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PARTIE I : Chapitre II / Acides amins, Peptides et Protines

1. Dfinition-Formules gnrales...

2. Rle des acides amins...............

3. Classification des acides amins.

4. Autres classifications des aminoacides..

5. Les acides amins non standards...

Aminoacides subissant une modification post-traductionnelle (protiques non standards)

Autres aminoacides (non protiques non standards)

6. Proprits des acides amins.....

6.1. Chiralit-Activit optique...

6.2. Spectre dabsorption de la lumire

6.3. Solubilit...

6.4. Proprits ioniques...

7. Mthodes danalyse des acides amins..

7.1. Chromatographie changeuse dion...

7.2. Electrophorse..

AA

AACCIIDDEESS AAMMIINNEESS


Sur un ensemble de quelques 300 aminoacides, pour le moment inventoris, seuls 20 de ceux

ci composent les protines en tenant compte du fait que certains aminoacides non standard,

trouvs dans les protines, sont modifis aprs la traduction (modification post-

traductionnelle).

Les noms de ces 20 aminoacides, dont le dernier tre caractris fut la thronine en 1935,

n'obissent aucune nomenclature et voquent soit leurs sources, soit leurs proprits

physiques ou encore un quelconque caractre analytique.

On a l'habitude d'utiliser des abrviations trois lettres ou une lettre pour cette srie de vingt

aminoacides.

1. Dfinition-Formules gnrales (Fig. II-01)

Les aminoacides ont en commun d'tre des molcules organique bifonctionnelles portant un

groupement amine (primaire) sur le carbone porteur du groupement carboxyle, dit carbone .

La fonction amine est une base et la fonction carboxyle est un acide (fonctions ionisables).

Ce sont des acides -amins (ou encore 2-amino-acides), exception pour la proline qui a une

amine secondaire (acide -imin). ( noter que la masse moyenne dun acide amin est

denviron 110 Da). Dans les valeurs de pH physiologique, les groupes acide carboxylique et

amino de l' -acide amin sont tous deux compltement ioniss (Fig. II-01). Un acide amin

peut donc agir la fois comme un acide ou une base. Les acides amins sont ainsi qualifis de

substances amphotriques ou ampholytes. Des molcules porteuses de groupes chargs de

polarit oppose sont appeles zwitterions ou ions dipolaires (Fig. II-01).

2. Rle des acides amins

Les acides -amins jouent un rle fondamental en biochimie comme constituants

lmentaires des protines : ils polymrisent en formant des liaisons peptidiques qui

aboutissent de longues chanes macromolculaires appeles peptides.

La dgradation des acides amins peut fournir aussi de lnergie, mais ils ne sont pas

stocks diffrence des sucres et des acides gras.

Les acides amins sont utiliss pour la synthse de molcules telles que hormones,

neurotransmetteurs etc. (ex. thyroxine, srotonine), comme mdiateur des ractions

allergiques (ex. histamine), cycle de lure (ex. citrulline et ornithine), coenzyme, antibiotique

(ex. cyclosrine et l'azasrine) etc.

3. Classification des acides amins (Fig. II-03-04)

Sept groupes d'aminoacides peuvent tre dfinis par rapport leurs chanes latrales :

a) Les acides amins chane aliphatique (aa neutre):

Glycine Alanine Valine Leucine Isoleucine

Les chanes aliphatiques plus grandes sont hydrophobes et ont tendance sagglomrer. La

structure tridimensionnelle des protines hydrosolubles est stabilise par le regroupement des

chanes latrales hydrophobes.

b) Les acides amins chane latrale aromatique :

Phnylalanine Tyrosine Tryptophane

Ces trois acides amins sont trs hydrophobes.

c) les acides amins soufrs :

Cystine Mthionine


Les chanes latrales contenant du soufre sont hydrophobes. Le groupe sulfhydryle de la

cystine est trs ractif et joue un rle spcial dans larchitecture de certaines protines en

formant des liaisons disulfures.

d) Les acides amins hydroxyls :

Srine Thronine

Ces acides amins sont hydrophiles.

e) Les acides amins basiques :

Lysine Arginine Histidine

La lysine et larginine sont charges positivement PH neutre. Lhistidine est rencontre dans

le site actif des enzymes ou son noyau imidazole peut osciller entre 2 tats afin de catalyser la

formation ou la rupture de liaison.

f) Les acides amins dicarcoxyliques et leurs amides :

Aspartate Glutamate Asparagine Glutamine

g) iminoacide, la proline :

Elle a une fonction amine secondaire (chaine latrale cyclique, Le groupe -amino est engag

dans une structure cyclique).

Elle est souvent rencontre dans les coudes bta des chanes protiques reployes.

4. Autres classifications des aminoacides

Par rapport la structure et la fonction des peptides et des protines, la classification des

aminoacides a t faite en tenant compte essentiellement des interactions de l'aminoacide avec

son environnement, c'est--dire les liaisons faibles: liaisons lectrostatiques, hydrogne,

interactions hydrophobes. On distingue trois classes sur le critre de la polarit de la chane

latrale (R) :

- R apolaire (hydrophobe)

Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Phe, Trp

- R polaire mais non charg pH physiologique (hydrophile)

Ser, Asn, Thr, Gln

- R polaire et charg (plus ou moins hydrophile selon le pH)

Asp, Glu, Cys, Tyr, Lys, His, Arg

Les animaux suprieurs sont incapables de biosynthtiser la totalit de ces aminoacides.

Chez l'homme, Iso, Leu, Lys, Met, Phe, Trp, Thr et Val doivent tre apports par la ration

alimentaire, ils sont qualifis d'indispensables (essentiels). A ceux-ci, on peut ajouter des

aminoacides essentiels que l'organisme synthtise une vitesse trop lente : l'arginine et

l'histidine, qui sont indispensables pour le nouveau-n ou l'enfant. Le reste sont dit acides

amines dite non essentiels car l'organisme humain les synthtise par des voies mtabolique

appropries.

5. Les acides amins non standards (Fig. II-06)

Les acides amins non standard sont soit :

- acide amin d'une protine modifi aprs la traduction (modification post-traductionnelle)

- des intermdiaires de la biosynthse d'autres aminoacides, des lments de construction

d'autres molcules (lipides, coenzymes) ou encore des molcules actives.


Aminoacides subissant une modification post-traductionnelle (protiques non standards)

Ces modifications peuvent concerner dans les protines, les groupes des extrmits terminales

ou ceux qui appartiennent la chane latrale. Citons titre dexemple : 4-hydroxyproline, 5-

hydroxylysine, -carboxyglutamate, desmosine etc.

Autres aminoacides (non protiques non standards)

Citons quelques drivs importants :

Les drivs obtenus par dcarboxylation :

- histidine dcarboxyle en histamine qui entre en jeu dans les ractions d'inflammation et

dallergie

- acide glutamique dcarboxyl en 4-aminobutanoique (GABA) qui est un neurotransmetteur

Chez les mammifres, citons :

- l'ornithine (homologue 5 carbones de la lysine) et la citrulline (driv amide du prcdent)

sont des intermdiaires du cycle qui convertit dans le foie l'ion ammonium en ure.

- la taurine est un acide 2-aminosulfonique (oxydation de la cystine en acide cystique puis

dcarboxylation de ce dernier) qui entre dans la composition des sels biliaires ncessaires

l'absorption des lipides.

Chez les plantes, champignons et bactries, citons :

- le poison -cyanoalanine, scrt par des plantes et des champignons

- la bactrie Streptomyces scrte des antibiotiques comme la D-cyclosrine et l'azasrine,

cette dernire est employe dans des thrapeutiques pour ses proprits antifongique et

antitumorale.

6. Proprits des acides amins

6.1. Chiralit-Activit optique (Fig. II-02)

Tous les acides amins, sauf la glycine, ont un carbone chiral au centre, puisque ce carbone

central est li quatre groupes diffrents (R, H, COOH, NH2). Cest donc un centre chiral

dont la conformation dfinira les stroisomres, isomres optiques pouvoir rotatoire

spcifique oppos. Chacun des acides amins, sauf la glycine, existent donc sous la forme de

deux nantiomres (formes L et D qui sont l'image miroir l'une de l'autre). Les deux

nantiomres sont dfinis de la mme manire que pour les oses en prenant le glycraldhyde

comme rfrence dans la reprsentation de Fischer. Comme c'est le cas avec la plupart des

exemples de ce type, la nature synthtise et utilise seulement un des deux nantiomres de

chacun des acides amins, soit la forme L. Tous les acides amins qui constituent les protines

du corps humain sont de la forme nantiomrique L. Les acides amins de la forme D sont

extrmement rares dans la nature. Certains sont retrouvs au niveau de la paroi cellulaire de

certaines bactries. Ces acides amins sont le rsultat de modifications post-traductionnelles.

Comme pour les oses, aucune prdiction du pouvoir rotatoire ne peut tre faite : un amino

acide de la srie L peut tre lvogyre ou dextrogyre. Le carbone 3 () de la thronine et de

l'isoleucine est aussi un centre chiral : leur nantiomre (L) existera sous deux formes

pimres. On affecte le prfixe "allo" l'pimre que l'on ne trouve pas dans les protines

La racmisation est le passage d'un nantiomre un autre. Certains microorganismes

peuvent utiliser ou produire des aminoacides D, par exemple les antibiotiques peptidiques

scrts par des bactries :

- une D-Phe dans la gramicidine S et la tyrocidine A

- 6 aminoacides D (D-Leu et D-Val) sur les 15 de la gramicidine A.


Cette particularit augmente la rsistance de ces peptides la dgradation par des enzymes

protolytiques dont une spcificit est d'agir que sur des aminoacides de srie L.

Une solution d'aminoacide L volue trs lentement vers un l'quilibre racmique. Aprs la

mort d'un organisme vivant qui ne contient que des aminoacides de srie L, on aura une

volution lente vers l'quilibre racmique pour chacun d'entre eux : l'valuation du rapport

D/L de l'acide aspartique est utilise comme mthode de datation de fossiles.

6.2. Spectre dabsorption de la lumire

- les aminoacides n'absorbent pas la lumire visible, leurs solutions sont incolores.

- les bandes d'absorption dans l'infrarouge sont caractristiques de leurs chanes latrales

- les chanes latrales aromatiques des aminoacides ont des spectres d'absorption

caractristiques dans l'ultraviolet moyen :

Spectres d'absorption des aminoacides aromatiques dans l'ultra-violet

La phnylalanine absorbe peu et le tryptophane est 4 fois plus absorbant que la tyrosine au

maximum d'absorption, proche de 280 nm. Cette proprit est trs souvent utilise pour le

dosage des peptides et des protines.

Remarquons que l'absorption de la tyrosine dans l'UV sera dpendante de l'tat d'ionisation du

phnol et par consquent du pH.

6.3. Solubilit

Gnralement les acides amins sont solubles dans l'eau, pas dans les solvants organiques (la

nature du radical peut cependant modifier cette solubilit).

La solubilit des aminoacides dans l'eau (de un gramme une centaine par litre) va dpendre

essentiellement de deux facteurs :

- le double groupement fonctionnel commun qui peut s'ioniser et donc favoriser la dissolution

- la chane latrale qui peut avoir un caractre plus ou moins polaire ou apolaire.

La solubilit dans les solvants organiques est faible de quelques mg/L et encore moins dans

les solvants plus apolaires. En prsence de deux phases liquides (thanol/eau), les

aminoacides se rpartissent dans les deux phases avec des coefficients de partage spcifique :

cette proprit est utilise pour les classer.

6.4. Proprits ioniques (Fig. II-07-08)

Lorsque l'acide amin est libre, il a au moins deux groupements fonctionnels sur le mme

carbone et pour certains un troisime sur la chane latrale.

L'un des deux groupements est un acide (carboxylique) et l'autre est une base (amine). C'est

une molcule amphotre. Les aminoacides qui portent au moins une fonction carboxylique et

une fonction amine se prsenteront en solution aqueuse sous diverses formes en quilibre,

charges positivement ou ngativement.


Nous pouvons faire la remarque importante suivante :

- pI, le point isolectrique est un pH intermdiaire o un acide amin est neutre et na aucune

charge.

- pour un pH infrieur la valeur du pI, la charge nette moyenne de l'aminoacide est

positive - pour un pH suprieur la valeur du pI, la charge nette moyenne de l'aminoacide est

ngative

Aminoacides chane latrale ne comportant pas de groupe ionisable

Les pK des groupes -COOH et -amin sont trs diffrents, celui correspondant l'acide

tant beaucoup plus faible. Les quilibres successifs de dissociation s'crivent avec les

constantes individuelles de dissociation (gales aux constantes successives dans ce cas).

La forme qui porte une charge nette nulle est un ion mixte ou bipolaire ou encore zwitterion.

Dans ce cas le pI = pK-COOH + pK-NH2/2

- pour un pH < pI, l'aminoacide a une charge totale nette moyenne positive

- pour un pH > pI, l'aminoacide a une charge totale nette moyenne ngative

Aminoacides chane latrale comportant une fonction acide

Dans le cas d'une fonction carboxylique, le phnomne d'ionisation est reprsent par les

quilibres successifs suivants (le pK du COOH de la chane latrale est plus lev que le pK

du -COOH et plus faible que le pK de l' -amine) :

Dans ce cas le pI = pK-COOH + pKR-COOH/2

Contrairement aux aminoacides chane latrale ne comportant pas de fonctions ionisables, il

n'y a pas de zone isolectrique pour l'acide glutamique : la forme portant une charge nette

nulle est au centre des deux quilibres correspondant aux deux fonctions carboxyliques et

leurs pK ont des valeurs trop proches. Il en est de mme pour l'acide aspartique.

Aminoacides chane latrale comportant une fonction base

Ces aminoacides portent une amine sur leur chane latrale. Le phnomne d'ionisation est

reprsent par les quilibres successifs suivants (le pK de la fonction -amine est plus faible

que celui de la fonction R-amine) :

Dans ce cas le pI = pK-NH2 + pKR-NH2/2

Contrairement aux aminoacides chane latrale ne comportant pas de fonctions ionisables, il

n'y a pas de zone isolectrique pour la lysine : la forme portant une charge nette nulle est au

centre des deux quilibres correspondant aux deux fonctions amines et leurs pK ont des

valeurs trop proches. Il en sera de mme pour l'histidine et l'arginine avec toutefois une

"petite" zone isolectrique puisque les deux quilibres concerns ont des valeurs de pK

diffrentes de 3 units.

Dans l'criture des quilibres successifs, il faut remarquer que, pour l'histidine, la fonction R-

amine perdra son proton avant celle -amine.

Rcapitulatif des pK des fonctions ionisables


7. Mthodes danalyse des acides amins

L'extraction des acides amins libres peut se faire simplement l'eau, puisqu'ils sont solubles.

On les spare sur des colonnes changeuses d'anions ou de cations (chromatographie

changeuse dion), c'est dire en fonction de leur caractre acide ou basique un pH donn :

on recueille ainsi trois fractions, acide, basique et neutre.

La sparation fine se fait gnralement par chromatographie (papier, basse ou haute pression,

CCM,). On utilise frquemment l'lectrophorse (sur papier) pour analyser les acides

amins.

7.1. Chromatographie changeuse dion

C'est en 1951, l'institut Rockefeller (universit de New York) que Stanford Moore et

William Stein dcrivent la mthode de chromatographie d'change d'ions en utilisant comme

support du polystyrne sulfonat pralablement quilibr avec une solution de NaOH.

Grce cette mthode, ils ont pu dterminer le site actif de la Ribonuclase bien avant que

l'on puisse tablir sa structure tridimentionnelle. Ils ont ainsi montr que ce site tait constitu

de 2 rsidus spcifiques de l'histidine.

La chromatographie changeuse dions se ralise sur des rsines (matrice insoluble) charges

lectriquement. Gnralement, elles se font sur des rsines sur lesquelles des groupements de

charges positives ou ngatives sont lies par covalence. Les acides amins sparer (en

solution) sont passes sur ces rsines. Ils y adhrent s'ils sont de charge oppose au support.

La rsine (dans une colonne) insoluble porte des charges ioniques qui retiennent les molcules

de charges opposes. Les matrices gnralement utilises pour sparer des protines sont le

DiEthylAminoEthyl Cellulose (DEAE-Cellulose) qui est charg positivement (+) et la

CarboxyMthyl Cellulose (CM-Cellulose) et la Phosphocellulose qui sont charges

ngativement (-). Le premier cas donne lieu une chromatographie changeuses d'anions. Le

second cas correspond une chromatographie changeuse de cations.

Rsine changeuse Ions fixs Charges lectriques rsine

d'anions (-), exemple: DEAE-cellulose anions (-) positives (+)

de cations (+), exemple: CM-cellulose cations (+) ngatives (-)

La force d'association entre les molcules charges et la matrice dpend de la force ionique et

du pH de la solution d'lution (solution tampon).

Le passage sur la colonne d'une solution luante, plus charge que la rsine entre en

comptition avec la rsine. Ceci permet de dcrocher les lments fixs.

Ainsi, pour la chromatographie des acides amins, ceux ci seront spars en fonction de leur

charge lectrique. Les lus (non fixs la colonne) seront ceux de mme charge que la

rsine. Tandis que ceux de charge oppose seront fixs. Plus lacide amin a un pHi loign

du pH du milieu, plus il sera acide ou basique par rapport celui-ci, donc dautant plus

charg. Il sera le premier tre lu ou fix, s'il est ou nest pas de mme charge que la rsine,

respectivement.

La chromatographie d'change d'ions se ralise en 4 tapes:

Premire tape: la rsine est quilibre dans un tampon dont le pH est tel que le groupement

port par l'changeur d'ions soit ionis.

Deuxime tape: dpot des molcules sparer sur la colonne. La solution est dans le mme

tampon de pH qui a permis dioniser l'changeur d'ions.


Troisime tape: lution des molcules fixes sur la rsine soit en modifiant le pH de la

phase mobile de telle sorte que les molcules qui sont charges ne le soient plus (pHi de

chaque acides amins) ou qu'elles portent une charge de mme signe que l'changeur d'ions. Il

n'y a plus alors d'interaction lectrostatique entre les molcules et le groupement charg port

par la rsine. Soit, en ajoutant un sel ( une concentration croissante) qui apporte forcment

un ion de mme charge que les molcules fixes la rsine: cet ion s'appelle un contre-ion.

Quatrime tape: rgnration de l'changeur d'ions (par lavage extensif avec une solution

de pH permettant de remettre les charges dans leur valeur initiale).

Chromatogramme dchange dion

Les applications de la chromatographie d'change d'ions : Cette technique est utilise pour sparer des molcules ionisables, quelle que soit leur taille

comme des ions minraux, acides amins, peptides, protines, nuclotides, acides nucliques,

glucides ioniss et lipides ioniss.

7.2. Electrophorse

Llectrophorse est - avec la chromatographie - la principale des techniques utilises en

biologie pour la sparation et la caractrisation des molcules. Elle a quelques applications en

chimie, mais est principalement utilise en biochimie ou biologie molculaire pour la

sparation des acides amins, des protines, des acides nucliques ou toutes molcules

charges.

On appelle lectrophorse, la migration des substances (acides amins, peptides, protines,

acides nucliques etc.) dissoutes ou en suspension dans un solvant sous l'action d'un champ

lectrique. Elle peut avoir lieu en phase liquide ou sur un support imprgn d'un lectrolyte

support convenablement choisi (acides amins/papier, protines/gel polyacrylamides, acides

nucliques/gel dagarose). L'lectrophorse peut tre utilise des fins de chimie prparatrice

ou analytique, et dans ce dernier cas, des buts, tant qualitatifs que quantitatifs.

Le support est plac dans une solution tamponne (pH choisi convenablement) et soumis un

champ lectrique. En fonction du pH et du champ, les acides amins migrent dans un sens,

dans l'autre, ou restent au niveau du dpt.

pH=1 pH=13 Gradient de pH de la

solution tampon (luant)

Temps de rtention Tr0 Trt

TrGlu/pHiGlu

TrAla/pHiAla


En solution aqueuse, les acides amins se prsentent comme un mlange de diffrentes formes

ionises: cation, anions et zwitterion. La forme prdominante et, par consquent, le sens de

migration de l'acide amin dpendent donc du pH de la solution tampon.

Montage simple dune lectrophorse sur papier

On appelle mobilit d'un ion, la vitesse limite atteinte par cet ion dans un champ lectrique

unitaire. Si on tablit une diffrence de potentiel entre les extrmits d'une bande de papier

imprgne par un lectrolyte convenable, une goutte de solution contenant les acides amins

sparer tant dpose sur la bande, les constituants ioniques se dplacent sous l'action du

champ lectrique avec leurs vitesses propres. Les dplacements peuvent tre suivis et mesurs

aprs rvlation par la ninhydrine dans le cas des acides amins (bleu de comassi pour

protines et bromure dthudium pour les acides nucliques).

Electrophorgramme acides amins

En rsum, la technique de l'lectrophorse est fonde sur le dplacement d'ions (molcules

charges positivement ou ngativement) sous l'effet d'un champ lectrique. Du fait de leurs

caractristiques propres et en fonction des conditions de l'lectrophorse ces ions auront des

vitesses de migration diffrentes, ils vont donc se sparer les uns des autres.

Les molcules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molcules cationiques (+) se

dplacent vers la cathode (-).

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