CRISPR-Cas9 pour la microbiologie synthétique et la lutte ...
Transcript of CRISPR-Cas9 pour la microbiologie synthétique et la lutte ...
Philippe Glaser
CRISPR-Cas9 pour la microbiologie synthétique et la lutte
contre l’antibiorésistance
Une reconnaissance du risque par les instances internationales
Des données alarmantes pour l’avenir
Les spécificité de la résistance aux antibiotiques
• Les bactéries pathogènes sont le plus souvent pathogène opportuniste présentes dans nos microbiomes
• Les bactéries s’échangent des gènes de résistance
Les parasites des bactéries
• Les bactériophages (virus)
• Les plasmides
• Les transposons conjugaifs
Ces éléments « parasites » sont apparentés
• Des phages s’intègrent dans les génomes comme les transposons conjugatifs
• Des phages se répliquent comme des plasmides
• Des transposons conjugatifs se répliquent comme des plasmides
• Des transposons et les plasmides peuvent passer de cellule à cellule par conjugaison
Tous ces éléments peuvent porter des gènes de résistance aux antibiotiques
Interactions bactéries – parasites
• Interaction complexe, les bactéries ont domestiqué certains de leurs parasites
• Ces éléments, en apportant des fonctions aux bactéries, peuvent favoriser leur dissémination
• La bactérie cherche à contrôler ces parasites
• Les parasite en particulier les bactériophages développent des stratégies pour les contourner
• Ces protections ciblent l’ADN
Les systèmes de restriction-modification
• 1er système de reconnaissance des ADN exogènes (non modifiés)
Met
Met
rep
Res
La base du génie génétique WernerHarber
CRISPR un système d’immunité Lamarckien (2007)
CRISPR
La diversité des systèmes CRISPRClass 1 Class 2
Origine des systèmes CRISPR - Cas
Les système CRISPR dériveraient d’intégrase d’éléments transposables appelés Casposons
Mécanime de coupure et d’identification de la cible
tracrRNA
Mécanime de coupure et d’identification de la cible
E. Charpentier J. Doudna
Homologous Recombination
NHEJ
Small indels
Point mutationGene insertion
etc.
No repair
Cell death
Cas9
Peut on utiliser CRISPR-Cas9 pour lutter contre les bactéries?
CRISPR comme outil biotechnologique
2014
2014
2019
CRISPR pour tuer spécifiquement des bactéries
Principe:• Introduire dans une bactérie:
• un gène exprimant Cas9 (la nucléase)• Un gène exprimant l’ARN guide ciblant la bactérie choisie:En fonction de l’espèceEn fonction de la résistance: un gène de résistance, un
plasmide
Problème: Utilisation d’OGMfaire rentrer ces ADN sans sélection avec une efficacité
proche de 100%Utilisation des éléments génétiques mobiles
Deux stratégies
Les bactériophages Les plasmides conjugatifs
Manipuler les phages pour injecter l’ADN construit Manipuler les plasmides
Deux difficultés: spécificité d’hôte et efficacité de transfert
CRISPR-Cas9 comme antibiotique
Elimination séquence-spécifique de S. aureus
pDB114
Bikard & al., Nat Biotech, 2014
Elimination par Cas9 de S. aureus
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KanR
KanS
Compétition avec des bactéries non-ciblées
OD
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Bikard & al., Nat Biotech, 2014
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Compétition avec des bactéries non-ciblées
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Compétition avec des bactéries non-ciblées
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Time (min)
Compétition avec des bactéries non-ciblées
Décolonisation spécifique d’une souche résistante de S. aureus sur la peau de souris
Chad Euler, RockefellerVince Fischetti, Rockefeller
Applications
Traitement d’une infection
Décolonisation spécifiques pour les souches MDR
Resensibiliser des souches résistantes (en ciblant le plasmide)
Méthode d’appoint lors d’une antibiothérapie
Modification spécifique du microbiome
CRISPR-CAS9 pour manipuler le génome
• Transformation du pneumocoque
Dans les survivant le gène cible à été remplacé par une copie mutée
dCas9 pour réguler l’expression génétique
• dCas9 est une version mutée sans activité nucléase
• dCas9 va se fixer sur l’ADN sur une cible correspondant à l’ARN guide
Peut aussi réprimer plusieurs gènes simultanémentAnalyse des gènes essentiels, d’épistasies
Le potentiel de systèmes connexes à CRISPR
• Transposase dirigée par un système CRISPR-Cas
Application : diriger l’intégration d’un fragment d’ADN
Remerciements
David Bikard