d’isolements et de culture des macrophages - univ-tebessa.dz · BCG : Mycobacterium bovis...

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES

Projet de Fin d’Etudes

En vue de l’obtention du diplôme de

Licence Domaine : Sciences de la nature et de la vie

Filière : Biologie

Spécialité : Biochimie fondamentale et appliquée

Thème

Encadreur : M

r. BOUAL Zakaria Présenté par :

Co-encadreur : Mlle. BENAOUN Fatima DAHMANI Souraya

Examinatrice : Mme

. BAYOUSSEF Zahia BAZZINE Messaouda

SENANE Soltana

Synthèse bibliographique sur les techniques

d’isolements et de culture des macrophages

In vitro

Année universitaire 2013/2014

II

Remerciements

Avant tout, nous remercions Dieu tout puissant de nous avoir donné la force, le courage,la

persistance et nous a permis d’exploiter les moyens disponibles à fin d’accomplir ce modeste travail. Merci de

nous avoir éclairé le chemin de la réussite.

Nous tenons à remercier particulièrement M BOUAL Zakaria, Maître Assistant au Département

des Sciences de la Nature et de la Vie à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la

Terre et de L’Univers de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla,et Melle BENAOUN FATIMA qui ont

encadrés ce travail depuis les premiers instants, leur pédagogie, leur écoute, leur ouverture d’esprit et leur

vision de la recherche scientifique, ont été importants pour nous que leurs connaissances éclectiques et ont

largement contribué à l’évolution de ce travail.

Nous exprimons nos profondes reconnaissances à M OULD ELHADJMohamed

Didi,Professeur au Département des Sciences de la Nature et de la Vie à la Faculté des Sciences de la

Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de L’Univers de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, qui nous

a ouvrir les portes de l’écosystème.

Nous tenons aussi à remercier Mme BAYOUSSEF Zahia,Docteur au Département des Sciences de

la Nature et de la Vie à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de

L’Univers de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, pour avoir accepté d’examiner ce travail.

Nous remercions Dr.BRADAI Lyès de nous pour son ouverture et son attention vis-à-vis de nos

questions et sa soutenance depuis les trois derniers années.

On n’oublie pas nos parents pour leur contribution, leur soutien et leur patience.

Un grand merci pour DAHMANI Omar pour leur soutien et leur générosité.

Enfin, nous adressons nos plus sincères remerciements à tous nos proches et amis, qui nous ont toujours

encouragées au cours de la réalisation de ce mémoire.

Merci à tous et à toutes.

III

Abréviations

BSA : Albumine bovine sérique

BCG : Mycobacterium bovis bacillus

calmette-guérin

CCE : Elutriation centrifuge à Contre-

courant

CMH : Complexe Majeur

d’Histocompatibilité

DMEM: Milieu d’Eagle modifié par

Dulbecco

EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétra

acétique

EGF: Epidermal Growth Factor

EtOH: éthanol

FCS: Sérum de veau Fœtal

FIM: Factor Increasing the

Monocytopoiesis

GM-CSF: Granulocyte-macrophage

colony-stimulating factor

HBSS : Solution saline équilibrée de Hank

HS :Sérum de cheval

IFN-γ :Interféron

IL-1 : Interleukine -1

IL-10 : Interleukine-10





iNOS: inductible Nitric Oxide

Synthetase

KC: Cellule Küpffer

LPS: Lipopolyscharides

M-CSF: Monocyte colony-stimulating

factor

MPO : Myéloperoxydase

MPS : Système Phagocytaire

Mononucléaire

NK: Naturel Killer

NO :Oxide Nitrique

PAMP: Pathogen Associated Molecular

Patten

PBMC : Cellules Mononuclées du Sang

Périphérique

PBS: Phosphate Buffered Saline

PGDF: Platelet-Derived Growth Factor

PGN: Peptidoglycane

PRR: Pattern-Recognition Receptors

RPMI -1640 : Roswell Park Memorial

Institute

S.M.A.F : Macrophage Armés par un

Facteur Spécifique

TGF-β : de Transforming Growth

Factor-β

TLRs: Toll-Like Receptors

TNF: Tumor Necrosis Facteur

TNF α : Tumor Necrosis Facteur α

DTH : Hypersensibilité retardée

MCP-1 : Protéine Chimio-attractive

Monocytaire 1

SR : Récepteur Scavenger

PGE2 : Prostaglandine E2

GBSS : Gey de l'équilibre Solution de

Sel

GBS : Gélose de Base

LCM : Cellule Milieu Conditionné

IV

Liste des tableaux

No

Titre Page

01 Les phénotypes de deux meilleurs caractéristiques des monocytes

chez le mammifère (GORDON et TAYTOR, 2005)

07

Liste des figures

No

Titre Page

01 (A) Image prise en microscopie électronique à balayage (SEM)

montrant des macrophages alvéolaires humains isolés par lavage

bronchioalvéolaire adhérant sur verre pendant 15 min avant fixation

(×3000),(B) Image prise en microscopie électronique à transmission

(TEM) montrant une coupe axiale de macrophages alvéolaires

humains (N :noyau) (FEREOL, 2005).

05

02 Schéma illustrant les différentes étapes de la différenciation de la

cellule souche en macrophage (FEREOL, 2005).

11

03 Apoptose des neutrophiles et clairance de phagocytose par les

macrophages dans la résolution de l’inflammation (PEARLINE

TEO, 2003).

14

V

Table de matière

Abréviation

Liste des tableaux

Liste des figures

Introduction 02

Chapitre I

Cellules mononuclées macrophages

I.-Macrophages 04

I.1.-Définition et historique 04

I.2.- Monocytes 05

I.2.1.- Hétérogénéité des monocytes chez l’homme 05

I.2.2.- Hétérogénéité des monocytes chez les souries 06

I.3.- Origine des macrophages 09

I.4.- Morphologie des macrophages 10

I.5.- Rôle des macrophages 11

I.5.1.- Filtration 11

I.5.2.- Reconnaissance et phagocytose 12

I.5.3.- Présentation de l’antigène aux lymphocytes T 12

I.5.4.- Sécrétion des cytokines 12

I.5.5.- Synthèse des protéines du complément 13

I.5.6.- Régulation de la production des monocytes au cours d’une inflammation

aiguë 13

I.5.7.- Apoptose 14

I.5.8.- Autres rôles 14

Chapitre II

Isolement et purification des macrophages

II.1.- Isolement des monocytes 17

II.1.1.- Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité 17

II.1.2.- Isolement des monocytes par la méthode de PETIT HORY et HO

THIN SAUJ 17

II.1.2.1.- Principe 17

II.1.2.2.- Méthode 17

II.1.3.- Isolement des monocytes par contre-centrifuge 18

II.2.- Purification des monocytes 18

II.2.1.- Epuisement des monocytes utilisant L-leucine méthyle ester 18

VI

II.2.2.- Purification des monocytes utilisant la gélatine 19

II.2.2.1.- Principe 19


II.3.- Isolement des macrophages 20

II.3.1.- Isolement des macrophages de la moelle osseuse 20


II.3.2.- Isolement des macrophages alvéolaires 21

II.3.3.- Isolement des macrophages testiculaires 21

Chapitre III

Culture des monocytes et des macrophages

III.1.- Culture cellulaire 24

III.1.1.- Types de culture cellulaire 24

III.1.1.1.- Culture primaire 24

III.1.1.2.- Culture secondaire 24

III.1.1.3.- Culture du linge cellulaire 24

III.1.2.- Milieu de la culture cellulaire 25

III.1.3.- Culture des monocytes in vitro 25

III.1.4.- Mesure de la libération de NO et de l’activité iNOS 25

III.1.5.- Induction de maturation des monocytes humains en macrophages in

vitro par la vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3 26

III.2.- Activation des macrophages 27

III.2.1.- Macrophages M1 et macrophages M2 28

III.2.2.- Prés-activation 29

III.2.3.- Voies d’activation 29

II.2.3.1.- Activation par la voie classique 29

II.2.3.2.- Activation par voie alterne 30

III.2.4.- Agents activateurs 31

III.2.4.1.- Agents d’origine bactérienne 31

III.2.4.1.1.- Lipopolysccharides (LPS) 31

III.2.4.1.2.- Peptidoglycane (PGN) 32

III.2.4.2.- Agents d’origine fongique 33

III.2.4.3.- Agents d’origine végétale 33

III.2.4.4.- Agents chimiques 34

III.2.4.4.1.- H2O2 34

Conclusion 36

Références bibliographiques 38

Annexes

Introduction

Introduction

2

Historiquement, les macrophages sont décrits comme acteurs clés de la réponse

immunitaire innée. ELIE METCHNIKOFF fut un pionnier dans la caractérisation des

macrophages en tant que cellules effectrices de la réponse immunitaire avec la description

de la phagocytose (GALES, 2009). Ces derniers sont une population de cellules dérivée de

progéniteurs de moelle osseuse CD34+ (MARUOTTI et al.,2013). Ils appartiennent à la lignée

myéloïde. Ils représentent la forme mature des monocytes qui circulent dans le sang et qui

migrent continuellement dans les tissus où ils se différencient après leur rencontre avec un

antigène (BERNARD, 2011).

Ils représentent une partie importante du système immunitaire, fournir a l’organisme

de première ligne de défense et dans le même temps responsable de la maintenance

quotidienne de l’homéostasie, les macrophages sont donc des cellules essentielles à la réponse

immunitaire (GRATCHEV et al., 2012). La réserve en macrophages tissulaires reste

relativement constante dans un organisme sain. Cependant ils sont constamment remplacés

par de nouveaux qui proviennent de monocytes circulants. Il est devenu clair que les

différentes maladies impliquent une modification de la fonction des monocytes circulants

(GRATCHEV et al., 2012).

La complexité des interactions cellulaires qui génèrent une réponse immunitaire a

conduit les immunologistes à se tourner bien souvent vers divers types de systèmes de culture

cellulaire in vitro, y compris les macrophages (KINDT et al., 2008). La culture cellulaire est

donc devenue une technique de routine pour certaine applications. Les techniques s’affinent

pour devenir de plus en plus contrôlées et reproductibles (OVAGUIMIAN, 2004). Certains

des domaines importants dans lesquels la culture cellulaire joue actuellement un rôle majeur

les tests de toxicité, recherche sur le cancer, virologie et découverte de nouveaux

médicaments (RYAN, 2007).

Pour cela l’objectif de ce travail est de décrire les différentes techniques d’isolement et

de culture des macrophages in vitro.

A cet effet cette étude s’articule autour trois parties, le premier partie correspond à une

synthèse bibliographique présentant les cellules mononuclées monocytes /macrophages,

origine, morphologie, hétérogénéité et rôles. Le second chapitre de ce manuscrit explique des

différentes techniques d’isolement des monocytes et macrophages. Le dernier chapitre de ce

mémoire présente des techniques de culture des monocytes in vitro, ainsi les différentes voies

d’activations des macrophages avec quelques exemples d’agents activateurs.

Chapitre I

Cellules mononuclées macrophages

Chapitre I Cellules mononuclées macrophages

4

I.- Macrophages

I.1.- Définition et historique

Les macrophages sont des globules blancs a durée de vie longue qui assurent la

surveillance immunitaire dans les tissus et qui y jouent un rôle d’entretien important. Ils

dérivent des monocytes qui circulent dans le sang et ils se différencient en quittant le flux

sanguin. Comme les neutrophiles, ils ingèrent et détruisent les micro-organismes

(DEFRANCO et al., 2009). Ils sont impliqués dans la phagocytose, dans le déclenchement et

la régulation de l’inflammation, dans l’apprêtement et la présentation des antigènes aux

lymphocytes T ainsi que dans la production de cytokines telles que l’IFN-y, le TNF-a et

l’IL-la, qui régulent l’immunité adaptative (STEVENS et al., 1997).

Ils tiennent leur nom de gros mangeur du grec (makros = grand, phagein = manger)

(SCHWARTZ, 2012). Ils sont initialement comptabilisés par ELIE METCHNIKOFF en 1838

que les cellules phagocytaires responsables de l’élimination des agents pathogènes et des

fonctions d’entretien ménager dans un large éventail d’organismes, d’invertébrés au vertébrés

(MARTINEZ et al., 2008).

En 1924, ASCHOFF a proposé la conceptualisation au système réticulo-endothélial

(RES) et inclus les macrophages (histiocytes) comme un élément majeur de ce système, avec

des cellules réticulaires et réticuloendothélial (TAKAHASHI, 2000). Bien que plusieurs

tentatives ont été faites pour classer les macrophages, les plus réussis définitions est le

système phagocytaire mononucléaire (MPS), qui englobe ces cellules phagocytaires

(phagocytes professionnels) et leur les progéniteurs de la moelle osseuse, les macrophages

tissulaires adultes sont définis comme des cellules de la lignée phagocytaire mononucléaire

dérivée d’extrémité à partir de monocytes qui prennent naissance dans la moelle osseuse de

circulation (WYNN et al., 2013).

Ce n’est qu’en 1972 que VAN FURTH à compris qu’a une grande dispersion

macrophagique correspondait en fait une fonctionnalité unique (BENE et al., 2005). Les

macrophages sont une population hétérogène de cellules réparties de façon ubiquitaire dans

les diverses organes et des tissus des êtres humains et des animaux; ils montrent différentes

morphologies et ont des fonctions variables selon les exigences des tissus dans les quels ils se

produisent (TAKAHASHI, 2000). Chez les mammifères adultes, ils se trouvent dans tous les

tissus où ils affichent une grande diversité anatomique et fonctionnelle. Dans les tissus, ils

sont organisés en motifs définis à chaque cellule occupant son territoire, un type de

macrophage dans un tissu (WYNN et al., 2013).


5

Fig.01- (A) macrophages alvéolaires humains en microscopie électronique à balayage (×3000),

(B) coupe axiale de macrophages alvéolaires humains en microscopie électronique à

transmission (FEREOL, 2005).

I.2.- Monocytes

Les monocytes appartiennent au système des phagocytes mononuclées (GALES,

2009). Ces cellules sont de grands leucocytes, 10 à 20μm caractérisées par un noyau en forme

de fer à cheval et possédant de nombreux lysosomes qui contiennent un large panel

d’enzymes (BARANEK, 2007). Ils représentent 2 à 10 % des leucocytes (HELLAL, 2007). 5

à 10 % des leucocytes circulants chez l’homme et 2 % des leucocytes circulants chez la souris

(BELIARD-LASSERRE, 2011). Les monocytes circulent dans le sang de 1 à 3 jours avant de

se différencier en différents types de cellules phagocytaires (BARANEK, 2007).

I.2.1.- Hétérogénéité des monocytes chez l’homme

Les monocytes circulants donnent lieu à une variété de macrophages tissulaires

résidants dans tout le corps. Les premiers travaux sur les monocytes humains ont permis

de rendre compte de l’hétérogénéité, tout d’abord la morphologique des monocytes. En effet

ces études permettant une séparation des cellules sur des critères morphologiques (GALES,

2009). Les monocytes du sang périphérique montrent une hétérogénéité morphologique, tels

que la variabilité de la taille, la granularité et la morphologie nucléaire (GORDON et

TAYLOR, 2005). Ces trois critères ont constitué les premiers constats d’une hétérogénéité de

la population monocytaire.

Deux populations sont alors distinguées. Une première, majoritaire, correspond

aux monocytes «réguler». Ces monocytes présentent une forte capacité de phagocytose et une

importante activité myéloperoxydase. Une seconde, minoritaire, constituée de « petits »

monocytes, est initialement caractérisée comme ayant une capacité importante à produire de

l’IL-1(GALES, 2009). L’identification ultérieure de l’expression différentielle des marqueurs


6

antigéniques ont montré que les monocytes dans le sang périphérique humain sont hétérogène,

et sont les premiers indices sur les différentes activités physiologiques de sous-ensembles des

monocytes (GORDON et TAYLOR, 2005).

L’expression différentielle de CD14 et CD16 (également connu sous le nom de Fc

RIII γ ) divise les monocytes en deux sous-ensembles. La première sous-population dite «

classique » parce que son phénotype ressemble à la description originale de monocytes. Elle

correspond aux monocytes présentant un faible taux d’expression du marqueur CD16

mais une expression importante du marqueur CD14 (CD14haut

CD16-). Elle représente plus de

80% des monocytes circulants chez un sujet sain. La deuxième sous-population est

caractérisée par la co-expression des deux marqueurs CD14 et CD16 (CD14+ CD16

+),

elle représente environ 10% des monocytes circulants. Ils expriment une quantités plus

élevée de molécules CMH de classe II et CD32 ( également connu sous le nom de Fc γ RII ) ,

et il a été suggéré que Ces cellules ressemblent à des macrophages tissulaires matures

(GORDON et TAYLOR , 2005) .

Des expériences in vitro ont permis des suggérer que ces différentes sous-populations de

monocytes pourraient avoir des fonctions différentes. En effet des différences dans leur

capacité de phagocytose et d’activation ont été reportées. Cependant, le rôle spécifique de

chaque ses sous-populations ainsi que leur importance physiopathologique restent à

déterminer (CHATENOUD L et BACH., 2012).

I.2.2.- Hétérogénéité des monocytes chez les souries

Une étape clé dans la caractérisation des cellules du système des phagocytes

mononuclées est l’arrivée des anticorps monoclonaux (GALES, 2009). Il émergea deux

marqueurs des cellules de ce système chez la souris (F4/80 et CD11b), les monocytes

identifiés chez la souris par leur phénotype F4/80+ CD11b

+. De manière comparable à la

population monocytaire humaine, les monocytes de souris sont subdivisés en deux sous-

populations distinctes basées sur les niveaux d’expression de deux marqueurs de

surface CCR2 (également connu sous le nom de L-sélectine) et CX 3 CR1 récepteur de

chimiokine C-1. Un sous-ensemble de monocytes exprimé CCR2 et seulement des quantités

modérées de CX 3 CR1dit population « résidente », tandis que la seconde n’exprime pas le

récepteur CCR2 ou CD62L mais a exprimé des quantités plus élevées de CX 3 CR1, cette

population dite « inflammatoire » (GORDON et TAYLOR, 2005).


7

Tableau 01- : Les phénotypes de deux meilleurs caractéristique des monocytes chez les

mammifères

Autres récepteurs

CD4 + + ND ND +/- ++

CD11a ND ND + ++ ND ND

CD11b ++ ++ ++ ++ ++ ++

CD11c ++ +++ - + - +

CD14 +++ + ND ND ND ND

CD31 +++ +++ ++ + ND ND

CD32 +++ + ND ND +++ +

CD33 +++ + ND ND ND ND

CD34 ND ND - + - +

Antigè

ne

“Monocytes

inflammatoi

res”

Humains

CD14hi

CD16 -

“monocyte

s

résidentes”

Humains

CD14+CD

16+

“Monocytes

inflammatoi

res” Souries

CCR2+

CX3CR1LO

W

“monocy

tes

résidente

s”

Souries

CCR2-

CX3CR1

hi

“Monocytes

inflammato

ires Rat

CD43low

“Monocy

tes

residente

s” Rat

CD43hi

Les récepteurs de chimiokines

CCR1 + - ND ND ND ND

CCR2

‡

+ - + - + -


CCR5 - + ND ND ND ND

CCR7 + - ND ND + -

CXCR

1

+ - ND ND ND ND

CXCR

2

+ - ND ND ND ND

CXCR

4

+ ++ ND ND ND ND

CX3C

R1 ‡

+ ++ + ++ - +



8

CD49b ND ND + - ND ND

CD62L ++ - + - + -

CD80 ND ND ND ND ND ND

CD86 + ++ ND ND ND ND

CD115 ++ ++ ++ ++ ND ND

CD116 ++ ++ ++ ++ ND ND

CD200R ND ND ND ND + -

F4/80 ND ND + + ND ND

Ly6C ND ND + - ND ND

7/4 ND ND + - ND ND

CMH

classe II

+ ++ - - ND ND

(-) : Aucune expression, (+ / -) : expression marginale, (+) : Existence d’une expression, (++,

…) : Expression en plus, (ffi) : Ces récepteurs présentent une bonne conservation des

différences d'expression.


9

La population CCR2+ CD62L+ CX3CR1bas Ly6C+ est assimilée à la population

de monocytes « classique » humaine. Parallèlement la population CCR2- Ly6C- est

corrélée à la population CD14+ CD16+ humaine. Ces monocytes Ly6C- CX3CR1haut

auraient un rôle de patrouilleurs dans les vaisseaux sanguins et assureraient l’élimination

des lipides oxydés, des cellules mortes mais seraient alors aussi impliqués dans la

pathogenèse de l’athérosclérose. Cependant ces monocytes patrouilleurs seraient très réactifs

en cas de dommages tissulaires et l’extravasation vers le tissu lésé serait réalisée très

rapidement. Ces correspondances entre sous-populations murines et humaines qui sont

encore actuellement étudiées, sont importantes afin d’appuyer la relevance de l’étude

des populations monocytaires, leurs caractéristiques fonctionnelles chez la souris pour

mieux comprendre les phénomènes (GALES, 2009).

I.3.- Origine des macrophages

Sabin et al. (1925) après coloration supra-vitale a signalé que les macrophages sont

tirées à partir de monocytes. Aussi EBERT et FLOREY (1939) au cours des études in vivo,

faites à l’oreille de lapins, ont constaté que les macrophages dans les foyers inflammatoire

étaient obtenues à partir de monocytes migrent du sang périphérique. Ainsi AMANO en 1948

a également maintenu sur la base des études par coloration supra-vitale que les macrophages

dans les foyers inflammatoires ou a l’état d’équilibre normal sont obtenues à partir de

monocytes migrent du sang périphérique (TAKAHASHI, 2000).

Les monocytes proviennent de cellules souches pluripotentes de la moelle osseuse

(WILSON et al., 2005). En présence de granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

(GM-CSF) et de monocyte colony-stimulating factor (M-CSF), les cellules souches exprimant

CD34 se différencient en monocytes (BURMESTER et al., 2000). Ils se transforment par

diverses étapes de maturation en monoblastes, puis finalement en monocytes qui sont

rapidement libérés dans la circulation (WILSON et al., 2005). Les monocytes circulants sont

hétérogènes. Cette hétérogénéité reflète la spécialisation de la fonction qui est adopté par les

macrophages dans différents emplacements anatomiques (GORDON et TAYLOR, 2005). Ils

y restent de un à trois jours ou moins dans le cas de maladies inflammatoires avant de migrer

dans les tissus et de se différencier en macrophages ou cellules dendritiques (WILSON et al.,

2005). De façon intéressante, la rate constitue un réservoir de monocytes dites inflammatoires

peuvent être recruté rapidement en particulier lors d’une défaillance cardiaque

(CHATENOUD et BACH, 2012).

Au départ, les monocytes roulent sur la surface de l’endothélium et sont exposés à des

chimiokines telles que CCL5 et CXCL8 liées à CD44 et aux protéoglycanes à sulfate


10

d’héparine sur la surface de la cellule endothéliale. Ces interactions activent les intégrines

leucocytaires, comme LFA-1, Mac-1 et VLA4, ce qui accroît leur affinité pour leurs ligands

endothéliaux. Ceci favorise une adhésion ferme et par la suite la diapédèse à travers

l’endothélium (WILSON et al., 2005). L’activation des cellules endothéliales accentue

l’efficacité avec laquelle elle interagit avec les monocytes, et des preuves que l’activation par

différentes cytokines influence les propriétés de transmigration des monocytes apparaissent.

Le recrutement par des chimiokines particulières influence également la maturation ultérieure

des monocytes. Les événements qui dictent si un monocyte va maturé en cellule dendritique

ou en macrophage et le type de macrophage qu’il va devenir surviennent très rapidement

après la migration et la localisation dans le foyer inflammatoire, et dépendent des signaux de

compétence délivrés par l’endothélium. Malgré cela, le microenvironnement des tissus

endommagés fournit probablement les signaux dominants à la fois pour la différenciation et

l’activation. En conséquence, IL-4, IL-15 et TNF- α conduisent les monocytes vers un

phénotype de cellule dendritique, alors que IFN- γ, IL-6, IL-10 et l’activation des récepteurs

de type Toll (TLR) favorisent un phénotype macrophage (WILSON et al., 2005).

I.4.- Morphologie des macrophages

La différenciation d’un monocyte en un macrophage tissulaire implique de nombreux

changement ; la cellule grossit cinq a dix fois, ces organites intracellulaires augmentent en

nombre et en complexité ; elle acquiert une plus grande capacité phagocytaire, produit des

taux plus élevés d’enzymes hydrolytique et commence à sécréter toute une série de facteurs

solubles. Les macrophages sont dispersés dans tout l’organisme. Certains élisent résidence

dans des tissus particuliers, où ils deviennent des macrophages résidents, tandis que d’autres

demeurent mobiles et sont appelés macrophages libres ou voyageurs. Les macrophages libres

se déplacent grâce à des mouvements amiboïdes à travers les tissus (KINDT et al., 2008).

Des cellules semblables aux macrophages assument divers fonctions dans des

différents tissus et sont dénommées en fonctions de leurs localisations tissulaires ,

macrophages de moelle osseuse, cellules du Küpffer, macrophages spléniques, macrophage

cérébraux et les cellules microglies, ostéoclastes, macrophages alvéolaires, et macrophages

des cavités séreuses.


11

Fig.02- Schéma illustrant les différentes étapes de la différenciation de la cellule souche en

macrophage (FEREOL, 2005).

I.5.- Rôle des macrophages

Les macrophages ont des nombreuses fonctions importantes. Il débarrassent

l’organisme des matériels étrangers ou des cellules mortes. Ils ont également un rôle

important dans la réponse immunitaire et d’autres activités spécialisées (COUJARD et

al.,1980).

I.5.1.- Filtration

Les macrophages ont un rôle crucial dans la filtration car ils sont présents dans tous

les territoires proches de l’extérieur, le poumon, le foie où les cellules de Küpffer sont situées

en première ligne face à ce qui vient du tube digestif et les ganglions (DEGOS, 1987). On les

trouve aussi dans la rate qui peut être considérée, notamment, comme un filtre du sang, le

sang lui-même sous forme de monocytes, les séreuses, le rein et le cerveau où ils constituent

la microglie (DEGOS, 1987). Les macrophages sont les principales cellules responsables de

nettoyage du matériel autochtone usagé et sachent le reconnaitre ; hématies vieilles,

lymphocyto-phagocytose dans les organes lymphoïdes (COUJARD et al., 1980).


12

I.5.2.- Reconnaissance et phagocytose

D’un point de vue fonctionnel, les macrophages sont doués par ses possibilités de

phagocytose ou de reconnaissances (DEGOS, 1987). Après sa mobilisation vers la cible la

macrophage doit reconnaitre l’antigène à ingéré puis l’ingérer, c’est la phagocytose

proprement dit dont le terme doit êtres la destruction et la digestion de cet agent agressif

(COUJARD et al.,1980).

La phagocytose propremendit est exepliquer comme suit, une fois acculée à la

membrane cellulaire, les substances à phagocyter est entouré par des pseudopodes se

rejoingent fusionnent forment alors des visicules de phgocytose ou phagosome (COUJARD et

al.,1980). Dans cette vois, un phagosome se déplace vers l’interieur de la cellule, où il

fusionne avec un lysosome, pour former un phagolysosome, les lysosomes contiennent du

lysozyme et de toute une gamme d’autres enzymes hydrolytiques qui digérent le matériel

ingéré (KINDT et al., 2008). Le macrophage est capable de restaurer non seulement la

membrane cytoplasmique par la formation de ces vacuoles, mais aussi les récepteurs

membranaires (COUJARD et al., 1980). Et finalement les constituants digérés du

phagolysosome sont ensuite éliminés par un processus dit exocytose (KINDT et al., 2008).

I.5.3.- Présentation de l’antigène aux lymphocytes T

La lyse des micro-organismes phagocytés se fait au sein de la cellule à l’aide de

dérivés activés de l’oxygène, de l’oxyde nitrique et d’enzymes lysosomiales (BURMESTER

et al., 2000), et notamment grâce aux péroxydases et aux estérase, cette digestion n’est

cependant pas complète car le macrophage doit présenter les antigènes aux lymphocytes T

(DEGAS, 1987). Le macrophage présente les antigènes sous forme de fragments, qui sont des

peptides présentés dans le contexte des molécules de classe II d’histocompatibilité, ce qui

signifie que le signal transmis par le macrophage aux lymphocytes est constitué d’un

assemblage du fragment antigénique et de molécules de classe II du complexe majeur

d’histocompatibilité (DEGOS, 1987). Les lymphocytes T représentent avec les macrophages

les cellules de l’immunité cellulaire (COUJARD et al.,1980).

I.5.4.- Sécrétion des cytokines

Les macrophages sont des cellules sécrétrices responsables de la sécrétion et la

libération des produits dans le milieu extracellulaire. Ils réalisent la synthèse des substances

intervenant dans la défense anti-infectieuse (COUJARD et al.,1980). Les macrophages

sécrètent des facteurs de croissance ; PGDF, TGF-β, EGF, TNF-α et IL-1 induit la


13

prolifération de l’endomètre (BELAISCH et al., 2003 ). Ils activent aussi la myélopoïèse

(CSF), cette dernière c’est la production des cellules myéloïdes ; globules rouges,

polynucléaires, monocytes et plaquettes (DEGOS, 1987).

Les macrophages jouent également un rôle dans la coordination des autres cellules et

tissus du système immunitaire ou d’autres système de soutien, Ils exercent cette influence par

la sécrétion d’une variété de cytokines, incluant I’IL-1, le TNF-α et L’IL-6, ces cytokines sont

particulièrement aptes à activer la réponse inflammatoire, bien que chacun de ces agents ont

des effets variés (KINDT et al., 2008). Par exemple, les macrophages stimulés par

l’inflammation peuvent contribuer à produire de l’IL-15, une faible concentration de ces

cytokines donne lieu à un processus de compétition entre les lymphocytes T CD8 mémoire,

les événements les plus dépendantes de l’IL-15 comprennent le développement et

l’homéostasie des cellules T CD8 mémoire, les cellules tueuses naturelles et les lymphocytes

intra-épithéliaux (CASTILLO, 2012).

Ainsi que l’IL-1 active les lymphocytes, et l’IL-1, l’IL-6 et le TNF-α favorisent la

fièvre en influent sur le centre thermorégulateur situé dans l’hypothalamus (KINDT et al.,

2008). De même, que de nombreuses autres cellules produisent de l’interféron lors d’une

atteinte virale et d’autant plus que l’individu est immunisé contre les virus (COUJARD et

al.,1980). Les macrophages sécrètent des facteurs non spécifiques qui inhibent la réponse

immunitaire comme les prostaglandines (DEGOS, 1987).

I.5.5.- Synthèse des protéines du complément

Avec les cytokines, les cellules du système phagocytaire mononuclée ; monocytes et

macrophages des organes lymphoïdes réalisent la synthèse des fractions C1, C2 et C3 du

complément (COUJARD et al.,1980). Les macrophages activés produisent des protéines du

complément qui favorisent l’inflammation et aident dans l’élimination des pathogènes, bien

que le site principal de la synthèse des protéines du complément soit le foie, ces protéines sont

également produites dans les macrophages et d’autre type cellulaire (KINDT et al., 2008).

I.5.6.- Régulation de la production des monocytes au cours d’une inflammation

aiguë

Le plasma et le sérum recueilli au cours de l’apparition d’une réaction inflammatoire

contiennent un facteur qui stimule le monocytopoiesis. Ce facteur est appelé facteur

augmentant le monocytopoiesis (FIM). Le FIM est synthétisé et sécrété par les macrophages

au site inflammatoire et ensuite transporté par l’intermédiaire de la circulation de la moelle

osseuse, où il exerce son action stimulatrice (VAN FURTH, 1985).


14

I.5.7.- Apoptose

Les macrophages participent également dans la clairière de cellules apostoliques.

L’apoptose est crucial dans le développement et l’homéostasie de tous les organismes

multicellulaires. Les caractéristiques typiques de cellules apoptotiques sont la fragmentation

nucléaire, bourgeonnement de la membrane et la présentation des signaux « mange- moi ».

L’intégrité de la membrane est préservée, et les cellules sont soigneusement englouties par les

cellules voisines et les phagocytes professionnels (PEARLINE TEO, 2003).

Fig.03- Apoptose des neutrophiles et clairance de phagocytose par les macrophages dans la

résolution de l’inflammation (PEARLINE TEO, 2003).

I.5.8.- Autres rôles

Dans la réponse secondaire de l’immunité de type humorale, les macrophages sont

également des cellules effectrices par leur phagocytose augmentée en présence d’opsonines

(COUJARD et al.,1980). L’opsonine molécule qui se fixent à la fois à l’antigène et aux

macrophages et intensifient la phagocytose, l’anticorps et le complément fonctionnent comme

des opsonines (KINDT et al., 2008). Ou par la destruction des cellules entourées par des

anticorps cytophiles (COUJARD et al.,1980). Ce processus par la quel des antigènes

particulières sont rendus plus sensibles à la phagocytose est appelé opsonisation (KINDT et

al., 2008).

Dans l’immunité anti-tumorale, les lymphocytes T après avoir reconnu la cellule

tumorale, transmettent aux macrophages une substance les rendant capables de détruire


15

spécifiquement ces cellules tumorales. Les macrophages prennent alors le nom de

macrophage armés par un facteur spécifique (S.M.AF) (COUJARD et al.,1980). Les

macrophages sont impliqués dans la défense anti-tumorale, ce pouvoir tumoricide est

considérablement amplifié par l’IFN-γ actif à très faibles concentrations à l’inverse, une

modulation négative peut-être exercée par l’IL-1, l’IL-10 et le TGF-β, cependant ,il a été

également démontré que les macrophages associés aux tumeurs peuvent, dans certains cas

,exercer des effets pro-tumoraux en particulier via une activité angiogénique ( BACH, 2008).

Chapitre II

Isolement et purification des macrophages

Chapitre II Isolement et purification des macrophages

17

II.1.- Isolement des monocytes

Il ya environ de 300 à 500 monocytes par µl de sang chez l’homme, soit 3 à 7% des

leucocytes dans la moelle. Pour un homme de70 kilos, le nombre totale est d’environ 7,3 ×109

dans la moelle et 1,7×109 dans le sang (GADAIS, 1981).

II.1.1.- Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité

Le sang périphérique est le principale source de cellules lymphoïdes et des cellules du

système immunitaires (KANOF et al., 1996). Le sang total prélevé sur anticoagulant est dilué

dans une solution saline, puis déposé sur une solution de Ficoll-Hypaque (Voir annexe 1)

(VAUBOURDOULLE, 2007). Après centrifugation, les hématies et les polynucléaires qui

ont une densité plus élevée se déposent au font du tube, alors que les cellules mononuclées ;

monocytes et lymphocytes formant un anneau à l’interface Ficoll-plasma

(VAUBOURDOULLE, 2007). Les monocytes sont sélectionnés à partir des cellules

mononuclées du sang périphérique (PBMC) par tri sélectif magnétique positif à l’aide

d’anticorps anti-CD14 (BELLO, 2008).

Les monocytes sont analysées par cytométrie en flux FACS (Fluorescence-Activated

Cell Sorter) en utilisant un double marquage anti-CD3 humain-FITC (isothiocyanate de

fluorescéine) et anti-CD14 humain-PE (phycoérythrine). Les monocytes sont caractérisés par

un phénotype CD14+/CD3-. La pureté des monocytes après tri cellulaire est au moins

supérieure à 90% à chaque fois (BELLO, 2008).

II.1.2.- Isolement des monocytes par la méthode de PETIT HORY et HO THIN SAUJ

II.1.2.1.- Principe

Cette méthode est basée sur la centrifugation du sang prélevé avec anticoagulant,

l’élimination des plasma et la lyse des érythrocytes par l’utilisation d’une solution

hypotonique (DULAT et al., 1984).

II.1.2.2.- Méthode

1. Prélever 10ml de sang dans des tubes stériles (vacutainer) avec deux anticoagulants,

Héparine 50 U.I (2 gouttes), et Rhéomacrodex (1ml).

2. Centrifuger à une vitesse de 3000-4000tours/mn. Après l’obtention de 3 couches,

Plasma, leucocytes et hématies.


18

3. Eliminer le plasma par aspiration sous vide, et laver le culot constitué de leucocytes et

d’hématies 3 fois par de l’eau physiologique, et centrifuger à chaque lavage.

4. Après ces lavages à l’eau physiologique, hémolyser les hématies par 30 gouttes de

saponine à 2% dans le sérum physiologique.

5. Laisse agir la saponine durant 2 minutes puis on centrifuge de nouveau pour ne laisser

se déposer que les leucocytes, un dernier lavage à l'eau physiologique donnera un

culot de centrifugation dépourvu d’hématies.

II.1.3.- Isolement des monocytes par contre-centrifuge

La centrifugation à contre-courant (CCE) est une méthode très efficace pour un grand

nombre de monocytes de PBMC purifiées (WAHL et al., 2005). La séparation des différentes

populations cellulaires se fait en fonction de leur taille et de leur densité.

Le contenu de la poche de cytaphérèse est introduit, à l’aide d’une pompe

péristaltique, dans une chambre d’élutriation conique tournant à grande vitesse (BARANEK,

2007). Le protocole comprend quatre parties, montage du système de CCE, préparation de

cellules mononucléaires, et l’isolement des monocytes par le CCE. L’avantage de cette

méthode que le CCE ne conduit pas à l’activation de monocytes lorsqu’elle effectué en

l’absence complète de l’endotoxine (WAHL et al., 2005).

II.2.- Purification des monocytes

II.2.1.- Epuisement des monocytes utilisant L-leucine méthyle ester

Les monocytes peuvent également être épuisés à partir de suspensions de cellules

mononuclées du sang périphérique ; PBMC par une procédure qui prend avantage de leur

riche teneur en enzyme lysosomale. Cette procédure utilise un agent méthyle de L-leucine

lysosomotropique ester qui est repris par des cellules phagocytaires et des cellules

cytotoxiques. Cette molécule est concentrée dans les lysosomes, où il est converti par des

enzymes lysosomales à l’ester méthylique de L-leucyl-L-leucine, qui est toxique pour les

lymphocytes B et la majorité des cellules T (cellules non riches en lysosomes). Toutefois, cet

agent ne supprime pas les cellules NK et les lymphocytes T cytotoxiques (KANOF et al.,

1996).


19

II.2.2.- Purification des monocytes utilisant la gélatine

II.2.2.1.- Principe

Les monocytes de sang périphérique humain sécrètent une glycoprotéine associée à la

membrane cellulaire, de la globuline insoluble à froid (fibronectine). Etant donné que la

fibronectine se lie à la surface de la gélatine revêtue. La technique la plus simple pour la

séparation des monocytes du sang périphérique provenant de la préparation de cellules

mononucléaires ensemble. Ces préparations sont caractérisées par un degré de pureté élevé

de monocytes (plus de 90%), de la contamination des plaquettes bas et une excellente viabilité

(HASSAN et al., 1986).

II.2.2.2.- Méthode

1. Préparer des Flacons revêtus de gélatine de 2 g de gélatine.

2. Ajouter à 100 ml d’eau bi distillée et passer à l’autoclave à 110 ° C pendant 40 min.

3. Porter la solution de gélatine à 2% à la température ambiante et ajouter 10 ml à 75 cm2

Corning flacons de culture tissulaire.

4. Incuber les flacons de culture à 37 ° C dans un incubateur sec pendant 2 h.

5. Eliminer la gélatine complètement par aspiration et stocker les flacons à 37 ° C dans

un incubateur sec pendant 48 h avant utilisation. Ces flacons peuvent être utilisés

pendant au moins 2 semaines.

6. Rincer deux fois les flacons de culture revêtues de gélatine avec du tampon de DMEM

(Voir annexe 3) et ajouter à chaque flacon 15 ml de suspension de cellules

mononucléaires (2-4. 106/ml) Après 1 h d’incubation à 37 ° C, 5% CO2, éliminer les

cellules non adhérentes par aspiration et laver doucement les flacons plusieurs fois

avec du DMEM préchauffé à 37°C.

7. Ajouter 5 ml de mélange 1: 1 de 10 mM d’acide éthylène diamine tétra acétique

(EDTA) en Ca 2 +

, Mg2 +

, libre PBS avec du DMEM 20% de sérum de cheval (HS)

préchauffé à 37 ° C.

8. Incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 minutes pour éliminer les cellules adhérentes.

9. Tapotant doucement avant et après l’incubation le détachement cellulaire optimale.

10. Centrifuger les cellules, et remis en suspension dans un milieu DMEM, (20% HS).


20

II.3.- Isolement des macrophages

L’isolement de cellules de Küppfer (KC) à partir de souris par élutriation de

centrifugation à contre-courant (CCE) a été décrit en 1977 par Knook et Sleyster mais

l'isolement des macrophages spléniques est beaucoup plus difficile puisque la rate possède

différents types de macrophages y compris les macrophages de la zone marginale et

macrophages de la pulpe rouge, la feuille péri-artériolaire, et les metallophils marginaux qui

tous possèdent des caractéristiques différentes (TEN HAGEN et al., 1996).

L’élutriation centrifuge à contre-courant est un procédé de séparation qui permet la

séparation des différentes populations de cellules mononuclées du sang périphérique

(DUPONT, 2011). Et même est une méthode de choix pour obtenir des macrophages

tissulaires résidants, tels que ceux qui sont présents dans le poumon ou le foie qui ne sont pas

facilement isolé (JANOUSEK, 1993). Cette technique combine deux principes physiques ;

La centrifugation qui est un procédé de sédimentation sous l’effet d’une force centrifuge.

L’élutriation qui est un procédé de séparation sous l’effet d’un flux de tampon dont la vitesse

d’écoulement est contrôlée par une pompe péristaltique (DUPONT, 2011).

La séparation des différentes populations cellulaires se fait en fonction de leur taille et

de leur densité. Le contenu de la poche de cytaphérèse est introduit, à l’aide d’une pompe

péristaltique, dans une chambre d’élutriation conique tournant à grande vitesse (BARANEK,

2007).

II.3.1.- Isolement des macrophages de la moelle osseuse

La moelle osseuse des os de la jambe de souris est une grande source macrophages

(MO) qui peuvent être facilement cultivées (DORRINGTON, 2011).

II.3.1.1.- Méthode

1. Verser le milieu contenant les os dans la première petite boîte de Pétri.

2. Transférer les os avec pinces stériles à la deuxième boîte de Pétri contenant 70 %

d’EtOH pendant une minute, puis à la troisième boîte de Pétri contenant du PBS

stérile.

3. Retirez un os de la PBS avec des pincettes et couper les extrémités.

4. Rincer la moelle osseuse dans le tube Falcon de 50 ml en insérant une aiguille de

calibre 26 fixée à la seringue de 20 ml remplie de PBS sur le côté du genou des deux

types d’os.


21

5. Passer le PBS à travers l’os jusqu’à ce que la couleur de l’os passe du rouge au blanc,

ce qui indique que toute la moelle a été expulsée.

6. Lorsque tous les os ont été lavés de la moelle, ajouter tout le PBS restant de la

seringue dans le tube Falcon.

7. Disperser la moelle osseuse par aspiration dans un 20 ml seringue vide à travers une

aiguille de calibre 19 deux fois, faire cela plus de deux fois pour cisailler les cellules.

8. Centrifuger les cellules à 1500rpm pendant 5 minutes à 4 ˚ C.

9. Rejeter le surnageant dans un récipient avec l’eau de Javel ou Virkon et remettre les

cellules en milieu 15mL R10 contenant 15% de LCM, le volume de 15 ml est suffisant

pour ensemencer 3 grandes plaques ou 3 flacons T175 (5mL/plate).

10. Chaque plaque ou flacon doivent être préparés avec les médias 20 ml R10 + 15 %

LCM. Ajouter 5 ml de suspension cellulaire et agiter à distribuer cellules dans un

milieu.

11. Incuber à 37 ˚ C et 5 % de CO2. Ne pas sceller la plaque avec du parafilm

II.3.2.- Isolement des macrophages alvéolaires

Les macrophages alvéolaires sont isolés à partir de poumon de rats ou rates sains

pesant environ rats 375-400g. Dans un premier temps, les animaux sont anesthésiés par une

injection de 30 mg /kg de pentobarbital de sodium. Après l’exsanguination, un cathéter est

placer dans la trachée et des lavages broncho alvéolaire avec massage des poumons, sont

réalisés avec 100 ml de solution I contenant 140ml de NaCl,5 mM de KCl, 2,5de PBS, 10

mM d’Hepes, 6 Mm de D-glucose, et 0,2 Mm d’ EDTA (acide éthylène diaminotétraacétique

sel disodique) à 37 C. Les premiers 10 ml du liquide de lavage sont jetés afin de ne

sélectionner que les macrophages les plus adhérents et ceux réellement issus des alvéoles

pulmonaires. En effet, LAPLANTE et COLL ont montré que les macrophages alvéolaires

issus de 3 premiers lavages broncho-alvéolaires sans massage sont moins adhérents que ceux

issus des 5 derniers lavages avec massage. Les liquides de lavages sont ensuite centrifugés à

500g pendant 10 minutes. Le culot cellulaire est repris dans le milieu de culture RPMI

complété avec 0,1 % BSA. Une moyenne de 4.106/rat est obtenue (FEREOL, 2005).

II.3.3.- Isolement des macrophages testiculaires

Macrophages testiculaires isolé à partir du tissu interstitiel par digestion enzymatique

du testicule suivie par centrifugation en gradient de densité et élutriation cellulaire. Testicules

décapsulés ont été lavées trois fois dans du PBS stérile. Six testicules ont été incubés dans 50

ml de PBS contenant de la collagénase (30U) dans un bain -marie à agitation à 34 ° C pendant

10 min. Les tubes séminifères ont ensuite été autorisés les sédiments, et le surnageant a été


22

soigneusement retiré avec seringue stérile. La suspension de cellules interstitiel ont ensuite été

déposés délicatement sur 15 ml de Ficoll -Hypaque et centrifugés (1200 x g) à 4°C pendant 20

min pour sédimenter les restes tubules des cellules germinales, les érythrocytes, et les débris

cellulaire.

Une fraction contenant des macrophages brut était recueillies à partir de l’interface

surnageant-Ficoll, lavé deux fois par centrifugation dans du HBSS (Voir annexe 2) à 250 X g

pendant 5 min, et remises en suspension dans 10 ml de HBSS prêt pour élutriation, et pour

cela, une centrifugeuse BeckmanJ2 -21 et Beckman JE- 6B élutriation rotor ( Beckman

Instruments , Palo Alto , CA) utiliser à une vitesse constante de 2000 + /- 40 rpm. HBSS

stérile contenant 1 % de BSA a été pompé à travers le rotor sous une pression positive par une

pompe à Desaga (Heidleberg, Allemagne). La préparation des cellules testiculaires (10 ml)

était injecté dans la chambre d’élutriation de mélange, et après un premier lavage de 150 ml

avec la pompe fixée à un taux de 15 ml / min, trois fractions de cellules (150 ml chacune en

volume) ont été éluée. Fractions collectées au taux de débit de la pompe 19 ml /min, 28 ml

/min, et 31 km / min à condition que les rendements les plus élevés de macrophages telles que

décrites par DIRAMI et al. Les cellules dans ces fractions ont été lavées une fois par

centrifugation (250 X g pendant 5 minutes) et remises en suspension dans du RPMI -1640

(Voir annexe 4) (KERN, 1995).

Chapitre III

Culture des monocytes et des macrophages

Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages

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III.1.- Culture cellulaire

La culture de cellule animale en dehors l’organisme permet l’observation de cellules

vivantes dans des conditions favorables (DE ROBERTIS et al., 1983). L’utilisation et la

culture de cellule eucaryote isolée sont plus récentes début de XX siècle que celles d’autres

cultures (BRANGER et al., 2007). Depuis de 1912 alors que CARREL le premier réussissait

à faire croitre des explants tissulaires durant plusieurs génération cellulaires des progrès

considérables ont été accomplis dans la technique des cultures cellulaires (DE ROBERTIS et

al., 1983) . Les cellules en culture présentent plusieurs avantages sur l’organisme intacts pour

la recherche en biologie cellulaire (MASSON et al., 2005).

III.1.1.- Types de culture cellulaire

On peut distinguer trois types principaux de culture, primaire, secondaire, et les

cultures utilisant la lignée cellulaire établit (DE ROBERTIS et al., 1983).

III.1.1.1.- Culture primaire

La culture primaire est obtenue directement de tissu animal, ce type de la culture peut

être considérée comme telle jusqu’à son premier repiquage. Les cellules peuvent dans certains

cas se diviser, mais pour de nombreux types cellulaires, il s’agira seulement d’un maintien en

survie (RYAN, 2007).

III.1.1.2.- Culture secondaire

La culture secondaire obtenue par repiquage à partir d’une culture primaire et dans un

milieu de culture frais (DE ROBERTIS et al., 1983).

III.1.1.3.- Culture du linge cellulaire

La culture utilisant de lignée cellulaire établies qui sont adapté à une croissance

prolongée in vitro, parmi les lignées cellulaires les plus connues, les cellules L et 3T3 de

l’embryon de souris, les cellules BHK extrais de rein d’un hamster nouveau-né et les cellules

CHO de l’ovaire de hamster chinois (POPESCU et al., 1998).


25

III.1.2.- Milieu de la culture cellulaire

Les conditions de culture doivent permettre l’entière satisfaction des besoins des

cellules afin d’assurer de maintien de l’activité cellulaire, mais aussi la croissance, la

multiplication et la différenciation (MASSON et al., 2005). Le milieu de culture et

l’environnement physicochimique idéaux (PH, température, pression osmotique, oxygénation)

reproduirait exactement les conditions dans les quelles les cellules se trouvent in vivo

(BRANGER et al., 2007).

III.1.3.- Culture des monocytes in vitro

1. Les cellules obtenues sont remises en suspension dans un milieu de culture, et

supplémenté avec le sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FCS).

2. Ensemencer les cellules, lorsque le tapis de culture arrive à confluence il faut décoller

les cellules du support, les disperser et les réensemencer à une densité plus faible dans

un nouveau récipient de culture. Cette opération est appelée repiquage, La dispersion

des cellules peut être réalisée par grattage du tapis, ou plus classiquement par

utilisation d’un mélange de trypsine et d’EDTA).

3. Incuber les cellules dans une atmosphère humidifiée au CO2.

4. Eliminer les cellules non adhérentes par aspiration, et laver le ballon deux fois avec un

tompon stérile.

5. Déplacer les monocytes adhérents et par la suite incuber dans le tompon et d’éthylène

diamine tétra acétate (EDTA) à 37 ° C avec 5% CO2.

La population de cellules obtenue est de 70 à 90% des monocytes. Etaler ces cellules

dans du milieu de culture, et de FCS, à une densité de 3-2× 106 cellules / ml et cultiver à une

atmosphère humidifiée au CO2 (MACKENZIE et al., 2002).

III.1.4.- Mesure de la libération de NO et de l’activité iNOS

On détermine la production de NO indirectement, par dosage de nitrite dans le

surnagent de culture, le produit final stable de NO réagit avec l’oxygène moléculaire (YANG

et al., 2007). Les macrophages adhérés sont cultivées avec différentes concentrations de LPS

ou de PPA, H2O2 à 37 °C pendant 36h après le traitement (YANG et al., 2007 ).


26

Après l’activation, les phagocytes expriment des taux élevés de l’enzyme inductible

NO synthétase (iNOS de inductible nitric oxide synthetase), une enzyme qui oxyde la L-

arginine pour donner la L-citrulline et l’oxyde nitrique (NO de nitric oxyde).

L’oxyde nitrique a une activité antimicrobienne puissante et peut se combiner avec

l’anion superoxyde pour donner des substances antimicrobiennes encore plus puissantes. Des

preuves récentes indiquer que l’oxyde nitrique et les substances qui en dérivent comptent

pour beaucoup dans l’activité antimicrobienne des macrophages contre les bactéries, les

champignons, les helminthes ou les protozoaires (KINDT et al., 2008).

100µl de surnagent sont isolés et mis à réagit avec le réactif de Greiss (1%

sulfanilamide, 0 ,1% N-1- naphtyle éthylène diamine di chlorhydrate, 2 ,5% l’acide

phosphorique) à la température ambiante pendant 10 min (YANG et al., 2007 ). La

production de nitrite a été déterminée par la mesure de l’absorbance à 550nm par rapport à

une courbe standard NaNO2 (YANG et al., 2007 ).

L’activité de iNOS a été déterminé par l’utilisation d’un kit de dosage de réactif

Jiancheng BioEngineering. Le dosage de l’activité iNOS dépend de la capacité de catalyser

l’arginine pour former NO, qui peut en outre réagir avec des substances nucléophiles pour

produire le composé chromophore, qui a une absorbance maximale à 530 nm (longueur

d’onde) (LI et al., 2008). Une unité d’activité de iNOS a été défini comme la production de

NO par 1 mol .1 × 106

cellules par min et exprimée en U / m (YANG et al., 2007 ).

III.1.5.- Induction de maturation des monocytes humains en macrophages in vitro par la

vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3

Les cellules du système des phagocytes mononuclées proviennent de monocytes du

sang circulant qui subissent une maturation supplémentaire à la sortie du système vasculaire et

la migration dans les divers tissus et des cavités du corps. Cette étape de différenciation

terminale est également observée in vitro dans le sang lors de monocytes sont cultivées en

présence de sérum (KREUTZ et al., 1990). On constaté que le métabolite actif de la vitamine

1,25-dihydroxyvitamine D3 [l, 25(OH) 2D3] pourrait déclencher la maturation des monocytes

purifiée à partir du sang et mettre en culture primaire d’élutriation en macrophages et aussi

en l’absence de tout protéines de sérum. La vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3 peut jouer

un rôle essentiel dans l’ontogenèse du système des phagocytes mononuclées (KREUTZ et al.,

1990).


27

Les cellules doivent être cultivées pendant 7 jours en présence la vitamine 1,25-

dihydroxy vitamine D3. La vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3, est dissous dans l’éthanol

100% à une concentration de 2 x 10-3

mol / L et stockés à 2O°C (KREUTZ et al., 1990).

À une concentration optimale de 10-8

mol / L de la vitamine 1,25- dihydroxyvitamine

D3 (1,25 (OH) 2 D3) a favorisé le développement de macrophages complètement

différenciées dont le phénotype et la compétence fonctionnelle en termes de libération de

cytokines (facteur de nécrose tumorale α (FNTα), l’interleukine-6, la fibronectine, et

lysozyme) était comparable aux macrophage cultivés dans le sérum (KREUTZ et al., 1990).

III.2.- Activation des macrophages

Les monocytes et les macrophages répondent à un certain nombre d'agents exogènes

par des altérations dans le métabolisme et l'expression des gènes dans un procédé de façon

lâche appelé «activation» (CARLSEN et PRYDZ, 2006). Le concept d’activation des

macrophages daté les années 1960, et lié aux études de NORTH ET MACKANESS (

WILSON et al., 2005). Ces études qui montrent que l’infection des souris avec

Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) ou Listeria monocytogenes accroit

l’activité antimicrobienne des macrophages de façon antigène-non-spécifique. Ce concept

d’activation cellulaire a été développé a partir d’observation de cellule en culture in vitro qui

réagissent à une variété de substance en alternat leurs propriétés biochimiques et leurs

activités fonctionnelles (DE GAGNE, 2005).

Les macrophages équipé par des récepteurs pour les cytokines des lymphocytes T

auxiliaires, de cellules IFN- c et de l’IL -4, les macrophages sont soumis à des programmes

d'activation spécifiques au cours de la réponse immunitaire de type Th1 ou Th2. Ces profils

d'activation, appelés classique ou respectivement alternatif d’activation, elles sont réglés en

outre par la présence et la reconnaissance des modèles de microbiennes associées

moléculaires, d'autres cytokines, des lipides, et même une adhérence au substrat. L’activation

des macrophages s'appuie également sur le fond de la maturation des cellules, le

déclenchement de complexes cascades de signalisation intracellulaires, et la diaphonie entre

les différents éléments de signalisation (MARTINEZ, 2011).

Les macrophages activés répondent à l’activation par une augmentation de la taille

et nombre des granules cytoplasmiques, dont un phagocyte mononucléaire activé par les

lymphokines à une taille deux fois plus grosse à un macrophage au repos. Les fonctions vont

aussi être altérées. On remarque un métabolisme plus actif ainsi qu’un transport d’acides

aminées et du glucose , une augmentation d’activité enzymatique , de prostaglandine, du


28

GMPc , du l’activateur du plasminogène, du calcium intracellulaire, de la phagocytose, de la

pinocytose et la capacité à lyser les bactéries et les cellules cancéreuses(DE GAGNE, 2OO5)

.Et par conséquence la phagocytose des bactéries et la production de cytokines comme l’

IL-1, le TNFα et l’IL-6 qui déclenchent la réponse inflammatoire et activent les

lymphocytes du bras adaptatif du système immunitaire (REICHHART et IMER ,2000 ).

III.2.1.- Macrophages M1 et macrophages M2

Selon leur réponse immunologique, les macrophages ont été classés en deux sous

catégories (MALU DIANE ,2011). Polarisation fonctionnelle des macrophages en M1 ou M2

est une utilité opérationnelle, conceptuel simplifié cadre décrivant la plasticité des

mononucléaires phagocytes (MANTOVANI et al.,2005). D’une autre façon les macrophages

peuvent s’orienter vers un phénotype pro-inflammatoire (M1) ou anti-inflammatoire (M2) qui

va permettre de moduler la réponse immunitaire (CASSARD-DOULCIER et PERLEMUTER

,2011).

Les macrophages de type1 (polarisation M1) sont dits activés et sont impliqués

dans les réponses inflammatoires . Ils interviennent dans la résistance de l’hôte aux

pathogènes intracellulaires, la destruction tissulaire et la résistance anti-tumorale. Ils

sont activés lorsqu’ils sont stimulés par l’IFN-γ, le TNF-α ou par des composants

bactériens comme le LPS. Leur activation est bloquée par L’IL-4 et l’IL-13. Les

macrophages M1 sont caractérisés par une forte capacité à présenter les antigènes, à produire

de l’IL-12 et de l’IL-23 (24) et par conséquent à polariser la réponse immune vers la voie Th1

(BERNARD ,2011).

En revanche, les macrophages de type 2 (polarisation M2), activés de manière

alternative, ont une activité modulatrice (MALU DIANE ,2011). Ils interviennent dans les

phénomènes de réparation, de remodelage tissulaire, dans l’allergie, la résistance contre les

parasites et le développement de tumeurs. Il existe 3 sous-classes de macrophages M2 :

M2a, M2b, M2c. Les macrophages sont activés alternativement lorsqu’ils sont stimulés

par l’IL4 ou l’IL13 (M2a), par les complexes immuns ou des agonistes de l’IL-1R (M2b) ou

par l’IL-10 (M2c) (28). Ils sont caractérisés par une forte production d’IL-10, (TGF-β)

et une faible production de cytokines pro-inflammatoires (IL-12, d’IL-1, d’IL-6, TNF-α),

orientant la réponse immunitaire vers la voie Th2 (BERNARD ,2011).


29

III.2.2.- Prés-activation

La prés-activation est une première étape très efficace avant une activation complète, la

cellule est préparée par une insulte initiale et elle est prête lors d’une insulte subséquente.

Cependant, la cellule pré-activée, n’a pas le phénotype d’une cellule activée et par

conséquence ne produit pas de cytokines pro-inflammatoire ou autres médiateurs cytotoxique.

Les macrophages tissulaires sont souvent prés-activés avant de subir l’activation classique ou

ils subissent une activation alternative. L’activation est toujours accompagnée par la

désactivation ou par la mort cellulaire (DE GAGNE, 2005).

III.2.3.- Voies d’activation

II.2.3.1.- Activation par la voie classique

La compréhension de l’activation classique des macrophages remontent aux année 60

et provient d’études de NORTH ET MACKANESS comme nous avant montré

précédemment (DE GAGNE, 2005).Cette activation nécessite une exposition à deux stimuli

(WILSON et al., 2005). L’INT-γ semble être le stimulus le plus important dans l’activation

des macrophages (DE GAGNE, 2OO5). Mais c’est pas lui-même qui active les macrophages

directement (MOSSER, 2003).Suivi de l’exposition aux microbes ou un produit microbien

qui lient les récepteurs de type Toll (par exemple CpG, LPS) ou les cytokines pro-

inflammatoires comme IL-1 et le facteur de nécrose tumorale (TNF) ( WILSON et al., 2005).

Ce dernier qui est Le deuxième stimulus, lui-même ou leur inducteur.TNF exogène peut agir

en tant que second signal , mais le deuxième signal physiologiquement pertinente

généralement à le résultat de récepteur type Toll ( TLR ) , qui induit TNF endogène la

production par les macrophages lui-même (MOSSER, 2003).

Les macrophages activés par la voie classique sécrètent des médiateurs pro-

inflammatoires qui détruisent et dégradent les bactéries en augmentant la production

d’espèces oxygénées toxiques et de monoxyde d’azote (NO). Ils expriment des niveaux élevés

de CMH de classe II, de molécules Co-stimulatrices (telles que les CD86) et de cytokines (par

exemple l’IL-12) qui soutiennent les réponses immunitaires exercées par Th1 [24]. Ils

sécrètent également des chimiokines et des cytokines pro-inflammatoires mais expriment peu

de récepteurs du mannose et ont une capacité réduite à ingérer les cellules apoptotiques [27]

(WILSON et al., 2005). L’INT-γ induit l’expression des molécules du CMH II et les

récepteurs Fcγ augmenté la respiration oxydative, et augmenté la libération de TNF,

augmenté la production de cytokine pro-inflammatoire, diminué sélectivement l’activité des

récepteurs (DE GAGNE, 2005).


30

II.2.3.2.- Activation par voie alterne

Au début des années 1990, pendant l'examen de la réglementation de l'expression des

récepteurs de mannose induite par les macrophages, GORDON ET COLL a remarqué que la

manière particulièrement efficace pour déclencher l'expression du récepteur était de traiter ces

macrophages avec IL-4. Les auteurs ont conclu que les macrophages traités avec IL-4 assumé

un phénotype d’activation alternative. Il s'agit donc de la première description d'un

macrophage qui présentait des signes d'activation mais était clairement distincte de son

homologue classique activé. Des études ultérieures par GOERDT ET ORFANOS ont défendu

de cette cellule comme un macrophage réglementaire avec divers rôles biologiques différents

du cellule activée par la voie classique (MOSSER, 2003).

L’activation alternative des macrophage par l’IL-4 et l’IL-13 est beaucoup moins

définie .Ces cytokines sont généralement produits dans des réponses de type Th2 (anticorps et

défense antiparasitaire) , particulièrement dans les allergies, les réponses cellulaires et

hormonales aux parasites et pathogènes extracellulaires (DE GAGNE, 2005). Cette activation

survient lorsque les macrophages sont incubés avec IL-4, IL-13 ou des glucocorticoïdes.

Ces macrophages ne sont pas cytotoxiques, mais ils sont essentiellement impliqués dans

la réparation tissulaire et provoquent une augmentation de la déposition de matrice

extracellulaire ( WILSON et al., 2005).dans cette voie d’activation en présence d’ ’IL-4 et

d’IL-13qui signalent aux macrophages en partie par un récepteur commun, IL-4Rα (DE

GAGNE, 2005).

L’IL-4 et IL-13 ont pour effet d’induire l’expression des molécules du CMH II et

d’augmenter le niveau d’activité des récepteurs mannoses des macrophages dans le but

d’accroître les mécanismes d’apprêtement et de présentation des antigènes. Contrairement à

l’activation de type classique, les macrophages activés alternativement démontrent une

diminution de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires et ils sont résistants à la

réactivation (DE GAGNE, 2005).

Les macrophages activés par la voie alternative caractérisés par l’expression des

molécules du CMH II, une augmentation de l’expression des récepteurs du mannose

(WILSON et al., 2005), dans le but d’accroître les mécanismes d’apprêtement et de

présentation des antigènes (DE GAGNE, 2005). Ainsi que d’autres récepteurs « scavenger »

et des récepteurs antagonistes de l’IL-1 (IL-1ra). Et Ils neutralisent faiblement les agents

pathogènes intracellulaires en raison de l’inaptitude à produire des radicaux NO( WILSON et

al., 2005). Contrairement à l’activation de type classique, les macrophages activés


31

alternativement démontrent une diminution de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires

et ils sont résistants à la réactivation (Voir annexe 5) (DE GAGNE, 2005).

III.2.4.- Agents activateurs

III.2.4.1.- Agents d’origine bactérienne

III.2.4.1.1.- Lipopolysccharides (LPS)

Au début du 20 e siècle, une certaine activité toxique des bactéries fut associée à un

facteur composé de lipides et carbohydrates (SZALO et al., 2006). L’infection bactérienne

constitue un bon exemple qui est les bactéries à gram négative expriment sur leur paroi

externe des lipopolysaccharides (LPS), cette molécule est fortement immunogène. le LPS

représente la principale composante non-protéique de la membrane externe des bactéries G

- et est composé de trois parties. Le lipide A, situé à la partie proximale du LPS et à

l’intérieur de la bicouche lipidique, possède un caractère hydrophobe (SZALO et al., 2006),

est responsable de la majeure partie de l'activité immunostimulante du LPS (DOUGHTY ,

2011) . l’antigène O (pour Ohne Kapsel), situé à la partie distale du LPS, de nature

polysaccharidique, possède un caractère hydrophile ,le noyau (ou core ) de nature

polysaccharidique représente le pont entre les deux autres parties et est divisé à son tour en

deux parties : le noyau interne plutôt hydrophobe et le noyau externe plutôt hydrophile

(SZALO et al.,2006). Ces composants du LPS sont pas les mêmes à partir de toutes les

bactéries à Gram négatif et peuvent être distinguées par des variations de phosphorylation, des

chaînes acyles, le nombre de monosaccharides, des liens, et la composition en acides gras.

Ces variations sont très importantes pour l’activité immunostimulante du lipide A et le LPS

(DOUGHTY, 2011).

Lors d’une d’infection, le récepteur CD14, réparti sur la membrane des monocytes et

des macrophages, est le récepteur du LPS par excellence. L’activation cellulaire

intervient après un laps de temps de 15 à 30 minutes, délai lié à l’internalisation du

complexe LPS/CD14.L’activation est déclenchée grâce à la coopération de la CD14 avec la

protéine TLR4 et MD2 . Ensuite, deux protéines adaptatrices MyD88 et TIRAP

mobilisent la voie de signalisation dépendante des protéines IRAK4, TRAF6, TAB1 et

TAK1. La protéine TAK1 est capable d’activer la voie des MAP kinase et plus

particulièrement la protéine. Cette cascade d’activations moléculaires induit l’activation

d’AP1 menant à l’activation transcriptionnelle. AP1 est largement connu pour jouer un rôle

dans la prolifération, la différenciation, l’apoptose, la survie mais surtout l’inflammation.

Les gènes de l’inflammation régulés par AP1 sont très variés comme les gènes codant pour


32

des cytokines (IL-1, IL-6, TNF…), des chimiokines (IL-8…) , des métallo protéases

(MMP-1…), des molécules d’adhésion (intégrine…) ou encore des enzymes comme COX-1

et 2 . Cette cascade d’activations moléculaires induit l’activation d’AP1 menant à l’activation

transcriptionnelle. AP1 est largement connu pour jouer un rôle dans la prolifération, la

différenciation, l’apoptose, la survie mais surtout l’inflammation. Les gènes de

l’inflammation régulés par AP1 sont très variés comme les gènes codant pour des cytokines

(IL-1, IL-6, TNF…), des chimiokines (IL-8…), des métalloprotéases (MMP-1…), des

molécules d’adhésion (intégrine…) (ou encore des enzymes comme COX-1 et 2 (FOLLOT,

2011).

III.2.4.1.2.- Peptidoglycane (PGN)

Le peptidoglycane (PGN) est un polymère présent dans la paroi cellulaire de la plupart

des espèces bactériennes (LAWRENCE C et NAUCIEL , 1998), et le composant majeur de

la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif (CHEN et al., 2006) . Dont il est responsable

de la rigidité de la paroi cellulaire (LAWRENCE C et NAUCIEL , 1998).

PGN est composé de chaînes linéaires d’une alternance de N-acétylglucosamine et

l'acide N- acétylmuramique qui sont réticulés par des chaînes peptidiques constituant un grand

polymère .Cette macromolécule associée à des glycolipides tels que les lipoprotéines LTA et

qui sont ancrées dans la membrane interne de la cellule au PGN (DOUGHTY, 2011) .

Comme le lipopolysaccharide (LPS) le PG possède diverses activités

immunomodulatrices et donc joue probablement un rôle important dans le déclenchement des

réponses de l'hôte à des infections bactériennes (LAWRENCE C et NAUCIEL , 1998). Le

D14 a été proposé pour être le récepteur à la fois PGN et LPS .Par conséquent, il a été

démontré que la liaison de PGN et LTA à CD14 conduire à l'activation des cellules CD14-

dépendante.

Ce agent bactérien stimule la libération excessive de cytokines pro -inflammatoires

comme le facteur de nécrose tumorale (TNF) , l’IL- 1 et IL-6, et autres médiateurs

inflammatoires à partir des cellules immunitaires , y compris les macrophages

(SCHWANDNER et al., 1999) Ces molécules inflammatoires sont la principale cause des

divers signes et des symptômes qui se produisent pendant les infections bactériennes, y

compris la fièvre, l'inflammation et des réponses de phase aiguë (CHEN et al., 2006) .

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lawrence%20C%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nauciel%20C%5Bauth%5D






33

III.2.4.2.- Agents d’origine fongique

Plusieurs polysaccharides d'origine fongique sont capables de stimuler

simultanément les différentes composantes du système immunitaire, ce qui leur confère

différentes propriétés thérapeutiques, notamment des propriétés anti-tumorales et anti-

inflammatoires (SANCHEZ, 2006). La paroi cellulaire et la surface des cellules composantes

de nombreux types de champignons ont été identifiés comme critiques pour PAMP et

déclencher des réponses inflammatoires. Zymosan, mannane, et phospholipomannan glucane

sont PAMP exprimés sur une variété de pathogènes fongiques importantes, notamment

Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Cryptosporidium neoformans(DOUGHTY, 2011).

La plupart de ces polysaccharides sont essentiellement des (1,3)-p-D-glucanes présentant

souvent des ramifications simples P-(l, 6). Quelques-uns de ces polysaccharides seront

décrits dans le texte qui suit (SANCHEZ, 2006).

Les champignons présentent de nombreux PAMP et nécessitent de nombreux types de

systèmes PRR de contrôle des infections, le TLR2/6 hétérodimères reconnaissent zymosane,

homodimères de TLR2 reconnaissent glucane, et phospholipomannan, et TLR4 reconnaît

mannane (DOUGHTY, 2011). Puisque les polysaccharides, y compris les 3-glucanes, ne

peuvent pas pénétrer dans les cellules en raison de leur grande taille moléculaire, ils exercent

leur action en se liant à des récepteurs spécifiques à la surface des cellules immunes

telles que les macrophages, les neutrophiles, les cellules cytotoxiques naturelles (NK) et

les lymphocytes T. Parmi ces récepteurs, le CR3, un des plus importants récepteurs

membranaires chez les phagocytes impliqués dans la reconnaissance des pathogènes, a été

identifié comme un des récepteurs des P-glucanes, au même titre que le CRI

(SANCHEZ, 2006) .

III.2.4.3.- Agents d’origine végétale

La plupart polysaccharides issus de plantes supérieures sont relativement non toxique

et ne pas causer d’importants effets secondaires, contrairement aux polysaccharides

immunomodulatrices des bactéries ou composés synthétisé. Ainsi, polysaccharides végétaux

sont les candidats idéaux pour thérapeutiques avec immunomodulatrices, anti-tumorale et la

cicatrisation action (SCHEPETKIN et QUINN, 2005). Il existe 35 espèces végétales parmi

les 22 familles différentes fournissent des polysaccharides indiquer pour améliorer les

fonction des macrophages (SCHEPETKIN et QUINN, 2005). Ces composés montrent une

augmentation d’activité cytotoxique des macrophages contre les cellules tumorales et les

microorganismes par l’activation de phagocytose, augmenter la production de dérivés

oxygénés réactifs (ROS), production de l'oxyde nitrique (NO) et renforcer la sécrétion de


34

cytokines et chimiokines, comme facteur de nécrose tumorale (TNF-a), l'interleukine (IL)-1h,

IL-6, IL-8, IL-12, IFN-g et IFN-h2 (SCHEPETKIN et QUINN, 2005).

III.2.4.4.- Agents chimiques

III.2.4.4.1.- H2O2

Au cours de l’évolution, l’adaptation des espèces vivantes à l'oxygène s'est traduite par

l'apparition d’enzymes facilitant non seulement sa consommation, mais également la

détoxification de ses métabolites réduits que sont le radical superoxyde O2-

et le peroxyde

d'hydrogène H2O2 .Ces espèces sont appelées espèces

réactives de l’oxygène (ERO) car

elles sont beaucoup plus toxiques que ne l'est l'oxygène lui-même (GARDES-ALBERT et

al.,2003). Un tel déséquilibre entre systèmes producteurs d'ERO et systèmes de défense

caractérise l'état de stress oxydant , sans qu'il soit aisé de déterminer si ce dernier est causal ou

s'il constitue seulement une réponse de l'organisme à des stimuli, notamment inflammatoires

(GARDES-ALBERT et al., 2003).

Fait important, le processus d'activation confère également des signaux de survie

essentiels pour l'intégrité fonctionnelle des monocytes permettant aux cellules de rester

viables dans des micro-environnement de lésions inflammatoires ou immunitaires qui sont

riches en médiateurs inflammatoires et cytotoxiques espèces radicalaires réactives (PERERA

et WALDMANN,1998) .

Phagocytes répondre à une stimulation par une salve de la consommation d'oxygène ,

une grande partie, sinon la totalité, de l'oxygène supplémentaire consommé est converti

d'abord à l'anion superoxyde, puis à H2O2 ( KLEBANOFF et HEADLEY,1999).La

myéloperoxydase (MPO) (libérée des granules cytoplasmiques des neutrophiles et des

monocytes) et de peroxydase éosinophile (sorti à partir de granules de polynucléaires

éosinophiles) peut réagir avec le H2O2 formé pour oxyder un halogénure et former des

oxydants puissants, qui sont toxiques pour les microorganismes ingérés et des cibles

extracellulaires adjacents( KLEBANOFF et HEADLEY,1999).

Conclusion

Conclusion

36

Il était difficile d’étudier les activités des cellules immunitaires en absence de modèles

animaux génétiquement définis, et sans les techniques modernes de culture de tissus. Aussi il

est difficile à isoler et cultiver les macrophages humains en quantités suffisantes à partir de

tissu. En outre, les cellules obtenues présentent souvent une hétérogénéité phénotypique

importante. Les macrophages dérivés de monocytes fournissent une excellente alternative,

depuis monocytes sanguins humains facilement disponibles en grand nombre et qui peuvent

être différenciées en macrophages in vitro. Les monocytes/macrophages sont légèrement

adhérents et peuvent être séparés des autres cellules qui poussent en suspension.

L’isolement par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très

petit, l’obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement

long (environ 30 jours), la méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon

rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode.

Les cellules in-vitro présentent deux propriétés fondamentales qui sont la capacité

proliférative et leur fonction différentiée. Ces propriétés ont tendance à évoluer de manière

très différente quelle que soit la méthode de culture employée. Les avantages dans de

nombreux cas, une cellule unique peut rapidement se développer en une colonie constituée de

nombreuses cellules identiques

Un des principaux inconvénients des cellules en culture est le fait qu’elles ne sont pas

dans leur environnement normal et que, par conséquent, leurs activités ne sont pas régulées

par les autres cellules comme dans le cas d’un organisme intact, ainsi que la culture cellulaire

nécessite des conditions de stérilité absolues, toute contamination microbienne entraîne la lyse

des cellules

La culture cellulaire permet d’étudier la cellule eucaryote et ses relations avec son

environnement. Ainsi l’utilisation des cellules en culture permet l’étude des mécanismes de la

physiologie cellulaire, contrôle de cycle cellulaire, métabolisme, régulation de l’expression

des gènes, l’étude des mouvements et des jonctions cellulaires.

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Annexes

Annexe

47

Annexe 1

Solution Ficoll-Paque PLUS

Ficoll-Paque PLUS est une solution aqueuse de densité 1,077 + 0,001 g / ml contenant

5,7 g de Ficoll 400, et 9 g de diatrizoate de sodium avec 0,0231 g de calcium di sodium de

l’acide ethylenediamintetraacetic dans chaque 100 ml. Ficoll 400 est un synthétique à haut

poids moléculaire (Mw 400 000) un polymère de saccharose et de l’épichlorhydrine qui est

facilement soluble dans l’eau. Les molécules de Ficoll 400 sont hautement ramifiées. Ficoll

400 a une faible intrinsèque viscosité (17 ml / g) par rapport aux polysaccharides linéaires de

même masse moléculaire (cf. dextrane Mw 400 000: / h / 49 ml / g) et des solutions de Ficoll

400 ont des pressions osmotiques faibles).diatrizoate de sodium est un composé facile à

utiliser avec Ficoll 400, car il forme des solutions de faible viscosité avec une densité élevée.

Diatrizoate de sodium (M. 635,92) est le sel de sodium de l’acide 3,5-diacetamido-2, 4,6-

triiodobenzoïque de densité 1,077.

Annexe

48

Annexe 2

Solution saline équilibrée de Hank HBSS

Composition Masse molaire Concentration

(mg/l)

Molarité (mM)

Sels inorganiques

Chlorure de

calcium CaCl2 111

0.14 1.26

Le chlorure de

potassium KCL

75 0.40 5.33

Kh2PO4 136 0.06 0.44

MgCl2-6H2O 203 0 .10 0 .50

MgSO4-7H2O 246 0.10 0 .41

NaCl 58 8.00 138.00

NaHCO3 84 0.35 4 .00

Na2HPO4 142 0.048 0.30

Autres composition

D-Glucose 180 1 .00 5.60

Phénol 398 0 .01 0.03

Annexe

49

Annexe3

Milieu d’Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)

Avec 4.5grams glucose par litre et de la L-Glutamine Sans bicarbonate de sodium, le

phosphate de sodium et le pyruvate de sodium

Ingrédients mg /l

Sels inorganiques

-Chlorure de calcium di hydraté

-Ferrique non hydraté Fe (NO 3)3・9H2O

-Le sulfate de magnésium anhydre

-Le chlorure de potassium KCL

-Chlorure de sodium NaCl

265.000

0.100

97.720

400.000

6400.000

Acides aminés

-Glycine

-L-Arginine chlorhydrate

-L-cystine di chlorhydrate

-L-glutamine

-L-histidine monohydrate

-L-isoleucine

-L-Leucine

-Le chlorhydrate de L-Lysine

-L-méthionine

-L-phénylalanine

-L-sérine

-L-Thréonine

-L-tryptophane

-L-Tyrosine sel disodique

- L-Valine

30.000

84.000

62.570

584.000

42.000

105.000

105.000

146.000

30.000

66.000

42.000

95.000

16.000

103.790

94.000

Vitamines

-Le chlorure de choline

- D-Ca-pantothénate

-L'acide folique

-Nicotinamide

-Chlorhydrate de pyridoxal

-Riboflavine

-Thiamine chlorhydrate

-I-inositol

4.000

4.000

4.000

4.000

4.000

0.400

4.000

7.200

Autres

-D-Glucose

-Sel de sodium de rouge de phénol

4500.000

15.900

Annexe

50

Annexe 4

Milieu RPMI-1640

Avec L-glutamine , sans glucose et bicarbonate de sodium

Ingrédients mg /L

sels inorganiques

- Nitrate de calcium tétra hydraté

- Le glutathion réduit

- Le sulfate de magnésium anhydre

- Sel de sodium de rouge de phénol

- Le chlorure de potassium

- Chlorure de sodium

- Phosphate de sodium dibasique anhydre

100.000

1.000

48.840

5.300

400.000

6000.000

Acides aminés

- Glycine

- L-Arginine chlorhydrate

- L-asparagine

- Acide L-aspartique

- L-cystine di chlorhydrate

- L’acide L-glutamique

- L-glutamine

10.000

241.000

50.000

20.000

65.200

20.000

300.000

Annexe

51

Annexe 5

Etats d’activation des macrophages et propriétés fonctionnelles sélectionnées de

différentes populations

Classique Alterne Fixation cellulaire

apoptotiques

Stimulus INF γ+ LPS ou

TNF-α

Il-4 : IL-13

Cellules apoptotiques

+LPS

Propriétés d’iNOS

Il-Iβ

TNF-α. Il-6.

Il-8. Il-12.

MCP-1.

MHC classe II

CD 86

récepteur de mannose

CMH II.

Arginase.

SR.FIZZII/Yml.

Il-Ira.

d’iNOS.TNF.Il-6.

TGF-β. PGE2.

TNF-α. Il 8.

MCP-1

Fonctions -Pro-inflammation

-Destruction des

microbes. DTH

Anti-inflammatoire.

RégulationTh2,

allergie, destruction des

parasites.

Anti-inflammatoire.

Immunosuppresseur

Annexe

52

Résumé : Synthèse bibliographique sur les techniques d’isolements et de culture des macrophages in vitro

La présente étude est consacrée à une synthèse bibliographique sur les différentes techniques d’isolements et de

culture des macrophages in vitro.

Macrophages, les cellules les plus plastiques du système hématopoïétique, se trouvent dans tous les tissus et montrent

une grande diversité fonctionnelle. On distingue deux types de cellules, les cellules libres et circulantes comme les cellules du

sang (monocytes), et les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu (macrophage). Les techniques

d’isolement de ces deux classes de cellules sont différentes. Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et

centrifugation, et les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en œuvre de techniques plus originales qui peuvent être

divisées en deux groupes, la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique. La complexité des interactions

cellulaires qui génèrent une réponse immunitaire a conduit les immunologistes à se tourner bien souvent vers divers types de

systèmes de culture cellulaire in vitro, y compris les macrophages.

En biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble des techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de

leur organisme ou de leur milieu d’origine, dans un but d'expérimentation scientifique, tests génotypiques, diagnostic direct,

nous avons mis en évidence des techniques pour la survie à long terme et de la maturation des monocytes en macrophages. Le

concept d’activation cellulaire est développée à partir de l’observation de cellule en culture in vitro réagissaient à une variété

de substances en altérant leurs propriétés biochimiques et leurs activités fonctionnelles, nous avons touché les différentes

voies d’activation des macrophages.

Mots clés : Macrophage, Monocytes, Isolement, Culture, Activation.

Abstract: Bibliographic review on techniques for isolation and culture of macrophages in vitro

This work is bibliographic review about the various isolation techniques and culture of macrophages in vitro.

Macrophages, most plastics cells of the hematopoietic system, are found in all tissues and show high functional diversity.

There are two types of cells, free circulating cells such as blood cells (monocytes), and the cells cohesion with each other,

forming a fabric (macrophage). The isolation of two classes of cells these techniques are different. The circulating cells are

obtained by centrifugation and collection, the cells and organized tissue require the implementation of more novel techniques

which can be divided into two groups, the method by dissection and enzymatic digestion method. The complexity of cellular

interactions that generate an immune response leading immunologists to turn often to various types of systems in vitro cell

culture, including macrophages.

In biology, cell culture is a set of techniques used to grow cells outside their body or their home environment, with

the aim of scientific experimentation, genotypic tests, and direct diagnosis. We demonstrated techniques for long-term

survival and maturation of monocytes into macrophages. The concept of cellular activation is developed from the observation

of cell culture in vitro responded to a variety of substances altering their biochemical properties and functional activities, we

hit the different faces of macrophage activation.

Keywords : Macrophages, Monocytes, Isolation, Culture, Activation.

دراسة نظرية حول تقنيات عزل وزرع البالعات الكبيرة في المخبر :ملخص

وتتواجد يف مجيع النظام ادلكون للدم ،هذا العمل هو دراسة نظرية حول خمتلف تقنيات عزل وزرع البالعات الكبرية يف ادلخرب. البالعات الكبرية هي اخلاليا ادلرنة السائدة يف مع بعضها البعض ، مشكلة نسيج )البالعات الكبرية( األنسجة و تظهر تنوعا وظيفيا عاليا. ومنيز نوعني من اخلاليا، اخلاليا احلرة مثل خاليا الدم ) وحيدات النواة(، و اخلاليا ادلتماسكة

اليا.اخل. و ختتلف تقنيات عزل هذه الفئتني من فيذ ادلزيد من تقنيات اخلاليا اليت تسري حرة يف الدم عن طريق استخراج عينة من الدم مث بواسطة الطرد ادلركزي أما اخلاليا ادلتواجدة يف األنسجة تتطلب تنيتم احلصول على

.باستعمال األنزميات اذلاضمة واألصلية اليت ميكن تقسيمها إىل رلموعتني ، إما عن طريق التشريح أ

خمتلفة من التقنيات اليت تستعمل يف زراعة اخلاليا يف ادلخرب ، علتفاعالت اخللوية اليت تولد استجابة مناعية قادت علماء ادلناعة إىل االهتمام بتطوير أنوا إن التعقيدات يف اا خارج العضوية أو وسطها األصلي، وذلك هبدف التجارب العلمية مبا يف ذلك البالعات الكبرية يف البيولوجيا زراعة اخلاليا هي عبارة عن رلموعة من التقنيات ادلستخدمة لنمو اخلالي

ضوج وحيدات اخللية إىل بالعات كبرية مت تطوير واالختبارات الوراثية والتشخيص ادلباشر؛ تطرقنا يف دراستنا لتقنيات اليت تضمن بقاء اخلاليا على قيد احلياة على ادلدى الطويل و نوقد أحصينا بعض الطرق مراقبة زراعة اخلاليا يف ادلخرب واستجابتها جملموعة متنوعة من ادلواد اليت تغري خصائصها الكيميوحيوية ونشاطها الوظيفي ، اخلاليا من خالل زتحفيمفهوم ت

البالعات الكبرية.لتحفيز

.تحفيز،زرع ،عزل ،وحيدات النواة ،البالعات الكبيرة :المفتاحية الكلمات

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