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UE2 : Anatomie pathologique

Pr Cazes

25/10/2019 de 08h30 à 10h30

Ronéotypeur : Mariam BEN HADJ YAHIA ; Matthieu GEOFFROY

Ronéoficheur: Mariam BEN HADJ YAHIA ; Matthieu GEOFFROY

Cours n°1 : Prélèvements – Technique en

Anatomie- pathologique

A savoir :

- 5 Cours Magistraux : Introduction et Techniques, Lésions élémentaires, Inflammation (2 fois), Métabolisme

Dont 2 cours Interactif à préparer sur Moodle (venir avec un smartphone)

- 2 ED (2 heures) :

RESPECTER SON GROUPE +++ Lame virtuelle à visualiser avant l’ED (sur Moodle)

- EXAMEN : Question rédactionnelle et QRM portant sur les cours et les ED

Le cours n’a absolument pas changé par rapport à celui de l’année dernière !

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Sommaire :

I. Introduction

1) L’étude des lésions

2) La démarche diagnostique

3) Les prélèvements

II. La cytologie (cellules isolées)

1) Techniques de prélèvement

2) Indications, avantages et limites

III. Prélèvements tissulaires

1) Prélèvements standard

2) L’examen extemporané

3) Congélation des tissus pour conservation

IV. Principes d’analyse d’une coupe histologique

V. Techniques complémentaires spéciales

1) Les colorations histochimiques spéciales

2) Immunohistochimie

3) Biologie moléculaire « in situ » HIS ou ISH

VI. L’anatomopathologie en résumé

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I. Introduction :

L’anatomie pathologique est une spécialité médicale qui étudie les lésions provoquées par les maladies sur les

organes, tissus ou cellules. L’anatomopathologie est pratiquée en laboratoire (et non en service).

Afin d’étudier ces lésions, nous allons utiliser des techniques principalement morphologiques. Les lésions sont des altérations morphologiques des organes décelables par tout moyen d’observation.

L’ensemble des ces lésions sont plus ou moins spécifiques des maladies.

L’anatomopathologie est le fait de les reconnaitre au microscope optique (MO) pour proposer un diagnostic et évoquer une maladie.

Exemples de lésions : nécrose, fibrose, inflammation, prolifération...

1) L’étude des lésions :

Pour analyser des lésions, il nous faut un support c’est à dire un tissu. On fait donc un prélèvement de tissu puis on

l’examine : On a plusieurs échelles d’examen :

- Soit à l’œil nu = Examen MACROSCOPIQUE. (Limité pour faire un diagnostic)

- Soit, après la macroscopie, le plus souvent au Microscope optique (MO) = Analyse MICROSCOPIQUE. Les prélèvements sont coupés et colorés sur une lame de verre.

2) La démarche diagnostique :

Comment l’anatomopathologie intervient dans la démarche diagnostique pour la prise en charge du patient ?

Le patient présente un symptôme, il va voir son médecin et

ce dernier va l’examiner et élaborer un examen clinique

avec des hypothèses.

Des examens complémentaires sont donc pratiqués en accord avec les symptômes du patient : imagerie (une

radio), examen biologique (une prise de sang par ex), un

examen d’anatomopathologie (= qui porte sur un

prélèvement).

Dans le cas où un prélèvement est possible, on le prélève et on l’envoie au laboratoire pour une analyse. Le technicien

rédige un compte rendu d’anatomopathologie qui est destiné au médecin.

Le médecin qui prend en charge le patient va faire une synthèse de tous les examens, ce qui va aboutir à un

diagnostic. Un traitement et/ou une surveillance pourront alors être mis en place selon sa maladie.

Ainsi, l’anatomopathologie s’intègre dans la démarche diagnostique, et ceci passe par l’analyse tissulaire ou

cellulaire.

3) Les prélèvements :

A partir de quels prélèvements nous pouvons étudier ces lésions ?

On distingue 2 grands types de techniques ou mode de prélèvements :

- On peut analyser des cellules isolées, c’est la CYTOLOGIE. Des cellules hors de leur tissus d’origine.

NB : L’analyse des cellules du sang n’est pas réalisée en Anapath mais en Hématologie.

Prélèvement de ces cellules à partir des liquides biologiques : analyse d’urine ou liquides pathologiques :

épanchement pleural, lavage bronchique.

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Prélèvement des cellules à partir des tissus : gros tissus, éléments chirurgicaux (organe entier) ou biopsie (petit

fragment). Ces cellules prélevées sur un tissu sont des cellules dans leur environnement avec tout ce qui les soutient.

Les cellules isolées sont posées sur lame, colorées et analysées.

La cytologie est une technique très rapide (quelques heures) mais qui est moins précise et apporte moins

d’informations que l’analyse tissulaire.

- On peut aussi prélever et étudier des tissus, c’est l’HISTOLOGIE.

Les prélèvements arrivent en anapath avec une feuille de demande nécessaire pour la traçabilité. Les prélèvements

doivent être extrêmement bien identifiés. En effet, le prélèvement va être mis dans un tube, un pot avec une étiquette

identifiant le patient. Ce prélèvement est accompagné d’une feuille de renseignements avec l’indentification du patient, son état civil mais aussi les renseignements cliniques du médecin qui a prélevé, la nature du prélèvement

(peau, rein …) + les examens complémentaires : les imageries et la biologie (tout ce qui peut aider à résonner).

II. La cytologie (cellules isolées) :

1) Techniques de prélèvement :

Prélèvement sur un Liquide :

- Liquide physiologique : Liquide Céphalo Rachidien (suspicion de méningite) - Liquide anormaux : les épanchements des séreuses : Pleurésie = liquide dans la plèvre. Ascite =

épanchement dans le péritoine. On récupère ce liquide pour analyser les cellules.

- Lavage : Broncho-alvéolaire : On injecte un liquide dans les alvéoles pulmonaires puis on le récupère avec

des cellules pour diagnostiquer.

Grattage ou brossage : des muqueuses (buccale, génitale), frottis du col de l’utérus. On gratte et on récupère les

cellules pour les étaler sur une lame.

Apposition : Apposition de pièces opératoires. Ex du ganglion. On le pose sur une lame de verre délicatement, les

cellules se déposent et cela laisse une empreinte.

(Ponction a l’aiguille d’une masse ou bien d’un organe plein. Pour un kyste : on ponctionne à l’aiguille pour

absorber le liquide. S’il y a une grande présence de PNN (polynucléaire neutrophile) c’est un abcès tumoral.) pas

évoquée a l’orale

Techniques traditionnelles :

Une fois que les cellules sont étalées sur la lame (soit directement ou alors après centrifugation du liquide), on va les

sécher a l’air ou par fixation par laque puis les colorer au MGG ou Papanicolaou.

Explication :

- Le frottis : étalement sur la lame du matériel rapidement après son prélèvement.

- Cytocentrifugation du liquide (centrifugation puis projection sur lame des cellules isolées) permet de tourner

les cellules et de les projeter sur les lames directement.

- Apposition ou empreinte d’un tissu sur une lame de verre

Inconvénient : il n’y a pas de réserve de prélèvement une fois la lame colorée. (Contrairement au prélèvement

tissulaire)

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Techniques plus récente (moderne) :

La cytologie en milieu liquide correspond à l’immersion immédiate des cellules dans le milieu de conservation. On va récupérer les cellules en suspension dans un milieu de conservation, et on les transfère sur une lame en couche

mince. Contrairement à la technique traditionnelle, on peut garder les cellules en réserve pour pouvoir faire des

analyses plus tard (technique utilisée en cytologie gynécologique).

Par Exemple : Epanchement pleural : liquide dans la plèvre. On ponctionne ce

liquide : ensuite on le met dans des tubes, on utilise un cytocentrifugation et les cellules

sont projetées sur une lame.

Observation : Le liquide pleural contient des Lymphocytes tumoraux visibles en

coloration MGG. Cellules violettes avec de gros noyaux qui occupent quasiment toute

la cellule (cytoplasme faible) = ce sont donc des cellules tumorales avec une atypie cytonucléaire (anomalie nucléaire et cytoplasmique). Ces cellules sont irrégulières dans la taille et la forme. C’est

donc un liquide pleural avec des cellules cancéreuses.

Exemple 2 : Examen normal de frottis cervico vaginal coloré au

Papanicolaou (utilisé pour voir les cellules épithéliales).

Observation : A gauche : cellules non atypiques = bonne maturation

de l’épithélium. Bonne répartition des cellules.

Diffèrent du côté droit, où l’on retrouve des atypies cytonuclaires : où les cellules sont très grosses, irrégulières en taille avec des

noyaux foncés (hyper chromatiques) = diagnostic du cancer du col à

confirmer avec une biopsie.

2) Indications, avantages et limites :

Ses avantages : La cytologie est peu invasive, rapide et performante.

Indication : La cytologie à des indications assez larges. Elle permet l’accès à des lésions profondes (à l’aide d’une aiguille en profondeur) à des endroits où l’accès chirurgical n’est pas possible. Elle peut aussi aider à faire des

dépistages et des surveillances car elle est peu invasive ainsi que des examens complémentaires. (Ex : l’étude d’un

épanchement pleural).

Ses limites : La qualité cytologique n’est pas toujours optimale et pas toujours reproductible.

Le problème c’est qu’on a accès uniquement aux cellules et non pas aux cellules avec leur environnement et le tissus

tout autour, c’est donc moins précis. Le matériel n’est pas très abondant.

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III. Prélèvement tissulaire : (du plus petit au plus grand)

Biopsie : prélèvements instrumentaux d’un fragment de tissu pour analyse anatomopathologique.

– On peut avoir une biopsie par ponction (aiguille coupante ou un trocart) (foie, rein, os, etc.) : Cette ponction

peut se faire « à l’aveugle » ou sous repérage (échographie, scanner) lorsque la ponction doit être dirigée sur

une lésion focale.

– Souvent les biopsies sont faites au cours d’une endoscopie (moyen qui permet de voir à

l’intérieur d’un organe creux. Par ex : une endoscopie du tube digestif).

– Ou une biopsie Au bistouri, au punch....

Des biopsies sous fibroscopie : très précises (prélèvement de qq mm) et très techniques.

Pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d’un ou de plusieurs organes. Les pièces sont de différentes tailles ;

ex : valve aortique 1cm < Tumorectomie du sein 5cm < Pneumonectomie avec pariétectomie (retrait de morceaux de

côte en plus du poumon).

Autopsie (ou nécropsie) = examen anatomopathologique pratiqué sur un cadavre. 2 types d’autopsies :

- Les autopsies médico-légales sont pratiquées sur ordre de la justice dans tous les cas de mort suspecte

(pratiqué par un médecin légiste et non pas un médecin d’anapath). - Les autopsies à but scientifique sont pratiquées dans les hôpitaux, généralement à la demande des médecins

(pour connaître les raisons du décès).

1) Prélèvement standard :

La Prise en charge d’un prélèvement : du tissu à la lame…

1ère étape : Etape cruciale et irréversible : La Fixation du tissu (à savoir)

La fixation est une méthode permettant de conserver les cellules et le tissu dans un état fixe le plus proche possible de

l'état physiologique, pour éviter que le tissu ne se dégradent. Il faut le faire rapidement après le prélèvement.

On utilise le plus fréquemment = la fixation au Formol, une fixation chimique par immersion. On va tremper le

prélèvement dans un bain de formol et on va laisser le prélèvement dans le formol pendant une durée variable selon la

taille (de quelques heures à quelques jours).

La prof à montré un vidéo illustrant la prise en charge macroscopique d’une pièce opératoire : https://youtu.be/6-

HdKZFb9xo

Commentaire de la prof concernant la vidéo :

On réceptionne le prélèvement avec la feuille de renseignement. Le technicien enregistre le prélèvement. Ensuite on

fait un examen macroscopique du prélèvement une fois enregistré. Le prélèvement est une rate et un pancréas avec un kyste. On peut faire des photographies des pièces macroscopiques du prélèvement pour que ça reste dans le dossier

du patient. Ensuite on trempe le prélèvement dans du formol pendant 24h. Le tissu est donc fixé, la couleur et l’aspect

des organes ont aussi été changés. On va ensuite faire l’examen macroscopique dit fixé. Le prélèvement est ensuite

coupé et mis dans des cassettes par un technicien. Ensuite, inclusion de ces cassettes en paraffine. Le reste du

prélèvement est stocké provisoirement.

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Les prélèvements tissulaires arrivent du laboratoire et vont être enregistrés. Ensuite, on va réaliser un

examen macroscopique sur tissus frais. Le

prélèvement va ensuite être fixé au formol.

Une fois fixé, le technicien réalise un examen

macroscopique sur tissus fixé : Description du prélèvement, mesure de la pièce, choix des lésions à

analyser (ex : tumeur, marges de résection, ganglion).

Ensuite, on va sélectionner les zones qu’on veut

analyser et les mettre en cassette. Le tissu est ensuite inclus en paraffine pour lui donner une certaine

rigidité pour le couper.

Inclusion en paraffine du tissu : Le prélèvement est déshydraté dans des bains d’alcool (car la paraffine ne se lie pas

à l’eau donc on déshydrate), on remplace ensuite l’alcool par du solvant (toluène /xylène). Ensuite, on remplace ce

solvant par de la paraffine liquide chaude, et donc création d’un « bloc de paraffine » refroidie contenant le tissu à

analyser.

Le tissu est coupé au microtome, mis sur des lames et coloré. Coloré à l’HES (Hématoxyline Eosine Safran) A

connaître

La coloration standard est HES : Hématéine Eosine Safran. (+++)

- Hématéine (hématoxyline) : noyaux en bleu

- Eosine : cytoplasme en rose

- Safran : tissu conjonctif et collagène en jaune

Enfin, nous pouvons observer la lame avec un MO : c’est l’examen microscopique.

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2) Examen extemporané :

Il se définit comme un examen histologique rapide (10 à 15 mins) réalisé en cours d’une intervention chirurgicale

dont les résultats orienteront les suites de l’intervention. Il est réalisé sur un prélèvement frais (pièce opératoire ou

biopsie) mesurant 1 à 2 cm au maximum. Ce prélèvement sera congelé au cryostat(-20°C) qui est une enceinte

combinant un microtome permettant la coupe (4 microns). Cette étape de congélation nous permet de nous affranchir

des étapes classiques (formole, paraffine…) de préparation en raison d’un manque de temps. La coloration sera réalisée

rapidement à la main. Les résultats sont par la suite communiqués immédiatement par téléphone.

Néanmoins cet examen comporte des limites. Dans un premier temps la congélation altère la morphologie des cellules.

La coloration se faisant rapidement, elle est par conséquent pas toujours très bien réalisée, dans un cas cela est

correctement coloré et dans l’autre très mal. De plus il ne permet qu’une analyse partielle du prélèvement (1à 2 cm).

En raison de ce manque de fiabilité, il sera toujours confirmé par un examen après fixation/inclusion en paraffine du

reste du prélèvement. Il est donc moins fiable que l’examen définitif ! Ce n’est pas un examen de confort.

3) Congélation des tissus pour conservation :

Il est possible de conserver les tissus/cellules à -80 °C après congélation en azote liquide. Cela permet la constitution de

banques de tissus que l’on nomme des « Tissuthèques » ou « Tumorothèques ». Ces conservations sont réalisées en

vue d’étude de biologie moléculaire (ARN+++), études protéiques ou bien d’immunofluorescence. Elles s’inscrivent

également dans le cadre du soin (utile au diagnostic) ainsi que dans le cadre de la recherche biomédicale. A noter que

les tissuthèques sont gérées en conformité avec la loi (information et non opposition des patients).

La congélation des tissus pour leur préservation est différente d’un examen extemporané. Cela se fait à partir d’un

prélèvement frais c’est-à-dire non fixé, le plus rapidement possible après sa réception et est souvent réalisée à l’état

« macroscopie fraîche ». Le stockage se fait à -80°C jusqu’à réutilisation.

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IV) Principe d’analyse d’une coupe histologique

Dans un premier temps il faut d’abords réaliser un examen à faible grossissement (×25) afin d’avoir une vision globale

de l’architecture tissulaire, c’est-à-dire que l’on doit pouvoir estimer si l’organe est normal ou pas, nous devons pouvoir

aussi repérer les zones lésionnelles. S’en suit un examen à plus fort grossissement (×400) nous permettant d’apprécier

les détails cellulaires dans le but final de poser un diagnostic. Il y a donc une « gymnastique » perpétuelle entre

augmentation et diminution du grossissement pour pouvoir au mieux analyser le prélèvement.

(Faible grossissement) (fort grossissement)

Nous observons en B une alvéole pulmonaire dont le contour est parsemé de cellules plus foncées. À plus fort

grossissement, nous remarquons que ces cellules sont caractéristiques de celle d’un fumeur.

Pathologie 2.0 : Du microscope a la lame virtuelle…

Le principe est simple, il consiste en la numérisation d’une lame à l’aide d’un scanner de lame. Une fois numérisée

la lame est stockée sur un serveur. Les images obtenues peuvent être très lourdes allant de 0,1 à 5 G par lame. Elles

seront par la suite analysées par un logiciel approprié. Ceci nécessite une adaptation des moyens matériels et des

compétences. L’avantage d’une telle technologie est de pouvoir choisir librement la zone à examiner et le

grossissement par ailleurs il n’y a aucune contrainte de lieu ou du nombre d’observateurs.

Cette technologie est employée dans le cadre de l’enseignement, dans la présentation de cas lors des réunions de

concertation multidisciplinaire, lors d’une demande d’avis ou bien lors d’une présentation devant un groupe d’experts.

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Colorations Applications

➢ Coloration PAS

➢ Coloration de Perles

➢ Rouge Sirius

➢ Coloration de Grocott

➢ Coloration de Ziehl-Neelsen

➢ De couleur rose/rouge, met en évidence entre

autres le mucus ainsi que le glycogène ainsi que certains champignons.

➢ Colore le fer en bleu, permet d’observer les surcharges en Fer au sein des cellules.

➢ Se fixe sur le collagène, colore les tissus ayant trop de collagène dans le cadre de lésions

élémentaire que l’on appelle la fibrose. Ces

fibres peuvent être observées par une

coloration au safran ou HES mais elles seront moins bien visualisées.

➢ Permet de colorer les champignons,

(mycoses), filaments, levures, kystes.

➢ Coloration permettant l'identification des Mycobactéries (Bacille Acido-Alcoolo

Resistants, BAAR.

2) Immunohistochimie : (important aussi…)

Cette technique permet de mettre en évidence certaines protéines (Antigènes) qu’elles soient membranaires,

cytoplasmiques ou nucléaires. Elle repose sur une réaction antigène-anticorps. Par la suite le complexe formé est

rendu visible par un marqueur. Ceci permet la localisation et la quantification de la ou des protéines concernées. Le

système révélateur utilisé est un chromogène ou bien un fluorochrome, nous parlons alors d’immunofluorescence.

Il existe également une méthode indirecte, celle-ci est réalisée sur une coupe tissulaire ou une lame de cytologie. Le

but est d’appliquer un anticorps primaire spécifique de la cible, puis un anticorps secondaire couplé à une

enzyme à laquelle nous fournissons un substrat. Le produit coloré de la réaction enzymatique apparait au niveau

du complexe Antigène-Anticorps si la liaison a eu lieu.

V) Techniques complémentaires spéciales

1) Les colorations histochimiques « spéciales » : (important)

Le but est ici de mettre en évidence des constituants particuliers « in situ ». Les éléments observés sont très

variables :

• Cellules : mucus, glycogène, pigments…

• Matrice extracellulaire : fibres élastiques, amyloses.

• Agents infectieux : bactéries, parasites, champignons.

Ce sont des techniques histochimiques basées sur des réactions biochimiques. Voici quelques exemples :

• Identification du glycogène, mucopolysaccharides neutres dans la réaction de shiffs. (Coloration de PAS).

-oxydation de certains polysaccharides par l’acide

-Révélée par une coloration rouge.

Voici quelques types de colorations que l’on peut retrouver :

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L’immunohistochimie a de nombreuses applications :

Intérêt diagnostique : classification d’une tumeur (épithéliale, lymphoïde, conjonctive…)

• Mise en évidence d’un agent infectieux : CMV, herpès.

• Mettre en évidence une sécrétion

• Détection de molécules ayant une importance pronostique (Ki-67)

• Intérêt thérapeutique : recherche d’une cible : recherche de récepteurs aux œstrogènes, protéine HER2 dans les

cancers du sein.

3) Technique de biologie moléculaire in situ HIS ou IHS :

Cette méthode se base sur le principe d’hybridation in situ. Son but est de mettre en évidence et de localiser sur des

coupes tissulaires ou étalements cellulaires des séquences connues d’ADN ou d’ARN par le biais de sondes

d’acides nucléiques complémentaires le plus souvent couplées à une enzyme ou un fluorochrome. (Fluorescent

ISH, nécessite un microscope à fluorescence +++). Cela fait appel aux propriétés de la molécule d’ADN à savoir la

possibilité de la dénaturer et donc de séparer les deux brins. Lors de la renaturation les bases se réassocient de façon

complémentaire.

Dès lors il devient possible de localiser l’expression d’un gène dans un tissu, de mettre en évidence l’amplification

d’un gène ou bien sa perte ou bien encore de mettre en évidence la cassure d’un gène.

Exemple : Cas d’un cancer du sein. La technique de visualisation FISH permet de visualiser le gène HR2 et

particulièrement son amplification. Cela permet d’orienter le traitement notamment par l’utilisation du trastuzumab.

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VI) L’anatomopathologie en résumé…

• Anatomie pathologique = discipline médicale

• Etudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci sur les organes, tissus ou cellules

• Lésions analysées en intégrant la connaissance de la clinique +++ et de l’imagerie

• Interprétation et non mesure exacte

• Utilise des techniques principalement morphologiques en constante évolution (veille technologique ++)

• Aboutit à la rédaction d’un compte-rendu comportant :

– diagnostic / hypothèses diagnostiques,

– indications sur potentialité évolutive des lésions

– éléments permettant d'orienter le pronostic/le traitement

Vous trouverez ci-joint le lien d’une vidéo permettant d’illustrer les informations qui vous ont été données

précédemment. Elle a été visualisée en cours, certes elle est détaillée mais n’est pas à retenir, elle vous est donnée en

bonus.

https://youtu.be/kH1Z0A_TxTE

Matthieu :

Petite dédicace à toute la team d’athlé de Bichat, à Xavier : répares nous cette clavicule rapidement, on compte sur

toi pour tous les soulever au PIMP !

A Alban mon amour <3 on se marie quand tu veux (Ps : si tu me trompes avec cyprien je te tue…). Ulysse ne sois pas

jaloux…

Dédicaces de Mariam:

Mercii Au Tunisian gang qui sont troop drôles + Aziadéé que j’aime Et Wafaa la meilleure !!

A Matthieuu, mon co roneotypeur avec qui on a bien galéré en PACES

A Malik qui critique les ronéos (j’espère que ma fiche t’a plus)

+ Vive la « Direction D1 »