COURS N°3 Physiologie et exploration de l’hémostase

Ronéo 2 cours n°4 1 sur 16

UE 6 – Tissu Sanguin Pr Faille Lundi 2 octobre 2017 de 15h30 à 17h Ronéotypeur : Capucine d’Hoop Ronéoficheur : Louis Trohel

COURS N°3

Physiologie et exploration de l’hémostase (1ère partie)


SOMMAIRE

I) Hémostase primaire A/ Les principaux protagonistes

1. Les vaisseaux 2. Les plaquettes 3. Le facteur von Willebrand

B/ Les différentes étapes de l’hémostase primaire

1. Adhésion des plaquettes au sous endothélium 2. Activation plaquettaire 3. Recrutement et simplification 4. Agrégation plaquettaire

II) La coagulation plasmatique

A/ Les principaux protagonistes 1. Le facteur tissulaire 2. Les facteurs de coagulation B/ Les différentes étapes 1. Initiation de la coagulation 2. Amplification 3. Les multiples fonctions de la thrombine 4. Système contact 5. Fibrinoformation


Généralités :

Ø Définition de l’hémostase L’hémostase est un processus physiologique désignant l’ensemble des phénomènes déclenchés par une lésion vasculaire et destinés à limiter les pertes sanguines au niveau de la brèche vasculaire. L’hémostase est une balance de phénomènes à la fois pro thrombotiques, pro coagulants et anticoagulants. En effet, si les phénomènes pro coagulants sont trop nombreux, la pathologie associée sera de type thrombotique ; à l’inverse si les phénomènes anti coagulants sont trop nombreux, la pathologie associée sera de type hémorragique. L’hémostase est donc en équilibre instable.

Ø L’hémostase dans la vie du médecin Ce tableau n’est pas à apprendre, il est donné à titre informatif. Il renseigne sur les différentes pathologies auxquelles nous serons confrontés.

Ø Caractéristiques - L’hémostase est provoquée par une lésion vasculaire, et donc localisée au niveau de cette brèche vasculaire. Elle fait intervenir une cascade de réactions enzymatiques (à apprendre) ayant lieu uniquement à la surface des plaquettes activées permettant ainsi de maintenir cette réaction localisée au niveau de la brèche. - Cette cascade de réactions aboutit à la formation d’un thrombus ou caillot formé d’agrégats plaquettaires et de fibrine. - L’hémostase a la capacité de s’auto-amplifier augmentant ainsi sa rapidité et son efficacité. Elle est aussi contrôlée négativement pour limiter sa diffusion lorsque la coagulation est terminée. - Une fois le caillot formé, un processus de cicatrisation se met en place et le caillot qui n’est plus nécessaire est détruit : c’est la fibrinolyse (dissolution de la fibrine).


L’hémostase se compose de deux étapes simultanées et complémentaires :

ü L’hémostase primaire qui aboutit à un agrégat de plaquettes ü La coagulation plasmatique qui met en jeu des facteurs de la coagulation (solubles) et

aboutit à la formation d’un caillot de fibrine, réseau de mailles qui vient entourer les plaquettes déjà activées

I) L’hémostase primaire

A. Les principaux protagonistes

1. Le vaisseau Le vaisseau est le premier protagoniste de l’hémostase primaire, en particulier le sous endothélium et les protéines qui lui sont associées (collagène). Structure d’un vaisseau sain : Il est composé de trois couches : l’intima, le media et l’adventice.

Vaisseau intact : Pas de contact des plaquettes et des facteurs de coagulation dans le plasma avec le sous endothélium (en gris sur le schéma)

Lésion vasculaire : Lors du saignement, il y a exposition du sous endothélium et contact de celui-ci avec le sang. Le sous endothélium active les plaquettes et les facteurs de coagulation.

Thrombus : Il se compose de plaquettes agrégées et d’un réseau de fibrine. Le saignement s’arrête progressivement.

Plaquettes agrégées

Hémostase primaire (flèche rouge) : agrégat de plaquettes

Coagulation plasmatique (flèche verte): caillot de fibrine


2. Les plaquettes

§ Elles sont fabriquées dans la moelle osseuse à partir du mégacaryocyte. Ce sont les plus petites cellules du sang, elles ne mesurent que 4 µm.

§ De forme discoïde, elles sont anuclées et peuvent contenir un peu d’ARN, c’est pour cette raison qu’elles sont colorées lorsque l’on fait une coloration violette au MGG (May Grunwald Giesma)

§ Leur durée de vie est de 8 à 10 jours (élimination par les macrophages de la rate et du foie et moelle osseuse)

§ Elles ont une numération normale de 150 à 400G /l

Composition d’une plaquette :

§ Une plaquette est un « sac » avec une membrane plasmique, constituée d’une bicouche de phospholipides et de glycoprotéines plaquettaires. Ces glycoprotéines sont des récepteurs de protéines qui permettent aux plaquettes d’adhérer aux protéines du sous-endothélium. La membrane plasmique a un rôle important au niveau de la plaquette.

L’intima : C’est la structure la plus interne du vaisseau. Elle est constituée d’une monocouche à l’intérieur de cellules endothéliales qui sont physiologiquement anti-thrombogènes. L’endothélium est donc non thrombogène et quand il est intact il n’y a pas d’activation de l’hémostase. En dessous de ces cellules endothéliales se trouve le sous endothélium qui est très thrombogène : dès qu’une lésion apparaît au niveau des cellules endothéliales, il y a exposition de molécules thrombogènes du sous endothélium comme le collagène, le facteur Von Willebrand, la fibronectine et la thrombospondine.


§ Contenu plaquettaire : - Le système canaliculaire ouvert qui permet aux plaquettes de relarguer le contenu de leurs

granules lorsqu’elles sont activées. Les granules fusionnent avec le système canaliculaire et leur contenu est libéré dans le milieu EC.

- Les mitochondries - Les lysosomes - Quelques réserves de glycogène - Les microtubules permettent à la plaquette de changer de forme (contraction)lorsqu’elle est activée - Les granules qui contiennent tous les deux des acteurs importants de l’hémostase primaire. Ainsi quand la plaquette reste activée, elle va relarguer le contenu de ces granules (=dégranuler) ce qui auto-amplifie l’activation de l’hémostase primaire.

Ils sont de deux types (différenciables au microscope électronique) :

ü Les granules α , qui contiennent le facteur 4-plaquettaire, la β-thromboglobuline, le fibrinogène et le facteur von willebrand

ü Les granules denses contiennent de l’ADP, de l’ATP, du calcium et de la sérotonine. L’ATP est un agoniste d’activation des plaquettes qui a des récepteurs spécifiques à l’ADP à la surface des plaquettes. Quand elles s’activent et qu’elles dégranulent, elles relarguent de l’ATP, qui va à son tour activer d’autres plaquettes via les récepteurs membranaires des autres plaquettes. Le contenu de ces granules permet d’auto-amplifier la réaction.

3. Le facteur von Willebrand

§ C’est une protéine, un multimère de très haut poids moléculaire, synthétisée par la cellule endothéliale et le mégacaryocyte.

§ Il est présent un peu partout dans la circulation : dans les granules α , il est lié au facteur VIII (facteur de coagulation) dans le plasma ce qui protège la dégradation de ce facteur dans le plasma. (la maladie de Willebrand se caractérise par une anomalie du facteur willebrand et est souvent associée à un taux de facteur VIII bas car il n’y a pas assez de facteur willebrand pour protéger le facteur VIII en circulation) Il est aussi présent dans l’endothélium, à l’intérieur des granules de Weibel palade et dans le sous endothélium sous conformation directement active. Ainsi en cas de brèche vasculaire les plaquettes qui ont des récepteurs spécifiques au facteur Willebrand viennent directement se fixer au sous endothélium.


B. Les différentes étapes de l’hémostase primaire

1. Adhésion des plaquettes au sous endothélium

§ Les plaquettes vont adhérer aux protéines du sous endothélium qui sont pro-thrombotiques. Une fois les plaquettes accrochées, elles vont s’activer et auto amplifier la réaction en activant d’autres plaquettes.

⇒ Cela aboutit à un agrégat plaquettaire

§ Deux molécules du sous endothélium permettent aux plaquettes de s’y accrocher : le collagène et le facteur Willebrand

ü Liaison directe : Les plaquettes ont sur leur membrane cytoplasmique des glycoprotéines ou récepteurs spécifiques au collagène : l’intégrine α2β1et la GPVI (glycoprotéine VI) .Grâce à ces récepteurs spécifiques, les plaquettes vont donc pouvoir adhérer de manière directe au collagène du sous endothélium

ü Liaison indirecte du facteur willebrand :

Ce facteur est une très grosse molécule circulant dans le plasma sous forme de « pelote de laine » en conditions physiologiques, les plaquettes ne peuvent donc pas y adhérer. Dès lors qu’il y a des perturbations de flux sanguins (lors d’une brèche vasculaire), le facteur willebrand change de conformation ce qui permet aux sites de fixation à la glycoprotéine plaquettaire GPIb d’être démasqués. Grâce à ce changement de conformation, la plaquette peut se coller au facteur willebrand.

§ Cette première étape d’adhésion plaquettaire aboutit à la production de signaux intracellulaires et à l’activation des plaquettes

2. Activation plaquettaire

§ La plaquette se contracte grâce à ses microtubules et émet des pseudopodes.

Cela permet une fusion des granules α et des granules denses avec le système canaliculaire ouvert qui déversent leur contenu dans le milieu extracellulaire.

- Contenu des granules denses : ADP et sérotonine

Les plaquettes ont à leur surface des récepteurs spécifiques à l’ADP et à la sérotonine.

Le FVW (facteur von willebrand) sert de « pont » entre le collagène et la glycoprotéine GPIb. On parle de « string » de FVW lorsqu’il est recouvert de plaquettes.


ü L’ADP est une molécule pro-agrégante car c’est un agoniste d’activation des plaquettes.

ü La sérotonine a une action vasoconstrictrice qui permet aussi de limiter le saignement en cas de brèche vasculaire, on parle de vasoconstriction réactionnelle.

- Contenu des granules α : fibrinogène important pour l’agrégation plaquettaire et la

coagulation et le facteur V

§ On observe aussi pendant l’activation plaquettaire :

ü un changement de conformation du récepteur du fibrinogène GPIIb/IIIa qui devient fonctionnel et peut se lier au fibrinogène

ü une transformation de l’acide arachidonique, phospholipide membranaire, en thromboxane A2 (Tx A2) qui est aussi un agoniste plaquettaire via la cyclo-oxygénase 1 (COX 1)

ü un phénomène de « flip-flop » : inversion d’exposition des phospholipides anioniques à la surface externe des plaquettes. Ces phospholipides vont servir de support et d’ancrage aux facteurs de la coagulation

v Précision sur le métabolisme de l’acide arachidonique

§ Lorsque les plaquettes sont activées, les phospholipides présents au niveau de leur membrane vont être métabolisés par les phospholipases aboutissant à une synthèse d’acide arachidonique. A son tour, celui ci va être métabolisé par COX 1 ce qui aboutit à la production de prostaglandines et notamment de thromboxane A2 qui est un puissant agoniste plaquettaire (présence de récepteurs spécifiques de TX A2 à la surface des plaquettes).

ü Aspirine est un inhibiteur direct des COX 1 et est donc un anti-agrégant plaquettaire. Elle bloque le métabolisme de l’acide arachidonique.


v Précision sur le phénomène de « flip flop »

Cellule au repos : asymétrie de distribution des phospholipides de la MB plasmique. Les phospholipides anioniques sont normalement à la surface interne de la membrane. Cellule activée : activation de certaines enzymes permettant une inversion de la distribution de ces phospholipides. Les phospholipides anioniques vont se retrouver à la surface externe de la MB. Cela crée une tension, la MB va « bourgeonner » et libérer des micro vésicules. Les phospholipides anioniques servent d’ancrage aux facteurs de la coagulation et permettent à l’activation de la coagulation d’être localisée au niveau de la brèche vasculaire. Ils serviront de support aux facteurs de la coagulation par la suite.

3. Recrutement et amplification

§ On trouve à la surface des plaquettes des récepteurs spécifiques à : ü l’ADP (sécrété par les granules) et au TxA2 sécrétés par les plaquettes lors de leur

activation ü la thrombine produite au terme de la coagulation

4. Agrégation plaquettaire

§ Liaison du fibrinogène à son récepteur spécifique GPIIB/IIIa qui a changé de conformation pendant l’activation des plaquettes. Le fibrinogène, protéine dimérique, va servir de pont ente deux plaquettes, c’est l’agrégation plaquettaire.

Ces molécules recrutent de nouvelles plaquettes, amplifient l’activation plaquettaire et permettent la croissance du thrombus


A la fin de l’hémostase primaire, on obtient un agrégat plaquettaire appelé le thrombus blanc

A retenir : (ne pas retenir uniquement ça) L’hémostase primaire aboutit à l’agrégat plaquettaire. Trois étapes sont essentielles :

1. L’adhésion des plaquettes au sous endothélium notamment au collagène et au FVW 2. L’activation plaquettaire avec la sécrétion de leurs granules et la production de métabolites

avec le recrutement secondaire de plaquettes 3. L’agrégation plaquettaire avec la liaison du fibrinogène à la GPIIb/IIIa activée

Ne pas oublier le « flip flop » c’est-à-dire l’inversion des phospholipides qui sert de support à l’activation des protéines de la coagulation II) La Coagulation plasmatique C’est une succession de réactions enzymatiques aboutissant à la formation d’un réseau de fibrine qui va servir de « ciment » pour l’agrégat plaquettaire issu de l’hémostase primaire.

A) Les principaux protagonistes de la coagulation Majoritairement ce sont les facteurs de la coagulation ainsi que des inhibiteurs plasmatiques. Mais le principal déclencheur est le Facteur tissulaire (une protéine membranaire). Les facteurs de la coagulation sont :

- Le fibrinogène - Des pro-enzymes : zymogènes - Des co-facteurs (permettront l’auto-amplification)

Les inhibiteurs de la coagulation constituent un système régulateur (nécessité d’un frein autant que d’un accélérateur).

La GPIIb/IIIa au repos : ses liaisons au fibrinogène ne sont pas accessibles.

Lors de l’activation, changement de conformation et liaison au fibrinogène.


1. Le Facteur Tissulaire.

§ C’est une protéine membranaire, premier initiateur de la coagulation. Il est exprimé constitutivement (essentiellement) par les fibroblastes et les cellules épithéliales (cellules qui normalement ne sont pas au contact du sang), mais également par les cellules endothéliales et leucocytes activés en situation pathologique.

Il est important de comprendre que normalement, le FT (facteur tissulaire) n’est pas au contact du sang.

2. Les facteurs de la coagulation

§ Ce sont des protéines plasmatiques solubles. Ils sont désignés par des chiffres romains. Le facteur II correspond par exemple à la prothrombine.

§ Une fois activés, ils portent leur nom suivi du suffixe «a ». Le Facteur IIa désigne la thrombine.

Ce petit a est très important, la prof a précisé qu’on l’oubliait souvent pendant les examens ; par exemple ce n’est pas la même chose d’inhiber le facteur II ou le IIa.

§ Les facteurs de la coagulation sont présents dans le plasma (et non dans le sérum !)

Sérum= plasma sans facteurs de coagulation et fibrinogène. La façon d’obtenir le plasma et le sérum n’est pas la même. On obtient le plasma à partir de tubes citratés qui empêchent la coagulation du sang. En centrifugeant on récupérera alors plasma et culot cellulaire. Le sérum est récupéré dans des tubes sans anticoagulants (avec parfois même des activateurs de la coagulation) ; il y a alors consommation des facteurs de la coagulation qui sont donc absents après centrifugation. Le fibrinogène est le substrat final de la réaction d’activation de la coagulation ; clivé il donnera la fibrine. Les zymogènes sont des pro-enzymes sont des sérines protéases (càd qu’elles clivent des sérines) et une est une tranglutaminase. Les facteurs vitamine K dépendants sont les II, VII, IX,X. (cibles des anticoagulants qui empêcheront le recyclage de la vitamine k). Tous les facteurs de la coagulation (sauf le VIII) sont synthétisés par le foie. Les pro-enzymes et co-facteurs doivent subir une protéolyse pour acquérir leur activité biologique.

ü Précision sur les facteurs Vitamine K dépendants 4 facteurs de la Coagulation (II, VII, IX, X) ; 2 inhibiteurs de la coagulation : protéines C et S. Ils sont dits vitamine K dépendant car ils ont besoin d’une modification post traductionnelle dans l’hépatocyte. C’est une carboxylation de leurs acides glutamiques en acides γ-carboxyglutamiques (Gla) avec comme co-facteur la vitamine K réduite. La réductase est cible des tt AVK. Les plaquettes activées exprimeront leurs phospholipides anioniques ; les facteurs de la coagulation vitamine K dépendants viendront s’y lier grâce à leurs résidus Gla aux phospholipides : liaison calcium-dépendante.


ü Rôle des co-facteurs

Concentration de l’enzyme et son substrat à la surface des plaquettes. (Surface membranaire solide). En présence de co-facteur l’enzyme et le substrat sont rapprochés ce qui a pour effet d’augmenter l’effet catalytique.

Le facteur X clive la prothrombine en thrombine. Si il y a du calcium et des phospholipides, ces molécules vitamine K dépendantes s’ancrent avec s résidus Gla dans les plaquettes ; augmentant alors l’efficacité qui passe de 1à 50. Si il y a un co-facteur (le FVa) qui rapproche l’enzyme de son substrat alors l’efficacité est multipliée par 20 000. Ce système permet d’accroître l’efficacité enzymatique et de former le plus rapidement possible le thrombus.

B) Les différentes étapes de la coagulation plasmatique

La coagulation plasmatique commence par l’exposition du facteur tissulaire (normalement situé dans les tissus) au sang. C’est ce qu’on appelle la voie exogène (ou voie du FT). Voie exogène car déclenchée par quelque chose d’extérieur au vaisseau. Cette voie permet d’obtenir les premières traces de thrombine (FIIa), cette voie est rapide mais n’est pas suffisante (pas assez de thrombine) pour arrêter le saignement.


Se mettent alors en place la boucle d’amplification et le système contact : la voie endogène (car elle fait intervenir des protéines à l’intérieur du vaisseau).

1. Initiation de la coagulation plasmatique

La coagulation plasmatique est déclenchée par le FT, protéine membranaire (seule protéine membranaire qui intervient dans la coagulation). Dans le sang se trouve du facteur VII (et des traces de facteur VIIa) qui circule mais est inactif en l’absence de Facteur tissulaire. La FT est un co-facteur du FVII qu’il active en s’y liant et donnant du FVIIa.

Ensuite le complexe FT/FVIIa active les facteurs IX et X. Le Facteur Xa active la prothrombine (FII) en Thrombine (FIIa), ce qui est responsable des premières traces de thrombine. La thrombine est la molécule centrale de l’hémostase. Le Facteur VII, IX, X et la prothrombine sont des facteurs vitamine K dépendants ; on a donc besoin de la liaison Calcium-dépendante de leurs résidus Gla aux phospholipides anioniques des plaquettes activées. Cette réaction est indispensable au niveau de la brèche vasculaire. Le complexe FT/FVIIa active le FIX en IXa et le X en Xa (aussi activé par IXa). Le FXa transforme alors la prothrombine (FII) en thrombine (FIIa). Cette thrombine va transformer le fibrinogène en fibrine permettant la formation de ce « ciment » qui va venir stabiliser l’agrégat plaquettaire. A retenir : La coagulation intervient lorsque le FT (sécrété notamment par les fibroblastes) vient au contact du sang au niveau de la brèche vasculaire. Le FT interagit avec le FVII/VIIa, permet son auto-activation et l’activation du IX et du X. En pathologie, l’expression du FT à la surface peut être induite par les médiateurs de l’inflammation dans les cellules circulantes (monocytes) ou vasculaires (cellules endothéliales). Notamment en cas de gros sepsis, ou en cas de CIVD.


2. L’amplification de la coagulation.

Les premières traces de thrombine sont insuffisantes pour pouvoir avoir un caillot stable. Il va donc y avoir une auto-amplification. La thrombine va activer les co-facteurs (FV et VIII) et permettre la formation des complexes tenase et prothrombinase.

-‐ Le complexe Tenase constitué de plaquettes activées, du FIXa, et VIIIa permet la transformation du X en Xa de façon plus efficace que par la voie du FT.

-‐ Le complexe de la Prothrombinase est constitué de plaquettes activées du co-facteur Va et Xa ; il forme la Thrombine

La thrombine va également recruter et activer de nouvelles plaquettes (qui expriment à leur surface des récepteurs spécifiques de la thrombine) ainsi que le facteur XI (voie endogène). La thrombine a également un rôle stabilisateur de la fibrine, par activation XIII en XIIIa. Le FXIIIa rend la fibrine insoluble et permet au caillot d’être solide.

3. Les multiples fonctions de la thrombine

Son rôle principal est d’auto-amplifier sa production par activation des co-facteurs V et VIII et FXI. Elle est responsable de l’étape cruciale de la coagulation car elle convertit le fibrinogène en fibrine. Elle permet l’activation des plaquettes par le récepteur PAR. Elle joue un rôle dans la régulation de la coagulation car elle active le système d’inhibition de la coagulation par l’intermédiaire de la protéine C et du complexe thrombine/thrombomoduline.

4. Le système contact

A un rôle mineur comparé à la voie du Facteur Tissulaire (en physiologie). Le système contact est la voie endogène de la coagulation. Ce système résulte du contact du sous-endothélium avec 4 protéines plasmatiques en cas de lésion :

-‐ Des zymogènes : prékallikréine (PK), FXII et FXI (encore lui)

-‐ Cofacteur : Kininogène de Haut poids Moléculaire (KHPM)


Petite explication du schéma : La PK est transformée en Kallikréine par le KHPM. Puis K active alors FXII en XIIa. S’en suit alors l’activation du FXI en Xia (c’est ce qui nous importe pour la coagulation) Le système contact participe à l’amplification de la thrombine.

5. La fibrinoformation

C’est la conversion du fibrinogène soluble en fibrine insoluble. Le fibrinogène est formé de 6 chaînes polypeptidiques (dimère avec 2 chaînes α, 2 β, 2 γ). En présence de Thrombine il y a protéolyse qui libère des fibrinopeptides A et B et formant un monomère de fibrine soluble. Ces monomères sont ensuite polymérisés grâce à des liaisons hydrogènes donnant un polymère de fibrine solide mais instable. Le FXIIIa intervient (activé par la thrombine) et stabilise ce polymère par formations de liaisons covalentes. A la fin de l’hémostase primaire et de la coagulation on obtient des plaquettes agrégées au niveau de la liaison, maintenues en place par un réseau de fibrine. A retenir (mais pas seulement) : La coagulation est une succession de réactions enzymatiques ayant lieu à la surface des plaquettes activées (liaisons Ca-dep des facteurs de la coagulation aux Phospholipides anioniques des plaquettes). Cela aboutit à la formation d’un réseau de fibrine insoluble et stable. En faisant intervenir la voie exogène par le FT ; l’amplification de la thrombine par les premières traces de thrombine ; et également la voie endogène (système contact mais pas que, le FXI, IX, VIII font partie de cette voie.)

COURS N°3 Physiologie et exploration de l’hémostase

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