués dans le contrôle de la production et de la

différenciation des cellules épidermiques. En plus des changements morphologiques, le

kératinocyte subit de nombreux changements biochimiques. Le fait qu'une cellule de la

couche basale reste dans le groupe de celles qui se divisent ou qu'elle migre dans la couche

épineuse pour commencer sa différenciation serait contrôlé par un certain nombre

d'interactions faisant intervenir plusieurs facteurs de croissance. Le facteur de croissance

épidermique (EGF, epidermal growth factor), TGF -a et -~ (transforming growth factor-a et

-f3) et les cytokines interleukine-l a (IL-l a) et interleukine-6 (IL-6) semblent jouer des rôles

essentiels et distincts dans le contrôle de l'équilibre entre la prolifération et la différenciation

des cellules de la couche basale (Fuchs, 1990). Plusieurs gènes codant pour des protéines

structurales, telles les kératines et la filagrine, ainsi que des complexes de surface telles les

intégrines, sont hautement régulés tout au long du processus de différenciation (Byme et al.,

2003). Certains travaux suggèrent que les cellules souches seraient protégées de la

différenciation par l'expression accrue d'intégrines ~l à leur surface (Lavker and Sun, 2000).


De plus, une diminution d'expression de l'intégrine ~1 à la surface des kératinocytes de la

couche basale a été associée comme un stimulus du processus de différenciation terminale

(Watt and Jones, 1993).

Lorsque les kératinocytes de la couche basale migrent vers la couche épineuse,

l'expression de K5 et K14 diminue et apparaît celle des kératines 1 et 10 (Sun et al. , 1983).

De plus, les cellules de la couche épineuse synthétisent une protéine impliquée dans la

formation de la future couche cornée, soit l ' involucrine (Watt and Green, 1981).

Ensuite, les kératinocytes se dirigent vers la dernière couche nucléée de l'épiderme, la

couche granuleuse. Cette couche se caractérise par l'abondance des granules de

kératohyaline. La molécule constituant les grains de kératohyaline est la profilagrine, qui

dans la couche cornée, se transforme en filagrine devenant la matrice du cytoplasme des

cornéocytes (Dale, 1994). De plus, la loricrine, un autre précurseur de la couche cornée, est

également présente dans la couche granuleuse (Mehrel et al., 1990). Rendu à ce stade de la

différenciation, les kératinocytes commencent à mourir et leur membrane plasmique

commence à se désintégrer. Cette désintégration augmente leur perméabilité causant ainsi

une hausse de calcium intracellulaire qui résulte en une activation des enzymes

transglutaminases. Ceux-ci ont la capacité de former des ponts entre les protéines de

l'enveloppe cornée, rendant les cellules imperméables (Fuchs, 1990). Les MAPK (mitogen

activated protein kinase) sont également impliquées dans le processus de différenciation

terminale des kératinocytes. Entre autres la protéine DLK (dual leucine zipper-bearing

kinase) qui s'exprime au niveau de la couche granuleuse de la peau et de la gaine folliculaire

interne du follicule pileux (Germain et al., 2000). L'expression de cette kinase a été associée

à des changements phénotypiques survenant au cours de la différenciation terminale des

kératinocytes; dont la fragmentation de l'ADN, l'activation des transglutaminases,

l'augmentation de filagrine et la formation de la couche cornée (Robitaille et al., 2005).

La différenciation épidermique se termine par la mort programmée des kératinocytes

devenant cornéocytes. Au cours de ce processus, la profilagrine est clivée et déphosphorylée

et devient la filagrine. Celle-ci participe à l'agrégation des filaments de kératines (Dale,

1994) procurant imperméabilité et résistance aux cornéocytes.


Figure 1-13: La différenciation épidermique

Schéma adapté de Geras, 1990 (Geras, 1990).

1.6 PARTICULARITES DE LA PEAU MURINE

La peau de la souris présente certaines particularités par rapport à la peau humaine.

La principale différence est la présence abondante de follicules pileux recouvrant la souris.

L'épiderme interfolliculaire est presque inexistant. Malgré la ressemblance histologique,

l' épiderme murin ne possède que quelques couches de cellules vivantes (2-3)

comparativement à l'épiderme humain (3-5 couches).

1.7 LA PEAU RECONSTRUITE

Les progrès constants dans le domaine du génie tissulaire ont contribué à

l'amélioration des techniques de cultures cellulaires. Chez les grands brûlés, il est maintenant

possible de greffer des feuillets épidermiques autologues préparés in vitro. Le Laboratoire

d'Organogénèse Expérimentale (LOEX) fut le premier laboratoire au Canada à utiliser cette

forme de thérapie pour traiter les grands brûlés. Les feuillets sont préparés à partir de

kératinocytes isolés d'une biopsie de peau saine du patient (1 cm2). Les kératinocytes isolés

sont cultivés jusqu'à la formation d'un feuillet qui est ensuite greffé sur les sites lésés

(Germain et al. , 1993; Green et al., 1979). Après la prise de la greffe, les kératinocytes

s'attachent et forment un épiderme fonctionnel qui protège le patient des infections et de la

déshydratation. Ces feuillets épidermiques permettent la guérison plus rapide du patient et ne

25 ©Kristine Cuffley LOEX

sont pas rejetés puisqu'ils sont produits par les kératinocytes autologues. Cependant,

l'absence de la portion dermique ainsi que des annexes cutanées ne permet pas une

régénération complète de la peau avant deux à cinq ans, entre autres parce que la portion

dermique ne se réorganise que très lentement. Également au niveau de ces peaux les annexes

cutanées ne se régénèrent pas (Compton et al. , 1989). Ces lacunes ont mené au

développement de modèles tridimensionnels de peau reconstruite plus complète comprenant

un derme et un épidenne. Au LOEX trois modèles de peaux reconstruites in vitro sont à

l ' étude. Le premier modèle consiste à ensemencer des fibroblastes humains dans un gel de

collagène (Auger et al. , 1995; Bell et al. , 1979). Les fibroblastes sécrètent alors de la matrice

extracellulaire et se lient aux fibres de collagènes. Les kératinocytes sont ensuite ensemencés

à la surface du gel de collagène puis l'équivalent est positionné à l' interface air-liquide,

pennettant ainsi la différenciation épidennique (Prunieras et al., 1983). Cependant, le gel de

collagène n'offre qu'une faible résistance mécanique. En effet, en s'accrochant aux fibres de

collagènes, les fibroblastes les contractent en faisceau, ce qui peut faire diminuer la surface

de tissu de 80 % (Auger et al., 1995; Auger et al., 1998). Un système d'ancrage au fond du

flacon évite la contraction et pennet d'avoir une peau complète ayant les caractéristiques

d'une peau nonnale humaine (Lopez Valle et al. , 1992).

Une seconde approche a été développée en utilisant des biomatériaux colonisables par

les cellules et leur culture in vitro (Berthod et al., 1993). Ce modèle est basé sur l'utilisation

d'une éponge de collagène composée de collagène bovin de type 1 et III et de chitosane. Ce

dernier représente une innovation majeure dans ce type de modèle puisque les autres modèles

sont habituellement réticulés au glutaraldéhyde qui est un produit hautement toxique (Yannas

et al., 1980). Les fibroblastes humains sont ensemencés à la surface des éponges, qu'ils

colonisent très rapidement. Les kératinocytes humains sont ensuite ensemencés afin de

fonner la portion épidennique. Ces éponges représentent l'avantage de ne contracter que

faiblement et d'avoir une épaisseur et des dimensions facilement modulables (Berthod et al.,

1993; Berthod et al., 1994). Ce modèle d'éponge de collagène a entre autres pennis la

fonnation de pseudo-capillaires dans la matrice après l'ensemencement de cellules

endothéliales (Black et al., 1998). On nomme aInSI ces nouveaux capillaires, car leur

fonctionnalité n'a pas encore été établie.

Le troisième modèle qui est exclusif au LOEX, est un modèle tridimensionnel

développé par la technique d'auto-assemblage, comprenant une portion dennique constituée


de fibroblastes prélevés à partir d'une biopsie cutanée (Auger et al. , 2004; Auger et al. , 2000;

Michel et al. , 1999; Pouliot et al., 1999; Pouliot et al., 2002), secrétant leur propre matrice

extracellulaire grâce à l'addition d'acide ascorbique dans le milieu de culture (Geesin et al. ,

1988). Les kératinocytes sont ensemencés sur ces équivalents dermiques, sous des conditions

de cultures adéquates, permettant d'obtenir un substitut cutané composé de la portion

dermique et épidermique à l'image de la peau normale humaine. Ces peaux reconstruites sont

complètement autologues et dénuées de tout matériel exogène et présentent des propriétés

mécaniques très intéressantes. Par cette approche, il est possible d'introduire des follicules

pileux déjà formés au niveau des peaux reconstruites (Michel et al., 1999) ainsi que former

des vaisseaux sanguins exclusivement composés de cellules humaines (L'Heureux et al. ,

1998).

1.8 HYPOTHESE ET OBJECTIFS

Les cellules souches cutanées du follicule pileux sont à la base de la production et de

la régénération de la peau. Ce projet s'inscrit dans le cadre de travaux centrés sur la

caractérisation des cellules souches cutanées visant à évaluer leur potentiel de différenciation

à des fins de reconstruction tissulaire. La reconstruction d'organes par génie tissulaire repose

sur l'interaction entre différentes populations cellulaires isolées à partir d'un tissu, cultivées

et réassemblées de façon à reproduire in vitro les conditions nécessaires pour générer un tissu

semblable à celui d'origine. À cet effet, les cellules souches de la peau, qui possèdent un

vaste potentiel de prolifération et de différenciation ainsi qu'une capacité de renouvellement

infinie, représentent d'excellentes candidates pour la reconstruction de peau en laboratoire

par génie tissulaire.

Un grand défi dans l'étude des cellules souches est de comprendre les différents

mécanismes cellulaires impliqués dans leur différenciation en divers types cellulaires. Au

niveau de la peau, des études récentes démontrent que l'activation de la voie de signalisation

Wnt participe aux événements de régulation de la différenciation des cellules souches en

follicules pileux (Huelsken et al., 2001; Niemann et al., 2002; Zhou et al., 1995). À ce jour, il

n'existe aucun modèle de culture permettant la formation de follicules pileux in vitro.

L'étude des cellules souches et des mécanismes impliqués dans la différenciation

épidermique et folliculaire est très pertinente dans le développement d'annexes cutanées dans

les peaux reconstruites, qui devrait apporter une qualité supérieure au greffon. C'est pourquoi


au LOEX, le modèle de peaux reconstruites par auto-assemblage (Michel et al., 1999; Pouliot

et al. , 2002) a été adapté dans le but de fournir un environnement favorable aux cellules

souches cutanées et permettant d'évaluer leur potentiel de différenciation en follicule pileux

ou en d'autres types cellulaires (Larouche, 2005).

Le modèle consiste à incorporer des bourgeons de follicules pileux immatures (FPls)

de souriceaux nouveau-nés dans les peaux reconstruites par génie tissulaire. En effet, les FPls

contiennent entre autres des cellules souches folliculaires qui permettent la formation de poils

complets après leur greffe sur la souris (Larouche, 2005; Weinberg et al. , 1993). De plus, la

peau reconstruite par auto-assemblage est capable de soutenir la croissance des FPls en

follicules pileux matures suivant sa greffe sur la souris athymique (Larouche, 2005).

Cependant, seulement les peaux reconstruites ayant une portion dermique composée de

fibroblastes prélevés dans le derme de souriceaux nouveau-nés permettent aux FPls de

former des poils complets après la greffe, tandis que les FPls des peaux reconstruites ayant

une portion dermique faite à partir de fibroblastes de peau d'humains adultes développent

plutôt des kystes intradermiques après la greffe (Larouche, 2005). Le but de ces travaux était

donc d'évaluer l'influence des fibroblastes sur la différenciation des cellules souches dans les

peaux reconstruites par auto-assemblage cultivées in vitro en observant les différences

histologiques des épithélia obtenus ainsi que les variations dans l'expression de plusieurs

marqueurs de différenciation épidermique et de différenciation folliculaire. Étant donné

l'importance de la voie de signalisation Wnt dans le développement des follicules pileux,

quelques protéines effectrices spécifiques de cette voie ont été analysées afin d'approfondir

notre étude. Deux lignées cellulaires de fibroblastes ont été utilisées afin d'évaluer l'influence

des cellules dermiques sur la différenciation des cellules souches des follicules pileux. La

première lignée fibroblastique provient de dermes de souriceaux nouveau-nés et la seconde

lignée provient d'un derme humain adulte.

28 ©Kristine Cuft1ey LOEX

Chapitre 2 Matériels et méthodes

29 ©Kristine CuffleYI LOEX

2.1 EXTRACTION DES KERATINOCYTES ET DES FOLLICULES PILEUX IMMATURES

Les kératinocytes et les follicules pileux immatures (FPls) ont été extraits à partir de

peaux de souriceaux nouveau-nés C3H «24 heures) (Charles River Laboratories, Lasalle,

Québec) (Yuspa and Harris, 1974). Tout d ' abord, la peau a été traitée à la trypsine 0,25 %

(Intergen, Toronto, Ontario) contenant 400 J.lg/ml de DNAse durant une période de 16 heures

à une température de 4°C. La trypsine est une protéase qui brise les liens peptidiques entre les

cellules et la jonction denno-épidermique, alors que la DNAse est une enzyme qui digère

l 'ADN. Le derme a ensuite été séparé mécaniquement de l' épiderme à l ' aide de pinces. Les

kératinocytes de la portion épidermique ont été recueillis par une centrifugation à 2800 rpm,

pendant 30 minutes sur un gradient de lympholyte M (Cedarlane, Hornby, Ontario) afin de

séparer les kératinocytes des débris cellulaires. Puis, les kératinocytes ont été trypsinés une

seconde fois afin de briser les liens entre les cellules avoisinantes. Ils ont été ensuite

ensemencés sur des dennes reconstruits dans un milieu complet (DME-HAM complet)

optimisé pour la croissance des kératinocytes, composé de Dulbecco-Vogt Modification de

milieu Eagle (DME Gibco BRL, Burlington, Ontario) et de F12 HAM (Gibco BRL) dans une

proportion 3 : 1, additionnés à 5 % de sérum F etaI Clone II (Hyclone, PDI Biosciences,

Aurora, Ontatrio), 24,3 J.lg/ml d ' adénine (Sigma Chemicals, St-Louis, Mo), 5 J.lg/ml

d'insuline (Sigma), 0,4 J.lg/ml d'hydrocortisone (Calbiochem, La Jolla, CA), 5 J.lg/ml de

transférine (Boehringer Mannheim, Laval, Québec,), 10 - 10 M de toxine de choléra (ICN

Biomedicals, Montréal, Québec,), 10 ng/ml de facteur de croissance épidennique murin

(EGF, Sigma), 100 Dl/ml de pénicilline (Sigma) et 25 J.lg/ml de gentamicine (Scheering,

Pointe-Claire, Québec) en présence de 50 J.lg/ml d'acide ascorbique (Sigma).

Les FPls ont été obtenus suite à l'incubation de dennes de souriceaux nouveau-nés

«24 heures) dans une solution de collagénase lA (3,5 Jlg/ml) (Sigma) additionnée à 400

J.lg/ml de DNAse pendant 25 minutes à 37°C (Lichti et al. , 1993; Weinberg et al. , 1993). La

suspension cellulaire obtenue a ensuite été filtrée dans un tamis cellulaire (pores de 100 Jlm)

(Falcon, BDL, New Jersey) afin de séparer les FPls et les fibroblastes des agrégats. Puis,

dans le but de séparer les FPls des fibroblastes denniques, la suspension cellulaire filtrée a

subit trois centrifugations différentielles (400 rpm pendant 5 min). Par cette technique, les

FPls sédimentent en premier, ce qui pennet de les séparer grossièrement des fibroblastes

(Weinberg et al., 1993). Pour purifier davantage les FPls, le culot est filtré sur un tamis


cellulaire (pore de 30 J.lm) (Falcon). Les FPls ont été récupérés sur le filtre. Finalement, les

FPls (figure 2-1 B) ont été ensemencés dans un anneau d'ensemencement mesurant 2,25 cm

de diamètre sur les dermes reconstruits, soit l'équivalent d'un 1/2 derme de souris, dans un

milieu DME-HAM complet en présence d'acide ascorbique (figure 2-2).

Figure 2-1 : Follicules pileux immatures

Coupe histologique colorée au trichrome de Masson de peau de souris de 1 jour (A). Micrographie en contraste de phase des follicules pileux immatures (FPls) fraîchement

extraits (B). Barre de mesure 50 f..Dl1.

Souriceaux ~ ~ Fibroblastes dermiques

35 jours acide ascorbique

nouveau-nés~ ~ ~ ~ Épiderme dissocié:

~ Centrifugation Iympholite M

Trypsine 0 Q 8 16 heures ~ Superposition

",. b / ,~ ~~~ ___ d~e 2 feuillets

Séparation ~ derme-épiderme

Derme: Digestion collagénase

Ensemencement des cellules épithéliales

..... -FPI ~ Centrifugations différen tieUes

Culture à l'interface Air-liquide

Figure 2-2: Extraction des kératinocytes et des follicules pileux immatures et production des peaux reconstruites

2.2 CULTURE CELLULAIRE

Les fibroblastes humains utilisés lors de ces expériences proviennent d'une lignée

cellulaire déjà établie dans le laboratoire. Ils ont été extraits d'une biopsie de peau normale

humaine prélevée lors d'une réduction mammaire. Pour ce qui est des fibroblastes murins

utilisés, ils ont été extraits de peaux de souris nouveau-nés âgées de 2 jours. Brièvement les

31 ©Kristine Cuff1ey/LOEX

biopsies de peaux humaines ont été incubées dans une solution de thermolysine (Sigma)

durant 16 heures à une température de 4°C tel que décrit précédemment (Germain et al. ,

1995; Germain et al. , 1993). Par la suite, le derme et l ' épiderme ont été séparés

mécaniquement à l ' aide de pinces. Le derme a été incubé 16 heures dans une étuve sèche à

37°C dans 0,125 Ulml de collagénase H (Boehringer Mannheim, Laval, Québec) afin de

digérer la matrice de collagène entourant les fibroblastes. Les fibroblastes murins ont été

récupérés lors de l ' extraction des FPIs (voir section 2.2). Les fibroblastes sont cultivés dans

le Dulbecco-Vogt Modification de milieu Eagle (DME Gibco BRL) contenant 10 % de sérum

de veau fœtal (Hyclone) ainsi que 100 Ul/ml de pénicilline (Sigma) et 25 ~g/ml de

gentamicine (Scheering Inc.).

2.3 METHODE D'AUTO-ASSEMBLAGE

Les fibroblastes humains utilisés pour faire les feuillets proviennent d'une réduction

mammaire d 'une fille de 21 ans en passage cinq. Les fibroblastes murins quant à eux

proviennent de peaux de souris nouveau-nés (2 jours) en passage trois. Les fibroblastes ont

été ensemencés dans des flacons de 25 cm2 à une densité cellulaire de 6000 cellules/cm2. Ils

ont été cultivés dans du DME 10 % de sérum de veau fœtal additionné de pénicilline et

gentamicine en présence d'acide ascorbique (50 ~g/ml) permettant aux fibroblastes de

secréter leur matrice extracellulaire et de former des feuillets. Le milieu de culture à été

changé trois fois par semaine et les cellules ont été cultivées dans un incubateur à 37°C en

atmosphère humide contenant 8 % de CO2. Les feuillets de fibroblastes ont été cultivés

pendant environ 30 jours soit jusqu'à l'obtention de feuillets malléables. La portion dermique

des peaux reconstruites a été produite par la superposition de deux de ces feuillets afin

d'obtenir des dermes reconstruits plus maniable (Michel et al., 1999; Pouliot et al. , 2002).

Afin de permettre aux feuillets dermiques de fusionner ensemble, ils ont été cultivés

immergés dans le milieu de culture pendant une semaine avant que les kératinocytes et les

FPIs soient ensemencés. Les kératinocytes (600 000 cellules/cm2) et les FPls (1 /2

derme/5cm2) ont été ensemencés sur la matrice dermique délimitée par un anneau de 2,25 cm

de diamètre afin d'empêcher la solution cellulaire de fuir la zone d'ensemencement. Les

peaux reconstruites ont été cultivées dans du milieu DME-HAM complet toujours en

présence d ' acide ascorbique. Après 7 jours de culture en immersion, les peaux reconstruites

ont été cultivées à l'interface air-liquide, afin de permettre aux kératinocytes et aux FPIs de

32 ©Kristine Cuftley/LOEX

proliférer et de bien adhérer à la portion dermique. Le principe de la culture à l'interface air

liquide a été établi afin de stimuler la différenciation épidermique in vitro (Prunieras et al. ,

1983) (Figure 2-2). La portion dermique en contact avec le milieu est nourrie par celui-ci et

la surface de la portion épidermique étant à l'air libre permet la différenciation épidermique.

À ce stade, l'EGF n'est pas ajouté au milieu afin de favoriser la différenciation épidermique.

Afm d'avoir des résultats concluant, cette expérience a été répétée trois fois et pour

chaque expérience trois peaux reconstruites par condition ont été cultivées.

2.4 ANALYSES mSTOLOGIQUES

Des biopsies des peaux reconstruites ont été pnses après 7 jours de culture à

l'interface air-liquide. Ces biopsies ont été fixées dans une solution d'Histochoice™MB®

(Amresco, Solon, OH) ou de paraformaldéhyde 4 % et enrobées dans la paraffine. Des

coupes de 5 Jlm ont ensuite été réalisées à l'aide d'un microtome. Une coloration au

trichrome de Masson fut effectuée dans le but de faciliter la caractérisation histologique des

peaux reconstruites. Les observations ont été effectuées à l'aide d'un microscope Nikon

Eclipse E600 et les micrographies ont été prises par une caméra CCD Cool Snap.

2.5 DÉTECTION DE LA PHOSPHATASE ALCALINE ENDOGÈNE

Cette technique consiste à détecter l'activité de l'enzyme phosphatase alcaline

endogène. En effet les cellules fibroblastiques de la papille dermique expriment cette enzyme

(Handjiski et al., 1994). Pour ces analyses, les biopsies des peaux reconstruites ont été

enrobées dans l'OCT Tissue-Tek® (Miles Inc, Elkart, Indiana) et congelées. Des coupes de 5

Jlm ont été effectuées au cryostat, séchées 30 minutes à 37°C et conservées à -20°C. Après

décongélation, les coupes de tissus ont été fixées à l'acétone 100 % pendant 10 minutes à -

20°C suivi de trois lavages dans un tampon Tris-HCI 0,035M, pH 8. Par la suite, 50 ~l d'une

solution de révélation (tampon Tris-AMP 0,035M pH 8,7 [tampon Tris-HCI 0,035M; 0,1 M

NaCI; 0,05M 2-amini-2methyl-l,3 propandiol] contenant 1 g/l New Fushin, 1mM acide

naphtol-AS-BI-phosphorique) a été déposée sur chaque coupe et incubée pendant 15 minutes

à la température de la pièce tel que décrit dans Handjiski et al 1994 (Handjiski et al., 1994).

La réaction, qui mène à une coloration rouge-pourpre, fut arrêtée par un lavage dans un

tampon Tris-HCI 0,035 M, pH 6,5.


2.6 IMMuNomsTocmMIE

2.6.1 Immunofluorescence

Les antigènes d' intérêts ont été identifiés par l ' immunofluorescence indirecte. Cette

technique implique un anticorps primaire qui se fixe à un antigène spécifique sur une coupe

de tissus. Puis, la présence de l' anticorps primaire est détectée par un anticorps secondaire

couplé à un fluorochrome. La méthode indirecte augmente la sensibilité du marquage parce

que plusieurs molécules de fluorochromes se lient à chaque molécule d'anticorps primaire

par l'intermédiaire de plusieurs anticorps secondaires, augmentant ainsi la quantité de

lumière émise.

Pour les analyses d' immunofluorescence indirecte, les biopsies des peaux

reconstruites ont été enrobées dans l'OCT Tissue-Tek® (Miles Inc), congelées dans l'azote

liquide et conservées à -80°C. Des coupes de 5 ~m ont été effectuées au cryostat, séchées 30

minutes à 37°C et conservées à -20°C. Les coupes de tissus ont été décongelées à l'air libre

pendant quelques minutes. Puis, elles ont été fixées à l'acétone 100 % pendant 10 minutes à -

20°C suivi d'un rinçage dans un tampon PBS (phosphate buffer saline) (137 mM NaCl; 2,7

mM KC1; 6,5 mM Na2HP04; 1,5 mM KH2P04) additionné de MgCh (0,5 mM) et de CaCh

(0,9 mM) (deux éléments qui favorisent l'adhésion des anticorps). Ensuite, 25 ~l de

l'anticorps primaire (tableau 1) dilué dans du PBS supplémenté de 1 % d'albumine sérique

bovine (Sigma) (protéine servant à saturer tous les sites de fixation non spécifiques) a été

déposé sur les coupes de tissus. Les anticorps primaires ont été incubés pendant 45 minutes.

Ensuite, les anticorps secondaires (tableau 1) couplés à un fluorochrome ont été déposés (25

~l/coupe) sur les coupes pendant 30 minutes à la noirceur puisque la lumière peut diminuer la

fluorescence émise par le fluorochrome. Des rinçages au tampon PBS furent exécutés entre

les incubations des anticorps. Finalement, les noyaux ont été colorés avec une solution

Hoechst (Sigma), un agent qui s'intercale dans l'ADN permettant de visualiser les noyaux

des cellules, diluée selon un rapport 1 :100. Puis les coupes ont été rincées à l'H20. Les

marquages ont été observés au moyen d'un microscope à épifluorescence Nikon Eclipse

E600 (Nikon, Tokyo, Japon) et les micrographies ont été prises avec une caméra CCD Sensys

reliée à un système d'acquisition d'image. Pour les coupes contrôles l'anticorps primaire a

été omis pour être remplacer par du PBS supplémenté de 1 % d'albumine sérique bovine

(Sigma).

34 ©Kristine Cuffley /LOEX

2.6.2 Immunoperoxydase

La présence de l'antigène Ki67 (BD Biosciences, San Diego, California) a été mise

en évidence par une technique d'amplification à la streptavidine et à la biotine (Trousse Id

Labs Inc, London, Ontario). Le principe de cette technique est que l'anticorps primaire est

reconnu par un anticorps secondaire couplé à la streptavidine, une molécule qui peut lier

plusieurs molécules de biotines complexées à la peroxydase ce qui permet d' amplifier le

signal.

Les coupes de tissus ont été fixées à l' acétone 100 % pendant 10 minutes à -20°C, suivi

d'un rinçage au PBS additionné de MgCh et de CaCh. Ensuite 50 ~l/coupes de peroxyde

d'hydrogène 3 % ont été déposés pendant 10 minutes sur les lames afin d' inhiber les

peroxydases endogènes qui pourraient produire des marquages non-spécifiques. L'anticorps

primaire est ensuite incubé pendant 45 minutes, suivi de l'anticorps secondaire couplé à la

biotine pendant 30 minutes, séparé par trois rinçages au PBS. Par la suite, les coupes ont été

incubées pendant 20 minutes en présence d'une solution ayant le complexe

Streptavidine/peroxydase. Pour révéler l'activité de la peroxydase, les coupes sont incubées

dans une solution de 3,3 Diaminobenzidine (DAB), qui est le substrat de la peroxydase. En

dernier lieu, une contre-coloration à 1 'hématoxyline de Harris a été réalisée. Les observations

ont été réalisées à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse E600 et les micrographies ont été

prises par une caméra CCD Cool Snap.

2.7 ANALYSES MOLECULAIRES

2.7.1 Extraction des protéines

Les cellules des peaux reconstruites et peaux de souris âgées 7 jours ont été lysées

dans un tampon d'extraction (50 mM Tris-Hcl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1mM EDTA; 1%

Triton X-100, contenant des inhibiteurs de protéases [pepstatine, leupeptine, aprotinine]

(Complete™ proteases inhibitor cocktail, Roche, Laval, Qc) afin d'obtenir un concentré de

protéines totales. Toutes les étapes ont été faites sur glace ou à 4°C. Des biopsies d'environ 2

cm2 ont été prélevées des peaux reconstruites et déchiquetées à l'aide d'un polytron PT 3100

(Brinkmann, Mississauga, Ontario) à une vitesse de 27 000 rpm pendant 10 secondes. Cette

étape a été répétée trois fois. Ensuite, les échantillons ont été homogénéisés à l'aide d'un

sonicateur 250 (Branson, Danbury, Connecticut) à raison de trois fois (vitesse 8) pendant 5


secondes. Finalement, les échantillons ont été centrifugés à 15 000 rpm pendant 10 minutes

afin de récupérer le surnageant.

Pour l ' extraction des protéines nucléaires deux méthodes ont été utilisées. La

première méthode consiste à lyser les cellules des peaux reconstruites dans deux tampons

permettant l'extraction différentielle des protéines du cytosol et de celles du noyau. Des

biopsies de 2 cm2 ont été homogénéisées au polytron dans un tampon hypotonique (10 mM

HEPES, pH 7,9; 10 mM KCI; 1% Triton X-100; 1,5 mM MgCh; 0,5 mM DTT; 2 mM

Na3V04; contenant des inhibiteurs de protéases) à une vitesse de 27 000 rpm pendant 30

secondes. Ensuite, les échantillons ont été agités pendant 10 minutes à 4°C et centrifugés à 15

000 rpm pendant 20 minutes. Le surnageant, qui correspond à la fraction cytosolique, a été

recueilli et congelé à -80°C tandis que le culot, qui correspond à la fraction nucléaire, a été

resuspendu dans un tampon hypertonique (20 mM HEPES, pH 7,9; 420 mM NaCI; 1,5 mM

MgCh; 0,2 mM EDTA; 0,1 mM EGTA; 0,5 mM DTT; 2 mM Na3V04; 25 % de glycérol

contenant des inhibiteurs de protéases). Les échantillons ont été agités pendant 30 minutes à

4°C pour être ensuite homogénéisés à l'aide d'un sonicateur 250, trois fois pendant 5

secondes. Afin de purifier les extraits, une centrifugation à une vitesse de 15 000 rpm

pendant 10 minutes a été effectuée.

Afin de purifier davantage les échantillons une deuxième méthode d'extraction a été

utilisée. Cette méthode consiste à utiliser un gradient de sucrose (Hagenbuchle and Wellauer,

1992; Merdek et al. , 2004). Une biopsie de peau de souris âgée de 7 jours a été homogénéisée

dans 5 ml de tampon d'extraction (15 mM HEPES, pH 7,9; 60 mM KCI; 15 mM NaCI

contenant des inhibiteurs de protéases et 0,3 M de sucrose et 0,5 % Nonidet P-40) à l ' aide

d'un homogénéisateur Dounce (Kontes, VWR International Ltd., Montréal). Ensuite, l'extrait

a été versé dans un tube contenant 2,5 ml de tampon et 0,9 M de sucrose. Ce tube a été

centrifugé à une vitesse de 2000 rpm pendant 10 minutes afin d'enlever les débris cellulaires

et de concentrer les protéines nucléaires au culot. Une deuxième centrifugation a été

effectuée (2000 rpm, 10 min) et le culot a été resuspendu dans 5 ml de tampon d'extraction

(0,3 M de sucrose et 0,2 % de Nonidet P-40). La solution a été versée dans un tube contenant

2,5 ml de tampon et 0,9 M de sucrose. Le culot obtenu a été resuspendu dans un tampon de

lyse nucléaire (50 mM Tris-Hcl, pH 8; 250 mM NaCI; 2mM EDTA; 50 mM NaF; 0,1% SDS;

10 mM Na3V04; 1% Nonidet P-40 contenant des inhibiteurs de protéases) pendant 10

minutes sur glace et ensuite centrifugé à une vitesse de 15 000 rpm pendant 10 minutes.

36 ©Kristine Cuffley, LOEX

Tous les échantillons ont été conservés à -80°C jusqu'à l'utilisation et les protéines

ont été dosées selon la méthode Micro BeA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford,

Illinois).

2.7.2 Immunobuvardage

Les protéines (20 J.lg dans tampon Laemmli) ont été séparées sur un gel de

polyacrylamide 7,5% par la méthode SDS-PAGE puis transférées sur une membrane de

nitrocellulose (Amersham Biosciences, Baie d 'Urfé, Québec). Le marqueur de poids

moléculaire (Broad-range prestained SDS-P AGE standards, Biorad, Mississauga, Ontario) a

été utilisé pour évaluer le poids moléculaire relatif des protéines. Afin de bloquer les sites de

fixation non spécifiques, les membranes ont été incubées dans du TBS-Lait 5% (20mM de

Tris, pH 8; 150 mM NaCI et 5% de lait écrémé en poudre [Carnation]) pendant 1 heure à la

température de la pièce. Ensuite l'anticorps primaire K6IRS 1 (American Research Product

Inc TM, Belmont, Maryland) (Langbein et al., 2002), dilué dans du TBS-Lait 5%, a été incubé

pendant une heure à la température de la pièce sur un agitateur de membrane. L'anticorps

secondaire couplé à la peroxydase, également dilué dans du TBS-Lait, a été incubé pendant

une heure à la température de la pièce sur un agitateur de membrane. Par la suite, la présence

des anticorps couplés à la peroxydase a été détectée avec une solution ECL Plus (Amersham

Biosciences) par autoradiographie. Des rinçages au tampon TBS furent exécutés entre les

incubations des anticorps.

2.7.3 Rétention en gel (Electrophoretic mobility shift assay: EMSA)

La technique de rétention en gel permet de mettre en évidence des protéines,

habituellement des facteurs de transcription, interagissant avec l'ADN. Cette technique

consiste à faire migrer sur un gel de polyacrylamide une solution protéique contenant une

séquence courte d'oligonucléotides (15 à 30 nucléotides) marquée au 32p reconnue par la

protéine d'intérêt. Par rapport à la sonde seule, la migration d'un complexe protéine/sonde est

retardée et la formation de ce complexe peut être visualisée par autoradiographie. La

migration des sondes complexées aux protéines est suivie grâce au marquage radioactif au 32p

des sondes nucléotidiques.

Les analyses de rétention en gel ont été réalisées à partir d'extraits nucléaires des

peaux reconstruites et des peaux de souris âgées de 7 jours. Une sonde nucléotidique double


------------------------------~- ----

brin ayant le site de liaison spécifique au facteur de transcription Lef-l (5'

GACTGATCTTTGAACTCTCTTGCAGCTAGCGATC-3 ') a été chimiquement synthétisée à

partir de l' appareil Biosearch 8700 (Millipore). Environ 5 x 104 cpm de sondes

radiomarquées au 32p a été incubées avec 15 Jlg d'extraits nucléaires en présence de 500 ng

poly(dI-dC) (Pharmacia-LKB; Gaithersburg, MD) dans un tampon D (5 mM HEPES, pH 7.9;

10% glycérol [voVvol] ; 25 mM KCI; 0,05 mM EDTA, 0.5 mM dithiothreitol et 0,125 mM

PhMeS02F). Par la suite, les échantillons ont été incubés pendant 10 minutes à la température

de la pièce pour être ensuite séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 6% dans

un tampon Tris-Glycine (Schneider et al. , 1986). Les gels ont été séchés et la position des

complexes protéine-ADN formés a été révélée à -80°C par autoradiographie.

La spécificité de reconnaissance des sondes marquées peut être testée par l'ajout en

excès de la même sonde non-radioactive qui entre en compétition avec la forme radioactive.

Les essais de compétitions ont été effectués dans les mêmes conditions sauf qu'il y a eu

l ' ajout de 125 ou 250 fois plus de sondes non-radioactives aux échantillons, ayant soit le site

de liaison spécifique pour Lef-l (essai de compétition spécifique),

Spi (5'GATCATATCTGCGGGGCGGGGCAGACACAG-3 '), AP1(5'GATCCCCGCGTTGAG

TCATTCGCCTC-3 ') et NF1(5 '-GAAT TCCTCGAGGCAGTTATGTATTC-3 ') (essai de

compétition non spécifique).

La présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être mise en

évidence par l'ajout d'anticorps reconnaissant spécifiquement ces protéines. Lorsque des

anticorps sont ajoutés à la solution de protéines et de sondes, deux situations peuvent se

produire: 1) si l'anticorps se lie au site de liaison entre la protéine et la sonde, le complexe

protéine/sonde n'apparaîtra pas sur le gel, 2) si l'anticorps ne se lie pas au site d'interaction

entre la protéine et la sonde, le complexe protéine/sonde lié aux anticorps sera plus lourd et

sa migration sera retardée sur le gel d'électrophorèse. Ce retard s'appelle "supershift". Les

expériences de supershift ont été réalisées dans les mêmes conditions que les expériences

précédentes sauf qu'il y a eu l'ajout d'anticorps aux échantillons (Voir tableau 1 pour

quantité).


Tableau 1: Description des anticorps utilisés

Mar ua e en immuno uorescence Anticorps primaire Anticorps de lapin dirigés contre la loricrine (BabCo, Richmond, California)

Anticorps de lapin dirigés contre la Dlk (Douziech et al. , 1999)

Anticorps de chèvre dirigés contre Lef-1 (N-17) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)

Anticorps de lapin dirigés contre la ~-caténine (Cell Signaling, Beverly, Massachusetts)

Dilution Marqueur spécifique à 1/750 Marqueur de différenciation tardif de

l' épiderme (couche granuleuse)

1/200

1/50

1/100

Marqueur de la différenciation terminale des kératinocytes

Marqueur du facteur de transcription Lef-1 lors de l'activation de la voie Wnt dans les follicules pileux

Marqueur des membranes des cellules épidermiques et du noyau si la voie W nt est activée

Mar ua e en immuno Anticorps primaire Anticorps de souris dirigés contre Ki67 (BD Biosciences, San Diego, Califomia)

Dilution Marqueur spécifique à 1/400 Marqueur nucléaire lors de division

cellulaire

Mar ua e en western blot Anticorps primaire Anticorps de cochon d'Inde dirigés contre K6Irs (American Research Product Inc TM, Belmont, Maryland)

Anticorps de souris dirigés contre l'actine (Cedarlane, Homby, Ontario)

Dilution 1/1000

1/400

39

Marqueur spécifique à Marqueurs de la différenciation folliculaire (Gaine folliculaire interne)

Contrôle de chargement des puits

©Kri ,tine Cuffley/ LOEX

Anticorps primaire Marqueur spécifique à Anticorps de chèvre dirigés contre Lef-1 (N-17) (Santa Cruz Biotechno10gy)

Marqueur du facteur de transcription Lef-1 lors de l'activation de la voie Wnt dans les follicules pileux

Anticorps de souris dirigés contre le Tcf 3/4 (Sigma)

200 ng/J..t1 Marqueur du facteur de transcription Tcf 3/4

Anticorps de lapin dirigés contre la ~-caténine (Cell Signa1ing)

200 ng/Jl1 Marqueur des membranes des cellules épidermiques et du noyau si la voie Wnt est activée

Anticor s secondaire utilisés Anticorps secondaire

_ Anticorps de lapin anti-IgG de chèvre couplés à la Rhodamine (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania)

Anticorps de chèvre anti-IgG de lapin couplés à DTAF (Chemicon, Temecu1a, Ca1ifomia)

Anticorps de chèvre anti-IgG de cochon d'Inde couplés à la peroxydase (Chemicon)

Anticorps de chèvre anti-IgG de souris couplés à la peroxydase (Chemicon)

Anticorps anti-IgG de souris et anti-IgG de lapin couplés à streptavidine + Peroxydase biotiny1ée (kit Id Labs, London, Ontario)

40

Dilution 1/200

1/200

1/1000

1/6000

©K.ristine Cuffley/LOEX

Chapitre 3 Résultats


3.1 ApPARENCE MACROSCOPIQUE DE LA PEAU RECONSTRUITE IN VITRO

Environ 50 jours de culture sont nécessaires pour produire les peaux reconstruites.

Comme il a été mentionné auparavant, les feuillets de fibroblastes utilisés pour reconstruire la

portion dermique sont obtenus en 30 jours en moyenne. Lors de leur superposition, les

feuillets de fibroblastes sont transparents, minces et ils possèdent une certaine rigidité. En

effet, malgré les forces mécaniques exercées sur les feuillets lors de leur étalement nécessaire

à leur superposition, ceux-ci ne déchirent pratiquement pas. Après 7 jours additionnels de

culture, les kératinocytes murins ainsi que les follicules pileux immatures (FPls) sont

ensemencés sur les dermes reconstruits. Puis, les peaux reconstruites immergées dans le

milieu de culture sont cultivées pendant une semaine afm de permettre la prolifération des

kératinocytes. Les peaux reconstruites sont ensuite positionnées à l'interface air-liquide pour

permettre la différenciation des cellules épidermiques. Au fur et à mesure que la maturation

des peaux reconstruites progresse, plusieurs couches de kératinocytes s'organisent et la

différenciation des coméocytes contribue à la formation de l'opacité des peaux reconstruites

(Figure 3-1 A). Cependant, dans les peaux reconstruites ayant les FPls, des plages de lyse

apparaissent dans le tissu lors du processus de maturation en interface air-liquide (Figure 3-1

B). Puisque lors de la formation des follicules pileux, des enzymes sont sécrétées afin que le

follicule pileux pénètre dans le derme (Hardy, 1992), il est possible que les interactions entre

les FPls et le derme reconstruit dans notre modèle mènent à la production d'enzymes digérant

le derme, ce qui pourrait avoir contribué à la formation des plages de lyse.

Figure 3-1: Peaux reconstruite in vitro: Apparence macroscopique

Peaux reconstruites in vitro à partir de kératinocytes de souris (A) ou de FPls (B) après 14 jours de culture à l'interface air-liquide. Légende: FPls : follicules pileux immatures.

3.2. HISTOLOGIE DES PEAUX RECONSTRUITES

Les observations en microsopie optique des coupes histologiques des peaux

reconstruites à partir des kératinocytes de souris (Km) ont révélé un épiderme ayant les

42 ©K.ristine Cuffley/LOEX

caractéristiques histologiques d 'un épiderme de peau normale de souris et ce, tant au niveau

des peaux reconstruites comprenant un derme reconstruit fait à partir de fibroblastes murins

(Fm) ou humains (Fh) (Figure 3-2 A et B). L ' épiderme de ces 2 types de peaux reconstruites

possède 4 couches de différenciation et les cellules sont bien organisées. Les cellules de la

couche basale sont cuboïdales et tandis que les couches de cellules suprabasales présentent

les caractéristiques histologiques des couches épineuses, granuleuses et cornées. La

différence majeure entre les deux types de peaux est l ' épaisseur de l' épiderme. L ' épiderme

des peaux reconstruites à partir de fibroblastes humains est plus épais comparativement à

l ' épiderme des peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (Figure 3-2; voir également

Figure 3-3 A et B). Cette différence est probablement due au fait que les fibroblastes murins

interagissent avec les kératinocytes afin que ceux-ci forment un épiderme semblable à celui

de leur espèce, soit un épiderme d'environ 3-4 couches de cellules épidermiques. Il en est de

même pour la peau reconstruite à partir de fibroblastes humains où l'on retrouve 5-6 couches

d'épaisseur de cellules épidermiques. Les peaux reconstruites à partir de fibroblastes humains

ayant reçu les follicules pileux immatures (FPI/Fh) pour leur part développent un épiderme

complet (Figure 3-2 D) comprenant les 4 couches de différenciation épidermique (basale,

épineuse, granuleuse et cornée) mais aussi des sébocytes (données non présentées) et des

kystes intradermiques possédant des caractéristiques histologiques de différenciation

épidermique (Figure 3-2 E). En contact avec les dermes humains, les kératinocytes des FPls

se différencient vers l'intérieur au lieu de former des poils et les cornéocytes s'accumulent au

centre formant ainsi des kystes intradermiques qui grossissent avec le temps. Les peaux

reconstruites à partir de fibroblastes murins (Fm) où il y a eu ensemencement de FPls ne

présentent pas d'épiderme bien différencié. Dans ces peaux, il y a aussi eu apparition

d'inclusions intradermiques (Figure 3-2 C) mais ces inclusions n'ont pas les mêmes

caractéristiques histologiques de différenciation épidermique que celles retrouvées dans les

peaux reconstruites FPI/Fh. Les inclusions présentent plutôt des caractéristiques des cellules

de la gaine folliculaire externe des poils (2-3 assisses de cellules cuboïdales). Ces résultats

suggèrent que le derme humain favorise le sentier de différenciation épidermique des cellules

souches des FPls au lieu du sentier de différenciation folliculaire. Cependant, la

différenciation des sébocytes (données non présentées) est permise dans ces conditions. Ces

observations révèlent ainsi l'importance des fibroblastes utilisés dans la fabrication de peau

reconstruite par génie tissulaire sur la prolifération et la différenciation des cellules souches.


Fibroblastes murins Fibroblastes humains

Km

FPI

Figure 3-2: Histologie comparative des peaux reconstruites

Coupes histologiques de peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A et C) ou de fibroblastes humains (B, D et E) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls (C, D et E) après 7 jours de maturation à l 'interface air-liquide. Coloration au trichrome de Masson.

Barre de mesure: 50 f.1m excepté la figure E où 25 f.1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux immatures.

3.3 IMMUNOMARQUAGE DES PEAUX RECONSTRUITES

3.3.1 Analyse de la prolifération cellulaire

Afin de vérifier l'état de prolifération au niveau des cellules des peaux reconstruites,

un marquage de la protéine Ki67 a été effectué. Effectivement, la protéine Ki67 a été

identifiée comme marqueur spécifique des cellules ayant une forte activité mitotique (Gerdes

et al. , 1983). Au niveau des peaux reconstruites ayant reçu les kératinocytes épidermiques de

souris, le marquage de la protéine Ki67 a été identifié au niveau de la couche basale de

l'épiderme démontrant que les cellules basales sont en prolifération active (Figures 3-3 A et

B). Dans les peaux reconstruites ayant reçu les FPls, Ki67 est aussi présent dans la couche

concentrique externe, représentant la couche basale (Figure 3-3 C et D). Dans les peaux

reconstruites FPI/Fh, la contre coloration à l'hématoxyline de Harris permet de discerner les

grains de kératohyaline de la couche granuleuse des kystes intradermiques (Figure 3-3 D

*astérisque) ainsi qu'une accumulation de matériel anucléé au centre des kystes représentant

probablement des cornéocytes desquamés (Figure 3-3 D étoile). Ces deux caractéristiques

morphologiques sont spécifiques à la différenciation épidermique. La présence de Ki67 au

niveau des noyaux des cellules de la couche basale des peaux reconstruites ayant des FPls,

suggère que l'échec de la folliculogénèse complète n'est pas dû à un défaut de prolifération

des kératinocytes formant les FPls mais plutôt à un défaut de différenciation des cellules.


~----------------------------------------------------------~ -------------------------------------

ibrobla te .nurin ibrobla t.e· huma ·11

A ~~~k~

PI

Figure 3-3: Analyse de la prolifération cellulaire: Ki67

Immunomarquage du marqueur de prolifération cellulaire Ki67 dans les peaux reconstruites à partir defibroblastes murins (A et C) ou defibroblastes humains (B, D) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls (C et D) après 7 jours de maturation à l 'interface air-liquide. Barre de mesure: 50 f.1m (A et B) et 25 pm (C et D). Légende: Km : kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux immatures, * :grains de kératohyaline, * :cornéocytes.

3.3.2 Détection de la membrane basilaire de la peau

Dans la peau normale, les interactions entre le derme et l'épiderme permettent la

formation d'une membrane basilaire. Au niveau de la membrane basilaire, les laminines

jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire. Elles transmettrent entre autres des

informations morphogénétiques aux cellules avoisinantes via les récepteurs de la famille des

intégrines (Rousselle and Garrone, 1998). Afin de s'assurer de la présence de la membrane

basilaire dans les peaux reconstruites, le marquage de la laminine 5 et le marquage du

collagène IV, une autre composante de la membrane basilaire, ont été réalisés. Dans les

peaux reconstruites ayant reçu les kératinocytes, les marquages de la laminine 5 (Figure 3-4

A et B) et du collagène IV (Figure 3-4 E et F) ont été retrouvés tout au long de la jonction

dermo-épidermique. Dans les peaux reconstruites ayant reçu les FPIs, les marquages ont

45 ©Ktistine Cuffley/LOEX

également été identifiés au niveau de la jonction dermo-épidermique de même qu'autour des

kystes intradermiques (Figure 3-4 C, D, G et H). La présence de la laminine 5 dans nos peaux

reconstruites est intéressante, car celle-ci est essentielle au maintien de l'intégrité de la

membrane basilaire et au contrôle de la prolifération des kératinocytes sus-jacents via ses

interactions avec les intégrines (Nishiyama et al., 2000). Ces résultats suggèrent qu'il y a des

interactions entre le derme et l'épiderme permettant à ceux -ci d'échanger des messages tant

moléculaires que cellulaires.


~ -......l

@ r; :J. ~ 5" (!)

D ~ (!)

'< ? a ln ><

KmlFm Km/Fh FPI/Fm FPIlFh

Laminine 5

Collagène IV

Figure 3-4: Détection de la membrane basilaire: Laminine 5 et Collagène IV

Immunomarquage de la protéine laminine 5 (A, B, C, D) et du collagène IV (E, F, G, H) dans les peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A,C, E et G) ou defibroblastes humains (B, D, F et H) comprenant des kératinocytes (A, B, E et F) ou des

FP Is (C, D, G et H) après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide. Barre de mesure: 50 J1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPIs : follicules pileux immatures, Fm : Derme reconstruit à partir de fibroblastes

murins, Fh : Derme reconstruit à partir de fibroblastes humains.

3.3.3 Analyse de la différenciation épidermique

Dans la peau normale humaine et la peau de souris, la loricrine est exprimée par les

cellules de la couche granuleuse. Les peaux reconstruites à partir des kératinocytes

épidermiques de souris développent un épiderme possédant les caractéristiques histologiques

de l ' épiderme mais en plus, qui présente les marqueurs spécifiques à la différenciation

épidermique. En effet, la loricrine a été retrouvée au niveau de la dernière couche nucléée soit

la couche granuleuse de l'épiderme (Figure 3-5 A et B). La contre coloration au Hoechst

(Bleu), qui permet de colorer le noyau des cellules, a montré que les cellules basales nucléées

n'étaient pas marquées à la loricrine. Dans les peaux reconstruites FPVFh, le marquage de la

loricrine au niveau des kystes intradermiques a été retrouvé au niveau des couches

concentriques les plus internes des kystes. Le stade de différenciation de ces cellules

correspond probablement à celui des cellules de la couche granuleuse de l'épiderme. Dans les

kystes intradermiques des peaux reconstruites FPI/Fm, aucun marquage de la loricrine n ' a été

détecté suggérant que les kératinocytes ne prennent pas la voie de la différenciation

épidermique terminale (Figure 3-5 C). Par la suite, un marquage de la kinase DLK a été

réalisé au niveau des kératinocytes formant les kystes intradermiques dans les peaux

reconstruites FPVFh et FPIlFm. La kinase DLK est impliquée dans le contrôle du processus

de la différenciation terminale des kératinocytes épidermiques (Germain et al. , 2000;

Robitaille et al., 2005). Tel qu'attendu, le marquage de la kinase DLK a été détecté au niveau

de la couche granuleuse des kystes intradermiques dans les peaux reconstruites FPI/Fh

(Figure 3-6 B). La kinase DLK est également retrouvée au niveau de la gaine folliculaire

interne du follicule pileux (Germain et al., 2000). Cependant, les kératinocytes de la gaine

folliculaire interne ont des caractéristiques morphologiques très différentes des kératinocytes

épidermiques (Voir section 1.2.3.2) et morphologiquement, les kératinocytes exprimant DLK

dans les kystes des peaux reconstruites FPIIFh présentent plutôt l'aspect histologique des

cellules de la couche granuleuse de l'épiderme. Donc, le marquage retrouvé au niveau des

kystes représente probablement une activation du processus de différenciation terminal des

kératinocytes de l'épiderme et pas une activation de la différenciation de la gaine folliculaire

interne, tandis qu'aucun marquage n'a été décelé dans les peaux reconstruites FPVFm (Figure

3-6 A). Alternativement, l'absence d'expression de la DLK dans les couches plus internes

des kystes des peaux reconstruites FPI/Fm, en plus de faire état de la non-activation de la

cascade de signalisation impliquant DLK nécessaire à la différenciation de l ' épiderme,

48 ©Kristine Cuffiey/LOEX

suggère que la cascade impliquant DLK dans la différenciation de la gaine folliculaire interne

n'a également pas eu lieu.

Fibroblastes murins Fibroblastes humains

Km

FPI

Figure 3-5: Analyse de la différenciation épidermique: Loricrine

Immunomarquage de la loricrine dans les peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A et C) ou de fibroblastes humains (B, D) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls

(C et D) après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide.Barre de mesure: 50 f.1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPIs : follicules pileux immatures, ligne pointillée:

délimitation de la membrane basale.

49 ©Kristine Cuff1ey/LOEX

Fibroblastes murios Fibroblastes humains

FPI,

Figure 3-6: Analyse de la kinase DLK

Immunomarquage de DLK dans les peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A) ou defibroblastes humains (B) comprenant des FPls après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide. Barre de mesure: 50 f.1m. Légende: FPls : follicules pileux

immatures.

3.3.4 Analyse de la différenciation folliculaire

Les cellules de la gaine folliculaire interne du poil expriment certaines kératines

spécifiques. Afin de vérifier si les kératinocytes présents dans nos peaux reconstruites

démontraient des signes de différenciation de la gaine folliculaire interne, la présence de la

kératine K6IRS 1 a été évaluée par immunobuvardage (western blot) (Langbein et al., 2002).

Ainsi, contrairement aux peaux de souris âgées de 7 jours dont les poils sont matures et où la

gaine folliculaire interne est bien différenciée et dans laquelle la protéine K6IRS 1 a été

détectée à un niveau important, un très faible signal a été détecté dans les peaux reconstruites

cultivées, et ce, autant celles avec des kératinocytes épidermiques que celles avec des FPls

(Figure 3-7). L'immunobuvardage de l'actine a été effectué pour contrôler la quantité de

protéines chargées dans chaque puits et démontre qu'elle était équivalente (Figure 3-7).


- 208 ~ en E ~ E ~ -119 .~ 11. 11. 11. 11. - 99 ::1 :::::: :::::: ........ E 0 a. a. E en 11. 11. ~ ~

K6IRSI _52 Actine

-31

Figure 3-7: Analyse de la différenciation folliculaire: K6lRSl

l mmunobuvardage de la protéine K6lRSl de peau de souris âgées de 7 jours, de peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (Fm) ou de fibroblastes humains (Fh)

comprenant des kératinocytes ou des FPls après 7 jours de maturation à l 'interface airliquide. L ' actine est un contrôle de chargement des puits. Légende: Km : kératinocy tes de souris, FPls : follicules pileux immatures, Fm : Derme reconstruit à partir de fibroblastes

murins, Fh : Derme reconstruit à partir de fibroblastes humain.

3.3.5 Détection de la phosphata se alcaline endogène

La phosphatase alcaline est une enzyme retrouvée au niveau des fibroblastes de la

papille dermique (Handjiski et al., 1994). Afin de s'assurer que les FPIs dans les peaux

reconstruites possèdent les fibroblastes de la papille dermique, la détection de la phosphatase

alcaline endogène a été effectuée. L'activité de la phosphatase alcaline a été retrouvée au

niveau des deux types de peaux reconstruites à partir de FPIs (Figure 3-8 C et D). Ces

résultats suggèrent que l'échec d'une folliculogénèse complète au niveau des peaux

reconstruites à partir de FPIs n'est pas causé par l'absence des fibroblastes de la papille

dermique car ceux-ci sont présents au niveau des peaux reconstruites. Dans les peaux

reconstruites à partir de kératinocytes murins cultivées sur les dermes humains, la

phosphatase alcaline endogène n'a pas été détectée. Cependant dans les peaux reconstruites à

partir de kératinocytes murins cultivées sur derme murins la phosphatase alcaline a été

observée au niveau du derme et ce dû au fait que les fibroblastes proviennent de souris

nouveau-nés et que dans ces fibroblastes il y a probablement présence de fibroblastes de la

papille dermique.

51 ©Kristine Cut11ey/LOEX

Km

FPI

Fibroblastes murins Fibroblastes humains B

D

-Figure 3-8: Détection de la phosphatase alcaline endogène

Détection de la phosphatase alcaline endogène au niveau dans les peaux reconstruites à partir defibroblastes murins (A et C) ou defibroblastes humains (B et D) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls (C et D) après 7 jours de maturation à l 'interface airliquide. Barre de mesure: 50 pm. Légende :Km: kératinocytes de souris, FPls : follicules

pileux immatures.

3.3.6 Analyse de la voie de signalisation Wnt

3.3.6.1 Détection par immunofluorescence

Tel que décrit auparavant, la voie de signalisation Wnt joue un rôle primordial dans le

développement des follicules pileux. Dans les peaux reconstruites ayant les follicules pileux

immatures (FPIs), l'échec d'une folliculogénèse complète est peut-être la conséquence d'un

défaut de signalisation de la voie Wnt. Afin de vérifier cette hypothèse, la présence de deux

effecteurs de la voie Wnt a été évaluée par immunofluorescence, soit la f3-caténine et le

facteur de transcription Lef-l. Dans les noyaux des kératinocytes du bulbe des follicules

pileux de souris âgées de 7 jours, l'expression de Lef-l et de la f3-caténine a été identifiée

(Figure 3-9 A et B). La figure 3-9 C montre la colocalisation nucléaire de f3-caténine et de

52 COKristine Cuffley LOI:X

Lef-1 (marquage jaune) suggérant une activation de la voie Wnt. Dans les peaux reconstruites

à partir des kératinocytes ou des FPIs, le marquage nucléaire de ces molécules était absent

(Figure 3-10 A-L). Cependant la ~-caténine a été détectée au niveau des membranes

cellulaires, endroit où elle se retrouve dans le complexe des jonctions adhérentes (Akiyama,

2000). Ces résultats suggèrent que l ' absence d ' activation de la voie de signalisation Wnt

pourrait être la cause de l ' échec d'une folliculogénèse complète dans les peaux reconstruites

ayant des FPIs.

Figure 3-9: Analyse de la voie de signalisation Wnt (f3-caténine et Lei1): expression dans la peau de souris

Immunomarquage de Lei 1 (A) et de la f3-caténine (B) sur des coupes de follicules pileux de peaux d 'une souris âgées de 7 jours. Superposition du marquage de la f3-caténine et de Lei1

(C) démontrant la colocalisation Oaune) ainsi qu'une superposition du marquage Hoechst (D) (bleu) démontrant la position des cellules.

Barre de mesure: 50 pm.


Lef 1 B caténÎne S upe rposition

KmlFm

KmfFb

FPI/Fm

FPI/Fb

Figure 3-10: Analyse de la voie de signalisation Wnt (f3-caténine et Lef-l): expression dans la peau reconstruite

lmmunomarquage de Lef-l (A, D, G et J) et de la f3-caténine (B, E, H et K) de peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A, B, C, G, H et 1) ou de fibroblastes humains (D, E, F, J, K et L) comprenant des kératinocytes (A B,C, D, E et F) ou des FPls (G, H, l, J,

K et L) après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide. Superposition des marquages de Lef-l, f3-caténine et Hoechst des peaux reconstruites (C, F, l et L).

Barre de mesure : 50 J.1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux immatures, Fm : Derme

reconstruit à partir de fibroblastes murins, Fh : Derme reconstruit à partir de fibroblastes humains.


3.3.6.2 Détection par gel de rétention (EMSA)

Afin de confirmer l ' absence du facteur de transcription Lef-l dans les peaux

reconstruites, des études préliminaires par la méthode de gel de rétention ont été réalisées.

Ces études ont seulement été effectuées une fois , il sera donc nécessaire de les refaire, afin de

confirmer les résultats obtenus. Tout d ' abord, afin de vérifier l'efficacité de la sonde Lef-1

utilisée, des essais de compétition ont été réalisés à partir d'extraits nucléaires de peaux de

souris âgées de 7 jours. Les extraits nucléaires ont été mis en présence de la sonde Lef-1

marquée au 32p en plus de 4 différentes sondes non-radioactives soit: Lef-l , Sp 1, NF 1 et

API à des concentrations de 125 ou 250 fois plus que la sonde marquée (Figure 3-11 A).

Seulement les deux bandes de la figure 3-11 A, indiquées par des flèches , correspondent à la

formation d'un complexe spécifique à Lef-l. En effet, la disparition des deux bandes en

présence d 'un excès de sonde Lef-1 non-marquée indique que ces deux bandes représentent

bien des complexes sonde-protéine spécifiques au facteur Lef-1. Pour les essais de supershift,

les extraits nucléaires ont été obtenus par gradient de sucrose afin de purifier davantage les

échantillons. C'est probablement pour cette raison qu'il y a présence d'une seule bande

spécifique à Lef-1. Les études de supershift ont démontré la présence de Lef-l dans les peaux

de souris âgées de 7 jours. La disparition de la bande lors de l'ajout de l ' anticorps Lef-1

confirme la présence de la protéine Lef-1 dans le complexe ADN-protéine formé (Figure 3-

Il B, couloir 3). Afin de vérifier s'il y avait la formation du complexe Sonde-Lef-1-B

caténine, l'anticorps B-caténine a été ajouté aux extraits nucléaires. La figure 3-11 B couloir

4 démontre un supershift mais plus faible que celui retrouvé lors de l'ajout de l ' anticorps Lef-

1. Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait que dans les cellules des follicules pileux, Lef-1

est présent dans les cellules de la papille dermique, de la matrice, du précortex et cortex,

tandis que la B-caténine nucléaire est seulement présente à partir des cellules du précortex et

du cortex (Kobielak et al. , 2003) (voir Figure 4.1 section 4.1.3), donc la bande présente

pourrait corresponde à la protéine Lef-1 dans les cellules de la papille dermique et le

supershift aux cellules du cortex et du précortex. Afin de s'assurer de la spécificité des

anticorps, la sonde a été incubée avec un sérum IgG de lapin, qui n'altère pas la présence du

complexe sonde-protéine (Figure 3-11 B couloir 5).

55 ©Kristine Cuftley/ LOEX

'ouris 7j

A) B) •

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5

Figure 3-11: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux de souris âgées de 7 jours.

Les expériences de rétention en gel ont été réalisées à partir d'extraits nucléaires de peaux de souris âgées de 7 jours. Les échantillons des essais de compétitions ont été incubés avec

la sonde Lef-l marquée au 32 P ainsi que les sondes non-radioactives: Sp l, NF l, APl et Lef-1 (A). Les 2 flèches indiquent les bandes spécifiques à la sonde Lef-l (A). Pour les essais de

supershift 1 J.1g d'anticorps (Lef-l, fJ-caténine, IgG) a été ajouté aux échantillons (B).II y a eu supershift de la bande lors de l'ajout de l'anticorps Le!l et fJ-caténine. Aucun supershift n 'a

été détecté lors de l'ajout du sérum IgG de lapin (contrôle).

Au niveau des peaux reconstruites, les essais de compétitions ont révélé deux bandes

(indiquées par des flèches), qui disparaissent lors de l'ajout d'un excès de sonde Lef-l non

marquée, spécifiques à la sonde Lef-l (Figure 3-12 A). Cependant, aucun supershift n'a été

détecté lors de l'ajout de l'anticorps Lef-l au niveau des extraits nucléaires des peaux

reconstruites, suggérant l'absence de la protéine Lef-l au niveau des peaux reconstruites

(Figure 3-12 B couloir 3, 8, 12, 16). Ce n'est donc pas le facteur Lef-l qui se lie à la sonde

Lef-l. Afin d'élucider quelles protéines pourraient se lier à la sonde Lef-l, l'anticorps Tcf-

3/4 a été ajouté aux extraits nucléaires. Il y a eu alors un faible supershift au niveau des peaux

reconstruites à partir de fibroblastes humains comprenant des kératinocytes murins (K murins

IF humains) (Figure 3-12 B, couloir 4). Comme décrit auparavant, les protéines Tcf-3 et Tcf-

4 ont le même site de liaison à l'ADN que Lef-l (Zhou et al., 1995) mais jouent des rôles

56 ©K.ristine Cuftley/LOEX

différents (DasGupta and Fuchs, 1999; Menill et al. , 2001). Dans les autres peaux

reconstruites aucun supershift n'a été détecté avec l'ajout de Tcf 3/4 (Figure 3-12 B, couloir

9, 13, 17). Dans les échantillons nucléaires de peaux de souris, la protéine Lef-l a été

détectée contrairement aux peaux reconstruites où la protéine Lef-l semble absente. Ces

résultats suggèrent que l'absence de la protéine Lef-l au niveau des peaux reconstruites ayant

des FPls, pourrait être la cause de l'échec d'une folliculogénèse complète. Cependant ces

résultats sont des données préliminaires et les expériences devront être reprises afin de

confirmer les résultats obtenus.


K murin IF humain

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

K murins/F murins FP./ F humains FPI/F murins

'S'~,)- ~,)' ~ ..... )' ~~~~""')û ~~0û ~~~"-j

"'~ ",'" .~ -,"- ..... 0iJ ",'l' ~ ~"- ,~ "'~ ~ "r... . • B)

F

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Figure 3-12: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux reconstruites

Les expériences de rétention en gel ont été réalisée à partir d'extraits de peaux reconstruites. Les échantillons des essais de compétitions ont été incubés avec la sonde Lef-l marquée au

32 P ainsi que les sonde non-radioactives: Sp 1, NF 1, APl et Lef-l (A). Les 2 flèches indiquent les bandes spécifiques à la sonde Lef-l (A). Pour les essais de supershift, 1 f.1g d'anticorps

(Lef-l , Tcf 3/4, IgG) a été ajouté aux échantillons (B).II y a eu supershift de la bande lors de l'ajout de l 'anticorps Tcf 3/4 ( couloir 4). Aucun supershift n'a été détecté lors de l 'ajout du sérum IgG de lapin (contrôle).Légende : K: kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux

immatures, F : fibroblastes.

58 © Kristine Cuflley/ LOEX

4.1 DISCUSSION

4.1.1 Le génie tissulaire

Le génie tissulaire est un domaine biomédical en plein essor. La reconstruction

d ' organes par génie tissulaire repose sur l ' interaction entre différentes populations cellulaires

isolées et cultivées in vitro de manière à reproduire les conditions nécessaires pour la

conception d 'un tissu tridimensionnel semblable à celui d 'origine. Le LOEX a développé une

expertise unique au Canada en génie tissulaire, réparti selon quatre axes principaux: cutané,

vasculaire, orthopédique et oculaire. La reconstruction des tissus cutanés demeure toutefois

l 'une des priorités de ce laboratoire pour le traitement des grands brûlés. En 1986, la

première transplantation d ' épiderme pour le traitement des grands brûlés a été réalisée au

Canada et ce, grâce à l'expertise du LOEX. Au cours des dernières années, le génie tissulaire

a contribué à l'amélioration des techniques utilisées pour le traitement des brûlures sévères. Il

y a 25 ans, les chances de survie des grands brûlés étaient pratiquement nulles. Aujourd'hui,

il est possible de guérir des patients brûlés à plus de 900/0 de leur surface corporelle totale,

grâce à l'amplification de leurs propres cellules épidermiques en culture. Étant donné que la

reconstruction d'organes repose sur l'isolement de cellules ayant un vaste potentiel de

prolifération et de régénération, les cellules souches de la peau représentent donc

d ' excellentes candidates pour le génie tissulaire.

4.1.2 Les peaux reconstruites par la méthode d'auto-assemblage

Les peaux reconstruites selon la méthode d'auto-assemblage possèdent de

nombreuses similarités avec la peau normale humaine. Elles sont composées d 'un épiderme,

et d 'un derme, procurant l'élasticité et la souplesse aux peaux. Malgré l'absence des annexes

cutanées, les peaux reconstruites constituent d'excellents modèles pour l' étude de la

différenciation épidermique. La qualité première de la peau reconstruite in vitro est l'absence

de matériel synthétique ou exogène, évitant ainsi les risques de rejet de la part du système

immunitaire du patient. La portion dermique est composée de fibroblastes humains sécrétant

leur matrice extracellulaire en présence d'acide ascorbique. En fait, l'acide ascorbique

augmente la synthèse d'ARNm du pro collagène chez les fibroblastes (Chan et al. , 1990;

Geesin et al. , 1988) et est un co-facteur de l'enzyme qui permet 1 'hydroxylation post

transcriptionnelle de la lysine et de la proline du procollagène et qui rend possible son

60 © Kristine Cuftley/LOEX

assemblage en fibres de collagènes. Grâce à l ' ajout de l ' acide ascorbique dans les cultures,

les fibroblastes sécrètent davantage de collagènes et surtout, le collagène peut s ' assembler en

triple hélice (Rata and Senoo, 1989; Murad et al. , 1983), formant ainsi un tissu cohésif. Après

environ 30 jours de culture, un feuillet de fibroblastes est obtenu et superposé à un autre

feuillet pour former l ' équivalent dermique. Puis, des kératinocytes y sont ensemencés pour

former la portion épidermique. Une semaine plus tard, la peau reconstruite est installée à

l' interface air-liquide, c ' est à dire que le derme est nourri par le milieu de culture et

l ' épiderme est en contact avec l ' air environnant. L ' épiderme formé possède les quatre

couches caractéristiques de l ' épiderme soit la couche basale, la couche épineuse, la couche

granuleuse et la couche cornée et les cellules expriment adéquatement les protéines associées

à ces couches (Michel et al. , 1999). La présence de protéines de la membrane basilaire au

niveau de la jonction entre le derme et l'épiderme suggère une liaison solide entre l' épiderme

et le derme, et la laminine 5 et le collagène IV participent probablement au contrôle de la

différenciation des kératinocytes (Fuchs, 1990). La différenciation terminale des

kératinocytes de l'épiderme ou du follicule pileux implique aussi plusieurs changements

biochimiques à l'intérieur des cellules notamment le changement dans l'expression des

kératines. À cet égard, il serait intéressant d'évaluer la présence des kératines retrouvées dans

la différenciation épidermique telles les K5/KI4, et celle de la différenciation folliculaire

telle la K17. Les peaux reconstruites produites par auto-assemblage permettent non

seulement de perfectionner le traitement des grands brûlés, mais également de développer de

nouveaux outils pour des études fondamentales au niveau de la peau, telle que l'élucidation

des mécanismes impliqués dans la différenciation des cellules souches.

4.1.3 Caractérisation des peaux reconstruites

Des études antérieures ont démontré que la maturation in vivo, soit la greffe des

peaux reconstruites FPI/Fm sur des souris athymique, mène à la formation de poils complets.

La greffe des peaux reconstruites FPIlFh pour leur part, forment des kystes intradermiques

après leurs greffe (Larouche, 2005). Il en est de même in vitro où les peaux reconstruites

évoluent différemment, dépendamment des fibroblastes utilisés pour former la portion

dermique. Au niveau des peaux reconstruites à partir de kératinocytes de souris la différence

majeure est l'épaisseur de l'épiderme. Tandis qu'au niveau des peaux reconstruites à partir de

FPIs, les kystes intradermiques formés possèdent des caractéristiques morphologiques et


biochimiques différentes selon l' espèce des fibroblastes utilisés pour la reconstruction de la

portion dermique. Les fibroblastes semblent donc jouer un rôle très important dans le

contrôle de la destinée de différenciation des cellules souches folliculaires.

Les immunomarquages effectués sur les peaux reconstruites ont montré l' expression

de la protéine Ki67 au niveau des cellules de la couche basale des épidermes reconstruits à

partir des kératinocytes et dans la couche la plus externe des kystes dérivant des FPIs. Ce

résultat suggère que l ' incapacité des peaux reconstruites à soutenir la formation des poils à

partir des FPIs n'est pas due à un problème de prolifération mais plutôt à un changement de

programme de différenciation.

L'expression de plusieurs protéines retrouvées au cours du processus de

différenciation épidermique telles la loricrine et la DLK a été observée au niveau des peaux

reconstruites. L'expression de la loricrine au niveau des cellules des couches les plus internes

des kystes intradermiques des peaux FPI/Fh suggère que les cellules souches, présentes

initialement dans les FPIs, se sont engagées dans le processus de différenciation épidermique

au lieu de folliculaire. Alternativement, l'absence de la loricrine dans les cellules des kystes

intradermiques des peaux reconstruites FPI/Fm, suggère que le processus de différenciation

épidermique ne s'est pas entamé. La kératine K6IRS 1, une kératine exprimée au niveau des

cellules de la gaine folliculaire interne (Langbein et al. , 2002) n'a pas été détectée

significativement au niveau des peaux reconstruites FPI/Fh supportant l'hypothèse d'une

différenciation épidermique. Dans les peaux reconstruites FPI/Fm, les kystes dérivant des

FPIs n'ont pas présenté les caractéristiques généralement associées à la différenciation

épidermique. Cependant, l'absence d'expression de K6IRSl et de DLK, cette dernière étant

exprimée par les kératinocytes de la gaine folliculaire interne chez l'humain (Germain et al.,

2000) dans les peaux FPVFm suggère que la différenciation de la gaine folliculaire interne

n'a pas eu lieu.

Finalement, tel que décrit dans la littérature (Huelsken et al., 2001; Millar, 2002;

Schmidt-Ullrich and Paus, 2005), une co-localisation de la p-caténine et du facteur de

transcription Lef-l a été observée au niveau des kératinocytes du bulbe des follicules pileux

des souris âgées de 7 jours témoignant de l'activation de la voie Wnt. Par contre, ni Lef-l ni

p-caténine n'ont été détectés dans les kératinocytes des kystes intradermiques des peaux

reconstruites FPI/Fh. De façon intéressante, ces kystes sont très similaires à ceux observés

par l'équipe de Huelsken qui a étudié les souris transgéniques exprimant une B-caténine

62 ©Kristine Cuftley LOEX

mutée pendant l'embryogenèse par la méthode Cre/loxP au niveau des follicules pileux et

dont les cellules souches adoptaient un destin de différenciation épidermique (Huelsken et al.,

2001). Cela supporte l'hypothèse qu'une absence d'activation de la voie Wnt dans les peaux

reconstruites des peaux FPIIFh est impliquée dans la formation des kystes à caractère

épidermique. Les kystes intradermiques retrouvés au niveau des peaux reconstruites FPIlFm

pour leur part, sont plutôt similaires aux kystes observés dans la peau des souris

transgéniques n'exprimant pas le récepteur BMP lA. En effet, une activation des récepteurs

BMP lA serait requise à la transcription des gènes régulés par le complexe p-caténinelLef-1

parce qu'en l'absence de ce récepteur, la différenciation des cellules de la matrice des

follicules pileux en cellules de la tige et de la gaine folliculaire interne n'a pas lieu (voir

Figure 4-1) (Kobielak et al., 2003). Dans les peaux reconstruites FPIlFm, il est possible que

les cellules souches du follicule pileux aient généré les kératinocytes de la gaine folliculaire

externe mais que le contrôle de la différenciation en gaine folliculaire interne et en tige,

orchestré entre autres par la voie Wnt, était inadéquat.

L'inhibition de BMPRla est requise pour l'expression du gene Lef-1

L'activation de BMPRla est requise pour l'acti.vation des gènes régulés par le complexe Lef-l/~-caténine via la signalisation de Wnt

Papille dermique L.ef1# ....

Figure 4-1: Modèle suggérant que les différents niveaux d'expression des BMPs contrôlent l'expression du complexe Lefl/fJ-caténine au cours de la différenciation des lignées

cellulaires dérivant des cellules souches du follicule pileux

Schéma tiré de Kobielak 2003 (Kobielak et al., 2003).

63 ©Ktistine Cuffley/LOEX

4.2 CONCLUSION

Le génie tissulaire permet de faire un lien entre la recherche fondamentale et la

recherche clinique. Ainsi, c'est le besoin clinique qui dicte la construction d 'un type

particulier de tissu en laboratoire. Alternativement, lorsque les connaissances fondamentales

seront approfondies par la recherche, la création d'équivalents tissulaires greffables sur le

corps humain aura une portée clinique importante.

L ' évolution constante dans le domaine du génie tissulaire a contribué au

perfectionnement des peaux reconstruites. Cependant ces peaux reconstruites ne sont pas

assez complètes pour fournir un greffon possédant toutes les caractéristiques de la peau

normale humaine. La possibilité de reconstruire in vitro des peaux capables de soutenir la

croissance des follicules pileux apporterait plusieurs qualités supplémentaires aux greffons.

En effet, en plus d'être un réservoir de cellules souches, le follicule pileux peut détecter des

stimuli mécaniques et les glandes sébacées annexées au poil produisant du sébum,

contribuent à l'hydratation de la peau. Le développement de peaux reconstruites permettant

la formation des follicules pileux apporterait donc une qualité supérieure aux greffons. Le

traitement des blessures cutanées profondes serait amélioré ainsi que leur guérison. Ces

peaux reconstruites pourraient également être utilisées pour des tests pharmacologiques et

toxicologiques. De toute évidence, la compréhension des cellules souches cutanées est

primordiale pour l'amélioration des peaux reconstruites. En raison de son accessibilité et de

son habileté de régénération, le follicule pileux représente un excellent modèle pour l'étude

de la différenciation des cellules souches. En résumé, nous avons produit différents modèles

de peaux reconstruites dans lesquels les conditions recréées affectent différemment le

programme de différenciation des kératinocytes. Les peaux reconstruites produites par auto

assemblage permettent non seulement de perfectionner le traitement des grands brûlés, mais

également de développer de nouveaux outils pour des études fondamentales au niveau de la

peau, telle que l'élucidation des mécanismes impliqués dans la différenciation des cellules

souches.

4.3 PERSPECTIVES FUTURES

En perspective, il serait intéressant de vérifier si une stimulation ectopique de la voie

Wnt dans les peaux reconstruites, par exemple par l'ajout de lithium au milieu de culture,

permettrait de poursuivre la différenciation folliculaire des follicules pileux immatures. En

64 ©Krlstine Cuftley LOEX

effet, il fut démontré que le lithium peut inhiber les membres de la famille GSK-3 , ce qui

permet d'empêcher la dégradation de la p-caténine, lui permettant ainsi d'agir au niveau du

noyau (Stambolic et al. , 1996).

La protéine recombinante Noggin, qui est connue pour inhiber les BMPs (Botchkarev

et al. , 2002), pourrait être ajoutée au milieu de culture des peaux reconstruites afin de

permettre l'accumulation de Lef-1 dans les noyaux des cellules de la matrice du follicule

pileux. En effet, l'équipe de J amora a démontré que les kératinocytes in vitro sécrètent des

BMPs, ce qui empêche l' accumulation de Lef-1 dans les noyaux des cellules. Par conséquent,

la transcription des gènes spécifiques aux poils ne peut pas avoir lieu (Jamora et al. , 2003).

Ainsi il faudrait également évaluer la présence des BMPs dans les milieux conditionnés par la

culture des peaux reconstruites.

Pour ce qui est de l'influence du type de fibroblastes utilisés sur la différenciation des

kératinocytes, il serait intéressant d' évaluer les différents facteurs sécrétés par les différentes

lignées de fibroblastes, par exemple, en utilisant des membranes enrobées d ' anticorps

spécifiques à des facteurs de croissance. Ainsi, des facteurs impliqués dans le contrôle de la

destinée des cellules souches de la peau lors de leur différenciation pourraient être

découverts.


BIBLIOGRAPHIE

Akiyama, T. 2000. Wnt/beta-catenin signaling. Cytokine Growth Factor Rev. Il :273-82. Alonso, L. , and E. Fuchs. 2003a. Stem cells in the skin: waste not, Wnt not. Genes Dev.

17: 1189-200. Alonso, L. , and E. Fuchs. 2003b. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S

A. 100 Suppl 1 : 11830-5. Auger, F.A. , F. Berthod, V. Moulin, R. Pouliot, and L. Germain. 2004. Tissue-engineered

skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39:263-75.

Auger, F.A. , C.A. Lopez Valle, R. Guignard, N. Tremblay, B. Noel, F. Goulet, and L. Germain. 1995. Skin equivalent produced with human collagen. In Vitro Cel! Dev Biol Anim. 31 :432-9.

Auger, F.A., R. Pouliot, N. Tremblay, R. Guignard, P. Noel, J. Juhasz, L. Germain, and F. Goulet. 2000. Multistep production ofbioengineered skin substitutes: sequential modulation of culture conditions. In Vitro Cel! Dev Biol Anim. 36:96-103.

Auger, F.A. , M. Rouabhia, F. Goulet, F. Berthod, V. Moulin, and L. Germain. 1998. Tissueengineered human skin substitutes developed from collagen-populated hydrated gels: clinical and fundamental applications. Med Biol Eng Comput. 36:801-12.

Behrens, J. , J.P. von Kries, M. Kuhl, L. Bruhn, D. Wedlich, R. Grosschedl, and W. Birchmeier. 1996. Functional interaction ofbeta-catenin with the transcription factor LEF-l. Nature. 382:638-42.

Bell, E. , B. Ivarsson, and C. Merrill. 1979. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 76: 1274-8.

Berthod, F. , D. Hayek, O. Damour, and C. Collombel. 1993. Collagen synthesis by fibroblasts cultured within a collagen sponge. Biomaterials. 14:749-54.

Berthod, F. , G. Saintigny, F. Chretien, D. Hayek, C. Collombel, and O. Damour. 1994. Optirnization of thickness, pore size and mechanical properties of a biornaterial designed for deep bum coverage. Clin Mater. 15:259-65.

Bienz, M. 1998. TCF: transcriptional activator or repressor? Curr Opin Cel! Biol. 10:366-72. Bikle, D.D. 2004. Vitamin D regulated keratinocyte differentiation. J Cel! Biochem. 92:436-

44. Black, A.F., F. Berthod, N. L'Heureux, L. Germain, and F.A. Auger. 1998. In vitro

reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. Faseb J. 12: 1331-40.

Boissy, R.E. 2003. Melanosome transfer to and translocation in the keratinocyte. Exp Dermatol. 12 Suppl 2:5-12.

Botchkarev, V.A., N.V. Botchkareva, A.A. Sharov, K. Funa, O. Huber, and B.A. Gilchrest. 2002. Modulation of BMP signaling by noggin is required for induction of the secondary (nontylotrich) hair follicles. J Invest Dermatol. 118:3-10.

Burgeson, R.E., and A.M. Christiano. 1997. The dermal-epidermaljunction. Curr Opin Cel! Biol. 9:651-8.

Byme, C. , M. Hardman, and K. Nield. 2003. Covering the limb--formation of the integument. J Anat. 202: 113-23.

66 ©Krlstine Cuffley' LOEX

Chan, D., S.R. Lamande, W.G. Cole, and lF. Bateman. 1990. Regulation ofprocollagen synthesis and processing during ascorbate-induced extracellular matrix accumulation in vitro. Biochem J. 269: 175-81.

Chuong, C.M., BJ. Nickoloff, P.M. Elias, L.A. Goldsmith, E. Macher, P.A. Maderson, lP. Sundberg, H. Tagami, P.M. Plonka, K. Thestrup-Pederson, B.A. Bernard, lM. Schroder, P. Dotto, C.M. Chang, M.L. Williams, K.R. Feingold, L.E. King, A.M. Kligman, lL. Rees, and E. Christophers. 2002. What is the 'true' function of skin? Exp Dermatol. Il: 159-87.

Compton, C.C., lM. Gill, D.A. Bradford, S. Regauer, G.G. Gallico, and N.E. O'Connor. 1989. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness bum wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopie and immunohistochemical study. Lab Invest. 60:600-12.

Cotsarelis, G. , P. Kaur, D. Dhouailly, U. Hengge, and l. Bickenbach. 1999. Epithelial stem cells in the skin: definition, markers, localization and functions. Exp Dermatol. 8: 80-8.

Cotsarelis, G. , T.T. Sun, and R.M. Lavker. 1990. Label-retaining cens reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cel!. 61: 1329-37.

Coulombe, P.A. , and M.B. Omary. 2002. 'Hard' and 'soft' principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments. Curr Opin Cel! Biol. 14:110-22.

Dale, B.A. , K.A. Resing, and R.B. Presland. 1994. Keratohyalin granule proteins. In The keratinocyte handbook. LM. Leigh, E.B. Lane, F.M. Watt, editor. Cambridge University Press, Cambridge. 323-350.

DasGupta, R., and E. Fuchs. 1999. Multiple roles for activated LEF /TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation. Development. 126:4557-68.

DasGupta, R., H. Rhee, and E. Fuchs. 2002. A developmental conundrum: a stabilized form of beta-catenin lacking the transcriptional activation do main triggers features of hair cell fate in epidermal cells and epidermal cell fate in hair follicle cells. J Cel! Biol. 158:331-44.

Douziech, M., G. Laberge, G. Grondin, N. Daigle, and R. Blouin. 1999. Localization of the mixed-lineage kinase DLKlMUKlZPK to the Golgi apparatus in NIH 3T3 cells. J Histochem Cytochem. 47:1287-96.

Eastman, Q., and R. Grosschedl. 1999. Regulation ofLEF-1/TCF transcription factors by Wnt and other signaIs. Curr Opin Cel! Biol. Il :233-40.

Fuchs, E. 1990. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cel! Biol. 111 :2807 -14. Fuchs, E., and P.A. Coulombe. 1992. Ofmice and men: genetic skin diseases ofkeratin. Cel!.

69:899-902. Fuchs, E. , B.l. Merrill, C. lamora, and R. DasGupta. 2001. At the roots of a never-ending

cycle. Dev Cel!. 1: 13-25. Garber, B. , EJ. Kollar, and A.A. Moscona. 1968. Aggregation in vivo of dissociated cells. 3.

Effect of state of differentiation of cells on feather development in hybrid aggregates of embryonic mouse and chick skin cells. J Exp Zool. 168:455-72.

Geesin, lC. , D. Darr, R. Kaufman, S. Murad, and S.R. Pinnell. 1988. Ascorbic acid specifically increases type l and type III procollagen messenger RNA levels in human skin fibroblast. J Invest Dermatol. 90:420-4.


Geras, AJ. 1990. Dermatology: A medical artist's interpretation. Sandoz Pharma Ltd, Switzerland.

Gerdes, 1. , U. Schwab, H. Lemke, and H. Stein. 1983. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a hum an nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer. 31: 13-20.

Germain, L., 1. Fradette, H. Robitaille, R. Guignard, G. Grondin, A. Nadeau, and R. Blouin. 2000. The mixed lineage kinase leucine-zipper protein kinase exhibits a differentiation-associated localization in normal human skin and induces keratinocyte differentiation upon overexpression. J Invest Dermatol. 115: 860-7.

Germain, L., R. Guignard, M. Rouabhia, and F.A. Auger. 1995. Early basement membrane formation following the grafting of cultured epidermal sheets detached with thermolysin or Dispase. Burns. 21: 175-80.

Germain, L., M. Rouabhia, R. Guignard, L. Carrier, V. Bouvard, and F.A. Auger. 1993. lmprovement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19:99-104.

Green, H., O. Kehinde, and J. Thomas. 1979. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci USA. 76:5665-8.

Hagenbuchle, O., and P.K. Wellauer. 1992. A rapid method for the isolation ofDNA-binding proteins from purified nuclei of tissues and cells in culture. Nucleic Acids Res. 20:3555-9.

Halata, Z., M. Grim, and K.I. Bauman. 2003. Friedrich Sigmund Merkel and his "Merkel cell", morphology, development, and physiology: review and new results. Anat Rec A Discov Mol Cel! Evol Biol. 271 :225-39.

Handjiski, B.K., S. Eichmuller, U. Hofmann, B.M. Czametzki, and R. Paus. 1994. Alkaline phosphatase activity and localization during the murine hair cycle. Br J Dermatol. 131:303-10.

Hardy, M.H. 1992. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8:55-61. Hata, R., and H. Senoo. 1989. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation,

cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J Cel! Physiol. 138:8-16.

He, X. 2003. A Wnt-Wnt situation. Dev Cel!. 4:791-7. Huelsken, 1., R. Vogel, B. Erdmann, G. Cotsarelis, and W. Birchmeier. 2001. beta-Catenin

controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin. Cel!. 105:533-45.

Jamora, C., R. DasGupta, P. Kocieniewski, and E. Fuchs. 2003. Links between signal transduction, transcription and adhesion in epithelial bud development. Nature. 422:317-22.

Janes, S.M., S. Lowell, and C. Hutter. 2002. Epidermal stem cells. J Pathol. 197:479-91. Kanitakis, 1. 2002. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin.

Eur J Dermatol. 12:390-9; quiz 400-1. Kishimoto, 1., R.E. Burgeson, and B.A. Morgan. 2000. Wnt signaling maintains the hair

inducing activity of the dermal papilla. Genes Dev. 14:1181-5. Kobielak, K., H.A. Pasolli, L. Alonso, L. Polak, and E. Fuchs. 2003. Defining BMP functions

in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor lA. J Cel! Biol. 163 :609-23.

Langbein, L., M.A. Rogers, S. Praetzel, N. Aoki, H. Winter, and J. Schweizer. 2002. A novel epithelial keratin, hK6irs l, is expressed differentially in alllayers of the inner root

68 © Kristine Cuftley/LOEX

sheath, including specialized huxley cells (Flugelzellen) of the human hair follicle. J Invest Dermatol. 118:789-99.

Laplante, A.F. , L. Germain, F.A. Auger, and V. Moulin. 2001. Mechanisms ofwound reepithelialization: hints from a tissue-engineered reconstructed skin to long-standing questions. Faseb J. 15:2377-89.

Larouche, D. , K. Cuffley, C. Bissonnette, and L. Germain. 2005 . The dermis composition within a tissue engineered skin influences the differentiation lineage of hair follicle stem cells, Quebec.

Lavker, R.M. , S. Miller, C. Wilson, G. Cotsarelis, Z.G. Wei, J.S. Yang, and T.T. Sun. 1993. Hair follicle stem cells: their location, role in hair cycle, and involvement in skin tumor formation. J Invest Dermatol. 101: 16S-26S.

Lavker, R.M. , and T.T. Sun. 2000. Epidermal stem cells: properties, markers, and location. Proe Natl Aead Sei US A . 97: 13473-5.

L'Heureux, N. , S. Paquet, R. Labbe, L. Germain, and F.A. Auger. 1998. A completely biological tissue-engineered hum an blood vessel. Faseb J. 12:47-56.

Lichti, U., W.C. Weinberg, L. Goodman, S. Ledbetter, T. Dooley, D. Morgan, and S.H. Yuspa. 1993. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice. J Invest Dermatol. 101: 124S-129S.

Lopez Valle, C.A., F.A. Auger, P. Rompre, V. Bouvard, and L. Germain. 1992. Peripheral anchorage of dermal equivalents. Br J Dermatol. 127 :365-71.

Luelmo-Aguilar, J. , and M.S. Santandreu. 2004. Folliculitis: recognition and management. Am J Clin Dermatol. 5:301-10.

Lyle, S., M. Christofidou-Solomidou, Y. Liu, D.E. EIder, S. Albelda, and G. Cotsarelis. 1999. Ruman hair follicle bulge cells are biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype. J Investig Dermatol Symp Proe. 4:296-301.

Marieb, E.N. 1993. Anatomie et physiologie humaines. Éditions du Renouveau Pédagogique Inc. , Ville St-Laurent, Québec. 1014 pp.

Marinkovich, M.P., D.R. Keene, C.S. Rimberg, and R.E. Burgeson. 1993. Cellular origin of the dermal-epidermal basement membrane. Dev Dyn. 197:255-67.

Marks, M.S., and M.C. Seabra. 2001. The melanosome: membrane dynamics in black and white. Nat Rev Mol Cel! Biol. 2:738-48.

Mehrel, T. , D. Hohl, lA. Rothnagel, M.A. Longley, D. Bundman, C. Cheng, U. Lichti, M.E. Bisher, A.C. Steven, P .M. Steinert, and et al. 1990. Identification of a major keratinocyte cell envelope protein, loricrin. Cel!. 61: 1103-12.

Merdek, K.D. , N.T. Nguyen, and D. Toksoz. 2004. Distinct activities of the alpha-catenin family, alpha-catulin and alpha-catenin, on beta-catenin-mediated signaling. Mol Cel! Biol. 24:2410-22.

Merrill, B.J. , U. Gat, R. DasGupta, and E. Fuchs. 2001. Tcf3 and Lefl regulate lineage differentiation ofmultipotent stem cells in skin. Genes Dev. 15:1688-705.

Michel, M., N. L'Heureux, R. Pouliot, W. Xu, F.A. Auger, and L. Germain. 1999. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cel! Dev Biol Anim. 35:318-26.

Michel, M., N. Torok, M.J. Godbout, M. Lussier, P. Gaudreau, A. Royal, and L. Germain. 1996. Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomie sites, and their number varies with donor age and culture stage. J Cell Sei. 109 ( Pt 5):1017-28.

69 ©Kristine CuftleYI LOEX

Millar, S.E. 2002. Molecular mechanisms regulating hair follicle development. J Invest Dermatol. 118:216-25.

Miller, lR. 2002. The Wnts. Genome Biol. 3:REVIEWS3001. Milstone, L.M. 2004. Epidermal desquamation. J Dermatol Sei. 36: 131-40. Moll, I. 1994. Merkel cell distribution in human hair follicles of the fetal and adult scalp. Cel!

Tissue Res. 277:131-8. Murad, S., S. Tajima, G.R. Johnson, S. Sivarajah, and S.R. Pinnell. 1983. Collagen synthesis

in cultured human skin fibroblasts: effect of ascorbic acid and its analogs. J Invest Dermatol.81:158-62 .

Nelson, W.J. , and R. Nusse. 2004. Convergence ofWnt, beta-catenin, and cadherin pathways. Science. 303: 1483-7.

Niemann, C., D.M. Owens, J. Hulsken, W. Birchmeier, and F.M. Watt. 2002. Expression of DeltaNLefl in mouse epidermis results in differentiation of hair follicles into squamous epidermal cysts and formation ofskin tumours. Development. 129:95-109.

Nishiyama, T., S. Amano, M. Tsunenaga, K. Kadoya, A. Takeda, E. Adachi, and R.E. Burgeson. 2000. The importance oflaminin 5 in the dermal-epidermal basement membrane. J Dermatol Sei. 24 Suppl 1 :S51-9.

Ohlstein, B., T. Kai, E. Decotto, and A. Spradling. 2004. The stem cell niche: theme and variations. Curr Opin Cel! Biol. 16:693-9.

Oshima, H. , A. Rochat, C. Kedzia, K. Kobayashi, and Y. Barrandon. 2001. Morphogenesis and renewal ofhair follicles from adult multipotent stem cells. Cel!. 104:233-45.

Ozawa, M. , H. Baribault, and R. Kemler. 1989. The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in different species. Embo J. 8: 1711-7.

Paus, R. , and G. Cotsarelis. 1999. The biology ofhair follicles. N Engl J Med. 341:491-7. Peifer, M. 1993. Cancer, catenins, and cuticle pattern: a complex connection. Science.

262:1667-8. Peifer, M., S. Orsulic, L.M. Pai, and J. Loureiro. 1993. A model system for cell adhesion and

signal transduction in Drosophila. Dev Suppl: 163-76. Peifer, M., D. Sweeton, M. Casey, and E. Wieschaus. 1994. wingless signal and Zeste-white

3 kinase trigger opposing changes in the intracellular distribution of Armadillo. Development. 120:369-80.

Pispa, l , and I. Thesleff. 2003. Mechanisms of ectodermal organogenesis. Dev Biol. 262: 195-205.

Pouliot, R., L. Germain, F.A. Auger, N. Tremblay, and l Juhasz. 1999. Physical characterization of the stratum corneum of an in vitro human skin equivalent produced by tissue engineering and its comparison with normal human skin by ATRFTIR spectroscopy and thermal analysis (DSC). Biochim Biophys Acta. 1439:341-52.

Pouliot, R. , D. Larouche, F.A. Auger, J. Juhasz, W. Xu, H. Li, and L. Germain. 2002. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice. Transplantation. 73: 1751-7.

Prunieras, M., M. Regnier, and D. Woodley. 1983. Methods for cultivation ofkeratinocytes with an air-liquid interface. J Invest Dermatol. 81 :28s-33s.

Reddy, S., T. Andl, A. Bagasra, M.M. Lu, D.l Epstein, E.E. Morrisey, and S.E. Millar. 2001. Characterization of Wnt gene expression in developing and postnatal hair follicles and identification ofWnt5a as a target of Sonic hedgehog in hair follicle morphogenesis. Mech Dev. 107:69-82.

70 ©Kristine Cuftley/LOEX

Reynolds, A.l , and C.A. Jahoda. 1991. Inductive properties ofhair follicle cells. Ann N Y Acad Sci. 642:226-41; discussion 241-2.

Robitaille, H. , R. Proulx, K. Robitaille, R. Blouin, and L. Germain. 2005. The mitogenactivated protein kinase kinase kinase dual leucine zipper-bearing kinase (DLK) acts as a key regulator ofkeratinocyte terminal differentiation. J Biol Chem. 280: 12732-41.

Rogers, G.E. 2004. Hair follicle differentiation and regulation.lnt J Dev Biol. 48: 163-70. Rousselle, P. , and R. Garrone. 1998. [Collagen and laminin: which messages for which

cells?]. Pathol Biol (Paris) . 46:543-54. Schmidt-Ullrich, R. , and R. Paus. 2005. Molecular principles ofhair follicle induction and

morphogenesis. Bioessays . 27:247-61. Schneider, R. , 1. Gander, U. Muller, R. Mertz, and E.L. Winnacker. 1986. A sensitive and

rapid gel retenti on assay for nuclear factor l and other DNA-binding proteins in crude nuclear extracts. Nucleic Acids Res. 14:1303-17.

Sieber-Blum, M. , and M. Grim. 2004. The adult hair follicle: cradle for pluripotent neural crest stem cells. Birth Defects Res C Embryo Today . 72: 162-72.

Sorrell, lM. , and A.1. CapIan. 2004. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. J Cel! Sci. 117:667-75.

Spradling, A. , D. Drummond-Barbosa, and T. Kai. 2001. Stem cells find their niche. Nature. 414:98-104.

Stambolic, V. , L. Ruel, and lR. Woodgett. 1996. Lithium inhibits glycogen synthase kinase-3 activity and mimics wingless signalling in intact cells. Curr Biol. 6: 1664-8.

Stenn, K.S. , and R. Paus. 2001. Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev. 81 :449-494. Stevens, A. , l Lowe. 1997. Histologie humaine. De Boeck & Larcier s.a., Paris. 408 pp. Sun, T.T., R. Eichner, W.G. Nelson, S.C. Tseng, R.A. Weiss, M. Jarvinen, and J. Woodcock

Mitchell. 1983. Keratin classes: molecular markers for different types of epithelial differentiation. J Invest Dermatol. 81: 109s-15s.

Tumbar, T. , G. Guasch, V. Greco, C. Blanpain, W.E. Lowry, M. Rendl, and E. Fuchs. 2004. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303:359-63.

van Es, J.H. , N. Barker, and H. Clevers. 2003. Vou Wnt sorne, you lose sorne: oncogenes in the Wnt signaling pathway. Curr Opin Genet Dev. 13:28-33.

van Genderen, C., R.M. Okamura, 1. Farinas, R.G. Quo, T.G. Parslow, L. Bruhn, and R. Grossched1. 1994. Development of several organs that require inductive epithelialmesenchymal interactions is impaired in LEF-l-deficient mice. Genes Dev. 8:2691-703.

van Noort, M. , and H. Clevers. 2002. TCF transcription factors , mediators ofWnt-signaling in development and cancer. Dev Biol. 244: 1-8.

Waterman, M.L. 2004. Lymphoid enhancer factor/T cell factor expression in colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 23:41-52.

Watt, F.M. 1998. Epidermal stem cells: markers, patteming and the control of stem cell fate. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 353:831-7.

Watt, F.M., and H. Green. 1981. Involucrin synthesis is correlated with cell size in human epidermal cultures. J Cel! Biol. 90:738-42.

Watt, F.M., and P.H. Jones. 1993. Expression and function of the keratinocyte integrins. Dev Suppl: 185-92.

Weinberg, W.C., L.V. Goodman, C. George, D.L. Morgan, S. Ledbetter, S.H. Yuspa, and U. Lichti. 1993. Reconstitution ofhair follicle development in vivo: determination of


- -- ----

follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J Invest Dermatol. 100:229-36.

Yannas, LV., J.F. Burke, P.L. Gordon, C. Huang, and R.H. Rubenstein. 1980. Design of an artificial skin. II. Control of chemical composition. J Biomed Mater Res. 14: 107-32.

Yuhki, M., M. Yamada, M. Kawano, T. Iwasato, S. Itohara, H. Yoshida, M. Ogawa, and Y. Mishina. 2004. BMPR1A signaling is necessary for hair follicle cycling and hair shaft differentiation in mice. Development. 131: 1825-33.

Yuspa, S.H., and c.e. Harris. 1974. Altered differentiation of mouse epidermal cells treated with retinyl acetate in vitro. Exp Cell Res. 86:95-105.

Zhou, P., C. Byme, J. Jacobs, and E. Fuchs. 1995. Lymphoid enhancer factor 1 directs hair follicle patteming and epithelial cell fate. Genes Dev. 9:700-13.


Développement par génie tissulaire d'un modèle d'étude in ...

Documents

Transcript of Développement par génie tissulaire d'un modèle d'étude in ...