REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE

ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

DOMAINE DES SCIENCES DE LA NATURE

ET DE LA VIE

FILIERE: BIOLOGIE

RAPPORT DE STAGE

LICENCE: ANALYSE BIOLOGIQUE

THEME:

DOSAGE DES DIFFERENTS METABOLITES (PROTEINES, GLUCIDES ET LIPIDES) DANS

LES OVAIRES DE Blattella germanica.

SOMMAIRE

P

1. Introduction ……………………………………………………………………………………..

2. Matériel et méthodes ................................................................................…..............................

2.1. Matériel biologique ………………………………………………........…………….. 2.1. 1. Cycle biologique

………………………………………................................... 2.1.2. Position systématique

………………………………………………………...2.2. Extraction des différents métabolites dans les

ovaires…………………………… 2.3. Dosage des métabolites ovariens

………………………………………………….. 2.3.1. Dosage des protéines ……………………………………………………. 2.3.2. Dosage des glucides .……………………………………………………..

2.3.3. Dosage des lipides…………………………………………………………

3. Résultats ………………….……………………………………………………………………...

3.1. Quantité de protéines dans les ovaires………………………………………………..

3.2. Quantité de glucides dans les ovaires ………………………………………….

3.3. Quantité de lipides dans les ovaires…………………………………………….

4. Discussion ……………………………………………………………………………………….

1

2

22344466

8

8

911

13

SOMMAIRE DES FIGURES

Figures Titres Pages

Figure 1. Cycle biologique (Cornwell, 1968) …………………………………………. 3

Figure 2. Extraction (Shibko et al., 1966) et dosage des métabolites (glucides, lipides et protéines) ovariens chez les adultes femelles de B.germanica.................... 5

Figure 3. Dosage des protéines : courbe de référence (droite étalon) exprimant l’absorbance à 595 nm en fonction de la quantité d’albumine (µg)………….. 8

Figure 4. Dosage des glucides ovariens : courbe de référence (droite étalon) exprimant l’absorbance

à 620 nm en fonction de la quantité du glucose (µg)………......10

Figure 5. Dosage des lipides : droite de régression exprimant l’absorbance en fonction de la quantité

en lipides (µg). R2 : coefficient de détermination…………….. 11

SOMMAIRE DES TABLEAUX

Tableaux Titres Pages

Tableau 1.

Dosage des protéines ovariennes: réalisation de la gamme d’étalonnage……. 4

Tableau 2.

Dosage des glucides ovariens : réalisation de la gamme d’étalonnage………. 6

Tableau 3.

Dosage des lipides ovariens : réalisation de la gamme d’étalonnage………... 7

Tableau 4.

: Densités optiques (D.O) obtenues à 595 nm en fonction de la quantité d’albumine (µg)………………………………………………………………. 8

Tableau 5.

Quantité de protéines ovariennes (µg/paire d’ovaires) au cours du premier cycle

gonadotrophique des femelles de B. germanica (m ± s; n = 4 – 7)……9

Tableau 6.

: Densités optiques (D.O) obtenues à 620 nm en fonction de la quantité de glucose (µg)…………………………………………………………………. 9

Tableau 7.

Quantité de glucides ovariens (µg/paire d’ovaires) au cours du premier cycle

gonadotrophique des femelles de B. germanica (m ± s; n = 4 – 7)…………...

10

Tableau 8.

Densités optiques (D.O) obtenues à 530 nm en fonction de la quantité de lipides (µg)…………………………………………………………………… 11

Tableau 9.

Quantité de lipides ovariens (µg/paire d’ovaires) au cours du premier cycle

gonadotrophique des femelles de B. germanica (m ± s; n = 4 – 7)………….. 12

INTRODUCTION

1. INTRODUCTION

les Blattes appelées aussi cafards ou cancrelats, sont des insectes Dictyoptères, sous-

classe primitive dépourvue d’ailes qui sont apparues à l’époque silurienne (Elie, 1998), âge de

chaleur torride et d’humidité étouffante. Parmi les espèces identifiées, 4000 se sont adaptées

aux conditions de vie urbaine (Schal et al., 1984 ) et certaines sont qualifiées de domestiques

(Garfield, 1990); les espèces les plus courantes (Grandcolas, 1998; Wattiez & Beys, 1999)

sont Periplaneta americana (Cornwell, 1968), Blattella orientalis (Cornwell, 1976), Supella

longipalpa (Aouissi-Cherairia, 2003) et Blattella germanica (Guillaumin et al., 1969).

Les Blattes sont susceptibles de transporter des agents pathogènes pour l’homme

(Rivault et al., 1993) et constituent ainsi un important problème en terme d’hygiène et de

santé publique (Monk & Pembrok, 1987; Guerrier & Noiret, 1991; Robert, 1996; Grandcolas,

1998). Les Blattes se trouvent souvent à l’origine d’allergies (Rust et al., 1995 ) et leur

présence peut déclencher des crises d’asthme (Mindykowski et al., 2010; Peden & Reed,

2010; Sheehan et al., 2010) et transmettre aussi des maladies infectieuses comme l’hépatite, le

choléra et la tuberculose (Gordon, 1996; Tokuda et al., 2008).

La lutte contre les Blattes a surtout été réalisée grâce à une méthode chimique, utilisant

différents types d’insecticides possédant chacun des caractéristiques physiques et chimiques

propres, car le taux de toxicité, la dégradation, la biotransformation ou l’accumulation varient

d’un insecticide à un autre (Strong et al., 2000), la recherche a développé des insecticides

moins toxiques et plus spécifiques, qui perturbent le développement des insectes (Staal, 1982;

Dhadialla et al., 2005) basés sur des données physiologiques de l'insecte.

L’objectif de ce travail est d'étudier l'évolution des paramètres biochimiques essentiels

de la vitellogénèse par un dosage quantitatif des métabolites (protéines, glucides et lipides

ovariens) à différents âges (0, 2, 4 et 6 jours), au cours du premier cycle gonadotrophique des

adultes de B. germanica. Cet insecte représente un model de choix vu son fort potentiel

reproducteur et de sa prédominance parmi les espèces de blattes.

MATERIEL ET

METHODES

2. MATERIEL ET METHODES

2. 1. Matériel biologique

Blattella germanica (L.), Dictyoptère de la famille des Blattellidae, présente un

développement hétérométabole caractérisé seulement par deux phénotypes post-

embryonnaires: les larves et les adultes (Fig. 1).

Dénomination Blatte Germanique

Caractéristiques Long : de  10  à  14mm. 

Couleur  jaune  brunâtre  et brillant. 

Ailes couvrant tout l’abdomen.

 Deux  bandes  noires sur le thorax. 

Habitudes, habitat Recoins sombres, chauds et  humides

cuisine, salle d’eau

Fréquente les milieux sales, actifs

 pendant la nuit. 

Durée de vie de l’adulte De 4 à 6 mois 

Régime alimentaire de l’adulte Se  nourrit  de  toute  matière  organique 

avec préférence pour

les résidus alimentaires. 

Fécondité De 5 à 8 oothèques/femelle et de 20 à 40 

œufs/oothèques. 

2. 1. 1. Cycle biologique 

Les femelles matures déposent leurs oothèques, environ 8 jours après l’émergence.

L’oothèque comporte environ 40 œufs qui arrivent à éclosion après une période d’incubation

de 17 à 22 jours, pour donner naissance à des larves aptères (Swandner, 1995); ces dernières

Ponte(8 jours)

Période d’incubation(17-22 jours)

5 à 7 mues(5 à 6 mois)

♂♀

Dernier stade larvaire

(x 2,3)

Adultes

(x 2,7) Stade larvaire L I

(x 3,2)

subissent un nombre de mues variant de 5 à 7 au cours d’une période de 5 à 6 mois suivant les

conditions environnementales (Fig. 1). Les larves du dernier stade subissent enfin la mue

imaginale pour donner naissance à des adultes ailés. La longévité de l’adulte est de 128 jours

pour le mâle et de 153 jours pour la femelle (Cornwell, 1968).

2.1.2. Position Systématique : 

Embranchement: ArthropodaSous embranchement: MandibulataClasse: InsectaSous classe: PterygotaSection: Polyneoptera

Oothèque(37 œufs)

(x 3,8)

Figure 1. Cycle biologique (Cornwell, 1968) .

Ordre: DictyopteraSous ordre: BlattariaSuper famille: BlaberoidaeFamille: BlattellidaeSous famille: BlattellinaeGenre: BlattellaEspèce: germanica (L.)

2.2. Extraction des différents métabolites dans les ovaires

L’extraction des métabolites dans les ovaires des femelles adultes de B. germanica, a été

réalisée selon le procédé de Shibko et al., (1966) prélevés à 0, 2, 4 et 6 jours et conservés

dans 1 ml d’acide trichloroacétique (TCA) à 20%. Après un broyage aux ultra-sons (Sonifier

B-30) et centrifugation (5000 tours/mn pendant 10 mn), le surnageant I est récupéré et servira

au dosage des glucides. Au culot I on ajoute 1 ml d'un mélange éther/chloroforme (1V/1V) et

une deuxième centrifugation (5000 tours/mn pendant 10 mn) permet de récupérer le

surnageant II qui permettra le dosage des lipides; le culot II sera repris dans 1 ml d'eau

distillée pour l'estimation des protéines totales (Fig. 2).

2.3. Dosage des métabolites ovariens:

2.3.1. Dosage des protéines:

Les protéines ovariennes ont été quantifiées selon la méthode de Bradford (1976) qui

utilise le bleu brillant de coomassie G 250 (BBC) comme réactif et l’albumine de sérum de

bœuf (B.S.A) comme standard.

La gamme d’étalonnage (Tableau 1) a été réalisée à partir d’une solution mère de B.S.A.

(1 mg/ml) et le B.B.C (conservation environ 21 jours à 4°C) qui se prépare comme suit :

100 mg de BBC + 50 ml d’éthanol Agitation pendant deux heures

100 ml d’acide orthophosphorique sont alors ajoutés et le tout est complété à

1000 ml avec de l’eau distillée.

Le dosage des protéines ovariennes a été effectué dans une fraction aliquote (100μl).

Les absorbances ont été obtenues grâce à un spectrophotomètre et la lecture a été réalisée

à une longueur d’onde de 595 nm.

Tableau 1: Dosage des protéines ovariennes: réalisation de la gamme d’étalonnage.

1 ml (TCA 20) %)

Dosage des protéinesDosage des glucides

Goldsworthy et al (1972)Duchateau & Florkin (1959)

Bradford (1976)

Dosage des lipides

Tubes 1 2 3 4 5 6

B.S.A. (µl) 0 20 40 60 80 100

Eau distillée (µl) 100 80 60 40 20 0

BBC (ml) 4 4 4 4 4 4

Paire d’ovaire

Broyage (ultrasons)

Centrifugation (5000 tours/min, 10 min)

Surnageant I Culot I + 1 ml d’éther/chloroforme (1V/1V)

Centrifugation (5000 tours/min, 10min)

Surnageant II Culot II

Figure 2. Extraction (Shibko et al., 1966) et dosage des métabolites (glucides, lipides et protéines) ovariens chez les adultes femelles de B.germanica.

2.3.2. Dosage des glucides ovariens

Le dosage des glucides ovariens a été effectué selon Duchateau & Florkin (1959). Cette

méthode utilise l’anthrone comme réactif (150 mg d’anthrone, 75 ml d’acide sulfurique et 25

ml d’eau distillée) et une solution mère de glucose (1g/l) comme standard (Tableau 2).

La méthode consiste à additionner à une fraction aliquote de 100 µl de surnageant des

différents échantillons, 4 ml de réactif d’anthrone.

Après chauffage du mélange dans un bain marie (80°C pendant 10 min) une coloration

verte se développe. L’intensité de la coloration mesurée à une longueur d’onde de 620 nm est

proportionnelle à la concentration des glucides présente dans l’échantillon.

Tableau 2 : Dosage des glucides ovariens : réalisation de la gamme d’étalonnage.

Tubes 1 2 3 4 5 6

Quantité de la solution mère deGlucose (µl)

0 20 40 60 80 100

Quantité d’eau distillée (µl) 100 80 60 40 20 0

Réactif d’anthrone (ml) 4 4 4 4 4 4

2.6. Dosage des lipides ovariens

Le dosage des lipides ovariens a été effectué selon Goldsworthy et al., (1972). Cette

méthode utilise la vanilline comme réactif (0,38 g de vanilline, 195 ml d’acide

orthophosphorique à 85% et 55 ml d’eau distillée) et une solution mère de lipides (2,5 mg/ml)

comme standard (Tableau 2).

Aux échantillons est additionné 1 ml d'acide sulfurique (98%), après agitation, les tubes sont

chauffés un bain marie (100°C pendant 10 min); de chaque tube 200 µl sont ensuite prélevés

et il est ajouté 2,5 ml de réactif. Dosage des protéines

Dosage des protéines

Les absorbances sont lues après 30 mn d'obscurité à une longueur d’onde de 530 nm.

Tableau 3 : Dosage des lipides ovariens : réalisation de la gamme d’étalonnage.

Tubes 1 2 3 4 5 6

solution mère de lipides (µl) 0 20 40 60 80 100

Solvant chloroforme/méthanol (µl) 100 80 60 40 20 0

Vanilline (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

RESULTATS

3. RESULTATS.

3.1. Quantité de protéines dans les ovaires:

Les densités optiques (D.O), obtenues en fonction de la quantité d'albumine après la

réalisation de la gamme d’étalonnage sont mentionnées dans le tableau 4. Les concentrations

des protéines ovariennes ont été quantifiées à partir de la courbe de référence (Fig. 3).

Tableau 4: Densités optiques (D.O) obtenues à 595 nm en fonction de la quantité d’albumine (µg).

Quantité d’albumine (µg)

D.O1 D.O2 m ± s

20 0,191 0,167 0,179 ± 0,01240 0,411 0,363 0,387 ± 0,02460 0,652 0,478 0,565 ± 0,08780 0,804 0,650 0,727 ± 0,072100 0,908 0,764 0,836 ± 0,072

Figure 3. Dosage des protéines : courbe de référence (droite étalon) exprimant l’absorbance à 595 nm en fonction de la quantité d’albumine (µg).

Chez les séries étudiées des femelles adultes de B. germanica, le contenu en protéines

ovariennes (Tableau 5) au cours de la maturité sexuelle augmente à 2 et 4 jours où se produit

un pic; le contenu en protéines diminue ensuite à 6 jours.

Tableau 5: Quantité de protéines ovariennes (µg/paire d’ovaires) au cours du premier cycle

gonadotrophique des femelles de B. germanica (m ± s; n = 4 – 7).

Age (jours) Quantité de protéines ovariennes

0

103,40 ± 6,04

2

226,96 ± 4,21

4

265,26 ± 6,53

6

181,92 ± 4,44

3.2. Quantité de glucides dans les ovaires

Les densités optiques (D.O), obtenues en fonction de la quantité de glucose après la

réalisation de la gamme d’étalonnage sont mentionnées dans le tableau 6. Les concentrations

des glucides ovariens ont été quantifiées à partir de la courbe de référence (Fig. 4).

Tableau 6: Densités optiques (D.O) obtenues à 620 nm en fonction de la quantité de glucose (µg).

Quantité de glucose (µg) DO1 DO2 m ± s20 0,178 0,191 0,094 ± 0,00940 0,417 0,393 0,231 ± 0,0160 0,587 0,585 0,412 ± 0,00180 0,817 0,776 0,607 ± 0,02100 0,993 0,965 0,757 ± 0,01

Figure 4. Dosage des glucides ovariens : courbe de référence (droite étalon) exprimant

l’absorbance à 620 nm en fonction de la quantité du glucose (µg).

Chez les séries étudiées des femelles adultes de B. germanica, le contenu en glucides

ovariens (Tableau 7) au cours de la maturité sexuelle augmente à 2 et 4 jours où se produit un

pic; le contenu en protéines diminue ensuite à 6 jours.

Tableau 7: Quantité de glucides ovariens (µg/paire d’ovaires) au cours du premier cycle

gonadotrophique des femelles de B. germanica (m ± s; n = 4 – 7).

Age (jours) Quantité de glucides ovariens

0 176,11 ± 6,78

2 388,21 ± 10,14

4 510,5 ± 22,29

6 285,66 ± 23,17

3.3. Quantité de lipides dans les ovaires:

Les densités optiques (D.O) obtenues, en fonction de la quantité de lipide, et après

réalisation de la gamme d’étalonnage sont mentionnées dans le tableau 8. Les contenus en

lipides ovariens ont été quantifiés à partir de la courbe de référence (Fig. 5).

Tableau 8: Densités optiques (D.O) obtenues à 530 nm en fonction de la quantité de lipides (µg).

Quantité de lipides (µg) DO50 0,284100 0,322150 0,523200 0,734250 0,817

Figure 5. Dosage des lipides : droite de régression exprimant l’absorbance en fonction de la

quantité en lipides (µg). R2 : coefficient de détermination.

Au cours de la maturité sexuelle chez les femelles adultes de B. germanica, le contenu

en lipides ovariens des séries étudiées, augmente à 2 et 4 où un pic de 527,04 ± 30,51 µg /

paire d’ovaires est enregistré. Le contenu en lipides diminue ensuite à 6 jours (Tableau 9).

Tableau 9: Quantité de lipides ovariens (µg/paire d’ovaires) au cours du premier cycle

gonadotrophique des femelles de B. germanica (m ± s; n = 4 – 7).

Age (jours) Quantité de glucides ovariens

0 186,12 ± 14,11

2 307,91 ± 16,69

4 527,04 ± 30,51

6 466,56 ± 22,72

DISCUSSION

4. DISCUSSION

Le potentiel reproducteur des insectes étant le facteur le plus important à leur pullulation,

la perturbation de la capacité reproductrice semble être un outil fondamental dans le

programme de lutte.

La vitellogénèse ou phase d’accroissement correspondant à l’accumulation des

matériaux énergétiques variés : lipides (triglycérides, lipoprotéines), glucides (glycogène),

protéines et sels minéraux (Cassier et al., 1997).

Le vitellus constitue les réserves énergétiques utilisées par les embryons durant le

développement embryonnaire. Il est produit par l'organisme maternel et s'accumule dans

l'ovocyte au cours de l'ovogenèse. Ce sont les corps gras qui le produisent chez les insectes

puis acheminés par l'hémolymphe (insectes) vers les ovaires.

Les glucides représentent également l’élément énergétique de l’organisme jouant un

rôle essentiel dans la physiologie des insectes. Ils font partie, avec les protéines et les lipides,

des constituants essentiels des êtres vivants et de leur nutrition, car ils sont un des principaux

intermédiaires biologiques de stockage et de consommation d'énergie.

Les lipides ovariens représentent une partie important des réserves; faiblement

synthétisés par l’ovocyte et les follicules, ils proviennent des corps gras via l’hémolymphe

sous forme de lipoprotéines (Cassier et al.,1997).

Chez les femelles de B.germanica, le contenu en protéines, glucides et lipides ovariens

augmente à 2 et 4 jours de la vie adulte, pour diminuer ensuite à 6 jours juste avant

l’oviposition.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Aoussi-Cherairia M., 2003. Les blattes dans l’est algérien (Guelma) inventaire, biométrie et

biotypologie. Thèse de Magistère. Université d’Annaba. Algérie. P 139.

Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitication of microgram

quantities of protein utilising the Princip of protein-dye binding. Anal. Biochem, 72: 248-

254.

Cassier P., Lafont R., Descamps M., Porchet M. Soyez D., 1997. La reproduction des

invertébrés: stratégies, modalités et régulation. Intérêt fondamental et appliqué Masson,

(Eds). 354 p.

Cornwell P.B., 1968. The cockroach, Vol I. A laboratory insect and an industrial pest. 116p.

Cornwell P.B., 1976. The cockroach, Vol II. Insecticides and cockroach control. St Martins

Press. Newyork, 140p.

Dhadialla, T.S., Retnakaran, A. Smagghe, G., 2005. Insect growth and development

disrupting insecticides. In: Gilbert, L.I., Latrou K., Gill, S.S. (Eds.) Compreh. Mol. Insect

S,Elsevier-Pergamon, Oxford,UK(vol 6), 55-115.

Duchateau A. & Florkin P., 1959. La tréhalosemie des insectes et sa signification. Arch.

Insect. Physiol. Biochem, 67(2): 306-314.

Elie M.P., 1998. Blattes: une vie cachée. Magazine Québeq science. 40p.

Garfield E., 1990. The cockroach connection. Ancient, seemingly indestructible Pest. Part 2.

Population contol. Current comments, 46: 5-13.

Goldsworthy GJ, Mordue W, Guthkelch J., 1972. Studies on insect adipokinetic hormones.

Genr. Compar. Endocrinol. 18: 545-551.

Gordon D.G., 1996. The compleat cockroach: a comprehensive guide to the most despised

(and Least Understood). Creature on Earth. Ten speed pressm Berkely. 178p.

Grandcolas P., 1998. Les blattes. Organisation mondiale de la santé. Bureau régional de

l'Europe. 24 p.

Guerrier G. & Noiret A., 1991. Allergies aux blattes chez l’enfant. Rev. For. Allergol, 31:

153-156.

Guillaumin M., Renoux J. Stockman R., 1969. La blatte. Editions Doin.

Mindykowski B., Jaenick E., Tenzer S., Cirak S., Schweikardt T., Schild H., et Decker

H., 2010. Cockroach allergens Per a 3 are oligomers. Dev. Comp. Immunol, 34(7): 99-722.

Monk B. E. & Pembrok A. C., 1987. Cockroach dermatisis: an occupational hazard Brit.

Med. J, 294: 935.

Peden D. & Reed C.E., 2010. Enviromental and occupational allergies. J.Allergy.Clin

Immunol., 125 (2 suppl 2): S60-150.

Rivault C., Cloaree A. Le Guyader A., 1993. Bacterial contamination of food by

Cockroaches. J. Environ. Health., 55: 21-22.

Robert J., 1996. Cockroaches Linked with asthma. Br. Med. J, 60: 312-1630.

Rust M.K., Owens J.M. Reierson D.A., 1995. Understanding and Controling the German

Cockroach. New York Oxford. Oxford University Press, p 265.

Schal C., Gautier J.Y. Bell W. J., 1984. Behavioural ecology of cockroaches. Biol, Rev, 59:

209-254.

Schenider M.L., Smagghe G., Peneda S., Vinulela E., 2004. Action of insect growth

regulator insecticides and spinosad on life history parameters and absorption in third larvae

of the endoparasitoid Hyposoter didymator. Biological Control, 31: 189-198.

Shibko S., Koivistoinen P., Tratyneck C., New hall A. Freidman L., 1966. A method for

the sequential quantitative separation and glycogen from a single rat liver homogenate or

from a subcellular fraction, Analyt. Biochem, 19: 415-428.

Staal, G.B., 1982. Insect control with growth regulators interfering with the endocrine

system. Entomol. Exp. Appl, 31: 15-23.

Strong C. A., Koehler P. G. Patterson R. S., 2000. Oral toxicity and repellency of borates to

German cockroach (Dictyoptera : Blattellidae). J. Econ. Entomol, 86(5): 1458-1463.

Swandner C., 1995. Sane cockroad Management, Part I, journal of reform. 15(2): P22-23.

Tokuda G., Lo N., Takase A., Yamada A., Hayashi Y., Watanabe H., 2008. Purification

and partial genome characterization of the bacterial endosymbiont Blattabacterium cuenoti

form the fat bodies of cockroaches. Bmc. Res. Notes, 1: 1-9.