CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Purification et caractérisation des...

CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1

CHMI 2227FBiochimie I

Purification et caractérisation des protéines


Purification des protéines Les protéines sont toujours retrouvées en tant que composantes d’un mélange

complexe incluant d’autres macromolécules biologiques;

Alors que certaines protéines sont très abondantes (anticorps sanguins), d’autres ne sont rencontrés qu’en quantités très infimes (quelques molécules par cellule);

La première étape dans l’étude de la structure/fonction d’une protéine sera donc toujours sa purification;

À partir d’un échantillon biologique contenant la protéine d’intérêt, on effectue une série d’expériences effectuées séquentiellement qui permettront progressivement d’obtenir la protéine désirée sour forme « pure »;

La purification d’une protéine est grandement facilitée si on connaît au départ: Les caractéristiques physico-chimiques générales de la protéine: Mr, pI, solubilité; Si une méthode expérimentale permet de détecter la présence de la protéine

(réactifs, réaction enzymatique, effect physiologique, etc).


Purification des protéines Procédure générale

Homogénéisation

Extrait protéique brut

Étapes de purification grossières

Chromatographie 1, 2, 3….x étapes

PURE!(bon, bin, j’espère…)

Détection de la présence de la protéine d’intérêt: - Activité- Pureté- Quantité


Purification des protéines 1. Méthodes grossières Basées sur la solubilité de la protéine d’intérêt sous différentes

conditions: pH Température Force ionique (i.e. concentration en sels);

L’idée de base est d’utiliser des conditions expérimentales qui feront précipiter beaucoup de protéines de notre extrait brut, tout en laissant notre protéine d’intérêt en solution;

Permet de nous débarrasser d’une bonne partie des «cochonneries » présentes dans l’extrait brut;


Précipitation différentielle1.1. Précipitation par modification du pH La solubilité des protéines est rendue

possible par des interactions entre les chaînes latérales et le solvant:

Si le solvant est l’eau: Liaisons hydrogène Interactions électrostatiques

Si le solvant est non-polaire: Interactions hydrophobes;

Ces interactions peuvent être modifiées en changeant la charge nette de la protéine, donc en modifiant le pH du solvant;

De manière générale, les protéines précipitent lorsque le pH de la solution est égal au pI de la protéine:

Les protéines s’aggrègent et formeront des agglomérats qui précipiteront.

pHso

lubi

lité

pI


Précipitation différentielle 1.2 «Salting out » La solubilité des protéines peut aussi être

modifiée en altérant la concentration de sel dans l’extrait;

Les sels ajoutés prendront la place de l’eau autour de la protéine;

Les sels neutraliseront les charges des chaînes latérales de la protéine;

Ces deux evènements favoriseront l’aggrégation et la précipitation des protéines;

Généralement, le « salting out » est fait par l’ajout de sulfate d’ammonium:

(NH4)2SO4 Plus soluble dans l’eau que le NaCl; Requiert une quantité moins grande que le

NaCl pour précipiter les protéines.

Une protéine donné précipitera généralement lorsqu’une concentration spécifique de (NH4)2SO4 est atteinte;

Ceci permet de nettoyer notre extrait brut de manière séquentielle;

Les protéines précipitées sont alors jetées à la poubelle, ou sujettes à la dialyse (pour enlever le sel de l’échantillon);

http

://w

ww

.tul

ane.

edu/

~bi

oche

m/m

ed/p

ure.

htm


Précipitation différentielle 1.2.Salting out

PRECIPITATION!!


Précipitation différentielle 1.2.Salting out

Centrifugation: Séparation selon la

densité;

Les molécules denses (i.e. grosses) vont sédimenter (former un culot) plus vite que les molécules moins denses (i.e. plus petites);

Mélange de protéines dans un tampon:A: précipite à [ ] sel = 15%B: précipite à [ ] sel = 25 %C: précipite à [ ] sel = 35%

1) Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 20%

2) Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées

Culot: protéine A

Surnageant: protéines B + C

1) Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 30%

2) Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées

Culot: protéine B

Surnageant: protéine C


Centrifugation Technique très utilisée permettant de séparer des

substance via l’application d’une force centrifuge;

L’intensité de la force centrifuge devant être appliquée varie selon la nature de la substance à séparer:

500 x g pour cellules entières 15 000 x g pour les mitochondries 150 000 x g pour les ribosomes

Note: 1 x g = force gravitationnelle terrestre au niveau de la mer (~ 9.8 m/s2)

Les substances particulaires vont atteindre le fond du tube (i.e., elles forment un culot)

Le liquide résiduel est appelé le surnageant.

Peut aussi être utilisé pour séparer des substances particulaires de densité différente (les substances plus denses sédimenteront plus rapidement que celles qui sont moins denses.

e.g. séparation des érythrocytes et leucocytes


Dialyse Parce que le sel ajouté pour le

« salting out » inhibe l’activité des protéines, il doit être enlevé avant de continuer la purification;

Ceci est fait par dialyse;

La solution de protéine est simplement introduite dans un sac fabriqué d’une membrane semi-perméable:

Perméable aux petites molécules (e.g. sels);

Imperméable aux protéines;

Permet aussi de changer de tampon avant de procéder à l’étape suivante.

Heures


Purification des protéines2. Méthodes fines

Après avoir utilisé des méthodes grossières afin de concentrer notre protéine favorite, on utilise des méthodes plus raffinées afin de purifier notre protéine le plus possible;

Ceci est fait généralement en utilisant différents types de chromatographie:

Échange d’ions; Tamisage moléculaire; Affinité

Ceci est fait généralement en utilisant la Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC).

Colonne

Collecteur de fractions

Réservoir de tampon

Pompes

Injecteur (échantillon)


Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions Permet de séparer les protéines

selon leur charge

Le mélange de protéines est placé dans un tampon dont le pH permet à notre protéine d’avoir une charge précise;

Le mélange est ensuite déposé sur la colonne de séparation;

Échange de cations: Phosphocellulose Carboxyméthyl (CM) cellulose

Échange d’anions: Diéthylaminoéthyl (DEAE) cellulose


Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions

DesorptionAdsorption

Anion exchanger

NaCl

Même si un changement de tampon avec un pH différent permettrait d’éluer la protéine d’intérêt, ceci est rarement effectué car le changement de pH pourrait dénaturer la protéine ou, pire, la faire précipiter;

L’élution est faite en ajoutant un tampon contenant une concentration de sel (NaCl) qui empêche la protéine de lier la colonne;

L’élution peut être faite à l’aide d’un gradient linéaire de concentration de sel, ou par étapes;

Exemple de chromato. à échange de cations


Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions

Changement linéairede concentration de NaCl

Changement brusque de concentration de NaCl

Ajoute tampon


Purification des protéines 2.2. Tamisage moléculaire

Aussi appelé chromatographie par filtration sur gel ou chromatographie d’exclusion;

Consiste en de petites billes contenant des pores d’une taille spécifique:

Les protéines plus grosses que les pores n’entrent pas dans les billes, ont moins de volume à traverser et vont éluer en premier;

Les protéines plus petites que les pores vont entrer dans les billes de leur élution sera retardée: elles élueront donc plus tard.;

Les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire;

La disponibilité de différents types de billes possédant des pores de différentes tailles permet la sélection du matériel de chromatographie qui donnera le meilleur résultat;

CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 16http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_Prod~SelGuides~Media~GFSelG


Purification des protéines 2.2. Tamisage moléculaire

La filtration sur gel a plusieurs applications: 1) Purification des protéines

2) Désalage PAS la même chose que le salting out; Les pores sont si petits que toues les

protéines éluent rapidement et seuls les sels voient leur élution retardée;;

3) Détermination de la masse moléculaire:

Nécessite d’abord la calibration de la colonne avec des standards protéiques (un mélange de protéines de Mr connu);

Permet de déterminer si la protéine d’intérêt fait parti d’un complexe multimérique. POURQUOI?


Purification des protéines2.3. Chromatographie d’affinité

Dans ce type de chromatographie, des billes sont couplées à une molécule appelée ligand qui a la propriété de lier uniquement la protéine d’intérêt;

Ligand: anticorps, substrat, métaux, autre macromolécule pouvant lier la protéine d’intérêt.

Lorsqu’un mélange de protéines est filtré dans cette colonne, seule la protéine d’intérêt sera retenue: les autres protéines contaminants seront éluées;

La protéine d’intérêt est alors récupérée par l’ajout d’un excès du ligand libre à la colonne;

C‘est une méthode très puissante, mais avec des limites importantes:

Le milieu de séparation est très dispendieux (pas approprié pour des séparations à grande échelle)

Disponibilité limité des billes liées au ligand d’intérêt;

Nécessite la connaissance préalable du ligand pouvant lier spécifiquement la protéine d’intérêt (ce qui est rarement le cas).


Analyse des protéinesÉlectrophorèse Pendant toutes les étapes de purification, la présence et la pureté des la

protéine d’intérêt doivent être déterminés;

Aussi, on a besoin de méthodes permettant d’étudier des protéines sans avoir à les purifier;

Les méthodes les plus populaires pour analyser les protéines sont basées sur le principe de l’électrophorèse;

L’électrophorèse implique la séparation de protéines via leur migration dans un gel lorsqu’elles sont soumises à un champ électrique.

Le matériel habituel pour séparer les protéine par électrophorèse est le polyacrylamide


Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS En PAGE-SDS, les protéines sont tout d’abord

placées dans un tampon contenant le détergent docécyl sulfate de sodium (SDS);

Le SDS recouvre toutes les protéines de façon similaire: on retrouvera environ 1 molécule de SDS par 2 acides aminés;

Ceci a la conséquence importante de donner à chaque protéine la même densité de charge négative, indépendamment du pI de la protéine.

Le -mercaptoéthanol (HS-CH2-CH2-OH) est aussi ajouté fréquemment (mais pas toujours) afin de briser les ponts disulfures.

Donc, en PAGE-SDS, la seule variable qui affectera la migration des protéines dans le gel est leur taille;

SDS


Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS

http://wine1.sb.fsu.edu/bch5425/lect20/lect20.htm

ww

w.biology.ucsd.edu/classes/bggn224.F

A06/crash_2.ppt



Les protéines sont alors placées dans un puits du gel PAGE-SDS, et soumises à un champ électrique;

Le protéines migreront alors vers l’anode positive: la distance migrée dépendra de la taille des protéines;

Les protéines sont visualisées à même le gel grâce à un colorant bleu appelé Bleu de Coomassie;

En plaçant, dans un puits adjacent, un mélange de protéines de masse moléculaire connue (standard de protéines), on peut déterminer la masse moléculaire de la protéine d’intérêt;

À noter: le traitement au SDS et -ME dénature les protéines et brise toutes les interactions entre protéines: la protéine migrera donc en tant que simple chaîne polypeptidique.

En certaines occasions, un PAGE NATIF est effectué: dans cette situation, on n’inclus pas le SDS ni le -ME. Ceci permet d’étudier des protéines faisant parti de complexes multimériques. POURQUOI?



Log

Mr

Distance migrée à partir du puits (cm)


Électrophorèse2. Focalisation isoélectrique Ici, les protéines sont séparées selon leur pI;

Un mélange de protéines est placé dans les puits d’un gel d’acrylamide contenant un gradient de pH sur toute sa longueur;

En soumettant les protéines à un champ électrique, elles migreront dans le gel selon leur charge: Protéines chargée positivement migreront vers la cathode négative; Protéines chargées négativement migreront vers l’anode positive;

Lorsqu’une protéine atteint une zone du gel où pH = pI, elles sera neutre et arrêtera de migrer;

Cette méthode permet donc de déterminer le pI de la protéine d’intérêt;


Électrophorèse2. Focalisation isoélectrique

pH in gel = pI of proteins


Électrophorèse3. Électrophorèse à deux dimensions Ici, les protéines sont d’abords

séparées en fonction de leur pI par focalisation isoélectrique.

Ensuite, la bande de gel de focalisation isoélectrique est placée sur un gel de PAGE-SDS: les protéines seront alors séparées selon leur Mr;

Cette méthode très puissante permet d’obtenir une très grande résolution dans la séparation de protéines présentes dans un mélange complexe.


Électrophorèse3. Électrophorèse à deux dimensions

Chaque tache est une protéine


Électrophorèse 4. Analyse Western Application très puissante du PAGE-

SDS;

Permet la détection d’une seule protéine présente dans un mélange très complexe;

Basé sur la propriété des anticorps de lier une seule molécule avec une très grande affinité;

Anticorps: 4 chaînes: 2 chaînes légères (25 kDa

chacune) et 2 chaînes lourdes (50 kDa chacune);

Chaque anticorps possède deux sites de liaison pour un même antigène (antigène: la molécule pouvant être liée spécifiquement et uniquement par l’anticorps).

Structure d’un anticorps


Électrophorèse 4. Analyse Western


Purification des protéines Exemple et analyse des données

À chaque étape, on prélève 3 échantillons: Un pour déterminer la quantité

de protéines présentes; Un pour mesurer l’activité de

la protéine; Un pour faire un gel PAGE-

SDS Le reste de la fraction est

soumise à l’étape de purification suivante;


Purification des protéines Exemple et analyse des données

Gel de PAGE-SDS coloré au Bleu de Coomassie


Purification des protéinesExemple et analyse des données

Informations importantes à obtenir afin d’évaluer le succès de la purification (surtout lorsqu’on met au point la méthode de purification): Activité spécifique (unités/mg): Activité totale (U)/ Protéine totale (mg) Rendement: (Activité totale à étape Y / Activité totale dans l’extrait brut) x

100; Niveau de purification: Activité spécifique à l’étape Y / Activité spécifique

dans l’extrait brut;


Séquençage des protéines

Toutes les propriétés structurales et fonctionnelles des protéines dépendent de l’ordre des acides aminés dans le polypeptide (sa séquence);

La structure 3-D d’une protéine est uniquement attribuable à la séquence en acides aminés de la protéine;

Plusieurs maladies héréditaires sont causées par une changement (insertion, délétion, substitution) d’un ou plusieurs acides aminés dans une protéine;

Les acides aminés importants dans la structure/fonction d’une protéine ne varient généralement pas toujours au cours de l’évolution. La comparaison de séquences en acides aminés de protéines provenant de

plusieurs espèces permet de révéler des fonctions/propriétés de la protéine d’intérêt.


Séquence des protéines - anémie falciforme

L’hémoglobine est un tétramère fait de 2 copies chacun de 2 polypeptides: HbA et HbB

L’anémie falciforme est causée par une mutation héréditaire dans la chaîne HbB:

Glu remplacé par Val

Crée une région hydrophobe (pourquoi?) qui mène à l’agrégation de l’hémoglobine mutée (appelée HbS).

Cette HbS agrégée forme de longs filaments qui changent la forme des érythrocytes. Ces érythrocytes allongés bloquent le flot sanguin. Ces cellules allongées sont aussi très fragiles et vont facilement éclater, causant une anémie.

MAIS: parce que le parasite causant la malaria pousse dans les érythrocytes, les gens souffrant d’anémie falciforme sont plus résistant à la malaria.

Globule rouge normal

Globule rouge falciforme


Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes

Enzyme Acide aminé Site de coupure

Trypsine Arg/Lys C-ter

Chymotrypsine Phe/Trp/Tyr C-ter

Protéase V8 Asp/Glu C-ter

Pepsine Phe/Trp/Tyr N-ter

Thermolysine Leu/Ile/Trp/Tyr/ Val/Ala/Phe

N-ter

Carboxypeptidase A

Tous les a.a. en C-ter., sauf Pro,

Arg/Lys

- Libère l’acide aminé C-ter

- Ne coupe pas si Pro est l’avant dernier acide aminé.

Carboxypeptidase B

Seulement Arg/Lys quant C-

ter.

Basé sur la propriété de réactifs chimiques/enzymes de couper le lien peptidique à un endroit très précis;

Réactif Acide aminé

Site de coupure

Bromure de cyanogène Met C-ter

-mercaptoéthanol Cys Ponts disulfure

Iodoacétate Cys Prévient la réduction des ponts disulfure

1) 1-Fluoro-2,4

dinitrobenzène (FDNB)

2) Chlorure de dansyl

3) Chlorure de dabsyl

Détruit tous les acides aminés sauf ceux en N-ter.

Hydrazine Détruit tous les acides aminés sauf ceux en C-ter.

NOTE: Trypsine, Chymotrypsine, protéase V8, pepsine et thermolysine ne COUPENT PAS si Pro fait partie du lien peptidique.


Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 1


Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 2

HCl 6M: Ala, Gly2, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr

CNBr: 2 peptides sont obtenus: Peptide 1: Ala, Gly, Lys, Thr Peptide 2: Gly, Met, Ser, Tyr

Trypsine: 2 peptides sont obtenus: Peptide 3: Ala, Gly Peptide 4: Gly, Lys, Met, Ser, Thr,

Tyr

Chymotrypsine: 2 peptides sont obtenus:

Peptide 5: Gly, Tyr Peptide 6: Ala, Gly, Lys, Met, Ser,

Thr

FDNB: donne Gly

Carboxypeptidase A: donne Gly

Les données suivantes ont été obtenus après traitement d’un octopeptide:

Quelle est la séquence de ce peptide?


Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman

Basé sur l’utilisation du phényl isothiocyanate (aka PTC; réactif d’Edman);

Le PTC réagit avec et marque l’acide aminé en N-terminal du peptide;

L’acide aminé marqué au PTC est libéré du peptide et identifié par chromatographie;

Plusieurs cycles de marquage et libération permettent de déterminer la séquence du peptide.


Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman

Identification


Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse Technique à la mode très puissante, permettant d’identifier et de séquencer

les protéines;

Les protéines sont vaporisées en fragments ionisés à l’aide d’un rayon laser;

Même des protéines coupées d’une gel PAGE-SDS peuvent être utilisées!!!

Les fragments sont séparés et leur masse moléculaire déterminée;

À partir de la masse moléculaire, le peptide peut être identifié;

En spectrométrie de masse en tandem (MS-MS), des fragments obtenus après une première ronde de MS sont sélectionnés pour une deuxième ronde de fragmentation et analyse: la masse de ces petits fragments permet de séquencer les fragments peptidiques.


Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse

Exemple de purification de protéine Apoptose: un type de mort cellulaire


Normale

Apoptose

Autophagie

Nécrose

Cu

rren

t Op

inio

n in

Ce

ll Bio

log

y 2

00

4, 1

6:6

63

–6

69

45

Apoptose –aspects morphologiquesht

tp://

ww

w.n

atur

e.co

m/n

rm/jo

urna

l/v9/

n3/e

xtre

f/nrm

2312

-s1.

mov

Blebbing

Shrinkage

Fragmentation

46

Apoptose –aspects morphologiques

http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n3/extref/nrm2312-s1.mov

47

Apoptose et physiologie

http://www.wikiwak.com/image/Celldeath.jpg

Exemple de purification protéique Acinus: une protéine impliquée dans la mort cellulaire


NATURE |VOL 401 | 9 SEPTEMBER 1999

49

Condensation de la chromatine et fragmentation du noyau pendant l’apoptose

Nature Reviews| molecular cell biology volume9 | march2008 | 231

Lane 1, 100,000g supernatant (3.4mg);

lane 2, HiTrap-Q(1.7mg); lane 3, Heparin Sepharose after

passing the hydroxyapatite column (150 ng);

lane 4, Phenyl Sepharose (70 ng);

lane 5, Superose 12 (50 ng); lane 6, Mono-Q (2.5 ng).

Arrowhead, position of purifed Acinus p17 protein.



CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Purification et caractérisation des...

Documents

Transcript of CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Purification et caractérisation des...