CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES

Master 2 BCPPÉpithéliums structures d’interface

Université Paris Diderot

Christine ClericiU700 – CRB3

UFR de Médecine Paris Diderot

MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE

•MSC et greffe tissulaire : régénération des tissus- réparation cardiaque- ostéogénèse imparfaite

• MSC et propriétés immuno-modulatrices - traitement de la GVH- insuffisance rénale - hépatite- diabète

MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE et PATHOLOGIES PULMONAIRES

• MSC et greffe tissulaire : fusion ou repopulation?- Poumon sain (Krause, 2001)- Fibrose pulmonaire à la bléomycine (Ortiz, 2003; Kotton,

2004)- Poumon radique (Theise, 2002)- Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009)

• MSC et propriétés immuno-modulatrices- Fibrose pulmonaire induite par la bléomycine (Ortiz, 2007) - Fibrose pulmonaire induite par la silice (Lassance, 2009)- Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009; Aslam, 2009)

• MSC vecteurs thérapeutiques

MSC et Syndrome de détresse respiratoire aiguë

Les Traitements Pharmacologiques Ne Sont Pas Les Traitements Pharmacologiques Ne Sont Pas Efficaces dans le SDRAEfficaces dans le SDRA

• Glucocorticoids

• Surfactant therapy

• Lisofylline

• Ketoconazole

• Inhaled nitric oxide

• Procysteine

• Neutrophil elastase inhibitor

• Activated Protein C

Quels effets des MSC dans des modèles pré-cliniques de lésions inflammatoires alvéolaires aiguës ?

1. MSC et ALI dans des modèles animaux– Effets de CSM in vivo dans un modèle d’oedème alvéolaire

induit par l’endotoxine chez la souris– Effets des CSM in vivo dans un modèle de VILI chez la souris– Effets des CSM in vivo dans un modèle de pneumopathie

bactérienne

2. MSC et ALI dans un modèle de poumon humain : études in vitro et in vivo

0 10 20 30 40 500

25

50

75

100

Hours

48 h

Sur

viva

l (%

)

PBS (n = 31)MSC (n = 30)

**

**p < 0.01

GUPTA ET AL, J IMMUNOLOGY, 2007

EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND LUNG HISTOLOGY IN MICE AFTER LPS E. COLI

E.Coli

ITprélèvementsMSC

IT

+4H +24/48H0

PBS

Exce

ss L

ung

Wat

er (µ

l)

**p=0.001

0

50

100

150

200

250

MSC

**

MSC

PBS

**p=0.005

BAL

Prot

ein

(mg/

L)

**

0

1

2

3

4

5

MSC REDUCES PULMONARY EDEMA AND BAL PROTEININ MICE AFTER LPS

0 10 20 30 40 500

25

50

75

100

PBS (n = 13)

MSC (n = 11)

hours

48 h

Sur

viva

l (%

)

*

A

0

50

100

150

200

250

300

PBS MSC

48 h

Exc

ess

Lung

Wat

er (µ

l)

*

B

EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND PULMONARY EDEMAIN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA

Gupta et al, unpublished data, 2009

E.Coli 106CFU

IT

prélèvementsMSC

IT

+4H +24/48H0

EFFECT OF MSC ON BACTERIA GROWTHIN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA

Krasnodembskaya, Stem Cells, 2010

MSC THERAPY ENHANCES THE RESOLUTION OF STRUCTURAL LUNG INJURY FOLLOWING VILI.

MSC THERAPY ENHANCES THE RESOLUTION OF STRUCTURAL LUNG INJURY FOLLOWING VILI.

Curley G F et al. Thorax 2012;67:496-501

MSC THERAPY MODULATES THE INFLAMMATORY RESPONSE TO VILI.

Curley G F et al. Thorax 2012;67:496-501

Lee JW et al, PNAS, 2009

EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN

1 h

- Right or left lung selected, surgical preparation- Begin perfusion without blood

1 h 4 h

- Lung Temp 36°C-Apply 10 cm H20 CPAP (95% O2 & 5% CO2 )

- Measure AFC over 1 h in RUL (Control)

- If AFC >10%/h in RUL,

Add 100 ml Fresh Whole Blood to Perfusate

Instill 0.1 mg/kg of endotoxin into the airspaces

of the RML

- Measure AFC over 1 h in RML (endotoxin)

Instill 5 x 10 allogeneic human mesenchymal stem cells or MSC conditioned medium to RML

6

1 h

EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN

ControlLung Lobe

LPSLung Lobe

LPS + MSCLung Lobe

LPS + MSC CM Lung Lobe

8 ± 5 x 10 cells 6

25 ± 25 x 10 cells 6 13 ± 11 x 10 cells

66 ± 5 x 10 cells

6

Absolute Neutrophil Counts

P < 0.003

Lee, PNAS, 2009

Control LPS LPS + MSC

En

do

thel

ial

Per

mea

bil

ity

(%

)

LPS + MSC CM

0

5

10

15

††

*

Control LPS LPS + MSC

Wed

/Dry

Rat

io

LPS + MSC CM

3

6

9*

* †

†

A B

EFFECT OF MSC ON ENDOTHELIAL PERMEABILITY AND PULMONARY EDEMA IN HUMAN LUNG INJURED BY LPS

HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS

• Engraftment

• Immunomodulation

• Alveolar fluid clearance

• Lung protein permeability

• Antibacterial properties

No, < 5%, Gupta et al., 2007

HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ALI IN MICE :IMMUNOMODULATION

• No cell contact : MSC secretion of soluble factors – modulation by the inflammatory environment?

• Cell-cell contact : Interaction with other inflammatory cells, leukocytes, macrophages….

• Candidate mediators released or induced by MSC- TGF-- TNFinduced protein (TSG 6)- PGE2

- IL-10- IL-1ra …..

MSC

PBS

MIP

-2 B

AL (p

g/m

l)

TNF-

α BA

L (p

g/m

l)

MSC

PBS

**

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMUNOMODULATION

Gupta et al., 2007

ALI - endotoxin ALI Pneumonia E. Coli

Krasnodembskaya, 2010

PBS MSC

8 h

BA

L IL

-10

(pg/

ml) *

0

10

20

30

40

PBS MSC0

200

400

600

800

24 h

BA

L IL

-10

(pg/

ml)

24 h

Pla

sma

IL-1

0 (p

g/m

l)

PBS MSC0

1500

3000

4500

6000

7500

9000 *

MSC Upregulate Production of anti-inflammatory cytokines inEndotoxin Induced Lung Injury in Mice

Nemeth et al, Nat Med, 2009 (ALI dans un modèle de sepsis par LC)

Nemeth et al. Nat Med,2009

MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMODULATION BY CELL-CELL INTERACTION

HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS

• Engraftment

• Immunomodulation +++

• Alveolar fluid clearance

• Lung protein permeability

• Antibacterial properties

Alv

eola

r F

luid

Cle

aran

ce (

%/h

)

Control MSC MSC CM0

10

20

30

Normal Lung Fibroblasts

**

† †

LPS* P<0.0001 vs. Control

† P<0.0001 vs. LPS (0.1 mg/kg)

MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN HUMAN LUNG: ALVEOLAR FLUID CLEARANCE

MSC induced increase in Na-dependent AFC

Alv

eola

r F

luid

Cle

aran

ce (

%/h

)

+ MSC CM + MSC CM+ 5 x 10 M Amiloride

LPS

-4

0

10

20

30

*

Data as mean ± SD, * P < 0.05 Lee JW et al, PNAS, 2009

64 kDa

ENaC Apical Membrane

0

40

80

120

% o

f C

ontr

ol

+ MSCControl

Cytomix 50 ng/ml

*

Cytomix 50 ng/ml

Control

+MSC

* †

0

40

80

120

*

85 kDa

GAPDH

* * †

*

ENaC Total Cell Lysis

% o

f C

ontr

ol

†

†

Quels facteurs paracrines susceptibles d’améliorer la clairance alvéolaire ?

• Diminution des cytokines pro-inflammatoires et augmentation des cytokines anti-inflammatoires dans le modèle ALI souris mais pas dans le modèle poumon humain.

• Sécrétion de facteurs de croissance, KGF, angiopoietine-1 qui sont connus pour réduire les lésions pulmonaires dans les œdèmes lésionnels : bléomycine, VILI, hyperoxie, HCl, pneumopathie bactérienne.

MSC sécrètent des facteurs de croissance

150

0

50

100

200

250

co

nce

ntr

atio

n (

pg

/ml)

Control

Cytomix

*

co

nce

ntr

atio

n (

pg

/ml)

Control

Cytomix +3%O2

*

KGF Angiopoietin-1

Alv

eola

r F

luid

Cle

aran

ce (

%/h

r)

* P<0.001 vs. Control

P<0.03 vs. LPS (0.1 mg/kg)

Control LPS LPS + CM MSC

LPS + CM MSC (KGF siRNA)

*

, #

# P<0.01 vs. LPS + CM MSC (KGF siRNA)

0

10

20

30

+ rhKGF (100ng)

*,

MSC IMPROVED ALVEOLAR FLUID CLEARANCE IN HUMAN LUNG: ROLE OF KGF

Mécanismes responsables de la restauration de la clairance alvéolaire par le KGF

1. Effet mitogène sur les cellules alvéolaires de type II, augmentant la capacité de transport de l’épithélium

2. Effet cytoprotecteur du KGF diminuant la perméabilité paracellulaire et/ou l’apoptose des cellules épithéliales

3. Le KGF pourrait augmenter la transcription des protéines impliquées dans le transport alvéolaire du sodium: ENaC & NaKATPase -

4. Le KGF pourrait augmenter l’adressage des canaux de type ENaC à la membrane apicale des cellules, un processus rapide déjà observé après stimulation de l’AMP cyclique en hypoxie (J Biol Chem, 2002)

HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS

• Engraftment

• Immunomodulation +++

• Alveolar fluid clearance ++

• Lung protein permeability

• Antibacterial properties

Upper compartment

lower compartment

Upper compartment

Lower compartment

131I-albumin

Human Alveolar Epithelial Type II Cells

0.4 M Microporous membrane

Allogeneic HumanMesenchymal Stem Cells

MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY

Control + MSC

Cytomix

Per

mea

bili

ty (

%/2

4 h)

+ Fibroblast

*

A

*

MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY

Per

mea

bil

ity

(%/2

4 h

)

Control + MSC KGF + MSC(KGF siRNA)

KGF+Ang-1

*

* *, *, *

Cytomix 50 ng/ml

Absence d’effet du KGF sur la perméabilité épithéliale

Per

mea

bili

ty (

%/2

4 h

)

Control + MSC

Cytomix 50 ng/ml

0

5

10

15

+ rhAng1 + MSC(Ang1 siRNA)

*

*

#

ROLE OF ANGIOPOIETIN-1

Fang et al. , J. Biol. Chem., 2010, 285, 26211

• Les MSC sécrètent l’angiopoietin-1

• Facteur de croissance vasculo-protecteur

• MSC transfectées avec AP-1 diminution des lésions vasculaires et des lésions pulmonaires modèle ALI souris (Mei et al., 2008)

HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS

• Engraftment -No

• Immunomodulation -Yes

• Alveolar fluid clearance -Yes

• Lung protein permeability - Yes

• Antibacterial properties ?

1. Les MSC ont-elles un pouvoir antimicrobien: nombre et croissance de bactéries in vitro

2. Les MSC permettent-elles de limiter la croissance et d’augmenter la clairance des bactéries dans un modèle in vivo de pneumonie bactérienne

MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE: ANTIBACTERIAL PROPERTIES

MSC REDUCES BACTERIA COLONY FORMATION in vitro

MSC REDUCES E. Coli COLONY FORMATION in vitro

0

2

4

6

8

PBS MSC MSC+anti-LL 37* Ab

E.

coli

CF

U

(x 1

05 /

ml)

*

Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010

Time (h)0 12 24 36 48

0

25

50

75

100

hMSC n=34

3T3 n=27

PBS n=42

Sur

viva

l (%

)

*

Intravenous hMSC Reduce Mortality & Bacteremia in Mice when Administered 4 hours after Peritoneal Pseudomonas Sepsis

MSC vs 3T3 p = 0.037, MSC vs PBS p = 0.005

01

,00

02

,00

03

,00

04

,00

0

3T3 (21) MSC (18) PBS (22)

Blo

od

Bac

teri

al C

ou

nts

(CF

U/m

l)

MSC vs 3T3 < p 0.01 MSC vs PBS < p 0.01

Samarani et al, 2010

P.a

erug

inos

a in

blo

od

(x

102

cfu/

ml)

Time (h)

0

400

800

0 8 12

MSC3T3PBS

0

10

100

3T3 MSC PBS

,√

P.a

erug

inos

a in

bl

ood

(cfu

/ml)

Severity of Sepsis: the rise in bacterial growth in blood is prevented by MSC treatment

MSC vs 3T3 p 0.0159MSC vs PBS p 0.0161

PBS +anti LL-37 Ab

+IgG102

103

104

105

E.c

oli C

FU

/ m

l in

BA

L

103

104

105

106

E.c

oli C

FU

/ m

l in

LH

PBS +anti LL-37Ab

+ IgG

MSC

MSC

* *

Neutralization of LL-37 Activity Abolishes the Antimicrobial Effect of MSC in vivo

Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010

3T3 PBSMSC 3T3 PBSMSC

Pha

gocy

tosi

s (%

)

Pha

gocy

tic In

dex

0

10

20

30

40

50

0

50

100

,√

0

RPMI

E.c

oli c

fu (

x 10

6 /m

l)in

incu

batio

n m

ediu

m

1

2

3

4

3T3 PBSMSC

A B

C

,√

,√

Phagocytic activity of mouse peripheral blood monocytes

MSC INCREASES PHAGOCYTIC ACTIVITY OF HOST IMMUNE CELLS

Alternative Activated (Type II) Macrophages

• Critical role in host defense for resolution of inflammation and with a high phagocytic activity against bacteria.

• CD163 (haptoglobin-hemoglobin scavenger receptor) and CD206 (macrophage mannose receptor) are markers of type II macrophages.

• Recent data suggest that CD163 can function as a macrophage receptor for gram positive and gram negative bacteria (Blood, 2009)

• Contrast with TLRs which recognize soluble dissociated microbial components, not intact bacteria.

3T3 MSC PBS

Immunofluorescence for CD163 on the slides of mouse spleen

H&E staining of mouse spleen slides

HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS

• Engraftment -No

• Immunomodulation – augmentation cytokines pro-inflammatoires

• Alveolar fluid clearance – role du KGF

• Lung protein permeability – role de l’angiopoietine

• Antibacterial properties- peptides anti microbiens

• Other mechanisms – microvesicules…..

Therapie cellulaire dans le SDRA?

• Confirmation que les MSC ont un effet bénéfique dans des pathologies respiratoires

• Quels types cellulaires? • Quand les administrer et pendant combien de

temps?• Quelle voie d’administration, IT, IV

Matthay et al. Chest, 2010