Les documents présentés dans ce cours sont issus :• soit de travaux personnels

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D. LOCKERProfesseur des Universités

Spécialité: Génétique Université d’Orléans

UFR/Faculté des Sciences

Les marqueurs de polymorphisme utilisés en génétique humaine

Séparation des protéines par électrophorèse

Le polymorphisme des protéines

Quelle est la proportion de polymorphisme dans les protéines ?

Mammifères 15%Oiseaux 22%Insectes 33%Plantes 25%

Le polymorphisme des protéinesavantage et inconvénient

Avantage: peu coûteuxDésavantage: Révèle

une faible partie dupolymorphisme de l’ADN

Qualités d’un marqueur moléculaire ADNpolymorphecodominantnon épistatiqueindépendant du milieuneutrerépartition uniforme dans le génomereproductibleéconomique

Les marqueurs ADN

RFLPRAPDAFLPVNTRSNPs

Les RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Les endonucléases de restriction coupentl’ADN en des sites précis qui peuvent êtrepolymorphes.

Les fragments de restriction aurontdes tailles différentes en fonction de la présence ou de l’absence d’un site reconnu par une endonucléase de restriction

AGATCTAllele n°1

Allèle n°2

TCTAGA

Un seul changement de nucléotideconduit à la disparition d’un site

de restriction

AGAGCTTCTCGA

Site de restriction

Disparition du site

Exemple de l’anémie falciforme : perte d’un site MstII

RFLP dans le gène de la βglobinePrésence (βA) ou absence (βS) du site MstII

Exemple de RFLP observé par la technique de SouthernPourquoi l’échantillon 5 donne-t-il 3 bandes d’hybridation ?

Révélation des RFLP par la méthode de Southern

L’analyse des individus par RFLP

Avantages: co-dominance des allèles; polymorphisme au niveau de l’ADN.

Désavantages: très laborieuse; demandede grandes quantités d’ADN

On préfère maintenant détecter les RFLP par PCR : il faut beaucoup moins

de matériel

Les VNTR (Variable Number Tandem Repeats)

• Non spécifiques des régions codantes• Répétitions de séquences courtes• Grand nombre d’allèles différents dans

les populations naturelles

Utilisation des VNTR dans les tests ADN

Reconnaissance de paternité

Recherche en criminalité

Les microsatellites

• Ne sont pas des objets en orbite dans l’espace!

• Ils sont plus utilisés que les VNTR• Ce sont des répétitions de 2, 3, ou 4 paires

de bases• Il y a beaucoup d’allèles différents• Avec à peu près 1000 loci chez l’homme

Détection des microsatellites

Résultats de la séparation des microsatellites par electrophorèse

Tests ADN à l’aide de microsatellites

Les RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

Principe de mise en évidence des RAPD : PCR + utilisation d’un seule amorce de 10 nt

Les RAPDs

Pour: c’est rapide, économique et il y a beaucoup d’allèles

Contre: les marqueurs sont dominants, la présence d’une bande ne permetpas de savoir si on a des hétéro oudes homozygotes

Exemple de résultats obtenus avec les RAPD

RAPD of P. aeruginosa

Les AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

Principe:• Digestion de l’ADN par 2 enzymes de restriction • Ligation de deuxadaptateurs• Utilisation d’amorces complémentaires aux adaptateurs et à la région 3’ de quelquesfragments seulement

AFLPAvantages: un grand nombre d’allèles,

reproductibilité, réalisation relativement simple

Désavantages: il faut de l’ADN de trèsbonne qualité et l’intensité des bandesest très variable

Détermination des AFLP• Les dominants

– Présence ou absence d’une bande• Détermination des Co-dominants (plus délicat)

– Classification:• A=Absence = pas de bande• B=Homozygote = bande intense• H=Hétérozygote = demi bande• C=A ou H• D=H ou B

Mise en évidence de 3 AFLP chez deux individus

Principe de la mise en évidence des AFLP

CTCGTAGACTGCGTACCCTCGTAGACTGCGTACCCATCTGACGCATGGTTAACATCTGACGCATGGTTAA

TACTCAGGACTCATTACTCAGGACTCATGAGTCCTGAGTAGCAGGAGTCCTGAGTAGCAG

1. DNA Extraction

AATTCNNNGNNN

NNNTNNNAAT

2. Digestion with EcoRI (E) and MseI(M)

M ME

EE M

Collection of 3 Types of Fragments:

3. Ligation of Sequence Specific Adaptors

•Etape importante car il faut de l’ADN très pur.•Une petite quantité d’ADN est nécessaire(50-500ng)•Une enzyme (EcoRI) coupe plus fréquemmentque l’autre (MseI).

CATCTGACGCATGGTTAACATCTGACGCATGGTTAAGNNN

NNNTTACTCAGGACTCATTACTCAGGACTCAT

NNNAATGAGTCCTGAGTAGCAGGAGTCCTGAGTAGCAG

CTCGTAGACTGCGTACCCTCGTAGACTGCGTACCAATTCNNN

CATCTGACGCATGGTTAACATCTGACGCATGGTTAAGNNN NNNAATGAGTCCTGAGTAGCAGGAGTCCTGAGTAGCAG

CTCGTAGACTGCGTACCCTCGTAGACTGCGTACCAATTCNNN NNNTTACTCAGGACTCATTACTCAGGACTCAT4. Amplification:

GACTGCGTACCAATTCACAATGAGTCCTGAGTAG •Pre-Selective

•SelectiveGACTGCGTACCAATTCACT

TGCAATGAGTCCTGAGTAG

Amplification de l’ADN

AFLPs : Résultats obtenus

Les SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Des exemples de SNP

ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT-ATATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGTCAT

↑ ↑ ↑SNP SNP indel

(Insertion/délétion)

Pourquoi utiliser des SNP ?

Il est parfois possible de les corréler à un caractère héréditaire

Qu’est ce qu’un SNP?Des gens différents peuvent avoir des nucleotides différents à une localisationdonnée sur un chromosome

Qu’est ce qu’une cartede SNP? ADN Humain

Localisation des SNP sur l’ADN Humain

Comment utiliser les SNPen médecine prédictive ?

Génotype pour les SNPPatients présentant la maladie

Patients ne présentant pas la maladie

Prédiction risque de maladie

Prédiction pas de risque de maladie…GGGAACTG…

…CCCTTGAC…

…GGAAACTG……CCTTTGAC…

…GGAAACTG…

…CCTTTGAC…

Administrer le bon médicament au bon malade !

Un exemple de l’utilisation des SNP pour déterminer l’association d’une région chromosomique

avec la maladie d’ Alzheimer

Pour utiliser les SNP il vaut mieux s’adresser aux organismes déjà séquencés

Des banques de données sont entièrementconsacrées aux SNP.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1996-1997

1997-1998

1998-1999

1999-2000

2000-2001

2001-2002

2002-2003

2003-2004

2004-2005

Occ

urre

nces

of

keyw

ord

SNPsMicrosatellite

Les marqueurs du type SNP sont mentionnés actuellement dans de nombreuses publications de génétique

Nickerson and Kruglyak, Nature Genetics, 2001

Nombre de SNP attendu dans le génome humain

De nombreuses techniques pour trouver les SNP!

•Séquençage•SSCP•DGGE•Spéctrométrie de masse•Puces à ADN•PCR•Hybridation

ABCDE

G C

F

PCR-RFLP ASO

GG GC CC

digestion Bcl I

Deux exemples de typage des SNP

Feb. 2001 - Human Genome Project and TSC

Deux sites sont consacrés au séquençage

Découverte des SNP

Caractérisation des SNP