CLAUDIO HENRIQUE MAGALHÃES ARANHA · 2011-08-09 · Biológicas da UFOP pelo constante apoio e...

CLAUDIO HENRIQUE MAGALHÃES ARANHA

INFLUÊNCIA DA SENESCÊNCIA SOBRE ASPECTOS

HISTOPATOLÓGICOS HEPÁTICOS E ESPLÊNICOS NA

ESQUISTOSSOMOSE MANSONI MURINA

GOVERNADOR VALADARES

AGOSTO DE 2009





Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Imunopatologia das Doenças Infecciosas e Parasitárias.

ORIENTADORA: Drª Elaine Speziali

CO-ORIENTADORAS: Drª Cláudia Martins Carneiro

Drª Alda Maria Soares Silveira

GOVERNADOR VALADARES AGOSTO DE 2009





Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Imunopatologia das Doenças Infecciosas e Parasitárias.

Governador Valadares, ___ de ________________ de ______.

Banca Examinadora:

_____________________________________________ Examinador(a)

____________________________________________ Examinador(a)

Dedico esse trabalho a Deus, Pai sempre presente,

por me dar forças e me permitir buscar a felicidade

e a meus pais por sempre estarem ao meu lado,

me mostrando o caminho certo,

e me ajudarem incondicionalmente nessa busca.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, professora doutora Elaine Speziali, cuja orientação permitiu a realização

deste estudo.

Às minhas co-orientadoras, professora doutora Cláudia Martins Carneiro e Alda Maria Soares

Silveira, pelas informações, ensinamentos e pela amizade.

Aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Imunologia da UNIVALE e do Laboratório de

Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Instituto de Ciências Exatas e

Biológicas da UFOP pelo constante apoio e incentivo.

Aos professores do curso de Mestrado em Ciências Biológicas da UNIVALE pelos

ensinamentos que contribuíram para meu crescimento e formação profissional.

À minha irmã Thereza pelo exemplo em toda vida.

Aos meus pais e familiares, por sempre acreditarem em mim.

Àqueles participantes deste estudo, pela oportunidade de me integrar ao projeto e adquirir

conhecimento.

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

EXECUÇÃO DO TRABALHO:

Laboratório de Pesquisa em Imunologia da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE),

Governador Valadares, MG.

Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Instituto de

Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto (NUPEB – ICEB -

UFOP), Ouro Preto, MG.

COLABORADORES:

Dra. Ana Maria Caetano de Faria

Depto de Bioquímica e Imunologia - UFMG

Dr. Paulo Marcos Z. Coelho

Centro de Pesquisas René Rachou – Fiocruz- MG

Dra. Andréa Teixeira de Carvalho

Centro de Pesquisas René Rachou

Dr. Olindo Assis Martins Filho

Centro de Pesquisas René Rachou- Fiocruz- MG

Dra. Débora Negrão Corrêa

Grupo Intradepartamental de Estudos sobre Esquistossomose (GIDE) - UFMG

ÓRGÃOS FINANCIADORES:

Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG

Centro de Pesquisas René Rachou – CPqRR / FIOCRUZ

Fundação Oswaldo Cruz/Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –

FIOCRUZ/CNPq (PAPES IV)

Universidade Vale do Rio Doce – UNIVALE

RESUMO

A senescência e o processo de envelhecimento são o resultado complexo de interações entre a

genética do indivíduo e o meio ambiente. Esse processo é marcado por alterações funcionais

bem descritas tanto em humanos quanto em uma variedade de animais, principalmente em

roedores. As alterações funcionais e estruturais dos tecidos associadas ao processo de

envelhecimento indicam uma menor capacidade de fornecer um ambiente propício para

respostas imunes. Essas alterações são observadas em infecções por doenças parasitárias e a

esquistossomose é uma das doenças parasitárias humanas de maior distribuição, acometendo

histopatologicamente o fígado e o baço. Evidenciam-se diferenças em aspectos relacionados

tanto à prevalência quanto à intensidade de infecção da esquistossomose com o

envelhecimento. O modelo murino é importante nesse aspecto, pois apresenta semelhanças

aos acometimentos demonstrados em humanos e vantagens para realização dos estudos. O

objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da senescência sobre os aspectos

histopatológicos hepáticos e esplênicos na esquistossomose mansoni murina. Os resultados

demonstraram que jovens apresentam maior número de granulomas hepáticos na fase crônica

em relação aos jovens na fase aguda. Em relação à área dos granulomas hepáticos, jovens na

fase crônica apresentaram granulomas com menor área que jovens na fase aguda e que idosos

na fase crônica. Quanto ao processo inflamatório no fígado, idosos na fase aguda

apresentaram maior inflamação que jovens na mesma fase de infecção. Em relação à

neoformação de colágeno, no tecido hepático não houve diferença entre os grupos de animais

infectados jovens e idosos. Entretanto, no baço, animais idosos na fase aguda de infecção

apresentaram maior neoformação de colágeno que jovens na mesma fase. Além disso, animais

jovens na fase crônica da infecção apresentaram maior neoformação de colágeno no baço que

jovens na fase aguda. O estudo fornece evidências que suportam a hipótese de uma

capacidade do organismo senescente de modular sua resposta já no início da infecção por S.

mansoni e uma menor capacidade desse organismo de amplificar sua resposta a novos

antígenos.

Palavras chave: senescência, esquistossomose, granuloma, fígado, baço, inflamação,

colágeno.

ABSTRACT

Senescence and aging are the result of complex interactions between genetic individual and

the environment. This process is marked by functional changes well described both in humans

and in a variety of animals, especially rodents. The functional and structural changes of the

tissues associated with the aging process indicate a lower capacity to provide an environment

conducive for immune responses. These changes are observed in infections and parasitic

diseases and the schistosomiasis is a human parasitic diseases of major distribution, affecting

histopathologically the liver and spleen. Are striking differences in aspects related to both

prevalence and intensity of schistosomiasis infection with aging. The mouse model is

important in this aspect, because it shows similarities to the affection demonstrated in humans

and advantages for the studies. The aim of this study was to evaluate the influence of

senescence on the histopathological hepatic and splenic aspects of the murine schistosomiasis

mansoni. The results showed that young animals have a higher number of hepatic granulomas

in chronic phase in comparison to animals in the acute phase. Regarding the area of the

hepatic granulomas, animals in chronic phase showed smaller granulomas area than youth in

the acute phase and than elderly animals in chronic phase. On the hand, elderly animals in the

acute phase showed more inflammation than young animals in the same stage of infection.

Regarding the neoformation of collagen, in the liver tissue, there was no difference between

young and old infected groups. However, in the spleen, the elderly animals in the acute phase

of infection had higher neoformation of collagen than young animals in the same phase.

Furthermore, young animals in the chronic phase of infection showed larger amount of

neoformation of collagen in the spleen than young animals in the acute phase. The study

provides evidence supporting the hypothesis that a senescent organism has the ability to

modulate its response in the early phase of the infection by S. mansoni and has also a lower

capacity to amplify its response to new antigens.

Key words: senescence, schistosomiasis, granuloma, liver, spleen, inflammation, collagen.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens e idosos infectados por

Schistosoma mansoni-------------------------------------------------------------------------------------- 31

Figura 2 – Fotos da quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens e idosos

infectados por Schistosoma mansoni-------------------------------------------------------------------- 32

Figura 3 – Determinação da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens e idosos


Figura 4 – Fotos da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens e idosos


Figura 5 – Análise da inflamação no fígado de camundongos jovens e idosos infectados por

Schistosoma mansoni-------------------------------------------------------------------------------------- 36

Figura 6 – Fotos da inflamação no fígado de camundongos jovens e idosos infectados por Schistosoma

mansoni------------------------------------------------------------------------------------------------------ 37

Figura 7 – Análise da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens e idosos infectados

por Schistosoma mansoni---------------------------------------------------------------------------------- 39

Figura 8 – Fotos da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens e idosos infectados


Figura 9 – Análise da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens e idosos infectados


Figura 10 – Fotos da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens e idosos infectados


Figura 11 – Análise dos dados parasitológicos referentes à infecção por Schistosoma mansoni em

animais idosos e jovens------------------------------------------------------------------------------------ 44

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------------------------------- 10

2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA-------------------------------------------------------- 20

3 OBJETIVO GERAL---------------------------------------------------------------------------- 22

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS----------------------------------------------------------------- 22

4 METODOLOGIA------------------------------------------------------------------------------- 23

5 RESULTADOS---------------------------------------------------------------------------------- 30

5.1 NÚMERO E TAMANHO DE GRANULOMAS HEPÁTICOS DE CAMUNDONGOS

JOVENS E IDOSOS ------------------------------------------------------------------------------ 30

5.2 ANÁLISE DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA PRESENTE NO FÍGADO DE

CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS------------------------------------------------------ 35

5.3 ANÁLISE DA NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO FÍGADO DE

CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS------------------------------------------------------- 38

5.4 ANÁLISE DA NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO BAÇO DE CAMUNDONGOS

JOVENS E IDOSOS------------------------------------------------------------------------------- 41

5.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS---------------------------------------- 44

6 DISCUSSÃO------------------------------------------------------------------------------------ 45


JOVENS E IDOSOS ----------------------------------------------------------------------------- 47


CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS----------------------------------------------------- 50

6.3 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO FÍGADO DE


6.4 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO BAÇO DE


6.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS--------------------------------------- 53

7 CONCLUSÃO---------------------------------------------------------------------------------- 54

REFERÊNCIAS----------------------------------------------------------------------------------- 55

10

1 INTRODUÇÃO

1.1 ALTERAÇÕES ASSOCIADAS AO PROCESSO DE ENVELHECIMENTO

O envelhecimento é o resultado complexo de interações entre a genética do indivíduo e

o meio ambiente no qual está inserido. Esse processo afeta uma grande variedade de funções

fisiológicas, incluindo o desenvolvimento e manutenção do sistema imune. O processo de

senescência, como fonte de alterações funcionais, tem sido bem descrito em humanos e em

uma variedade de espécies animais, principalmente em roedores. Essas modificações podem

ser observadas tanto nos órgãos linfóides quanto em células do sistema imune. Um dos

principais efeitos do envelhecimento pode ser observado no timo. Tal órgão representa o sítio

de maturação dos linfócitos T a partir de seus precursores da medula óssea. O timo é dividido

em medula interna e córtex externo, sendo a ultima, a porção que sofre atrofia com o processo

de senescência. A atrofia tímica associada ao progressivo envelhecimento, leva a redução do

tecido tímico funcional e ao declínio na geração de células T aí presentes (Takeoka et al.,

1996;Gruver et al., 2007;Jenkinson et al., 2008).

Há evidências na literatura de que o envelhecimento também estaria relacionado a

mudanças arquiteturais nos tecidos linfóides secundários como o aumento do peso do baço

devido à infiltração de fibroblastos, além da diminuição do córtex linfóide e dos centros

germinativos com a idade. Além disso, nos linfonodos há um declínio nas zonas medular e

paracortical, aumento do tecido adiposo e uma menor evidência de formação de centros

germinativos em idosos. Essas mudanças indicam uma menor capacidade de fornecer um

ambiente propício para respostas imunes, mas o impacto disso na resposta efetiva ainda é

desconhecido (Gruver et al., 2007).

Existem relatos de alterações no fenótipo das células T periféricas com a idade em

modelo murino. Tais alterações poderiam incluir mudanças em receptores de adesão (CD44),

receptores ligados a migração de linfócitos para linfonodos periféricos (CD62L) e marcadores

característicos dos fenótipos de “memória” ou “virgem” (CD45R) das células T CD4+ e

CD8+. Connoy e colaboradores (2001) encontraram mudanças associadas ao envelhecimento

na composição de esplenócitos (em murinos), incluindo aumento na freqüência de células B e

células TCD4 de memória, diminuição nas células T γ/δ e células T CD4 virgem. Outras

mudanças também foram documentadas em células do sistema imune de camundongos

11

associadas ao envelhecimento, tais como mudanças na quantidade de linfócitos T CD4+ e na

proporção de células CD4+/CD8+ em tecidos periféricos (Ernst et al., 1993;Barrat et al.,

1995;Kurashima and Utsuyama, 1997;Timm and Thoman, 1999;Gruver et al., 2007;Pinchuk

and Filipov, 2008).

Como relatado anteriormente, há uma modificação no percentual de células T virgens e

de memória na periferia. Há relatos de que células T virgens de camundongos idosos exibam

uma ativação, diferenciação e produção de citocinas reduzidas. Especificamente, células Th1

e Th2 de memória derivadas de células T virgens de animais idosos produzem muito menos

IL-2, IL-4 e IL-5, respectivamente, que células jovens (Haynes et al., 2003;Haynes et al.,

2005). O aumento dramático na produção constitutiva de IL-6 e IL-10 observada em animais

e humanos idosos parece estar relacionado a vários distúrbios na reatividade imunológica

relacionados ao processo de senescência (Daynes et al., 1993). Além disso, observou-se que

as alterações no perfil de citocinas relacionadas ao envelhecimento ocorrem gradualmente ao

longo da vida do animal ou do indivíduo e não abruptamente no animal já senil (Hobbs et al.,

1993).

Essa alteração no perfil de citocinas produzidas reflete mudanças importantes

observadas durante o envelhecimento como: o acúmulo de linfócitos T expressando um

fenótipo de células ativadas, resultado do processo natural e cumulativo de ativação e da

diminuição no aporte de células virgens do timo; mudanças nas interações com as células

apresentadoras de antígeno que também apresentam alterações com o envelhecimento;

alterações na transmissão de sinais nos linfócitos durante o envelhecimento que poderiam

afetar a forma como o indivíduo ou animal interagem com o ambiente externo, principalmente

no caso de injúrias (Daynes et al., 1993; Hobbs et al., 1993; Gruver et al., 2007).

Uma série de trabalhos tem relatado também modificações na resposta humoral

associadas ao envelhecimento. Essa resposta reduz com a idade, mesmo que não haja

mudanças no número de células B periféricas. Ocorrem modificações no repertório de

anticorpos com o envelhecimento, diminuição na produção de células B virgens na medula

óssea (Shi and Miller, 1992;Miller and Cancro, 2007;Gruver et al., 2007).

A literatura também aponta uma forte associação entre resistência a infecções e

reinfecções por parasitos helmínticos, especialmente por helmintos do gênero Schistosoma e

senescência em humanos (Ndhlovu et al., 1996), entretanto há uma escassez de trabalhos na

literatura com essa associação em camundongos. Foi demonstrado que a prevalência e a

intensidade de infecção, dada pela presença e quantificação, respectivamente, dos ovos nas

fezes ou urina dos indivíduos infectados, aumentam progressivamente com a idade

12

alcançando um pico máximo entre dez e vinte anos. Nas subseqüentes décadas de vida, tanto a

prevalência quanto a intensidade de infecção diminuem progressivamente (Wilkins et al.,

1987;Butterworth et al., 1988;Gryseels, 1994;Fulford et al., 1998;Ouma et al., 1998;Naus et

al., 2003). A explicação para essa característica epidemiológica ainda é controversa. Alguns

autores acreditam que essa diferença se deve a uma mudança de comportamento, ou seja, uma

redução dos níveis de exposição à água contaminada com a idade. Embora haja um consenso

que ocorra uma pequena redução nos níveis de exposição dos indivíduos com a idade, ela é

insuficiente para explicar a grande redução na intensidade de infecção, cuja causa foi

atribuída ao desenvolvimento de uma resistência adquirida com a idade (Butterworth et al.,

1988). Diante dessas evidências, fica clara a necessidade de se estabelecer correlações entre o

processo de senescência e o desenvolvimento das lesões associadas à esquistossomose

(Wilkins et al., 1987;Butterworth et al., 1988;Gryseels, 1994;Fulford et al., 1998;Ouma et al.,

1998;Naus et al., 2003). Além disso, trabalhos que associem o desenvolvimento da morbidade

da esquistossomose com o envelhecimento no modelo murino podem ser muito úteis na

investigação dessa doença, pois vários trabalhos mostram semelhanças tanto no

desenvolvimento da doença, quanto nas alterações associadas ao envelhecimento entre

humanos e murinos.

1.2 A ESQUISTOSSOMOSE MANSONI

A esquistossomose mansônica é uma das doenças parasitárias humanas de maior

distribuição, sendo a segunda doença tropical em importância em todo o mundo, precedida

apenas pela malária (WHO 1985). Cerca de 200 milhões de pessoas estão infectadas e 700

milhões sob risco de infecção, causando em torno de 500 mil mortes anualmente (Chitsulo et

al., 2000;Wilson et al., 2007). É uma doença prevalente em várias regiões do mundo e no

Brasil, particularmente no estado de Minas Gerais, e representa um dos principais problemas

de saúde pública (Savioli et al., 1997;Chitsulo et al., 2000b). De acordo com a Organização

Mundial de Saúde, 74 países são endêmicos para a esquistossomose mansônica (WHO 1985).

No Brasil, cerca de 12 a 14 milhões de pessoas estão infectadas pelo Schistosoma mansoni (S.

mansoni), (Conceição et al., 2007).

13

Além do Schistosoma mansoni, única espécie encontrada no Brasil, outras espécies do

gênero Schistosoma também podem infectar o homem como Schistosoma haematobium,

Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum e Schistosoma mekongi (Neves 2005).

Sua transmissão ocorre pelo contato com água contaminada com a forma infectante do

parasito, a cercária que penetra ativamente na pele do hospedeiro definitivo, perde a cauda e

transforma-se em esquistossômulo. Este migra através da corrente sanguínea e/ou vasos

linfáticos para os pulmões, e localizando-se, posteriormente, na veia porta, onde se

transformam em vermes adultos, macho e fêmea. Nas veias mesentéricas inferiores, os vermes

se acasalam e as fêmeas iniciam a postura de ovos. Cada fêmea elimina aproximadamente 400

ovos por dia na parede de capilares e vênulas, sendo que a maioria chega à luz intestinal (esse

período dura aproximadamente seis dias), onde são eliminados junto com o bolo fecal. Parte

dos ovos fica retido nos tecidos onde se tornam alvo da resposta imune do hospedeiro,

induzindo uma reação inflamatória do tipo granulomatosa. Quando eliminados pelas fezes e

em contato com a água, os ovos eclodem liberando o miracídio que infecta o caramujo, seu

hospedeiro intermediário (Biomphalaria glabrata). No caramujo, há o desenvolvimento do

esporocisto em cercária, a forma infectante da esquistossomose. Ao entrar em contato com a

água contaminada, a cercária penetra na pele do indivíduo reiniciando o ciclo. (BOGLIOLO,

1959;Warren, 1968;Pearce and MacDonald, 2002).

As manifestações clínicas da esquistossomose variam, dependendo da localização e

intensidade do parasitismo, da capacidade de resposta do indivíduo à infecção ou do

tratamento prescrito. A doença em humanos é caracterizada clinicamente pelas fases aguda e

crônica. A fase aguda pode ser dividida em pré e pós-postural. Na fase pré-postural, que

ocorre cerca de 10-30 dias após a infecção e algumas horas após a penetração das cercarias

na pele, observa-se um infiltrado de leucócitos polimorfonucleares ao redor dos parasitos.

Inicialmente, após a penetração das cercárias, pode ocorrer um quadro de dermatite

cercariana, caracterizado por dermatite urticariforme com eritema, edema e prurido (Torres,

1976;Boros, 1989). A fase aguda propriamente dita aparece em torno de 50 dias e dura até

cerca de 120 dias após a infecção. Na fase pós-postural ocorre a disseminação dos ovos,

principalmente na parede do intestino e no fígado, provocando, então, a formação de

granulomas cujo volume pode chegar até 100 vezes o volume do ovo. Os sintomas

característicos desta fase são: febre acompanhada de sudorese, calafrios, emagrecimento,

diarréia, cólica e alterações nas funções hepáticas. Também são observadas lesões

hepatoesplênicas, devidas principalmente a uma reação de hipersensibilidade do hospedeiro

aos antígenos solúveis secretados pelos ovos presentes no fígado. Essa reação que é mais

14

intensa no início da infecção decresce espontaneamente na fase crônica da doença. A fase

crônica apresenta variações clínicas dependendo dos órgãos atingidos. Inicia-se por volta do

6º mês após a infecção e é caracterizada pela redução do tamanho dos granulomas em torno

dos ovos, por uma modulação da reatividade imunológica inflamatória, que aparece de

maneira mais esparsa no fígado e também na mucosa e submucosa do intestino. As principais

formas clínicas da fase crônica são: intestinal, hepatointestinal e hepatoesplênica. A forma

intestinal é a mais freqüentemente encontrada em pacientes infectados. Nesta forma, os

sintomas são geralmente brandos: com perda de apetite, dispepsia e desconforto abdominal.

Embora não existam estudos detalhados relacionados à forma hepatointestinal, pacientes

portadores dessa forma clínica apresentam uma hepatomegalia não associada à

esplenomegalia. A forma hepatoesplênica é a forma mais grave da esquistossomose mansoni e

caracteriza-se pelo aumento considerável do baço e do fígado em conseqüência da fibrose

periportal, central e periférica, que pode levar a complicações significativas como hipertensão

porta e pulmonar (Lambertucci et al., 2000).

O estabelecimento da doença em camundongos infectados também se dá pelo

desenvolvimento de uma resposta granulomatosa, caracterizada pela formação de granulomas,

induzidos por antígenos solúveis do ovo (SEA), compostos por linfócitos T, linfócitos B,

macrófagos, eosinófilos e células epitelióides e gigantes. Ao longo do curso da infecção, na

qual há a passagem da fase aguda (70 dias) para a fase crônica (120 dias) também se observa

a modulação desses granulomas. Os animais apresentam alguns sintomas, tais como diarréia

durante a fase aguda e, pequenas lesões na mucosa intestinal que podem levar a morte através

do seu sangramento. Além disso, observam-se lesões glomerulares e insuficiência renal. Mas,

não são observadas varizes esofageanas. Em relação à hipertensão portal, ela está associada ao

número e tamanho dos granulomas (Wynn et al., 2004).

1.3 ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DA ESQUISTOSSOMOSE

Parasitos adultos de Schistosoma mansoni vivem na vasculatura portal, onde as fêmeas

realizam a ovoposição. Os ovos passam da parede intestinal para o lúmen desse órgão e a

partir daí para meio externo juntamente com as fezes. Além disso, como o sistema porta é

responsável pela irrigação sanguínea do fígado, com a oviposição que ocorre nessa

15

vasculatura muitos dos ovos são transportados para esse órgão (Dunne and Doenhoff,

1983;Amiri et al., 1992;Cheever et al., 2000;Pearce and MacDonald, 2002).

O fígado é um órgão bem localizado e recebe 25% do debito cardíaco e é a maior fonte

de linfa do corpo, contribuindo com 25 a 50% do fluxo do Ducto Torácico. Ele tem sido

considerado um órgão relativamente inerte no seu estado normal, não inflamado, sob ponto de

vista imunológico. Entretanto essa visão tem mudado nos últimos anos. Pesquisadores têm

observado que o fígado possui propriedades distintas (Bertolino et al, 2002 apud Crispe IN &

Mehal WZ, 1996; O’Farrelly C & Crispe IN, 1999; Bertolino P et al, 2000). A função

fisiológica do fígado – tais como remover patógenos e antígenos do sangue, síntese de

proteínas e metabolismo – requer uma resposta imune que é adaptada a essas necessidades e é

localmente regulada (Knolle & Gerken, 2000). A maior parte do suprimento sanguíneo

hepático é provido pela veia Porta, que leva nutrientes, toxinas e antígenos derivados do trato

gastrointestinal, assim como substâncias derivadas do baço. Isso permite que moléculas

absorvidas pelo intestino passem pelo fígado, onde são metabolizadas ou degradadas se

tóxicas. Como o fígado recebe uma variedade de antígenos estranhos, é importante evitar uma

ativação desnecessária do sistema imune. Isso é conseguido através da tolerância a esses

antígenos. O contato com esses antígenos leva a uma tolerância antígeno-específico que

previne uma ativação excessiva do sistema imune evitando dano tecidual. A infecção do

fígado por microrganismos patogênicos deve levar a uma indução de uma resposta imune

efetiva que elimina a infecção e previne o desenvolvimento de cronicidade. Assim, o fígado

parece ser um órgão imune privilegiado que favorece a indução da tolerância periférica assim

como a indução da imunidade (Bertolino et al, 2002; Knolle & Gerken, 2000).

O fígado é constituído principalmente por células hepáticas, os hepatócitos. Estes se

agrupam em placas que se anastomosam entre si formando unidades morfológicas chamadas

lóbulos hepáticos. Estas placas possuem capilares, chamados de sinusóides, que se

caracterizam pelas suas dilatações irregulares. Suas paredes são revestidas de células

endoteliais típicas e macrófagos que, no fígado, recebem o nome de células de Kupffer e

possuem função fagocitária. Além dos hepatócitos e células de Kupffer, o fígado possui um

subtipo incomum de linfócitos; mais de 50% dos linfócitos intra-hepáticos em um fígado de

camundongo normal expressa níveis intermediários de receptor de células T α/β (TCR) e o

marcador de células NK, NK1.1 (células T NK). Uma população equivalente também é

descrita em humanos (Bertolino et al, 2002 apud MacDonald, 2002; Bertolino et al, 2002

apud Doherty et al, 1999). Essa intrigante população de células T NK é também encontrada

com alta freqüência no timo e medula óssea. A maioria das células T CD4+NK são CD1-

16

restritas e podem prontamente secretar ambos os tipos de citocinas Th1 e Th2 após o estímulo

(Bendelac et al, 1997). A interação entre essas diferentes populações celulares encontradas no

fígado e os antígenos liberados pelos ovos do parasito, também presentes nesse órgão,

favorece uma adequada modulação da resposta granulomatosa desenvolvida durante o

processo da esquistossomose. Além disso, recentes relatos têm mostrado que a falta de células

T NK favorece a autoimunidade, entretanto a função dessas células no fígado ainda é

desconhecida (Bertolino et al, 2002 apud Hammond et al, 1998).

As lesões histopatológicas da esquistossomose são resultantes da reação inflamatória

granulomatosa aos ovos do parasito localizados nos tecidos hepáticos (Boros, 1989;Abath et

al., 2006;Gryseels et al., 2006;Lins et al., 2008). Essa resposta inflamatória granulomatosa, o

granuloma, resulta da reatividade do hospedeiro aos antígenos solúveis do ovo (Weinstock

and Blum, 1987). Antígenos liberados pelos de ovos induzem uma marcada resposta imune

caracterizada pela presença de células Th2 que guia o desenvolvimento de lesões

granulomatosas no fígado. A natureza protetora dessas lesões tem sido demonstrada por

estudos no modelo de infecção em camundongos (Dunne and Doenhoff, 1983;Amiri et al.,

1992;Cheever et al., 2000;Pearce and MacDonald, 2002).

Inflamação é uma resposta protetora do organismo à lesão tecidual e celular por

patógenos, sendo uma resposta primordial para eliminar ou neutralizar organismos ou

substâncias estranhas (Lawrence and Gilroy, 2007). Na esquistossomose mansônica, a reação

inflamatória granulomatosa tem uma função protetora para o hospedeiro, pois caso os ovos de

S. mansoni e suas toxinas não sejam neutralizados ou seqüestrados efetivamente, podem

causar danos aos tecidos afetados (Damian et al., 1984;Pearce and MacDonald, 2002).

Os granulomas hepáticos são iniciados após os ovos serem depositados nos capilares

pré-sinusoidais (Boros, 1989). Os ovos do S. mansoni excretam um antígeno solúvel

responsável pelo desencadeamento de um complexo fisiopatológico reacional que promoverá

a formação do granuloma em torno dos ovos (Lukacs et al., 1993;Lins et al., 2008). O

granuloma esquistossomótico é uma coleção compacta e organizada de células migrantes, que

junto com as células do órgão afetado, dispõem-se em meio a componentes de uma matriz

extracelular heterogênea, formando uma estrutura esférica que circunda cada ovo

individualmente (Lenzi et al., 1991). Nos estágios iniciais de formação do granuloma, há uma

produção de citocinas que certamente é importante para o desenvolvimento do granuloma por

recrutar células inflamatórias para o local de seqüestro do ovo do parasito (Lukacs et al.,

1993;Pearce and MacDonald, 2002;Wynn et al., 2004;Lins et al., 2008). Esse granuloma é

caracterizado pela presença de macrófagos, eosinófilos e linfócitos (Weinstock and Blum,

17

1987;Weinstock, 1992). Tal inflamação gera uma resposta de reparo tecidual, desencadeando

a deposição de colágeno tecidual, que quando em excesso é a expressão da fibrose (Warren,

1968;Cheever et al., 1985;Chiaramonte et al., 2001).

No início da resposta granulomatosa, a síntese de colágeno e a atividade das colagenases

ocorrem de forma equilibrada. Com o progresso da inflamação, a atividade dessas

colagenases diminui, mas a síntese de colágeno continua, levando a uma fibrose pronunciada

(Dunn et al., 1979;Takahashi et al., 1980;Singh et al., 2004). A lesão da esquistossomose

resulta de um excessivo depósito de colágeno nos espaços periportais, levando ao

desenvolvimento de uma fibrose periportal (fibrose de Symmer) característica da

esquistossomose mansônica (Cheever, 1968;Abath et al., 2006). Essa fibrose pode levar a

uma progressiva oclusão dos vasos portais, hipertensão portal, esplenomegalia e

hepatomegalia (Costa et al., 2003;Gryseels et al., 2006).

1.4 SENESCÊNCIA E ESQUISTOSSOMOSE

Existem algumas evidências na literatura mostrando modificações no desenvolvimento

de doenças parasitárias ao longo do processo de envelhecimento no que diz respeito a

gravidade e intensidade de infecção (Ndhlovu et al., 1996;Ouma et al., 1998;Naus et al.,

1999). Na esquistossomose humana, em particular, a intensidade de infecção, medida por

número de ovos nas fezes, geralmente aumenta muito nas duas primeiras décadas de vida

como resultado do contato com águas contaminadas pelos indivíduos vivendo em áreas

endêmicas. A partir de 30-40 anos de idade, esses mesmos indivíduos apresentam um declínio

progressivo na intensidade de infecção que aparentemente é concomitante à aquisição de

mecanismos de imunoproteção e ao desenvolvimento da fase crônica da doença (Naus et al.,

1999). Em estudos realizados em uma comunidade rural localizada no Zimbabwe (África),

mostrou-se que indivíduos jovens entre 10 e 14 anos de idade apresentaram um pico máximo

na intensidade da infecção pelo parasito S. haematobium (30,4 ovos/ml de urina)

acompanhado pela diminuição gradual da intensidade da infecção em indivíduos acima de 44

anos de idade (5,3 ovos/ml de urina) (Ndhlovu et al., 1996).

A ênfase dos estudos relacionando a idade e infecção pelo Schistosoma sp. tem sido

nesse perfil: um aumento na intensidade de infecção nas duas primeiras décadas de vida e o

declínio subseqüente. Essa diminuição poderia ser devido a uma resposta imune adquirida

18

pelos indivíduos idosos. Há alguns relatos mostrando que, em indivíduos acima de 60 anos,

especificamente, ocorre também um súbito aumento na intensidade de infecção (Fulford et al.,

1998). No entanto, a ausência de estudos sistemáticos da reatividade imunológica de

indivíduos idosos à infecção por S. mansoni tem impedido o entendimento dessa aparente

perda da imunidade adquirida em indivíduos vivendo em áreas endêmicas por toda a sua vida.

Um estudo importante realizado em populações africanas sugere uma relação entre

idade, intensidade da infecção e duração da infecção (Naus et al., 1999). Nesse estudo, os

autores foram capazes de se aproveitar de uma situação rara: analisar os índices de infecção

entre indivíduos de diversas idades de uma população recentemente assentada em uma área

endêmica. O fato de que os indivíduos infectados vivem na área desde a infância geralmente

impede uma correlação direta entre infecção e idade, pois os dados obtidos pela contagem de

ovos nas fezes normalmente se referem a re-infecção. Nos estudos relatados por Naus e

colaboradores, duas populações foram avaliadas: um “grupo estabelecido” que era exposto

durante anos ao parasito e um “grupo imigrante” vindo de uma área não endêmica. No “grupo

estabelecido”, observou-se um pico máximo da infecção nos indivíduos jovens (15-20 anos)

acompanhada de uma drástica diminuição a partir dos 30 anos que se manteve constante até

os 55 anos de idade. Já no “grupo imigrante”, o padrão da intensidade da infecção foi bem

mais baixo. Além disto, esse grupo apresentou um pico na intensidade da infecção mais

tardiamente (indivíduos adultos de 30 anos). Similarmente ao “grupo estabelecido”, a partir

dos 30 anos ocorria um declínio nessa intensidade que se mantinha constante até os 55 anos

de idade. Um ano após a chegada do “grupo imigrante”, os estudos mostraram um aumento

acentuado na intensidade da infecção nos indivíduos jovens (10 anos) desse grupo em relação

aos primeiros estudos, com uma diminuição dessa intensidade a partir dos 20 anos de idade.

Esses resultados sugerem que os indivíduos jovens do “grupo imigrante” apresentaram

possivelmente um padrão de resposta aguda para a infecção pelo S. mansoni.

Alguns trabalhos também demonstraram que a reatividade imunológica do indivíduo

frente aos antígenos liberados pelo parasito também pode ser influenciada pelo

envelhecimento. Webster e colaboradores (1997), estudando populações de áreas endêmicas,

mostraram alterações nos níveis de anticorpos em indivíduos jovens e idosos infectados pelo

parasito S. mansoni. Foi observado um aumento significativo nos níveis de IgE nos indivíduos

idosos (50 anos) quando comparado àqueles apresentados por indivíduos jovens (10-20 anos).

Entretanto, esse aumento foi evidenciado somente para os antígenos do verme adulto (SWAP)

já os níveis de IgE produzido por indivíduos idosos (50 anos) frente aos antígenos do ovo

(SEA), apresentaram-se mais baixos quando comparados com aqueles produzidos pelos

19

indivíduos jovens. Com relação aos níveis de IgG4, houve um aumento significativo na

produção deste isotipo para ambos os antígenos em indivíduos idosos (50 anos). Esses

resultados mostram a influência do envelhecimento na resposta imune do individuo frente à

esquistossomose (Webster et al., 1997).

Bethony e colaboradores (2001) também obtiveram resultados interessantes em relação

à intensidade de infecção por S. mansoni em indivíduos idosos na região endêmica de

Melquíades, Minas Gerais. Os autores estudaram uma população de 634 indivíduos

distribuídos em intervalos de 10 anos. Eles observaram, em acordo com a literatura, um

aumento na intensidade da infecção, medida pela contagem de ovos nas fezes, em indivíduos

jovens (10-20 anos), seguida de um declínio em indivíduos adultos (30-49 anos) e idosos (50-

59 anos) sugerindo novamente a aquisição de imunidade adquirida na idade adulta.

Surpreendentemente, eles também observaram que indivíduos acima de 60 anos de idade

apresentaram um novo pico da intensidade de infecção, sugerindo uma possível perda dessa

imunidade com o envelhecimento (Bethony et al., 2001).

Uma hipótese plausível para explicar esse aumento súbito poderia ser um maior contato

com águas contaminadas por parte dos indivíduos mais idosos. No entanto, dados do próprio

autor e de outros mostram, ao contrário, uma diminuição drástica no contato com águas

contaminadas em indivíduos acima de 60 anos (Ouma et al., 1998;Gazzinelli et al., 2001).

Como a esquistossomose é uma doença crônica cujo desenvolvimento se sobrepõe ao

processo também progressivo do envelhecimento, a avaliação da resposta granulomatosa

desenvolvida em camundongos jovens e idosos é de grande importância, uma vez que

poderemos analisar parcialmente o real impacto do envelhecimento durante o

desenvolvimento da esquistossomose mansoni experimental. Assim, o estudo de parâmetros

histopatológicos apresentados por camundongos jovens e idosos infectados, nos permite

traçar associações mais claras entre envelhecimento e o desenvolvimento da resposta

granulomatosa.

20

2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA

Recentemente, estudos em populações de áreas endêmicas brasileiras têm demonstrado

alterações associadas à intensidade de infecção em indivíduos idosos. Bethony et al.(2001)

mostram em Melquíades, uma área endêmica para a esquistossomose localizada no Estado de

Minas Gerais, o aumento da intensidade da infecção (ovos por grama de fezes) de uma

população de 634 indivíduos. Nessa população ocorre um pico na intensidade da infecção

entre 10-19 anos, um declínio após os 20 anos, uma diminuição acentuada entre 50-59, e

outro aumento estatisticamente significativo na intensidade da infecção (p< 0.005) após os 60

anos de idade. Quando foram analisados os mesmos grupos de indivíduos, o grupo acima de

60 anos que tem um comportamento de contato com águas contaminadas menor em relação às

outras faixas etárias, apresentou um aumento na quantidade de ovos presentes nas fezes

quando comparado com o grupo de indivíduos entre 20 e 49 anos. Essa diferença foi mais

acentuada quando comparada com os indivíduos entre 50-59 anos de idade (Bethony et al.,

2001).

As evidências citadas acima mostram um aumento na intensidade da infecção durante o

envelhecimento frente à infecção pelo S. mansoni, o que nos leva a acreditar que o

envelhecimento afeta o curso da doença e que alterações biológicas ocorridas durante a

senescência também podem interferir na forma pela qual o indivíduo responde à

esquistossomose. Entretanto, existem poucos dados na literatura mostrando quais as

diferenças no desenvolvimento da patologia da esquistossomose entre indivíduos jovens e

idosos, assim como em modelo murino.

Entender a histopatologia da esquistossomose, especialmente os mecanismos associados

ao granuloma e conseqüente formação da fibrose é de suma importância. Esses mecanismos

não são facilmente pesquisados em humanos por questões éticas e operacionais (Abath et al.,

2006). Não é possível definir claramente quando o indivíduo idoso se infectou, tornando,

então mais difícil a avaliação do real impacto do envelhecimento na patologia da

esquistossomose em seres humanos.

Infecções esquistossomóticas experimentais têm sido freqüentemente utilizadas como

modelo das características anatomopatológicas e fisiopatológicas da infecção em seres

humanos, bem como para o estudo da imunidade e tratamento (Costa et al., 2003;Abath et al.,

2006). Em camundongos infectados, o estabelecimento da patologia também se dá pelo

desenvolvimento de uma resposta granulomatosa, caracterizada pela formação de granulomas,

21

induzidos por antígenos solúveis do ovo (SEA), compostos por linfócitos T, linfócitos B,

macrófagos, eosinófilos e células epitelióides e gigantes. Ao longo do curso da infecção, na

qual há a passagem da fase aguda (70 dias) para a fase crônica (120 dias) também se observa

a modulação desses granulomas. Os animais apresentam alguns sintomas, tais como diarréia

durante a fase aguda e, pequenas lesões na mucosa intestinal que podem levar a morte dos

animais através do seu sangramento. Além disso, observam-se lesões glomerulares e

insuficiência renal. Mas, não são observadas varizes esofageanas. Em relação à hipertensão

portal, ela está associada ao número e tamanho dos granulomas (Wynn et al., 2004).

Portanto, o estudo da infecção pelo parasito S. mansoni em modelos murinos é

fundamental, uma vez que ela reproduz, em muitos aspectos, a patogenia em humanos,

permitindo desta forma, estudar mais detalhadamente todas as fases da doença e avaliar o real

impacto da senescência nessas fases (Cheever et al., 2000;Singh et al., 2004).

Neste trabalho, estudamos o papel das alterações associadas com a senescência no que

diz respeito à histopatologia da infecção por S. mansoni em camundongos idosos. Para isso, a

utilização do modelo murino possui algumas vantagens em relação ao modelo humano, tais

como: a) possuir menor período entre a juventude e a senescência (1 ano e meio); b) poder

sacrificar os animais e avaliar vários órgãos; c) poder caracterizar histológica e

morfometricamente os granulomas presentes no fígado de animais idosos comparando-os com

animais jovens; d) e o mais importante, poder avaliar separadamente as duas variáveis

infecção e envelhecimento, permitindo estudar a influência da senescência na resposta

granulomatosa e na evolução do processo fibrótico desenvolvidos por camundongos idosos

frente à infecção pelo parasito S. mansoni. Neste modelo foi analisado o desenvolvimento da

resposta granulomatosa em camundongos jovens e idosos, nas fases aguda e crônica de

infecção por S. mansoni, o que nos permitiu avaliar as alterações histológicas apresentadas

por animais jovens e idosos e associá-las aos parâmetros referentes à proteção em diferentes

momentos da infecção.

22

3 OBJETIVO GERAL

Estudar aspectos histopatológicos relacionados à resposta granulomatosa

compartimentalizada durante o desenvolvimento da esquistossomose mansoni em

camundongos jovens e idosos nas fases aguda e crônica da infecção.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

A) Avaliar a resposta granulomatosa através da quantificação do número de granulomas e

mensuração da área dos mesmos;

B) Analisar o processo inflamatório hepático;

C) Avaliar a neoformação de colágeno nos tecidos hepático e esplênico.

23

4 METODOLOGIA

4.1 ANIMAIS, PARASITOS E INFECÇÃO

Nesse estudo foram utilizados camundongos C57BL/6 jovens (7 semanas de idade)

fêmeas e camundongos idosos (70 semanas de idade) fêmeas, obtidos no Biotério do Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB – UFMG) e mantidos

no biotério do Grupo Intradepartamental de Estudos sobre Esquistossomose da Universidade

Federal de Minas Gerais (GIDE - UFMG) sob a Coordenação da Professora Doutora Débora

Negrão.

Os animais foram infectados com 19 cercárias de S. mansoni por inoculação

subcutânea. Para a infecção foram utilizadas cercárias da cepa LE do S. mansoni, obtidas a

partir de caramujos (B. glabrata) infectados experimentalmente, mantidos no mesmo Biotério.

Para a análise comparativa entre camundongos jovens e idosos e entre infecção aguda

(70 dias de infecção) e crônica (120 dias de infecção), os animais foram agrupados da

seguinte maneira: 1) grupo de camundongos jovens infectados com o S. mansoni,

eutanasiados 70 dias após a infecção (J70); 2) grupo de camundongos jovens infectados com

o S. mansoni, eutanasiados 120 dias após a infecção (J120); 3) grupo de camundongos idosos

infectados com o S. mansoni, eutanasiados 70 dias após a infecção (I70); 4) grupo de

camundongos idosos infectados com o S. mansoni, eutanasiados 120 dias após a infecção

(I120); e seus respectivos controles negativos. Cada grupo representa a análise de 3 animais.

O fígado desses animais foi analisado para os parâmetros referentes a número e tamanho

de granulomas em cada animal, aumento da celularidade dos infectados frente aos respectivos

grupos controle e aumento da neoformação de colágeno dos infectados frente aos respectivos

grupos controle. O baço desses animais foi analisado para o parâmetro de aumento da

neoformação de colágeno dos infectados frente aos respectivos grupos controle.

24

4.2 NECROPSIA, COLETA, FIXAÇÃO E PROCESSAMENTO DO MATERIAL PARA

MICROSCOPIA ÓPTICA

Os animais foram eutanasiados em dois períodos distintos. Para definição de animais no

período agudo da infecção por S. mansoni, os mesmos foram eutanasiados no 70° dia após a

infecção (DAI). Nesse período, foram também eutanasiados animais não infectados para

definição de um grupo controle 70 dias. Para definição de animais no período crônico da

infecção por S. mansoni, outros animais também infectados foram eutanasiados no 120° dia

após infecção (DAI). Nesse período, foram também eutanasiados animais jovens e idosos não

infectados para definição de um grupo controle 120 dias. Os animais foram sacrificados com

0,5 mL/Kg de massa corporal de tiopental sódico (0,03g/ml de solução salina 0,8%), por via

endovenosa. Durante a necropsia foram coletados o fígado, o baço, além do intestino,

linfonodo inguinal, linfonodo mesentérico e placa de Peyer. Neste trabalho, foram analisados

somente fígado e baço. As amostras foram fixadas em formol a 10% tamponado (pH 7.2).

4.3 HISTOPATOLOGIA E COLORAÇÕES EMPREGADAS

Um segmento de aproximadamente 0,5 cm foi retirado da amostra de fígado e baço

previamente fixado em formol 10% tamponado e processado, conforme a técnica descrita a

seguir para tecidos em parafina. As amostras foram desidratadas em concentrações crescentes

de álcool (70, 80, 90 e 100%), diafanizadas em dois banhos de xilol, e embebidas em parafina.

Após o processamento, as amostras foram incluídas em parafina. Os blocos obtidos foram

submetidos à microtomia para a obtenção de quatro cortes com espessura de quatro µm e para

cada análise foi utilizado um único corte histológico de fígado e de baço por animal.

Dos dois cortes obtidos para o estudo do fígado e do baço, o primeiro foi corado pelo

método de Hematoxilina-Eosina (HE) para análise rotineira das alterações histopatológicas,

tais como presença de granuloma hepático, análise da quantidade e da área desses granulomas

e análise do infiltrado celular inflamatório local no fígado por animal; o segundo foi corado

pelo método Tricrômico de Gomori (TG) para detecção da neoformação de colágeno no

fígado e no baço por animal.

25

4.3.1 Hematoxilina-Eosina (HE)

A coloração de HE foi utilizado para análise rotineira das alterações histopatológicas,

incluindo a quantificação do processo inflamatório. Os cortes foram desparafinizados em duas

trocas de xilol, hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) e

então lavados em água corrente. Em seguida, foram corados pela Hematoxilina, por 10

minutos e lavados em água corrente, para retirada do excesso do corante. Os cortes foram

diferenciados em álcool acidulado (100 mL de álcool absoluto e 10 gotas de ácido clorídrico)

e novamente lavados em água corrente para evitar acidificação excessiva. Posteriormente,

foram corados pela Eosina, por 30 segundos. Após a última lavagem em água corrente, foram

desidratados, em 2 banhos de álcool absoluto e levados à estufa a 56º C para secagem e

montados com lamínula e Entellan (Caliari et al., 2002).

4.3.2 Tricrômico de Gomori (TG)

Para observação do processo de neoformação de colágeno, os cortes histológicos do

fígado e do baço foram corados pela técnica de Tricrômico de Gomori. Essa técnica permitiu

a identificação do tecido conjuntivo fibroso pela sua tonalidade azul. Após desparafinização e

hidratação, os cortes foram corados pela Hematoxilina de Harris, por 5 minutos e lavados em

água corrente. Em seguida, os cortes foram mantidos, por 15 minutos, imersos em solução de

Tricrômico de Gomori, lavados em água corrente, desidratados e levados à estufa a 56°C para

secagem e montados com lamínula e Entellan (Caliari et al., 2002).

26

4.4 ANÁLISE QUANTITATIVA DE GRANULOMAS

Para quantificação dos granulomas hepáticos presentes nas amostras de fígado foram

contados o número de granulomas visualizados por microscopia óptica. A contagem foi

realizada em 20 campos microscópicos aleatórios (objetiva de 20X) de cada animal infectado

do estudo. As imagens visualizadas pela objetiva de 20x em microscópio Leica DM5000B

foram digitalizadas através da microcâmera Leica e do programa Leica Application Suite

(Versão 2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin

V3. A média do número de granulomas de cada grupo foi comparada entre os animais jovens

infectados e os animais idosos infectados com S. mansoni, tanto na fase aguda quanto na fase

crônica de infecção.

4.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DA ÁREA DO GRANULOMA HEPÁTICO

O processo de formação do granuloma foi avaliado, nesse estudo, através da medição da

área dos granulomas hepáticos apresentados pelos animais infectados, tanto jovens quanto

idosos. A área dos granulomas, em cada animal infectado do estudo, foi observada em cada

corte histológico de fígado obtido. As imagens visualizadas pela objetiva de 20x em

microscópio Leica DM5000B foram digitalizadas através da microcâmera Leica e do

programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi

utilizado o programa Leica QWin V3. A média das áreas dos granulomas hepáticos do grupo

de animais infectados jovens foi comparada com a média das áreas dos granulomas hepáticos

do grupo de animais infectados idosos, nas fases aguda e crônica da infecção por S. mansoni.

27

4.6 ANÁLISE DA CELULARIDADE E DO INFILTRADO CELULAR PRESENTE NOS

CORTES HISTOLÓGICOS HEPÁTICOS

Os cortes histológicos para a análise da celularidade de cada animal foram submetidos à

coloração pelo método de Hematoxilina-Eosina (HE) conforme descrito anteriormente. Para

quantificação da celularidade e do infiltrado de células inflamatórias presentes nos cortes

histológicos do fígado de cada animal, foi definida uma marcação que possibilitasse capturar,

processar imagens e definir condições morfométricas para contagens de todos os núcleos

contidos em cada imagem. Os núcleos de células residentes do tecido hepático, bem como os

leucócitos recentemente recrutados foram, então, contados (Pacheco et al., 2008). Os núcleos

celulares presentes nesses segmentos foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias

(área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2) de cada animal do estudo. As imagens

visualizadas pela objetiva de 20x em microscópio Leica DM5000B foram digitalizadas

através da microcâmera Leica e do programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1). Para

a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin V3. O processo

inflamatório foi determinado pela diferença entre o número de núcleos das células presentes

nos animais infectados com o S. mansoni e o número de núcleos celulares dos animais não-

infectados ± desvio padrão evidenciados em toda a amostra de tecido de cada animal, não

somente nos granulomas. Os resultados apresentados graficamente referem-se aos valores de

aumento da celularidade apresentado pelos grupos de animais infectados quando comparados

com seus respectivos grupos controle (média do valor total da celularidade do grupo infectado

menos a média do valor total da celularidade do respectivo grupo controle). Portanto os

gráficos mostram apenas as barras referentes aos valores de aumento da celularidade média

dos grupos de animais infectados jovens e idosos nas fases aguda e crônica da doença.

28

4.7 ANÁLISE DO PROCESSO DE NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO FÍGADO E

BAÇO DOS ANIMAIS

A área ocupada por tecido conjuntivo fibroso foi obtida por análise de imagem de 20

campos aleatórios por lâmina dos cortes corados por TG de cada animal do estudo. As

imagens visualizadas pela objetiva de 20x em microscópio Leica DM5000B foram

digitalizadas através da microcâmera Leica e do programa Leica Application Suite (Versão

2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin V3. Os

pixels com tons de azul foram selecionados para a criação de uma imagem binária e posterior

cálculo da área total ocupada por fibrose ou tecido conjuntivo fibroso normal. O processo

fibrótico foi determinado pela diferença estatisticamente significativa entre as áreas de

neoformação de colágeno presentes nos animais infectados com o S. mansoni e as áreas de

colágeno dos animais não-infectados ± desvio padrão evidenciados em toda a amostra de

tecido do fígado e do baço de cada animal, não somente nos granulomas. Os resultados

apresentados graficamente referem-se aos valores de neoformação de colágeno apresentado

pelos grupos de animais infectados quando comparados com seus respectivos grupos controle

(média do valor total de colágeno do grupo infectado menos a média do valor total de

colágeno do respectivo grupo controle). Portanto os gráficos mostram apenas as barras

referentes à média dos valores de neoformação de colágeno dos grupos de animais infectados

jovens e idosos nas fases aguda e crônica da doença, tanto do fígado quanto do baço.

As áreas obtidas foram comparadas entre os camundongos jovens infectados,

camundongos idosos infectados e animais do grupo controle estudados, tanto na fase aguda

quanto na fase crônica da infecção (Caliari et al., 2002).

29

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os testes estatísticos foram realizados com o apoio instrumental do software GraphPad

Prism 4.03 (Prism Software, Irvine, CA, USA). Para comparação do processo inflamatório,

número de granulomas, área ocupada por granulomas hepáticos e neoformação de colágeno

foi realizada análise estatística pelo teste t de Student para determinar as diferenças estatísticas

entre as médias de dois grupos. As comparações foram realizadas entre camundongos de

mesma faixa etária em fases diferentes da doença (jovens na fase aguda e na fase crônica ou

idosos na fase aguda e na fase crônica), ou na mesma fase da doença sendo de faixas etárias

diferentes (jovens e idosos na fase aguda ou jovens e idosos na fase crônica). As análises de

correlação foram executadas através do teste t de Student com intervalo de confiança de 95%.

Diferenças entre médias com valores de p menores que 0,05 foram consideradas

estatisticamente significativas.

30

5 RESULTADOS

A apresentação dos resultados foi realizada em três partes: a primeira refere-se aos

dados obtidos através da quantificação do número e tamanho dos granulomas hepáticos; a

segunda refere-se aos dados obtidos através da quantificação do processo inflamatório,

avaliando-se a celularidade e o infiltrado celular presente no tecido hepático como um todo; e

a terceira refere-se aos dados obtidos através da quantificação do processo de neoformação de

colágeno no fígado e no baço de camundongos infectados pelo Schistosoma mansoni.

Animais não infectados foram utilizados como controle negativo (dados não mostrados).

5.1 ANÁLISE DO NÚMERO E TAMANHO DE GRANULOMAS HEPÁTICOS DE

CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS.

Os cortes histológicos de fígado de camundongos jovens e idosos infectados por

Schistosoma mansoni foram avaliados quanto ao desenvolvimento dos granulomas

esquistossomóticos. O número de granulomas no fígado durante as fases aguda e crônica da

infecção por Schistosoma mansoni foi quantificado em 20 campos microscópicos por

camundongo (Figuras 1 e 2). O grupo de camundongos jovens eutanasiados com 120 dias (J

120) apresentou maior número de granulomas que o grupo de camundongos jovens

eutanasiados em 70 dias (J 70) (p=0,0008). Os grupos de camundongos idosos não

apresentaram diferença.

31

J 70 I 70 J 120 I 1200

1

2

3P= 0,0008

Núm

ero

de G

ran

ulo

mas

hep

áti

co

s/c

am

po

Figura 1 - Quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados por

Schistosoma mansoni, eutanasiados durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da doença. Diferenças

significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre J 120 e J 70

(p=0,0008). As barras representam a média dos 3 animais de cada grupo ± desvio padrão.

32

Figura 2 – Fotos representativas da quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens (J) e idosos

(I) infectados por Schistosoma mansoni, eutanasiados durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da

doença. Hematoxilina Eosina, 330X. A: fígado de jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J 70). B: fígado de

idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). C: fígado de jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J

120). D: fígado de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120).

33

Analisando-se a área do granuloma hepático presente em camundongos jovens e idosos,

observam-se diferenças significativas entre esses dois grupos (Figuras 3 e 4). O grupo de

camundongos jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J120) apresentou granulomas com

área menor que camundongos jovens eutanasiados em 70 dias (J 70) (p= 0,0486). Além disso,

camundongos idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120) apresentaram granulomas

maiores que os camundongos jovens eutanasiados em 120 dias (J 120) (p=0,0022). Por outro

lado, não foram observadas alterações com relação a área do granuloma hepático entre a fase

aguda e crônica da doença, no grupo de animais idosos.

J 70 I 70 J 120 I 1200

10000

20000

30000

40000

P= 0,0022

P= 0,0486

Are

a d

o g

ran

ulo

ma (

µµ µµm

2)

Figura 3 – Determinação da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I)

infectados por Schistosoma mansoni, durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da doença. Diferenças

significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre J 120 e J 70

(p=0,0486). Diferença entre I 120 e J 120 (p=0,0022). As barras representam a média dos 3 animais de cada

grupo ± desvio padrão.

34

Figura 4 – Fotos representativas da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens (J) e idosos

(I) infectados por Schistosoma mansoni, durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da doença. A:

fígado de jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J 70). B: fígado de idosos infectados eutanasiados em 70

dias (I 70). C: fígado de jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). D: fígado de idosos infectados

eutanasiados em 120 dias (I 120).

35

5.2 ANÁLISE DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA NO FÍGADO DE CAMUNDONGOS

JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE INFECÇÃO.

Sabe-se que a maioria do sangue proveniente do intestino passa pelo fígado via sistema

porta antes de atingir a circulação periférica e grandes quantidades de antígenos entram nesse

órgão, podendo ser capturados por células apresentadoras de antígeno. No fígado, são

encontradas várias populações celulares residentes, incluindo células de Kupffer, células

estreladas, células dendríticas e linfócitos (Tsutsui, et al., 1996, Matsui, et al., 1997, Doerty, et

al., 1999). Entretanto, durante o desenvolvimento da resposta granulomatosa na

esquistossomose, observa-se principalmente eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos

(Weinstock, 1992, Rumbley, et al., 1999).

Nesse contexto, após a análise do número e tamanho dos granulomas hepáticos, nosso

próximo objetivo foi avaliar a resposta inflamatória caracterizada pelo aumento da

celularidade em todas as amostras de tecido hepático dos animais infectados em relação à

celularidade presente também nas amostras de tecido hepático dos respectivos animais do

grupo controle. Observamos diferenças significativas entre os grupos de animais, com relação

ao processo inflamatório gerado pela formação dos granulomas durante a fase aguda e crônica

da infecção.

A análise da celularidade e do aumento do infiltrado celular no fígado dos camundongos

foi observada, inicialmente, comparando-se os grupos infectados com os grupos controle

(dados não mostrados graficamente). Os camundongos jovens infectados eutanasiados em 70

dias (J 70) apresentaram celularidade maior que os jovens não infectados eutanasiados no

mesmo período (p=0,0168). Da mesma maneira, camundongos idosos infectados eutanasiados

em 70 dias (I 70) apresentaram maior celularidade que os idosos não infectados eutanasiados

no mesmo período (p=0,0022). Entre os animais eutanasiados em 120 dias, camundongos

jovens infectados (J 120) apresentaram maior celularidade que camundongos jovens não

infectados (p=0,0312) e camundongos idosos infectados (I 120) apresentaram a mesma

tendência em comparação com idosos não infectados (p=0,0835) (dados não mostrados

graficamente).

Comparando-se os aumentos na celularidade apresentados pelos grupos infectados

(Figuras 5 e 6), observou-se que idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70)

apresentaram celularidade maior que jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J 70)

(p=0,0305). Essa diferença é observada como tendência entre o grupo de idosos infectados

36

eutanasiados em 70 dias (I 70) e idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120)

(p=0,0582).

J 70 I 70 J 120 I 1200

2000

4000

6000

8000 P= 0,0305

Infl

am

ação

no

fíg

ad

o(i

nfi

ltra

do

in

flam

ató

rio

)

Figura 5 - Análise da inflamação no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados, eutanasiados

durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose. Diferenças significativas foram

determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre I 70 e J 70 (p=0,0305). As barras

representam a média de células inflamatórias dos 3 animais de cada grupo ± desvio padrão.

37

Figura 6 – Fotos representativas da inflamação no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados,

eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada pelo aumento

da celularidade desses grupos em relação aos respectivos grupos controle. A: fígado de jovens infectados

eutanasiados em 70 dias (J 70). B: fígado de idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). C: fígado de

jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). D: fígado de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I

120).

38

5.3 ANÁLISE DA NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO FÍGADO DE

CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE

INFECÇÃO.

A análise do aumento da neoformação de colágeno no fígado dos camundongos foi

observada, inicialmente, comparando-se os grupos infectados com os grupos controle

negativo (dados não mostrados graficamente). Os camundongos jovens infectados

eutanasiados em 70 dias (J 70) apresentaram maior neoformação de colágeno que os jovens

não infectados eutanasiados no mesmo período (p=0,0448). Da mesma maneira,

camundongos idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70) apresentaram maior

neoformação de colágeno que os idosos não infectados eutanasiados no mesmo período

(p=0,0032). Entre os animais eutanasiados em 120 dias, camundongos jovens infectados (J

120) apresentaram maior neoformação de colágeno que camundongos jovens não infectados

(p=0,0237) e camundongos idosos infectados (I 120) apresentaram maior neoformação de

colágeno que camundongos idosos não infectados (p=0,0275) (dados não mostrados

graficamente).

Comparando-se os aumentos na neoformação de colágeno apresentados pelos grupos

infectados (Figuras 7 e 8), não foi observada diferença entre os grupos de animais jovens (J)

e idosos (I) nas fases aguda (70) e crônica (120) da infecção.

39

J 70 I 70 J 120 I 1200.0

2.0×1007

4.0×1007

6.0×1007

8.0×1007

Neo

form

ação

de c

olá

gen

o

no

fíg

ad

o (

µµ µµm

2)

Figura 7 - Análise da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados,


da presença de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle.

Diferenças significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. As barras

representam a média de colágeno dos 3 animais de cada grupo ± desvio padrão.

40

Figura 8 – Fotos representativas da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I)

infectados, eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada

pelo aumento de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle. A:

fígado de jovens não infectados eutanasiados em 70 dias (controle). B: fígado de jovens infectados eutanasiados

em 70 dias (J 70). C: fígado de jovens não infectados eutanasiados em 120 dias (controle). D: fígado de jovens

infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). E: fígado de idosos não infectados eutanasiados em 70 dias

(controle). F: fígado de idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). G: fígado de idosos não infectados

eutanasiados em 120 dias (controle). H: fígado de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120).

41

5.4 ANÁLISE DA NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO BAÇO DE CAMUNDONGOS


Analisando-se a deposição de colágeno no baço como aspecto determinante da fibrose

tecidual, foi possível observar alterações significativas quando os grupos foram comparados.

A análise do aumento da neoformação de colágeno no baço dos camundongos foi

observada, inicialmente, comparando-se os grupos infectados com os grupos controle (dados

não mostrados graficamente). Os camundongos jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J

70) não apresentaram maior neoformação de colágeno que os jovens não infectados

eutanasiados no mesmo período. Diferentemente, camundongos idosos infectados

eutanasiados em 70 dias (I 70) apresentaram maior neoformação de colágeno que os idosos

não infectados eutanasiados no mesmo período (p=0,0430). Entre os animais eutanasiados em

120 dias, camundongos jovens infectados (J 120) apresentaram maior neoformação de

colágeno que camundongos jovens não infectados (p=0,0220) enquanto camundongos idosos

infectados (I 120) apresentaram a mesma tendência de maior neoformação de colágeno que

camundongos idosos não infectados (p=0,0583) (dados não mostrados graficamente).

Comparando-se os aumentos na neoformação de colágeno no baço apresentados pelos

grupos infectados (Figuras 9 e 10), observou-se que idosos infectados eutanasiados em 70

dias (I 70) apresentaram maior neoformação que jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J

70) (p=0,0107). Além disso, camundongos jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J

120) apresentaram maior neoformação de colágeno que jovens infectados eutanasiados em 70

dias (J 70) (p=0,0088). Entre os grupos de jovens e idosos infectados eutanasiados em 120

dias (J 120 e I 120, respectivamente) não houve diferença.

42

J 70 I 70 J 120 I 1200.0

2.0×1007

4.0×1007

6.0×1007

8.0×1007

P= 0,0107

P= 0,0088N

eo

form

ação

de c

olá

gen

o

no

baço

(µµ µµ

m2)

Figura 9 - Análise da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados,


da presença de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle.

Diferenças significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre I 70

e J 70 (p=0,0107). Diferença entre J120 e J 70 (p=0,0088). As barras representam a média de colágeno dos 3

animais de cada grupo ± desvio padrão.

43

Figura 10 – Fotos representativas da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens (J) e idosos (I)

infectados, eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada

pelo aumento de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle. A:

baço de jovens não infectados eutanasiados em 70 dias (controle). B: baço de jovens infectados eutanasiados em

70 dias (J 70). C: baço de jovens não infectados eutanasiados em 120 dias (controle). D: baço de jovens

infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). E: baço de idosos não infectados eutanasiados em 70 dias

(controle). F: baço de idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). G: baço de idosos não infectados

eutanasiados em 120 dias (controle). H: baço de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120).

44

5.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS.

A análise dos dados parasitológicos, referentes à carga parasitária, foi realizada por parte

dos colaboradores, simultaneamente a este projeto.

Essa análise permitiu avaliar a real influência do processo de senescência sobre os dados

e análises obtidos por este projeto, excluindo diferenças na carga parasitária como causa dos

resultados observados.

Analisando-se os dados referentes à carga parasitária nos animais jovens e idosos, não

foi observada diferença estatística entre os grupos.

Dados Parasitológicos do Fígado

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

Animais

Núm

ero

de o

vos

jovens

velhos

Figura 11 - Análise dos dados parasitológicos no fígado de animais jovens e velhos referentes à infecção por

Schistosoma mansoni.

45

6 DISCUSSÃO

O objetivo desse trabalho foi estudar aspectos relacionados à resposta granulomatosa

compartimentalizada durante o desenvolvimento da esquistossomose mansoni em

camundongos jovens e idosos nas fases aguda e crônica da infecção. Para tal foram utilizadas

infecções por Schistosoma mansoni de camundongos jovens (7 semanas de idade) e idosos

(70 semanas de idade) eutanasiados com 70 dias de infecção (fase aguda) ou 120 dias de

infecção (fase crônica) e seus respectivos controles.

Infecções de camundongos têm sido freqüentemente utilizadas como modelos de

características anatomopatológicas e patofisiológicas de infecções parasitárias, como a

esquistossomose, em humanos assim como no estudo do tratamento e das características

imunes dessas infecções (Cheever et al., 2000;Cheever et al., 2002).

Muitos estudos têm demonstrado a semelhança no padrão da resposta imune frente à

infecção pelo Schistosoma mansoni, bem como na patologia associada a ela em camundongos

e humanos (Cheever et al., 2000;Cheever et al., 2002). Portanto optou-se por utilizar o modelo

murino de infecção esquistossomótica experimental, pois o mesmo permite avaliar, de

maneira geral, o efeito direto e isolado do envelhecimento sobre a resposta imune à infecção,

fibrose e o detalhamento da ativação inflamatória em vários órgãos, inclusive o fígado e o

baço que foi nosso objeto de estudo.

Como já mencionamos, o envelhecimento está associado a várias modificações

funcionais do sistema imune. Tais alterações podem estar relacionadas à involução tímica,

bem como às alterações no fenótipo, perfil de citocinas e no repertório de linfócitos. De um

modo geral, animais e seres humanos idosos apresentam uma reatividade imunológica

comprometida e uma diminuição na sua capacidade de reagir a antígenos novos. Está bem

documentada na literatura a dificuldade em vacinar indivíduos idosos assim como sua maior

suscetibilidade a infecções (Miller, 1996). E, todas essas alterações poderiam, de alguma

maneira, influenciar na forma como o indivíduo ou o animal responderia às doenças de caráter

infeccioso ou não.

Estudos também relatam modificações no desenvolvimento de doenças parasitárias

durante o processo de envelhecimento (Ndhlovu et al., 1996; Ouma et al., 1998; Naus et al.,

1999). Na esquistossomose humana, por exemplo, a intensidade de infecção geralmente

aumenta nas duas primeiras décadas de vida diminuindo progressivamente a partir da segunda

década de vida (Naus et al., 1999). Na literatura existe um consenso de que, embora ocorra

46

uma pequena redução nos níveis de exposição dos indivíduos com a idade, ela é insuficiente

para explicar a grande redução na intensidade de reinfecção, cuja causa foi atribuída ao

desenvolvimento de uma resistência adquirida com a idade (Butterworth et al., 1985).

Conseqüentemente, esforços têm sido realizados no sentido de elucidar os diferentes

mecanismos envolvidos na resistência ao Schistosoma mansoni (Butterworth et al.,

1985;Wilkins et al., 1987;Gryseels, 1994;Ndhlovu et al., 1996).

A morbidade da esquistossomose resulta da infecção com o parasito Schistosoma

mansoni e a severidade da doença é conseqüência da fibrose causada pela resposta imune aos

ovos que se encontram presos no sistema porta hepático, seqüestrados em lesões

granulomatosas (Cheever and Andrade, 1967;Warren, 1968;Chiaramonte et al., 2001;Abath et

al., 2006). O principal papel da reação granulomatosa na esquistossomose é proteger os

tecidos do hospedeiro, isolando as toxinas em potencial secretadas pelo ovo. Essa inflamação

gera uma resposta de reparação tecidual, desencadeando a deposição de colágeno tecidual,

que quando em excesso é a expressão da fibrose. Esse é um processo dinâmico em que o

tamanho e a composição celular das lesões variam com o tempo e é coordenado pela

influência de uma rede de mediadores inflamatórios como células inflamatórias e citocinas

(Conlon, 2005; Chiaramonte et al. 2001; Wynn & Cheever, 1995; Weinstock, 1992; Warren,

1972; Warren 1968; Cheever & Andrade 1967).

A resposta granulomatosa crônica que ocorre em torno dos ovos do parasito, agravada

pela fibrose, é o maior responsável pelo desenvolvimento da patologia. Os ovos do

Schistosoma mansoni excretam um antígeno solúvel responsável pelo desencadeamento de

um complexo fisiopatológico reacional que promoverá a formação do granuloma em torno

dos ovos (Lenzi et al., 1991;Lukacs et al., 1993;Pearce and MacDonald, 2002;Lins et al.,

2008). A resposta granulomatosa, e não somente a ação direta dos antígenos dos ovos do

parasito, pode ser responsável pelas manifestações patológicas teciduais. Estudos em micro-

circulação têm mostrado que os granulomas formados em torno dos ovos nos capilares pré-

sinusoidais impedem o fluxo de sangue hepático. Tal bloqueio no sistema Porta hepático

induz a hipertensão portal (Boros, 1989). Outro fator que contribui para hipertensão portal é a

fibrose de Symmers, que desenvolve em torno de ramos da veia porta. Com o

desenvolvimento do granuloma e da fibrose, juntamente com valores elevados de pressão

portal e intensa atividade imunológica do hospedeiro, pode levar ao desenvolvimento de

hepatosplenomegalia, forma clinica mais grave da doença (Boros, 1989). Apesar do papel na

patologia da esquistossomose, o granuloma também possui um papel protetor para o

hospedeiro. Os ovos do S. mansoni liberam toxinas que são tóxicas para as células teciduais.

47

Portanto, caso os ovos de S. mansoni e suas toxinas não sejam neutralizados ou seqüestrados

efetivamente, podem causar danos aos tecidos afetados (Damian et al., 1984;Pearce and

MacDonald, 2002).

Nesse contexto foi de interesse analisar a histopatologia do fígado e baço dos grupos de

camundongos jovens e idosos. Avaliou-se o número e tamanho dos granulomas, o infiltrado

celular (expressão da inflamação) e depósito de colágeno (expressão da fibrose) nesses

órgãos.



Na presente análise, os camundongos jovens apresentaram maior número de granulomas

durante a infecção crônica (J 120) quando comparado a infecção aguda (J 70) (p=0,0008).

Entretanto, não foi observada essa diferença nos animais idosos (I 70 - I 120) (Figuras 1 e 2).

Segundo Hernandez e colaboradores (Hernandez et al., 2004), o desenvolvimento dos

parasitos da forma de cercária infectante para vermes adultos produtores de ovos depende de

um sistema imune intacto. Esses autores demonstraram que em camundongos

imunodeficientes, o sistema imune do hospedeiro tem um papel fundamental no

desenvolvimento dos machos de S. mansoni e este, por sua vez, são essenciais ao

desenvolvimento da fêmea do parasito.

O envelhecimento está associado a mudanças no sistema imune, tanto na arquitetura dos

tecidos dos órgãos linfóides, como no fenótipo de células do sistema imunológico e alterações

no padrão de citocinas produzidas, tais mudanças poderiam afetar, de alguma forma, a postura

de ovos nos animais idosos (Ernst et al., 1993;Barrat et al., 1995;Kurashima and Utsuyama,

1997;Timm and Thoman, 1999;Gruver et al., 2007). Isso permitiria uma maior retenção dos

ovos no tecido hepático já no início da infecção, que se mantém na fase crônica nos animais

idosos. Embora não se tenha observado um aumento significativo entre J 70 e I 70, o que

poderia ser explicado pelo número de animais estudados.

Com relação à área dos granulomas, camundongos jovens apresentaram granulomas

menores na fase crônica (J 120) quando comparado com a fase aguda (J 70) (p= 0,0486)

(Figuras 3 e 4). Essa diferença não foi observada no grupo de camundongos idosos (I 70 – I

120). Durante a infecção por Schistosoma mansoni, há o desenvolvimento de uma resposta

48

inflamatória granulomatosa devido à deposição de ovos no tecido. Ao longo do curso da

infecção, durante a passagem da fase aguda para a fase crônica, observa-se uma modulação

desse granuloma, exercida por diversos fatores dentre eles a interleucina-10. A IL- 10 é uma

citocina moduladora produzida por uma diversidade de células tais como células

TCD4+CD25+ (células T reguladoras – Treg) além de macrófagos e células TCD4+ e TCD8+.

As células T reguladoras têm papel crucial na supressão da resposta imune a auto-antígenos e

na prevenção de doenças auto-imunes, além de controlarem a resposta imune a bactérias,

vírus, parasitos e fungos (de Waal et al., 1991;Mills, 2004). Em indivíduos idosos, não está

claro se o pool de Treg é significativamente diferente daquele encontrado em indivíduos

jovens, entretanto, alguns autores têm demonstrado que idosos têm um aumento nas Tregs em

comparação aos jovens (Kozlowska et al., 2007). Além disso, pode ocorrer uma produção

aumentada de IL-10 em animais idosos. Spencer e colaboradores (1996) demonstraram que o

tratamento de animais idosos com sulfato dehidroepiandosterona (DHEAS), um esteróide

natural, reverteu as alterações associadas ao envelhecimento na produção de citocina,

rendendo ao camundongo tratado total similaridade a adultos maduros controle (Spencer et

al., 1996). Sugere-se então que em animais idosos ocorreria uma modulação do granuloma já

na fase aguda da infecção que é mantida na fase crônica, enquanto que em animais jovens tal

modulação ocorreria na fase crônica. Tal fato estaria relacionado à patologia, e em animais

idosos a modulação possivelmente estaria associada tanto à patologia quanto ao

microambiente senescente, sabidamente alterado nesses animais. Interessantemente, em

animais jovens com 120 dias de infecção ocorre uma modulação da resposta granulomatosa

ao ponto que o seu granuloma fica significativamente menor que dos idosos no mesmo

período (p=0,0022) (Figuras 3 e 4). Esse fato pode ser explicado pelo grande pool de células

virgens de camundongos jovens comparado aos idosos. Isso possibilita ao animal jovem

ampliar sua resposta moduladora frente à inflamação granulomatosa existente em comparação

aos animais idosos.

O principal efeito do envelhecimento no sistema imune pode ser observado no timo

(sítio de maturação das células T). A atrofia tímica associada ao progressivo envelhecimento,

leva a uma redução de tecido tímico funcional e um declínio na geração de células T. Há

então, uma diminuição no aporte de células virgens desse órgão. Associado a essa diminuição,

o acúmulo de linfócitos T expressando um fenótipo de células ativadas - resultado do

processo natural e acumulativo de ativação - as mudanças nas interações com as células

apresentadoras de antígeno que também apresentam alterações com o envelhecimento,

sugerem que animais idosos possuam um perfil de citocinas diferente do perfil de animais

49

jovens, uma vez que as células T "virgens" secretam um perfil de citocinas diferente das

células T memória. Isso leva a crer que animais idosos apresentariam uma diminuição na sua

capacidade de reagir a antígenos novos (Jenkinson et al, 2008; Gruver et al, 2007; Miller,

1996; Takeoka et al., 1996; Hobbs et al., 1993, 1994). Assim, sugere-se que, por possuírem

um repertorio de células T memória inicial maior que o de animais jovens, os camundongos

idosos responderiam aos antígenos de ovo do S. mansoni já durante a fase aguda de infecção,

inclusive através de citocinas moduladoras como a IL-10, que já sabidamente se encontra

elevada no envelhecimento. Entretanto, animais jovens possuem uma maior capacidade de

responder a novos antígenos e evoluem para um granuloma com área menor que a de idosos

na infecção crônica. Além disso, estudos sugerem que animais idosos possuem um maior pool

de células T reguladoras, principal fonte de IL-10 - uma citocina reguladora produzida por

varias células tais como macrófagos e células TCD4+ (Kozlowska et al, 2007; Saverino et al,

2008). Isso sugere que os animais idosos podem ter uma regulação da resposta inflamatória

granulomatosa, mantendo assim a mesma área de granuloma durante a evolução da infecção

aguda para a crônica.

O presente estudo faz parte de um projeto mais abrangente que analisa a influência da

senescência na resposta imune frente à esquistossomose em modelo murino. Outros dados

foram obtidos pelos estudos adjacentes referentes ao mesmo projeto, determinando uma

análise fenotípica das populações celulares e das citocinas presentes no fígado de animais

jovens e idosos, nas fases aguda e crônica da esquistossomose experimental. Observou-se que

animais idosos apresentaram elevada concentração de interleucina-10 (IL-10) desde a fase

aguda de infecção, mantendo esses altos níveis na fase crônica de infecção. Já animais jovens

apresentaram maior flexibilidade, com aumento da IL-10 frente à exposição ao novo antígeno,

tanto do ovo (SEA) quanto do verme (SWAP) de S. mansoni. Em relação ao IFNγ, altos

níveis foram apresentados pelos animais idosos, sugerindo uma ativação precoce, com

pequena alteração frente ao antígeno e leve aumento na fase crônica de infecção, enquanto

que animais jovens apresentaram aumento de IFNγ frente aos antígenos tanto na fase aguda

quanto na fase crônica de infecção por S. mansoni. Dados complementares forneceram

informações referentes ao percentual de células virgens e ativadas nos animais. Animais

jovens apresentaram maior nível percentual de células virgens que animais idosos (T

CD4+CD62L+, por exemplo). Além disso, há leve diminuição desse percentual nos animais

jovens da fase aguda para a fase crônica, demonstrando mais uma vez a flexibilidade, em

contraste a uma manutenção de mesmos níveis percentuais de células virgens em animais

idosos nas fases aguda e crônica de infecção. Em relação às células ativadas (T

50

CD4+CD45RBhi+, por exemplo), jovens apresentam a mesma característica de flexibilidade

demonstrada pelo aumento no percentual dessas células da fase aguda para a fase crônica de

infecção enquanto animais idosos apresentaram pequena alteração nesse percentual de células

ativadas. Esse perfil apresentado pelos animais jovens sugere então maior adaptabilidade e

flexibilidade fenotípica frente a um novo antígeno e um padrão parcialmente modulado e

refratário por parte dos animais idosos, que pode ser explicado em parte pela supressão de

moléculas co-estimuladoras devidos aos altos níveis de IL-10 (Speziali et al., 2009).



INFECÇÃO.

Após a deposição dos ovos nos tecidos, eles são rapidamente cercados por infiltrados de

células inflamatórias, resultando no granuloma. Esse é um processo dinâmico no qual o

tamanho e a composição celular do granuloma variam com o tempo sendo regulado por uma

rede de mediadores inflamatórios. Durante o desenvolvimento da resposta granulomatosa na

esquistossomose, observa-se um recrutamento celular intenso (infiltrado inflamatório) cuja

composição principal é de eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos (Conlon, 2005;

Rumbley, et al., 1999; Wynn & Cheever, 1995; Weinstock, 1992). O extenso infiltrado

celular (expressão da inflamação) foi avaliado, neste estudo, através da diferença entre a

celularidade presente no tecido hepático dos animais infectados em relação ao tecido hepático

dos animais não infectados (controle).

Ao analisar a celularidade tecidual de animais jovens e idosos com 70 e 120 dias de

infecção, notou-se que a celularidade e infiltrado celular foi maior nos camundongos

infectados que no grupo controle, exceto para o grupo de idosos durante a fase crônica de

infecção (dados não mostrados graficamente). A análise realizada dessa maneira permite

caracterizar como processo inflamatório, o aumento da celularidade, marcado pelo aumento

do infiltrado celular no tecido hepático. Esse resultado já era esperado, uma vez que a

presença dos ovos do parasito desencadeia uma resposta inflamatória do tipo granulomatosa

caracterizada pela presença de macrófagos, eosinófilos e linfócitos (Chiaramonte et al. 2001;

Weinstock, 1992; Warren, 1972; Warren 1968; Cheever & Andrade 1967).

51

Comparando-se os grupos de camundongos infectados durante a fase aguda da infecção,

observou-se que a celularidade tecidual foi maior nos camundongos idosos (I 70) quando

comparado à celularidade tecidual dos animais jovens (J 70) (p=0,0305) (Figuras 5 e 6). Não

houve diferenças entre os grupos de camundongos jovens e idosos com 120 dias de infecção

(J 120 – I 120). Entretanto, pode-se notar uma leve tendência de diminuição de celularidade

no grupo de animais idosos da fase aguda para a fase crônica de infecção (P= 0,0583)

(Figuras 5 e 6).

Corroborando com a hipótese de que os animais idosos, por terem um repertório de

células T de memória maior que o de indivíduos jovens, poderiam responder à infecção de

uma forma mais rápida. E que a redução na geração de células T virgens, poderia levar a uma

incapacidade parcial do sistema imune senescente de amplificar a sua resposta. Além disso,

existem relatos de alterações nos fenótipos das células T periféricas com a idade, tais como

mudanças em receptores de adesão (CD44), nos receptores ligados a migração de linfócitos

para linfonodos periféricos (CD62L) e a diminuição na expressão das cadeias γ e β do

receptor de IL-2 (importante na proliferação celular). Essas alterações poderiam justificar a

diferença de migração leucocitária para o local da infecção entre animais idosos e jovens.

Vale salientar que o aumento de células inflamatórias ocorre para aumentar a modulação do

granuloma e diminuir seu tamanho (Timm & Thoman, 1999; Kurashima & Utsuyama, 1997;

Wakikawa et al, 1997; Barrat et al., 1995; Ernst, 1993).

É importante salientar que alterações nos fenótipos de células T podem levar a uma

mudança no perfil de citocinas, gerando assim, uma alteração da resposta aos antígenos pela

modificação no ambiente imunológico. Estudos sugerem que células T virgens de

camundongos idosos tenham uma reduzida ativação, diferenciação e produção de citocinas.

Células Th1 e Th2 de memória derivada de células T virgens senescentes produzem muito

menos IL-2 e, IL-4 e IL-5, respectivamente, que células jovens (Haynes et al, 2005, 2003).

52

6.3 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO FÍGADO DE


INFECÇÃO.

A análise da neoformação de colágeno no fígado dos animais infectados mostrou que

animais infectados apresentaram um maior deposito de colágeno quando comparado aos seus

controles (dados não mostrados graficamente). Resultado esperado, pois a neoformação de

colágeno ocorre em resposta aos antígenos do ovo durante a infecção pelo S. mansoni.

Entretanto não houve diferenças entre os grupos de animais infectados jovens e idosos,

durante infecção aguda e crônica (Figuras 7 e 8). Houve uma leve tendência de aumento de

depósito de colágeno tecidual em animais idosos na fase crônica (I 120), entretanto não foram

encontradas diferenças estatisticamente significativas, devido, provavelmente, ao número de

animais.

6.4 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO BAÇO DE


INFECÇÃO.

O baço é um órgão linfóide secundário que responde a antígenos sistêmicos por receber

antígenos drenados pelo sistema vascular (Pinchuk and Filipov, 2008). O sangue entra no

baço por uma rede de vasos, esses antígenos são seqüestrados e concentrados por células

dendríticas e macrófagos, e então apresentados aos linfócitos, iniciando assim uma resposta

ao antígeno apresentado (Pinchuk and Filipov, 2008).

Comparando a neoformação de colágeno no baço, observou-se que todos os animais

infectados apresentaram maior deposição de colágeno comparado aos seus controles, com

exceção do grupo de jovens eutanasiados com 70 dias de infecção. Da mesma forma que nos

outros aspectos histopatológicos já analisados, a resposta de deposição de colágeno é esperada

que seja maior nos infectados que nos animais não infectados, sugerindo que essa deposição

seja desencadeada pela infecção (dados não mostrados graficamente). Ao analisar os grupos

de animais infectados entre si, observou-se que os animais jovens apresentaram uma maior

deposição de colágeno no baço durante a infecção crônica (J 120) quando comparado a jovens

53

na fase aguda (J 70) (Figuras 9 e 10). Durante a infecção aguda de animais jovens, a resposta

é observada mais localmente no tecido hepático e não sistemicamente. Mas com a passagem

da fase aguda para a fase crônica, inicia-se, então uma maior resposta no baço. Isso sugere

que, enquanto na fase aguda, os antígenos estimulariam células mais localmente no tecido

hepático, com o decorrer da infecção, esses antígenos se espalhariam pelo sistema vascular,

gerando assim, uma resposta mais sistêmica expressa pela resposta esplênica a esses

antígenos, como por exemplo, ativação de fibroblasto e conseqüente produção de colágeno.

Durante a fase aguda de infecção, o grupo de camundongos idosos (I 70) apresentou

maior neoformação de colágeno quando comparado com camundongos jovens (J 70) (Figuras

9 e 10). Reforçando, então, a idéia de que o sistema imune senescente possui um repertório de

células ativadas maior, possibilitando a esses animais responderem precocemente já numa

fase aguda da infecção.

Diferentemente do observado em animais jovens, os animais idosos não apresentam

modificação no que diz respeito à deposição de colágeno. Tal resultado sugere que os animais

jovens com maior pool de células virgens amplificariam sua resposta ao longo da infecção

enquanto os idosos possuem uma menor capacidade de aumentar sua resposta, permanecendo

com a mesma resposta da fase aguda para a crônica. Isso pode ser reflexo de uma

adaptabilidade e flexibilidade do jovem de uma fase aguda para crônica. Sabe-se que o

processo de envelhecimento é acompanhado de uma modificação no padrão celular quando

comparamos animais jovens e idosos. Há uma modificação de um padrão de maior quantidade

de células virgens, maior contribuição do Timo, maior diversidade celular e menor quantidade

de células de memória em animais jovens, passando para um padrão de maior fenótipo de

células de memória, mínima contribuição do Timo e pequena diversidade celular nos animais

idosos (Berzins et al., 2002).

6.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS.

Os dados parasitológicos demonstraram que as diferenças observadas no presente estudo não

se devem à carga parasitária. Dessa forma, torna-se ainda mais relevante o processo de

senescência como fator responsável pelas alterações observadas.

54

7 CONCLUSÃO

O estudo proposto fornece evidências que suportam a hipótese de uma capacidade do

organismo senescente de modular sua resposta já no inicio da infecção por S. mansoni e uma

menor capacidade desse organismo de amplificar sua resposta a novos antígenos. Além disso,

sugere que essa menor capacidade pode ser resultado das mudanças no sistema imune, tanto

na arquitetura de tecidos de órgãos linfóides, como no fenótipo de células do sistema

imunológico. Sugere-se também uma refratariedade parcial no que diz respeito à resposta

imune apresentada pelos animais idosos frente à resposta granulomatosa. Essas características

determinam o desenvolvimento histopatológico diferenciado da resposta granulomatosa e

inflamação no fígado, e da fibrose hepática e esplênica de animais idosos quando comparados

com animais jovens, possibilitando inferir uma grande influência do processo de senescência

no desenvolvimento da esquistossomose mansoni murina.

55

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CLAUDIO HENRIQUE MAGALHÃES ARANHA · 2011-08-09 · Biológicas da UFOP pelo constante apoio e...

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