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Diagnostic moléculaireL’ADN au service du choix thérapeutique

Pr Jean-Louis MerlinUnité de Biologie des TumeursCentre Alexis Vautrin - NancyEA 4421 SiGReTO Nancy Université

jl.merlin@nancy.fnclcc.fr

Diagnostic moléculaire (1)

La meilleur connaissance de l’oncogenèse permet d’identification de marqueurs moléculaires spécifiques des tissus tumoraux

Les progrès technologiques rendent accessibles en clinique des techniques de pointe issues du monde de la recherche préclinique

La recherche translationnelle permet de valider en situation clinique des « pistes » moléculaires issues d’hypothèses scientifiques précliniques

Diagnostic moléculaire (2)

La biologie moléculaire permet d’apporter des données complémentaires à celles de l’histopathologie conventionnelle dans tous les domaines du diagnostic y compris en per-opératoire

Les analyses moléculaires peuvent être réalisées dans les laboratoires de pathologie (FISH, CISH,…) ou dans des plateformes spécialisées (plateforme de génétique moléculaire INCa)

Plateforme de Bio-pathologie intégrée

Circuit en per-opératoire

Prescription de l’analyse

1 - Oncologue 2 - Pathologiste

3 - Biologiste moléculaire

Validation de l’échantillon et transmission

Analyse et rendu de résultats

Cahier des charges en per-opératoire

Représentativité de l’échantillon

Niveau de qualité de l’échantillon analysé

Quantité de matériel biologique adéquate pour la technique envisagée

Durée de l’analyse et délai de réponse compatibles avec l’attente des chirurgiens

Contraintes

Logistiques

Biologiques

Techniques

Ex 1 : Génétique tumorale et thérapies ciblées

Facteurs prédictifs de réponseFacteurs pronostiques

KRAS, BRAF dans les CRC métastatiquesEGFR dans le NSCLC métastatiquesCKIT dans les GISTBCR-ABL dans les LMC…

Plateformes de génétique moléculaire des tumeurs

Programme initié par l’INCa en 2006

Structures régionales regroupant Laboratoires de génétiqueLaboratoires de pathologieLaboratoires de biologie moléculaire tumorale

Destiné à donner accès au diagnostic moléculaire à tous les patients et optimiser la prise en charge thérapeutique

En France

28 plateformes labélisées par l’INCa

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En lorraine…CHU et CAV

KRAS , BRAF mCRC au CAV (Pr JL Merlin)

EGFR mNSCLC au CHU (Pr JM Vignaud)

BCR-ABL au CHU (Pr P Jonveaux)

CKIT externalisé (Besançon)

La signalisation cellulaire…

… c’est complexe …

Mais avec un bon plan…

…on s’y retrouve…

Cibles / Cellule Tumorale

CRC et Mab anti-EGFR

membrane

P

Ligand EGFR

P PIP3

AKT1/2

mTOR

PIP2

PDK1/2

(EGF, TGF�, amphiréguline, épiréguline…)

eIF4E

4EBP1

p70S6K

TraductionSynthèse protéique

BAD

Survie cellulaire

VEGF

Angiogenèse

GSK3p21p27

Survie cellulaire

GrbhSOS

MEK1MEK2

ERK1/2

Voie PI3K/AKT

VoieRas/MAPK

transcriptionSurvie cellulaire

ProliferationAngiogenèse

Migration

PI3K

Ras

Raf

Facteurs de transcription

ADN

PTEN

Mutation 15-20%

Mutation 30-40%

10-20%

Mutation 15-40%

Plateforme KRAS CAV

3 techniques (HRM, Taqman, RFLP)2 « rapides », 1 « longue »Juin 2008 – décembre 2009 : 844 analyses549 analyses avec les trois techniques, 2.7 % discordance

Résultats rendus si 2 « rapides » concordent (env7 jours)Recours « RFLP » si discordance (env 10 jours)

Ex 2 : Ganglion sentinelle

� Approche conventionelle

� Analyse per-opératoireCoupes en congélationcoloration H&E

� Sensibilité faible(échantillonage)

� Analyse post-opératoireCoupes en paraffine:H&E + IHC

� Sensibilité moyenne

� Deuxième Opérationnécessaire si le ganglion sentinelle est positif dansl’analyse post-opératoire

� Biologie moléculaire

� Analyse per-opératoireGanglion sentinelle homogéniéséen intégralité.

� Haute sensibilité(pas d’erreur d’échantillonnage)

� Analyse post-opératoiren’est pas nécessaire

� Evite la 2 ème opération

Ganglion sentinelle - techniques PCR

Approche par PCR classique : BLN Gene Search® Veridex

Approche par PCR « isotherme » : OSNA Sysmex

Deux techniques basées sur expression de CK19

Choix de CK19 mRNA

1.0E+001.0E+011.0E+021.0E+031.0E+041.0E+051.0E+061.0E+071.0E+08

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Molecular ID

mR

NA

exp

ress

ion

leve

l in

HE

(+)

sam

ple

CEA CK19MUC1 CK18 CK20 ß-actin

Amount of expression in metastase-pos lymphnodes

1.0E+00

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Molecular ID

mR

NA

exp

ress

ion

ratio

betw

een

HE

(+)

and

HE

(-)

sam

ple

Quality of differentiation pos/neg

Source Sysmex®

Ganglion sentinelle - OSNA

Méthode: OSNA= One Step Nucleic acid A mplification,procédure isothermique sans extractionpréalable d‘acides nucléiques

(LAMP = Loop-mediated Isothermal Amplification)

Amplification

5 min

Homogénisation Centrifugation

1 min 16 min; 65 °°°°C

Ganglionlymphatique

Détermination de la quantité/nombre de RNA

Tamaki et al. Clin Cancer Res 2009

Étude 450 GASSpécificité : 94,3% (348/369)Sensibilité : 87,7% (71/81)NPV : 97,2% (348/358)PPV : 77,2% (71/92)

Ganglion sentinelle - OSNA

Mise en place STIC 2010 : Essai randomiséprocédure histopathologique vs OSNA

Implantation en cours dans 12 sites en France(CLCC, CHU)

Mise en place au CAV en routine en cours

Ex 3 : signature génomique(Puce à ADN)

Amsterdam 70 gene signature in N- breast carcinomas

Van’t Veer et al , Nature, 2002 Van de Vijver et al, NEJM, 2002

M+ <5y M+ <5y N=34N=34

((poorpoor signsign.).)

MM-- >5y >5y N=44N=44

(good (good signsign.).)

Validation in N- breast carcinoma

Year

Pro

babi

lity

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 2 4 6 8 10 12 14

Patients Events Risk group

113 16 Genetic low risk194 66 Genetic high risk

113 112 105 101 98 82 69 45 38 CLR194 185 168 147 130 110 90 53 39 CHR

Number at risk

Buyse M. et al JNCI 2006

307

MINDACT (6,000 PTS)

Clinical and Genomic

BOTH HIGH RISK

DISCORDANT Clinical

and Genomic RisksClinical and Genomic

BOTH LOW RISK

RANDOMIZE

Chemotherapy No chemotherapy

Use genomic riskUse clinical risk

High risk Low riskHigh risk Low risk

Assess clinical risk and genomic risk

N=3300 N=780

N=1920

55% 32% 13%

Mammaprint

Proposition commerciale Agendia

3000 euros

Non validé

Attente des résultats MINDACT

Ex 4 : Cellules circulantes

Détection d’évènements rares<1 cellule / 100 000 cellules sanguines

Nécessite une étape d’enrichissement (sélection) des CTC

Puis une méthode de détection spécifique et performante

Cellules circulantes - systèmes industriels

Adnagen®Séparation immunomagnétique non automatisée des CTCExtraction des ARNmPCR multiplexRésultats en positif/négatif (pas de numération)

Metagenex®Technique ISET : séparation des CTC par filtration (critère de taille)Système ouvert quant à la technique d’identificationNon automatisé (délai de séparation puis congélation )

Cell Search Veridex®Mostert et al, Cancer Treat Rev, 2009, Bidart, Bull Cancer, 2009

Cellules tumorales circulantescell Search ® Veridex

Technique cytologique automatisée« Clé en main »4 jours de conservation de prélèvementsEnrichissement immunomagnétique (EpCAM)Identification CK8, CK18, CK19 (CTC) vs CD45 (PBMC)Immunomarquage additionnel spécifique : HER2, EGFRUtilisation validée par la FDA (sein, colon, prostate)Technique fermée

Mostert et al, Cancer Treat Rev, 2009, Bidart, Bull Cancer, 2009

En résumé…

TumeurLe « somatique »

(ex : KRAS, BRAF, EGFR, CKIT…)

PatientLe « constitutionnel »

(ex : DPD, UGT, CYP, FcγRIIa/RIIIa …)

L’analyse d’ADN au service du choix thérapeutique… aujourd’hui et demain

Pharmacogénomique (génotypage tumoral)Thérapies ciblées : utilisation indissociable d’un d iagnostic moléculaire ( KRAS , EGFR, …)Chimiothérapie : signature génomique (cancer du sein N -), CTC et GAS : envahissement et maladie métastatique

Pharmacogénétique (polymorphisme génétique)Thérapie ciblées : prédiction de réponseChimio : prédiction de réponse / toxicité

Nouveaux critères diagnostiques, rationnel de prescriptionEnjeux médico-social et médico-économique

Les enjeux stratégiques…

Nécessité de disposer de plateforme associant des compétences en pathologie (validation des échantillons analysés) et en biologie moléculaire (expertise en génétique moléculaire des tumeurs)

« Bio-pathologie moléculaire intégrée »

Per-opératoire : plateforme à proximité immédiate des blocs opératoires (optimisation des délais de prise en charge et qualité des échantillons)

Médecine et thérapie individualisée…

“A surgeon who uses the wrong side of the scalpel cuts his own fingers and not the patient.

If the same applied to drugs they would have been investigated very carefully a long time ago”

Rudolph BucheimBeitrage zur Arzneimittellehre, 1849

Howard Mc Leod, Chapel Hill, North Carolina