Check-direct CPE IFU 080-03 FR 05Sept2013check-points.nl/downloads/manuals/Check-Direct_CPE... ·...

1Check-Direct CPE Mode d'emploi Version 1.1, publiée le 05-09-2013

Manuel d’utilisation

Check-Direct CPE Kit de PCR en temps réel pour la détection des entérobactéries productrices de carbapénémases Version 1.1 Date de publication : 05.09.2013

18-0080

48

080-03

Disponible sur les appareils : ABI 7500 Light Cycler®480 I&II CFX96™ Rotor-Gene Q

CHAMPS D’APPLICATION ....................................................................................................2 INTRODUCTION ...................................................................................................................2 PRINCIPE DU TEST DIAGNOSTIQUE .....................................................................................2 CONTENU DU KIT (POUR 48 RÉACTIONS) ............................................................................2 STOCKAGE, MANIPULATION ET STABILITÉ ..........................................................................2 MATÉRIEL REQUIS, NON FOURNI ........................................................................................3 PRECAUTIONS D’EMPLOI ET RECOMMANDATIONS .............................................................3 PRÉLÈVEMENT ET EXTRACTION DE L'ADN ...........................................................................4

1. PRÉLÈVEMENT SUR L'HUMAIN ................................................................................................ 4 2. EXTRACTION DE L'ADN DES PRÉLÈVEMENTS PÉRI-ANAUX OU RECTAUX AVEC LE NUCLISENS®

EASYMAG® ............................................................................................................................ 4 3. PRÉPARATION DES TÉMOINS POSITIF ET NÉGATIF ........................................................................ 4

ANALYSE PCR EN TEMPS RÉEL .............................................................................................4 1. MISE EN PLACE DE LA RÉACTION DE PCR EN TEMPS RÉEL ............................................................. 4 2. PARAMÈTRES DU SYSTÈME ABI 7500 ...................................................................................... 5 3. PARAMÈTRES DU SYSTÈME LC®480 I&II ................................................................................ 5 4. PARAMÈTRES DU SYSTÈME CFX96™ ....................................................................................... 5 5. PARAMÈTRES DU SYSTÈME ROTOR-GENE Q .............................................................................. 5

ANALYSE DES DONNÉES ......................................................................................................6 1. AVEC LE SYSTÈME ABI 7500 .................................................................................................. 6 2. AVEC LE SYSTÈME LC®480 I&II ............................................................................................ 6 3. AVEC LE SYSTÈME CFX96™ ................................................................................................... 7 4. AVEC LE SYSTÈME ROTOR-GENE Q .......................................................................................... 7

FOIRE AUX QUESTIONS (FAQ) – PROBLÈMES & SOLUTIONS ................................................8 PERFORMANCES ET VALIDATIONS ......................................................................................9 LEGENDE ........................................................................................................................... 10 LIMITES DU TEST ............................................................................................................... 11 ASSISTANCE TECHNIQUE ................................................................................................... 11


Champs d’application

Check-Direct CPE est un test diagnostic in vitro pour la détection rapide des gènes de carbapénémases directement dans les prélèvements péri-anaux et rectaux. Check-Direct CPE détecte la présence des gènes des carbapénémases KPC, NDM, VIM et OXA-48, qui sont actuellement les facteurs primaires de la production de carbapénémases chez les Entérobacteriaceae. L'analyse est exécutée avec un appareil automatique de PCR en temps réel, sur les prélèvements péri-anaux ou rectaux effectués sur les individus courant un risque de colonisation par des entérobactéries productrices de carbapénémases. Check-Direct CPE peut aider à identifier, prévenir et maîtriser la diffusion des entérobactéries productrices de carbapénémases susceptibles de coloniser des patients dans le milieu hospitalier. Check-Direct CPE n'est pas conçu pour diagnostiquer les infections dues aux entérobactéries productrices de carbapénémases, ni pour diriger ou surveiller le traitement de telles infections. Des cultures parallèles sont nécessaires pour récupérer les organismes et déterminer leur typologie épidémiologique, effectuer les tests de susceptibilité et confirmer l'identification.

Introduction

L'émergence et la dissémination mondiales de la résistance aux carbapénémases parmi les entérobactéries constituent un danger grave pour la santé publique. Ces organismes s'accompagnent d’un taux de mortalité élevé et ils sont susceptibles de se propager à grande échelle. La cause la plus courante de la résistance aux carbapénèmes est l'expression des gènes codant des carbapénémases par les entérobactéries dites productrices de carbapénémases (Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae ou CPE). Les CPE ont une résistance accrue ou totale aux carbapénèmes et à la plupart des autres antibiotiques bêta-lactamine. À l’heure actuelle, la grande majorité des CPE contiennent une des carbapénémases suivantes encodées dans une structure plasmidique : KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), VIM (Verona integron–encoded metallo-β-lactamase), NDM (New Delhi metallo-β-lactamase) ou OXA-48 (Oxacillinase-48). De plus, les CPE ont souvent d'autres composants déterminant des résistances autres qu'aux bêta-lactamines, ce qui donne lieu à des isolats résistants à plusieurs antibiotiques, voire à tous. Lorsqu'un patient est porteur de CPE, c'est plus souvent par colonisation du côlon. Par conséquent, le prélèvement rectal par écouvillon fournit un spécimen approprié pour la détection des CPE, et le prélèvement péri-anal peut constituer une alternative non invasive. Check-Direct CPE est un test rapide par PCR en temps réel pour détecter et différencier KPC, NDM/VIM et OXA-48 dans les prélèvements péri-anaux et rectaux.

Principe du test diagnostique

L'analyse Check-Direct CPE est basée sur la reconnaissance et l'amplification spécifiques par PCR de séquences cibles, et sur la détection simultanée de l'accumulation des produits de l'amplification au moyen de sondes ADN fluorescentes. Une molécule d'ADN servant de contrôle interne est ajoutée à l'échantillon clinique avant que l’ADN ne soit extrait ; elle permet de vérifier que l'extraction de l'ADN et l'amplification par PCR se sont bien déroulées. Cinq sondes moléculaires, marquées avec 4 fluorophores différents, sont utilisées pour détecter les différentes carbapénémases et l'ADN de contrôle. Check-Direct CPE différencie KPC, NDM/VIM et OXA-48. Pour chacun des 4 gènes de carbapénémases (KPC, OXA-48, NDM et VIM), de nombreux variants génétiques existent. Les amorces PCR et les sondes fluorescentes de Check-Direct CPE sont sélectionnées de façon à cibler des segments homologues de ces gènes de carbapénémases, ce qui permet une détection fiable des différents variants des gènes.

Contenu du kit (pour 48 réactions)

Composants (No.Mat.) Description Conditions de stockage

CPE PCR Mastermix (9-0080) 1 tube et capuchon transparents 630µl + 4°C

Solution CPE (9-0071) 1 tube marron (marque violette �) 140 μl

- 20°C, stocker à l'abri de la lumière

Contrôle interne, IC (9-0077) 1 tube (marque rouge �) 300 μl

Témoin négatif (9-0070) 1 tube (marque blanche �) 100 µl

Témoin positif KPC (9-0073) 1 tube (marque verte �) 100 μl

Témoin positif NDM (9-0075) 1 tube (marque or �) 100 μl

Témoin positif VIM (9-0074) 1 tube (marque jaune �) 100 μl

Témoin positif OXA-48 (9-0076) 1 tube (marque orange �) 100 μl

Mode d'emploi (9-0078) Brochure – à télécharger online Non critique

Stockage, manipulation et stabilité

Les réactifs du kit Check-Direct CPE sont expédiés réfrigérés. Le PCR Mastermix CPE doit être stocké à +4°C dès la réception. Tous les autres réactifs doivent être stockés à -20°C dès la réception. Veuillez procéder à l'examen visuel de l'emballage lors de la première ouverture pour vous assurer que le contenu est intact. Les solutions du kit Check-Direct CPE ne doivent pas être soumises à plus de 12 cycles décongélation-recongélation. Si vous avez d'autres questions, veuillez contacter Check-Points à l’adresse courriel suivante : [email protected] . Stockez les réactifs du kit à la température indiquée jusqu'à la date de péremption.


Matériel requis, non fourni

Matériel et consommables Équipement

• Kit d'extraction NucliSENS® easyMAG® (bioMérieux, France)

• Écouvillons pour la collecte et le transport de prélèvements rectaux et péri-anaux (par exemple : Sigma-transwabs (Medical Wire & Equipment, UK) ou Eswab™(Copan Diagnostics, US) dans le milieu de transport Amies).

• Gants de laboratoire jetables (sans poudre)

• Blouse de laboratoire

• Micropipettes automatiques et cônes (à filtres) jetables pour volumes de 1 à 1000 μl

• microtubes de 1,5 ml (type « Eppendorf »)

• Plaque de PCR à 96 puits, transparente, à l'usage du ABI7500

• Plaque de PCR à 96 puits blanche à l'usage du CFX96™ et du LightCycler®480

• Couvercle de plaque PCR

• Barrette de tubes PCR avec capuchons, taille 0,1 ml (QIAGEN,US)

• À l'usage du LightCycler®480: 4-Color Compensation Set (Ref : 18-0070, Check-Points Health B.V., NL)

• Plateforme d'extraction NucliSENS® easyMAG® (bioMérieux, France)

• Appareil de PCR en temps réel, à choix : ABI7500 (Applied Biosystems, US) LightCycler®480 I&II (Roche, CH) CFX96™ (Bio-Rad, US); RotorGene Q 5-plex (QIAGEN, US)

• Disque pour rotor à 72 puits de 0,1 ml, anneau de verrouillage pour le rotor à 72 puits, et bloc de chargement pour 72 tubes de 0,1 ml (QIAGEN, US)

• Mixeur Vortex

• Mini centrifugeuse

• Centrifugeuse à plaques

Precautions d’emploi et recommandations

Recommandations pour obtenir des résultats optimaux

• Le test doit être exécuté par les personnes qualifiées.

• Les réactifs ne doivent pas être utilisés après leur date de péremption.

• Avant utilisation, décongeler les réactifs entièrement à température ambiante et passer brièvement au vortex pour homogénéiser les solutions, puis centrifuger les solutions pour éviter toute contamination lors de l'ouverture du capuchon.

• Respecter les recommandations en matière de stockage, de manipulation et de cycles de décongélation-recongélation pour préserver la qualité des réactifs du kit.

• Protéger les réactifs de la lumière pour éviter la dénaturation des fluorophores.

• Vérifier régulièrement l'exactitude et la précision des pipettes, ainsi que le bon fonctionnement et l'étalonnage des instruments.

Prévention des contaminations Travailler dans des pièces séparées : un labo pré-PCR et un labo post-PCR.

• L'extraction de l'ADN et la préparation des réactions d'amplification sont effectuées dans le labo pré-PCR.

• L'incubation dans le thermocycleur à temps réel a lieu dans le labo post-PCR.

• Ne jamais transférer d'objets du labo post-PCR au labo pré-PCR.

Pour éviter toute contamination du labo par des produits de la PCR :

• Utiliser des micropipettes à cône filtre hydrophobe.

• Veiller à toujours utiliser un cône de pipette neuf pour ajouter solutions, échantillons à tester et témoins aux puits de la plaque à 96 puits.

• Respecter les techniques de pipetage appropriées pour éviter toute formation d'aérosols.

• Enfiler des gants jetables neufs et une blouse de laboratoire propre pour les différentes étapes du test.

• Changer de gants aux moindres soupçons ou possibilités de contamination.

• Les tubes contenant les composants du kit et les échantillons doivent être tenus fermés autant que possible.

• Nettoyer régulièrement les plans de travail et tout l'équipement avec une solution de d'hypochlorite de sodium à 0,5 %.

Avant d’utiliser ce kit, veuillez lire attentivement le manuel et suivre scrupuleusement les instructions afin de garantir la fiabilité et la pertinence des résultats du tests.


Prélèvement et extraction de l'ADN

1. Prélèvement sur l'humain

Pour obtenir un bon prélèvement, la procédure de prélèvement doit être respectée avec soin, et des écouvillons appropriés doivent être utilisés (voir la section Matériel requis, non fourni). 1. Faire le prélèvement péri-anal ou rectal en respectant les directives locales ainsi que les

recommandations du fabricant de l'écouvillon. 2. Placer chaque prélèvement dans son récipient avec 1 ml de milieu de transport liquide. 3. Étiqueter les récipients. 4. Consulter les instructions du fabricant de l'écouvillon à propos du stockage, de la

manipulation et de la stabilité. 2. Extraction de l'ADN des prélèvements péri-anaux ou rectaux avec le NucliSENS®

easyMAG®

Points importants avant de commencer : l'extraction de l'ADN a lieu dans le labo pré-PCR. Procédure : 5. Le test Check-Direct CPE a été validé avec la procédure NucliSENS® easyMAG®

d'extraction automatisée de l'ADN pour les prélèvements péri-anaux ou rectaux dans leur milieu de transport liquide. Suivre le protocole Générique 2.0.1. du fabricant pour les prélèvements péri-anaux ou rectaux.

6. Utiliser 200 μl du liquide du prélèvement péri-anal ou rectal par échantillon, et ajouter 5 μl de la solution de contrôle interne (solution IC, �) à chaque puits de la cartouche easyMAG®. Démarrer l'extraction de l'ADN selon le protocole d'extraction Générique.

7. L'élution de l'ADN a lieu dans 70 μl de tampon d'élution. 8. L'ADN extrait se conserve jusqu'à 6 mois à +4°C ; pour une conservation plus longue,

congeler à -20°C. 9. Utiliser immédiatement la solution d'ADN pour l'analyse par PCR en temps réel, ou la

stocker comme indiqué jusqu'au moment de l'utiliser.

3. Préparation des témoins positif et négatif

les témoins positif et négatif doivent être tester pour chaque Check-Direct CPE PCR test pour valider l'analyse. Les témoins positif et négatif sont fournis dans le kit.

• Témoin(s) positif(s) Tester les témoin(s) positif(s) fournis dans le kit. Les témoins positifs contiennent le contrôle interne.

• Témoin(s) négatif(s) Utiliser le témoin négatif (�) fourni dans le kit comme un échantillon, pour la validation de l'analyse. Le témoin négatif contient le contrôle interne. Nous recommandons également d’extraire l’ADN tel qu’indiqué ci-dessus, avec la solution de contrôle interne, sur un échantillon dont on sait qu’il est negative pour le test à exécuter (exemple : un ADN négatif pour les carbapénémases, ou le tampon d'élution).

Analyse PCR en temps réel

Points importants avant de commencer :

• La préparation des réactions de PCR en temps réel a lieu dans le labo pré-PCR.

• On utilisera les paramètres et matériaux appropriés au type d'appareil de PCR en temps réel utilisé.

• Les cibles sont détectées dans les canaux FAM, VIC et TexasRed. Le contrôle interne est détecté dans le canal Cy5.

1. Mise en place de la réaction de PCR en temps réel

1. Calculer le nombre de réactions. Décongeler les réactifs, passer au vortex, centrifuger brièvement et conserver sur de la glace.

2. Préparer le mélange réactionnel pour la PCR en temps réel (qPCR) selon le tableau 1. Multiplier la solution CPE et le PCR Mastermix CPE par le nombre exact d'échantillons et ajouter 10% en excès pour être certain d’avoir assez de mélange réactionnel qPCR pour toutes les réactions prévues.

3. Pipeter 15 μl de mélange réactionnel qPCR dans les puits de la plaque à 96 puits. 4. Pipeter 10 μl de chaque échantillon à analyser dans les puits de la plaque contenant

déjà 15 μl de Mastermix qPCR (voir le tableau 2). 5. Pipeter 10 μl de témoin positif (solution KPC (�), NDM (�), VIM (�) et/ou OXA-48 (�)

dans le puits de la plaque contenant déjà 15 μl de mélange réactionnel qPCR (voir le tableau 2).

6. Pipeter 10 μl de témoin négatif (�) dans le puits de la plaque contenant déjà 15 μl de mélange réactionnel qPCR (voir le tableau 2).

7. Sceller la plaque ou fermer les tubes. Mixer les réactifs en frappant légèrement la plaque sur le plan de travail, et centrifuger brièvement.

8. Transférer la plaque dans le labo post-PCR.


9. Placer immédiatement la plaque dans l'appareil qPCR, et lancer la réaction avec les paramètres adaptés à l'appareil utilisé (voir aux points suivants). Une fois la PCR achevée, disposée de la plaque conformément aux règlements locaux.

10. Selon les instructions du fabricant pour chaque appareil qPCR, utiliser les paramètres spécifiés dans les Tableaux 3 et 4 et ceux donnés dans le texte ci-dessous pour mettre en place et démarrer la reaction.

2. Paramètres du système ABI 7500

Dans le menu Set-up utiliser les paramètres suivants :

• Instrument : 7500 (96 wells) • Experiment : Quantitation – Standard Curve • Sélectionner ROX™ comme Référence passive • TaqMan®Reagents • Ramp speed : Standard • Reaction volume (volume de la réaction): 25 μl • Define targets and samples: utiliser les paramètres du tableau 3.

3. Paramètres du système LC®480 I&II

Pour utiliser le kit de test PCR Check-Direct CPE avec le système LightCycler®480 il est impératif d’utiliser un fichier de compensation pour les 4 fluorophores spécifiques au test, généré au moyen du 4-Color Compensation Set disponible auprès de Check-Points Health B.V. (Ref : 18-0070) .

• Detection format LC®480 I : Multi Color Hydrolysis Probe • Detection format LC®480 II: 4 color FAM VIC/HEX RED610 CY5 • Filter Combination Selection : voir au tableau 3. • Reaction volume : 25 µl • Analysis mode : Quantification for the amplification step • Integration time mode : Dynamic • Un objet ou fichier de compensation des couleurs (CC) est nécessaire.

4. Paramètres du système CFX96™

• Sample volume : 25 μl • Temperature Control Mode : Calculated • Scan Mode : All channel • Plate type (Type de plaque): BR blanc • Plate Setup : View/Edit Plate et Select Fluorophore selon les données du tableau 3

5. Paramètres du système Rotor-Gene Q

• Reaction volume : 25 μl • Sélectionner le rotor à 72 puits • Gain settings: Green 6 / Yellow 4 / Orange 3 /Red 8.

Tableau 1 : Composition du mélange réactionnel qPCR

Tableau 2 : Échantillon qPCR á tester

Tableau 3 : Paramètres optiques de la qPCR

Tableau 4 : Programme de qPCR

*on peut utiliser une durée de dénaturation de 3 min ou de 10 min, selon les autres analyses à effectuer simultanément avec le test Check-Direct CPE

Composant Volume par réaction

PCR Mastermix CPE 12,5 μl

Solution CPE (�) 2,5 μl

Volume total 15 μl

Type de réaction Composant Volume par réaction

Échantillon á tester Échantillon d'ADN 10 μl

Témoin positif KPC (�), NDM (�), VIM (�), OXA-48 (�) 10 μl

Témoin négatif Échantillon négatif ou témoin négatif fourni (�) 10 μl

Cible Détecteur ABI 7500

Détecteur LC®480 I Détecteur LC®480 II Détecteur CFX96™

Détecteur Rotor-Gene Q

KPC FAM FAM (483-533) FAM (465-510) FAM Green (510±5)

NDM, VIM VIC VIC/HEX/Yellow555 (523-568)

VIC/HEX

(533-580) VIC Yellow (557±5)

OXA-48 TexasRed (TXR)

Red610 (558-610) Red610 (533-610) TexasRed (TXR)

Orange (610±5)

Contrôle interne (IC) Cy5 Cy5 (615-670) Cy5 (618-660) Cy5 Red (660±10)

Étape Température Durée Cycles Collecte de données

Ramp rate (Mode d'accélération)

ABI 7500 /CFX96™/ Rotor-Gene Q

LC®480 I&II

1: 50°C 2 min 1 OFF standard 4.4°C/s

2: 95°C 10 min* 1 OFF standard 4.4°C/s

3: 4:

95°C 60°C

15 sec 60 sec

45 Plate read Optics on

standard 4.4°C/s 2.2°C/s


Analyse des données

Points importants avant de commencer : • Pour une description détaillée de l'utilisation de l'appareil de PCR en temps réel, et de

l'analyse des données, veuillez consulter le manuel de votre appareil. • On fera toujours un examen visuel des courbes d'amplification des échantillons testés, á

comparer aux valeurs CT obtenues par le logiciel.

1. Avec le système ABI 7500

1. Analyser les données avec ROX comme référence passive. 2. Sous les Options, pour chaque Target (cible) (voir le tableau 3), décocher les cases Auto

threshold et Auto baseline comme illustré à la Figure 1 (cercles rouges) et sélectionner Reanalyse.

3. Régler le seuil (Threshold) manuellement sur l'écran Analysis settings (paramètres d’analyse)de chaque canal de détection, en appliquant les valeurs recommandées au tableau 5.

4. Vérifier les graphiques d'amplification par rapport aux valeurs CT calculées par le logiciel, pour chacune des cibles.

Figure 1 : Capture d'écran d'une analyse typique sur un ABI7500, avec le logiciel ABI7500 v2.0.6 Graphique d'amplification d'échantillons positifs et négatifs au test Check-Direct CPE (échelle logarithmique); cercles rouges : décocher les cases Auto Threshold/Auto baseline.

2. Avec le système LC®480 I&II

1. Sélectionner Abs Quant/2nd

Derivative Max analysis (Figure 2). 2. Analyser les données à l'aide du color compensation object (objet de compensation de

la couleur) préalablement créée et spécialement fait pour l'analyse Check-Direct CPE (compensation object application, CC). Sélectionner Color Comp (On) – In database et sélectionner le CC object (objet CC) dans la base de données (voir le mode d'emploi du 4-Color Compensation set Check-Points, Ref : 18-0070).

3. Sélectionner l'option High Sensitivity et exécuter Calculate Cp values pour chaque Filter Comb. (combinaison de filtres ou détecteur).

4. Pour chaque combinaison de filtres, vérifier le graphique d'amplification par rapport aux valeurs Cp.

5. Dans le tableau des résultats, vérifier les valeurs Cp pour toutes les cibles par rapport au Status donné par le logiciel (rouge = positif, vert = négatif, bleu = incertain). Valider le Statut de l'échantillon, par l'examen visuel des courbes d'amplification (Figure 2).

Figure 2 : Capture d'écran d'une analyse typique sur un LC®480 system I, avec le logiciel LC®480 v1.5 Graphique d'amplification d'échantillons positifs et négatifs au test Check-Direct CPE (échelle linéaire); le seuil est calculé automatiquement par le logiciel (tableau 5).

Tableau 5 : Seuils (threshold settings) recommandés

Détecteur Cible ABI 7500 LC®480 I&II CFX™96 Rotor-Gene Q

FAM - green KPC 0.002 Auto-calculated 60-150 0.02

VIC - yellow NDM- VIM 0.001 Auto-calculated 200-250 0.015

TXR - orange OXA-48 0.006 Auto-calculated 400-800 0.03

Cy5 - red IC 0.003 Auto-calculated 40-100 0.06


3. Avec le système CFX96™

1. Ouvrir le fichier de données (Data file) pour l'analyse (Data Analysis). Dans le menu Analysis Settings (les paramétrages), régler les paramètres comme suit :

• Analysis Mode : Fluorophore

• Baseline Setting : Baseline Subtracted Curve Fit; Apply Fluorescent Drift Correction

• Cq Determination : Single Threshold

• Baseline Method : Auto Calculated

• Cycle to Analyze : 10-45

• Baseline Threshold : User defined (à définir par fluorophore) 2. Régler le seuil (Threshold) manuellement pour chaque canal de détection, en

appliquant les valeurs recommandées au tableau 5. 3. Vérifier les graphiques d'amplification (onglet Quantification) par rapport aux valeurs Cq

calculées par le logiciel, pour chacune des cibles du tableau de résultats.

Figure 3 : Capture d'écran d'une analyse typique sur un CFX96™, avec le logiciel CFX96™ software v2.0 Graphique d'amplification d'échantillons positifs et négatifs au test Check-Direct CPE (échelle logarithmique); régler manuellement le seuil au moyen de la barre Threshold sur le graphique d'amplification; (bleu : signal FAM).

4. Avec le système Rotor-Gene Q

1. Ouvrir le fichier de données (Data file). Ouvrir la page des données brutes du canal (Raw channel) pour chaque détecteur. Sélectionner Options et Crop start cycles. Dans la fenêtre pop-up Remove data before cycle, saisir 15 et OK.

2. Appliquer ensuite les paramètres donnés au tableau 6 pour analyser chaque canal de détection.

3. Régler le seuil (Threshold) manuellement pour chaque canal de détection, en appliquant les valeurs recommandées au tableau 5.

4. Vérifier les graphiques d'amplification par rapport aux valeurs Ct calculées par le logiciel, pour chacune des cibles du tableau Quant. Results.

Tableau 6 : Paramètres d'analyse du système Rotor-Gene Q

Figure 4 : Capture d'écran d'une analyse typique avec le logiciel Rotor-Gene Q v2.1.0 (Build 9) Graphique d'amplification d'échantillons positifs et négatifs au test Check-Direct CPE (échelle logarithmique) dans le canal Vert.

Detecteur / CIBLE Dynamic Tube (Tube Dynamique)

Slope Correct (Pente Correction)

OUtliners Removal (Suppression des Outliners )

Eliminate Cycles (Cycles à éliminer)

Green / KPC ON ON 10% 15

Yellow / NDM-VIM ON ON 6% 15

Orange / OXA-48 ON ON 10% 15

Red / IC ON ON 15% 15


Interprétation des données

1. Validation de la PCR : Tableau 6

Vérifier les courbes d'amplification des témoins positifs et négatif. Conditions d'une PCR valide :

• Pas de défaillances du système de l'appareil pendant l'exécution de la PCR.

• Le témoin négatif a une valeur CT de 30 ±3 dans le canal de détection Cy5 et une valeur CT nulle dans les autres canaux.

• Les témoins positifs sont attendus avec les valeur CT indiqués au Tableau 6. Les valeurs CT exactes des témoins positifs varient en fonction des appareils qPCR utilisés et des valeurs seuil (threshold) paramétrées.

2. Interprétation des résultats : Tableau 7

Une fois la PCR validée, on interprétera les résultats – positif, négatif ou non valide – obtenus pour les valeurs CT des échantillons en suivant les indications du tableau 7 :

• Les échantillons positifs pour une ou plusieurs carbapénémases auront une valeur CT dans le canal FAM, VIC et/ou Red(TXR). Une valeur CT dans le canal Cy5 est également attendue si l’amplification de la cible n'a pas supplanté le contrôle interne (IC) durant la PCR.

• Les échantillons négatifs pour les carbapénémases auront des valeurs CT nulles dans les canaux, FAM, VIC et Red(TXR), et on attend une valeur CT 30 ±3 dans le canal Cy5.

• Les échantillons dont les valeurs CT sont indéterminées ou N/A pour les canaux FAM, VIC et/ou Red(TXR), et ayant une valeur CT pour le contrôle interne (IC) dans le canal Cy5 nulle ou ≥33, sont des échantillons non valables ; consulter la FAQ et les Problèmes&Solutions, 3 à 7.

Tableau 6 :Critères d'une PCR valide avec le test Check-Direct CPE*.

Tableau 7 : Guide d'interprétation des données* KPC, NDM/VIM, OXA-48

Valeurs CT IC

Valeurs CT Interprétation

OUI OUI ou N/A Échantillon positif

N/A 30 ±3 Échantillon négatif

N/A N/A ou ≥33 Non valable

* Si les valeurs CT observées dévient fortement des valeurs attendues, consulter la FAQ et les Problèmes&Solutions

Foire aux questions (FAQ) – Problèmes & Solutions

1. Est-il possible d'utiliser Check-Direct CPE avec d'autres méthodes de préparation des échantillons et d'extraction de l'ADN ? Le test Check-Direct CPE a été mis au point avec des écouvillons et une solution de transport bien précis, combinés avec la méthode d'extraction NucliSENS® easyMAG®. Check-Points ne garantit pas la fiabilité du test avec des méthodes autres que celles recommandées dans ce manuel.

2. Les résultats de la PCR en temps réel donnent pour l'ADN à tester des valeurs CT/CP/Cq nulles, ou dont l'interprétation indique que l'échantillon est non valable. Causes possibles & solutions : • L'échantillon d’ADN n'a pas été ajouté au mélange réactionnel. • L’échantillon d’ADN testé avec Check-Direct CPE est négatif et le témoin de

contrôle interne n'a pas été ajouté avant l'extraction de l'ADN. Veuillez recommencer l'extraction de l'ADN.

• L'ADN n'a pas été extrait car le contrôle interne n'a pas été détecté. Veuillez recommencer l'extraction de l'ADN.

• L'échantillon d'ADN à tester contient des contaminants qui inhibent les réactions. Veuillez recommencer l'extraction de l'ADN.

• La Solution CPE ou le PCR Mastermix CPE n'ont pas été ajoutés au mélange réactionnel. Veuillez recommencer le test.

• Les réactifs sont dénaturés ou périmés.

3. Les résultats de la PCR en temps réel donnent pour le témoin positif des valeurs CT/CP/Cq nulles, ou dont l'interprétation indique que l'échantillon est non valable. Causes possibles & solutions : • Le témoin positif n'a pas été ajouté. Veuillez recommencer le test. • La Solution CPE ou le PCR Mastermix CPE n'ont pas été ajoutés au mélange

réactionnel. Veuillez recommencer le test. • Les réactifs sont dénaturés ou périmés.

Sample Type / Expected CT values

Instrument KPC

FAM - green NDM

VIC - yellow VIM

VIC - yellow

OXA-48 Red(TXR) –

orange

CI Cy5 – red

Témoins positifs ABI7500, CFX™96,

Rotor-Gene Q 25 ±3 29 ±3 26 ±3 24 ±3 30 ±3

Témoins positifs LC®480 I&II 28 ±3 30 ±3 27 ±3 26 ±3 30 ±3

Témoins né gatifs (contenant le CI)

POUR TOUS N/A N/A N/A N/A 30 ±3


4. Causes possibles et solutions en cas de résultat non valide. Recommencer le test avec le même extrait d'ADN. Si le résultat non valide persiste, préparer un nouvel extrait d'ADN à partir du prélèvement d'origine et recommencer le test. Sinon, préparer un nouvel extrait d'ADN à partir d'un nouveau prélèvement, et recommencer le test avec celui-ci.

5. Les résultats de la PCR en temps réel donnent des signaux fluorescents extrêmement

faibles pour tous les échantillons et sur tous les canaux de détection, y compris le contrôle interne. Causes possibles & solutions : • La solution CPE contenant les sondes fluorescentes et les amorces s'est dégradée.

Veuillez vérifier la date de péremption du tube de solution CPE et le nombre de cycles de décongélation-recongélation qu'il a subis, et contrôler s'il a toujours été stocké correctement.

• De tels résultats peuvent également être imputables au système de PCR en temps réel. Veuillez consulter le manuel de votre appareil ou contacter le représentant du fabricant.

6. Problèmes avec les valeurs CT/CP/Cq.

• Échantillons donnant des valeurs CT très faibles et pas de courbe d'amplification. Le seuil paramétré manuellement (Threshold) est trop bas. On considère comme négatifs les échantillons dont la valeur CT est <15 et sans courbe d'amplification. La valeur CT détectée est un artéfact de l'analyse par le logiciel : le seuil croise le bruit de fond de la courbe.

• PCR invalide : les valeurs CT mesurées pour les témoins et contrôles ne correspondent pas aux valeurs attendues données au tableau 6. Vérifier que ces différences ne sont pas imputables à un seuil trop élevé ou trop bas. Si les résultats ne s'améliorent pas après modification du seuil, consulter la FAQ 3. à 6.

7. L'appareil de PCR en temps réel donne un message d'erreur. Veuillez consulter le manuel de votre appareil ou contacter le service technique local du fabricant.

8. Une ou plusieurs solutions (CPE, contrôle interne, témoin positif/négatif) ont été

laissées hors congélateur (-20°C) Les réactifs doivent être conservés à -20°C pour que le test fonctionne correctement. La fiabilité du produit ne peut pas être garantie si la ou les solutions ont été stockées hors congélateur (-20°C) pendant plus de 24 heures.

9. Des échantillons testés en réplique avec Check-Direct CPE ne donnent pas de résultats

identiques. Les valeurs CT/CP/Cq d'échantillons identiques peuvent varier d'une réaction à l'autre. Si les variations sont grandes, de l'ordre de >2 valeurs CT, elles font soupçonner des erreurs de pipetage ou autres différences entre les échantillons.

10. Analyse des données et interprétation. En cas de difficultés avec l'analyse des données et leur interprétation, veuillez contacter le service de soutien technique Check-Points sous [email protected].

Performances et validations

1. Sensibilité analytique La limite de détection analytique (LD) du test Check-Direct CPE par PCR en temps réel a été établie pour quatre gènes codant des carbapénémases liés à la production de carbapénèmes chez les entérobactéries : KPC, NDM, VIM et OXA-48. Jusqu’á cette date, aucun kit de quantification génomique de référence n’a été décrit pour ces marqueurs; par conséquent, la sensibilité du test a été établie à l'aide d'un plasmide ayant comme séquence cible un fragment d'ADN de 400 pb. La LD du test Check-Direct CPE par PCR en temps réel a donc été établie avec de l'ADN plasmidique testé directement dans le mélange réactionnel de la PCR. Pour la détermination de la limite de détection, une dilution en série a été incrémentée jusqu'au point où le test ne détectait la cible que dans au maximum 5 % des produits de réplication. Résultats : voir tableau A. Tableau A

Cible LD (copies/PCR)

KPC 5

NDM 5

VIM 5

OXA-48 5

2. Spécificité 2.1 Spécificité In silico La spécificité du test diagnostic Check-Direct CPE est garantie par la sélection d’amorces et de sondes spécifiques, ainsi que par le choix de conditions de réaction contraignantes. Les séquences des amorces et sondes ont été validées par analyse in silico. Les séquences des amorces et sondes ont été conçues spécialement pour identifier les variantes des gènes données au tableau B. Pour dépister les homologies de séquences, les amorces et les sondes ont été comparées avec toutes les séquences de gènes publiées par la banque internationale des séquences (GenBank ®, base de données NIH) par analyse comparative de séquences.


Résultats : Aucune homologie croisée avec d'autres organismes n'a été trouvée pour les amorces et sondes check-Direct CPE . Tableau B

Gène Variantes

KPC 1 à 15

NDM 1 à 8

VIM 1 à 6, 8 à 37

OXA 48, 162, 163, 181, 204, 232, 244, 245.

2.2 Spécificité analytique La spécificité expérimentale du test diagnostic Check-Direct CPE a été établie par des tests de réactivité croisée avec des échantillons contenant des organismes non cible. 132 souches non productrices de carbapénémases ont été testées pour vérifier la spécificité du test Check-Direct CPE, la liste des souches de bactéries est donnée au tableau C. Résultats : Tous les isolats donnent un résultat négatif à l'analyse Check-Direct CPE, et le contrôle interne est détecté dans tous les échantillons. Le test Check-Direct CPE donne une spécificité de 100 % sur la base des souches de référence testées. Tableau C

Organismes # Organismes #

Citrobacter freundii 5 Enterococcus faecalis 2

Campylobacter jejuni 2 Klebsiella oxytoca 1

Enterobacter aerogenes 1 Klebsiella pneumoniae 16

Enterococcus casseliflavus 1 Pseudomonas aeruginosa 2

Enterobacter cloacae 42 Staphylococcus aureus 2

Escherichia coli 51 Salmonella thypimurium 1

Pseudomonas mirabilis 3 Stenotrophomonas maltophilia 2

Serratia marcescens 1

3. Réactivité analytique La réactivité analytique a été évaluée au moyen d'une étude rétrospective sur 93 souches de bactéries, représentant 26 espèces à Gram négatif différentes. Les 93 souches testées avec Check-Direct CPE avaient auparavant été confirmées comme productrices de carbapénémases par un résultat positif au test diagnostique Check-MDR CT103 (Check-Points Health).

Résultats : Dans les 93 souches de bactéries, les gènes codant les carbapénémases ciblés ont été identifiés correctement par le test Check-Direct CPE. Tableau D

# Check-MDR CT103 Check-Direct CPE

19 KPC KPC

16 NDM NDM/VIM

1 NDM+OXA-48 NDM/VIM+OXA-48

33 VIM NDM/VIM

1 VIM+OXA-48 NDM/VIM+OXA-48

23 OXA-48 OXA-48

Légende

Dispositif médical de diagnostic In vitro

Témoin négatif

Numérodu catalogue Témoin positif KPC

Numèro de lot Témoin positif VIM

numéro IFU Témoin positif NDM

Solution CPE Témoin positif OXA-48

Contrôle interne CPE PCR Mastermix

Température de conservation À utilise avantYYYY-MM

Nombre d’expèriences

Fabricant

Consulter le manuel d’utilisation

11

Check-Direct CPE Mode d'emploi Version 1.1, publiée le 05-09-2013

Check-Points Health BV Binnenhaven 5

6709 PD Wageningen The Netherlands

Tel: +31 317 453 908 Fax: +31 317 210 147

[email protected] www.check-points.com

Limites du test

Check-Direct CPE est un test par PCR en temps réel, basé sur la détection d'ADN, pour détecter la présence des gènes codant les carbapénémases KPC, NDM/VIM et OXA-48 dans les Enterobacteriaceae. Ce test détecte les variants suivants des gènes de carbapénémases : blaVIM1-6;8-34; blaOXA-48-162-163-181-232-244-245; blaNDM1-8 et blaKPC1-15. KPC, NDM, VIM et OXA-48 représentent les carbapénémases dont la prévalence clinique chez les entérobactéries est la plus forte dans la plupart des régions du monde. Cependant, d'autres gènes de carbapénémases, plus rares et non détectés par le test Check-Direct CPE, peuvent également être responsables de la production de carbapénémases chez les entérobactéries. La résistance aux carbapénèmes peut de plus être dûe à d'autres facteurs et mécanismes que la production de carbapénémases. Un résultat négatif du test Check-Direct CPE ne prouve donc pas que la bactérie n'est pas résistante aux carbapénèmes ; il montre seulement que la bactérie n'est probablement pas porteuse de l'un des variants des gènes de carbapénémases KPC, NDM, VIM et OXA-48 que détecte Check-Direct CPE. C'est pourquoi le résultat du test Check-Direct CPE ne doit jamais être déterminant pour un traitement médical.

La qualité de l'ADN analysé est un facteur de la plus haute importance pour la fiabilité des résultats du test Check-Direct CPE. L'ADN doit provenir de prélèvements péri-anaux ou rectaux, pris par écouvillon et conservés dans le milieu de transport approprié, et il doit être extrait avec le système NucliSENS® easyMAG® (bioMérieux, FR). Aucun autre système d'extraction de l'ADN n'a pour l'instant été approuvé pour être utilisé avec le test Check-Direct CPE. Les écouvillons validés sont les Sigma-transwabs (Medical Wire & Equipment, UK) et les Eswab™(Copan Diagnostics, US), dans le milieu de transport Amies. D'autre types d'écouvillons sont probablement également appropriés, mais aucun n'a encore été validé.

Le test a subi des essais poussés avec des échantillons contenant différentes bactéries à Gram négatif comme Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter et Pseudomonas, avec d'excellents résultats. Cependant, on ne peut jamais exclure la possibilité que d'autres bactéries à Gram négatif, ou certaines souches particulières des espèces nommées ci-dessus, donneront de mauvais résultats. Le test Check-Direct CPE ne peut avoir et n'a pas la prétention d'être capable de détecter correctement les gènes pour KPC, NDM, VIM et OXA48 dans toutes les bactéries à Gram négatif, dans toutes leurs sous-espèces et tous leurs types, ni dans les échantillons cliniques de toute source, et ne donne aucune garantie dans ce domaine. Suivant les cas, il peut être nécessaire de confirmer les résultats par d'autres voies méthodologiques (p.ex. dans le cas d'échantillons réglementaires). Vu la grande variabilité des génomes bactériens, on doit tenir compte de la possibilité que certains sous-types ne soient pas détectés. Le test reflète l'état des connaissances actuelles de Check-Points Health B.V.

Comme pour tout test diagnostique, les résultats de ce test doivent être interprétés uniquement en conjonction avec les données cliniques et de laboratoire complémentaires mises à la disposition du personnel responsable. Ce test doit être exécuté et utilisé uniquement par des personnes qualifiées, formées à l'exécution des méthodes de détection moléculaires de l'ADN.

Assistance technique [email protected]

+31 317 453 908

Check-Points a apporté le plus grand soin au développement et à l'élaboration de ce protocole, mais ne peut cependant être tenu responsable pour d’éventuelles erreurs, omissions et/ou modifications futures. Citation en référence : dans le cas de publication scientifique d'une procédure employant ce produit, veuillez le désigner sous le nom de Check-Direct CPE.. Avertissement à l'acheteur : Ce produit est vendu sous licence de PHRI Properties, et les droits de brevet de PHRI Properties autorisent l'utilisation uniquement pour les diagnostics humains in vitro, les analyses alimentaires, les tests vétérinaire, et à des fins de recherche. Marques commerciales

TaqMan® est une marque déposée de Roche Molecular Systems, Inc. Sigma-transwabs est une marque déposée de Medical Wire & Equipment Eswab est une marque déposée de Copan Italia S.p.A. ABI, FAM, VIC, ROX sont des marques déposées de Applera Corporation ou de ses filiales, aux USA et/ou dans d'autres pays. Red610 est une marque déposée de Biosearch Technologies, Inc

Cy5 est une marque déposée de Amersham Biosciences Ltd

NucliSENS® easyMAG® est une marque déposée de bioMérieux

Check-direct CPE IFU 080-03 FR 05Sept2013check-points.nl/downloads/manuals/Check-Direct_CPE... ·...

Documents

Transcript of Check-direct CPE IFU 080-03 FR 05Sept2013check-points.nl/downloads/manuals/Check-Direct_CPE... ·...