Cours Ifsi Role Du Laboratoire de Microbiologie Nathalie Grall 1

8/11/2019 Cours Ifsi Role Du Laboratoire de Microbiologie Nathalie Grall 1

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Rle du laboratoire demicrobiologie:

prlvements, examen biologique


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Plan

1. Gnralits

2. Diagnostic direct 2.1 Prlvements des produits pathologiques 2.2 Etude des produits biologiques

2.2.1 Bactriologie classique 2.2.2 Recherche dantignes solubles

2.2.3 Mthodes molculaires

3. Diagnostic indirect: srodiagnostic


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Maladies infectieuses

1ire cause de mortalit dans le monde (17millions/an)

Etat pathologique transmissible induit par unagent infectieux:

Organisme vivant: champignons, parasites, bactries

Parasite molculaire: virus, prions

Rsultats dun conflit hte-agent infectieuxaboutissant des lsions chez lhte infect.


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Dfinitions

Bactries saprophytes :

Se nourrissent de matires organiques en dcomposition Bactries de lenvironnement

Bactries commensales : Vivent aux dpens dun autre organisme sans lui causer de dommage

Flore rsidente Effet barrire

Bactries pathognes Pouvoir pathogne : capacit induire des troubles morbides chez lhte

(typhode, cholra, tuberculose)

Li la virulence et la susceptibilit individuelle Flore normale : pneumocoque, mningocoque

Ou non : salmonelle, tuberculose


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Flores bactriennes humaines

Flore cutane:106 bactries

Bactries grampositif(staphylocoques,corynbactries)

Flore oro-pharynge:

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bactriesAnarobies,streptocoques,Haemophilus,Neisseria

Flore digestive:1014 bactries

Anarobies,entrobactries,entrocoques


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Diagnostic dune maladie

bactrienne1. Clinique

Signes gnraux

Signes spcifiques

2. Examens complmentaires

Radiologiques

Biologiques

3. Diagnostic de ltiologie de la maladie bactrienne


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Diagnostic de ltiologie de la

maladie bactrienne

1. DIAGNOSTIC DIRECT ou bactriologique:

- Dtecter la bactrie ou ses constituants (protines,polyosides, acides nucliques)

- Isoler en culture et identifier le genre et lespce decette bactrie

2. DIAGNOSTIC INDIRECT ou srologique:

- Dtection dune rponse immunitaire spcifique de labactrie suspecte


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Plan

1. Gnralits






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Prlvements des produits

pathologiques Guids par la symptomatologie et lexamen clinique

O ? : dans les organes cibles (LCR, abcs profonds, panchements...) dans le sang au cours de la dissmination la porte d'entre cutano-muqueuse toujours recherche

Quand ? le plus tt possible,

avant l'antibiothrapie

Comment ? Strilement

Transport rapide au laboratoire


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Prlvements cutano-muqueux


pathologiques


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Urines (ECBU) Toilette soigneuse de la rgion vulvaire ou du gland Recueil du 2imejet dans un pot strile Acheminement rapide au laboratoire ou conservation

4C


pathologiques


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Prlvements pulmonaires

Crachats (ECBC)

Le matin au rveil, aprs rinage bucco-dentaire Effort de toux (les crachats salivaires sont liminer)

LBA (Lavage Broncho-Alvolaire)

PDP (Prlvement Distal Protg)


pathologiques


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Selles (coproculture)

Il faut distinguer Coproculture standard la recherche de Salmonella,

Shigella,Yersinia, Campylobacter Coproculture la recherche de BMR

Coproculture la recherche de Clostridium difficile

Ecouvillonnage rectal si pas de selles


pathologiques


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Pus ou liquides dpanchements

Foyers infectieux ouverts (contamination par la florecommensale) ou infections fermes

Seringue strile ou couvillon

Si recherche danarobies: milieux spcifiques(Portagerm ou flacon dhmoculture anarobie)


pathologiques


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LCR (Liquide Cphalo-Rachidien) Urgence absolue en cas de suspicion de mningite Transport urgent +++


pathologiques


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Hmocultures Une hmoculture = un flacon arobie + un flacon

anarobie Prlvement veineux strile Indications

Hyperthermie >38,5 C

Hypothermie


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Plan

1. Gnralits






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Etude des produits biologiques Bactriologie classique

Examen macroscopique

Examen microscopique Mise en culture Identification antibiogramme

Recherche dantignes solubles

Mthodes molculaires


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Examen macroscopique


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Examen microscopique: examen

direct Examen cytologique

quantitatif ou semi-quantitatif (leucocytes, hmaties)

qualitatif (type de cellules, MGG)

Examen bactriologique

tat frais (mobilit)

coloration

Information au clinicien

Choix des milieux de culture


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Diffrentes techniques de coloration

des bactries Coloration universelle : coloration au bleu demthylne


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Coloration de Gram

Information rapide et mdicalement importante, carpouvoir pathogne et sensibilit aux antibiotiques trsdiffrents

4 groupes: Bactries Gram positif (bleu)

Bactries Gram ngatif (rose)

Bactries sans paroi (non colorables) Bactries non colorables par la mthode de Gram (mycobactries,

trponmes)


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Composition de la paroi en fonction

des espces ou du groupe bactrien


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Cocci Gram positif


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Bacilles Gram positif


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Cocci Gram ngatif


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Bacilles Gram ngatif


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Colorations particulires

(bactries non colorables par la mthode de Gram)

Mycobactries

Non colorables par lamthode de Gram

Treponema pallidum

Agent de la syphilis

Non cultivable

Ziehl-Neelsen


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Conclusion J0

Arguments diagnostiques de forteprsomption

Mise en route d'une thrapeutique adapte

Culture et isolement de l'agent causalessentiels : identification et sensibilit auxantibiotiques


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Cultures des produits biologiques

Diffrents milieux de culture Milieux solides/liquides Milieux plus ou moins enrichis

Diffrents types de culture Qualitative identification

Quantitative numration bactrienne (Urines,prlvements pulmonaires)


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Diffrentes conditions dincubation (anarobiose,ajout de CO2,)

Diffrents dlais dincubation (24h 48h engnral)

Choix fonction des renseignementscliniques, du type de prlvement et delexamen direct


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Type respiratoire : culture en arobiose et/ou enanarobiose

Aspect des colonies

Prsence d'une hmolyse (alpha, bta)

Tests dorientation : tat frais, Gram, oxydase,catalase, srogroupage

Analyse qualitative des bactries

isoles


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Prlvements uni- ou pauci-microbiens


isoles


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Prlvements plurimicrobiens


isoles


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Conclusion 24h ou 48h

(bactries usuelles)

Identification prsomptive

Staphylocoque Streptocoque Bacille Gram - Anarobie

- coagulase ngative

- dor

--hmolytique

--hmolytique groupage

- non hmolytique

- entrobactrie

- oxydase + pyocyanique

- typeHaemophilus sp.

-


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Identification dfinitive

Proprits biochimiques (mtabolismerespiratoire, glucidique, enzymatique): galeriesadaptes

Constituants antigniques (agglutination)

+/- biologie molculaire


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Interprtation

Prlvements monomicrobiens:

provenant de sites normalement striles (sang, urine, LCR,tissus...)

dinterprtation assez facile Examen direct capital, rapide, trs informatif

Prlvements polymicrobiens:

du revtement cutano-muqueux avec flore commensale(gorge, selles, vagin, peau) diagnostic plus difficile: reprer une bactrie pathogne au

milieu de bactries commensales souvent trs abondantes Examen direct peu contributif


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Antibiogramme

Dtermination de la sensibilit des bactries auxantibiotiques

Fonction de lespce bactrienne et de lacquisition demcanismes de rsistance aux ATB

Adaptation dutraitement antibiotique


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Recherche dantignes solubles

Avantages : prcocit, simplicit, rapidit, diagnostic

tardif Sensibilit variable

Urines : pneumocoque, Legionella pneumophila

LCR Selles : toxines de Clostridium difficile

Inconvnient : pas disolement de la bactrie


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Exemple : antignurie

Legionella pneumophilatype 1


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Nouvelles techniques de diagnostic

par biologie molculaire La bactriologie traditionnelle peut tre prise

en dfaut:

Culture impossible (traitement antibiotique pralable,Treponema) Culture trop complexe (Chlamydia trachomatis) Culture trop lente par rapport lurgence

(Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitidis, )

On utilise alors lamplification gnique par PCR(Polymerase Chain Reaction) de squencesbacteriennes.


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Arbre phylogntique

extraction Taq pol

PCR(20 - 60 cycles)

Bactrie

Biopsie tissulaire

lectrophorse

M.W.

1 2

ADN

Banquede donnes

squenage


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Diffrents types de PCR: PCR universelle: dtection et identification des

microorganismes dans les prlvements

biologiques ou aprs isolement (ARN 16S)

PCR spcifique: dtection et identification dune espce bactrienne

partir de prlvements biologiques ou aprsisolement (gne spcifique despce)

Epidmiologie: dtection de gnes de rsistance oude virulence


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Plan

1. Gnralits



2.2.3 Mthodes molculaires 3. Diagnostic indirect: srodiagnostic


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Serodiagnostic

Indications: Infection due une bactrie croissance difficile ou

impossible

Infection dcapite par les antibiotiques Diagnostic rtrospectif dune infection rcente

tudes pidmiologiques : sroprvalence

Principe: les bactries expriment des antignes(Ag), qui induisent une rponse immunitairespcifique (apparition danticorps)


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Cintique de production des Ac

IgM

IgG

semaines mois annes

Titre desanticorps

temps

Exposition lagentinfectieux

Rponse diffre(8-10 j)

Ac spcifiquesIgG/IgM

Rexposition lagentinfectieux

Ascensionimmdiate

Ac spcifiques IgG

Taux rsiduel bas

Taux rsiduel lev


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Principales srologies bactriennes

Bactries responsables dinfections pulmonaires Chlamydia pneumoniae

Legionella pneumophila

Mycoplasma pneumoniae

Bactries responsables dinfections gnitales Chlamydia trachomatis

Treponema pallidum

Bactries responsables de maladies dissmines difficiles cultiver

Brucellose

Maladie de Lyme


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Conclusion : diagnostic

dune maladie bactrienne

Faisceau darguments clinico-biologiques Examen direct parfois suffisant

Diagnostic indirect parfois seul recours enroutine

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