N° 2009-ISAL-0115 année 2009

THESE

Présentée devant L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

Pour l’obtention du

DIPLOME DE DOCTORAT

Spécialité Biochimie Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé

par

Ping CHEN

Caractérisation d’un métabolite oxygéné dérivé de l’acide docosahexaénoïque

Effet sur les plaquettes sanguines

Soutenance le 16 décembre 2009

Directeur de thèse : Professeur M. GUICHARDANT Jury de thèse: Docteur T. DURAND (Rapporteur) Docteur J.E. FABRE (Rapporteur) Professeur M. LAGARDE (Président) Professeur M. GUICHARDANT Docteur H. VIDAL (Invité)

Cette thèse a été préparée au laboratoire Régulations métaboliques, Nutrition et diabètes, l’INSA de Lyon (INSERM UMR 870)

1

REMERCIEMENTS

Les recherches qui ont conduit à ce mémoire ont été réalisées au sein de l’unité mixte

INSERM 870, INSA de lyon, RMND (Régulations Metaboliques, Nutrition et Diabètes)

dirigée par le Pr. Michel LAGARDE et son successeur le Dr. Hubert VIDAL.

J’exprime ma reconnaissance au Pr. Michel LAGARDE pour m’avoir accueillie au

sein de son unité de recherche, et je le remercie sincèrement pour ses conseils et ses

encouragements tout au long de ce travail.

Je voudrais témoigner ma reconnaissance au Pr. Michel GUICHARDANT pour avoir

encadré cette thèse. Je le remercie particulièrement pour sa rigueur scientifique, son

exigence, sa disponibilité et ses encouragements, en me faisant partager son expérience et

ses connaissances scientifiques, et aussi pour m’avoir supportée durant ces années. Je lui

exprime mon profond respect.

J’exprime mes remerciements aux rapporteurs, le Dr. Jean-Etienne FABRE, et le Dr.

Thierry DURAND, pour avoir accepté de juger ce travail. Je remercie aussi le Dr. Hubert

VIDAL pour m’avoir encouragée tout au long de ma thèse et pour accepter de participer

au jury en tant qu’invité.

Je voudrais aussi remercier le CSC Chinese Scholarship Council qui m’a soutenue

financièrement.

Mes sincères remerciements vont également au Dr. Evelyne VERICEL qui m’a

beaucoup aidée durant cette étude. Je la remercie notamment de m’avoir enseignée les

bases scientifiques, théoriques et pratiques, touchant au fonctionnement des plaquettes.

Je remercie sincèrement Sabine MICHAUD et Bernard FENET pour leur aide à

réaliser et interpréter les spectres RMN.

Je souhaite également remercier très chaleureusement tous les membres du

laboratoire.

Alain GELOEN pour sa bonne humeur et sa profonde gentillesse.

Catherine CALZADA pour sa gentillesse et son aide ‘sang pour cent’.

2

Madeleine PICQ pour les bons gâteaux et son esprit agréable.

Magali PEREZ pour sa patience à comprendre mon français, pour son aide ainsi que

pour tous les merveilleux moments passés ensemble hors du laboratoire.

Patrick MOLIERE pour sa patience, sa générosité et ses compéténces en

informatique. Valérie PRUNETA-DELOCHE pour sa gentillesse et jolie sourir.

Aux anciens thésards (les Dr. Bader ZARROUKI, Caroline ZEILLER, Salam

IBRAHIM, Nicolas GUILLOT, Jérome BOUVIER) qui m’ont fait profiter de leurs

expériences.

À Rami JAAFAR et Asami MAKINO, sans qui ces trois dernières années auraient été

mornes. À Emilie CAILLET, Jennifer LEFILS, Nicolas PILLON, Romain COLAS, pour

leur aide dans mon travail.

Je remercie aussi tous ceux qui ont participé à mon intégration dans ce laboratoire et

permis de me sentir moins seule dans ce pays.

Je remercie mes parents, mes frères, mes belles-seurs et toute ma famille pour leur

soutien moral.

3

RESUME L’acide docosahexaénoïque (DHA) est un acide gras d’intérêt nutritionnel avec des

potentialités bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires. Des résultats

récents montrent que le DHA est oxygéné en dérivés dotés de propriétés

anti-inflammatoires puissantes appelés résolvines. Parmi ces dernières, la protectine D1

(PD1) a fait l’objet de recherches approfondies (Serhan CN. et al., 2006).

Cette thèse montre la caractérisation d’un isomère, que nous avons nommé PDX,

molécule capable d’inhiber l’agrégation des plaquettes sanguines humaines.

La PDX a été préparée par oxygénation du DHA catalysée par la 15/ω-6-lipoxygénase

de soja. Une série d’approches physico-chimiques à haute performance (GC-MS,

UPLC-MS/MS équipée d’une interface de mobilité d’ions) et différentes techniques RMN

ont permis de caractériser la position des groupements hydroxyles, la stéréochimie des

carbones oxygénés et la géométrie de chaque liaison du triène conjugué. L’utilisation

d’18O2 a également montré que la synthèse se fait via un mécanisme de double

oxygénation. La PDX est donc l’acide 10(S),17(S)-docosa-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-

hexaénoïque qui diffère de la PD1 par la configuration du carbone 10 qui est S (au lieu de

R pour la PD1) et par la géométrie du triène conjugué qui est 11E,13Z,15E (au lieu de

11E,13E,15Z pour la PD1).

Connaissant les propriétés anti-agrégantes du DHA, nous avons aussi recherché si la

PDX peut inhiber l’agrégation plaquettaire. La PDX inhibe à des concentrations

submicromolaires l’agrégation induite par le collagène ou l’acide arachidonique. Nous

avons trouvé également que la PDX inhibe dans les plaquettes sanguines humaines la

synthèse des prostaglandines sans altérer l’activité 12-lipoxygénase. La PDX inhibe aussi

l’agrégation induite par l’analogue stable de la prostaglandine H2 (U-46619) qui agit

spécifiquement sur le récepteur du thromboxane A2.

Par ailleurs, nous avons montré que tous les composés dihydroxylés contenant un

triène conjugué et présentant une géométrie E/Z/E sont capables d’inhiber l’agrégation

4

plaquettaire, alors que ceux qui ont une géométrie E/E/Z, ou E/E/E, sont inactifs. De plus,

la position du triène conjugué sur la chaîne hydrocarbonée de l’acide gras ainsi que le

nombre de doubles liaisons extérieures au triène n’affectent pas les propriétés inhibitrices

de ces composés.

En conclusion, la PDX s’avère être un puissant agent anti-agrégant plaquettaire avec

des potentialités anti-thrombotiques.

MOTS-CLES : Acide docosahexaénoïque, Protectine, Lipoxygénation, Chromatographie

à haute performance, Spectrométrie de masse, RMN, Agrégation plaquettaire

5

SUMMARY

Docosahexaenoic acid (DHA) is a fatty acid of nutritional interest and potential

benefits for cardiovascular disease prevention. Recent results show that DHA is

oxygenated into derivatives with potent anti-inflammatory properties called resolvins.

Among them, protectin D1 (PD1) has thoroughly been investigated (Serhan CN. et al.,

2006).

This thesis deals with the characterization of a PD1 isomer, that we have called PDX,

able to inhibit human blood platelet aggregation.

PDX has been prepared by oxygenation of DHA catalyzed by the soybean

15/ω6-lipoxygenase. A series of high performance physical and chemical approaches

(GC-MS, UPLC-MS/MS equipped with an ion mobility interface) and different NMR

techniques allowed us to characterize the position of the hydroxyl groups, the

stereochemistry of oxygenated carbons, and the geometry of each conjugated triene

double bond. The use of 18O2 also showed that the synthesis occurs via double

oxygenation mechanism. Therefore, PDX is 10(S),17(S)-docosa-

4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-hexaenoic acid, which differs from PD1 by the carbon 10

configuration which is S (instead of R for PD1) and by the geometry of the conjugated

triene which is 11E,13Z,15E (instead of 11E,13E,15Z for PD1).

Knowing the anti-aggregatory properties of DHA we also investigated whether PDX

can inhibit platelet aggregation. PDX inhibits at submicromolar concentrations the

aggregation induced by collagen or arachidonic acid. We also found that PDX inhibits

platelet prostaglandin synthesis without altering their 12-lipoxygenase activity, and

inhibits aggregation induced by the stable analog of prostaglandin H2 (U-46619) which

specifically acts through thromboxane A2 receptor.

On the other hand, we showed that all dihydroxylated compounds containing a

conjugated triene with a E/Z/E geometry are able to inhibit platelet aggregation, whereas

those with E/E/Z geometry, or E/E/E geometry are inactive. Moreover, the conjugated

6

triene position in the fatty chain, as well as the number of double bonds out of the

conjugated triene do not affect the inhibitory properties of these compounds.

We conclude that PDX appears to be a potent anti-aggregatory agent with

antithrombotic potential.

KEY WORDS: Docosahexaenoic acid, Protectin, Lipoxygenation, High performance

chromatography, Mass spectrometry, NMR, Platelet aggregation.

7

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS ............................................................................................................2

RESUME ...............................................................................................................................4

SUMMARY ...........................................................................................................................6

TABLE DES MATIERES....................................................................................................8

INDEX DES FIGURES ET TABLEAUX ........................................................................13

AVANT-PROPOS...............................................................................................................16

ABRÉVIATIONS................................................................................................................18

INTRODUCTION...............................................................................................................21

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ..................................................................................24

Chapitre 1: Rappels sur les acides gras polyinsaturés et leur métabolisme oxygéné...25

I. Acides gras polyinsaturés (AGPIs) ................................................................................25

II. Métabolisme oxygéné des acides gras polyinsaturés (AGPIs) dans les plaquettes

sanguines.........................................................................................................................27

II.1 Voie de la cyclooxygénase.......................................................................................27

II.2 Voie de la 12-lipoxygénase......................................................................................32

II.2.1 Mécanisme général des lipoxygénases ...........................................................32

II.2.2 Rôle de la 12-lipoxygénase plaquettaire .........................................................35

III. Autres lipoxygénases ...................................................................................................37

III.1 Autres 12-lipoxygénases......................................................................................37

III.2 La 15-lipoxygénase..............................................................................................38

III.3 La 5-lipoxygénase................................................................................................43

III.4 Autre oxygénases .................................................................................................45

IV. Métabolisme oxygéné des AGPIs de la série n-3 ........................................................47

IV.1 Les acides gras monohydroxylés dérivés du DHA..............................................47

IV.2 Les docosatriènes : protectines et marésines .......................................................49

IV.2.1 Les protectines ..............................................................................................49

8

IV.2.2 Les marésines ...............................................................................................53

IV.3 Les résolvines ......................................................................................................55

IV.3.1 Les résolvines E............................................................................................55

IV.3.2 Les résolvines D ...........................................................................................58

Chapitre 2: Rappels sur les plaquettes sanguines............................................................61

I. Les plaquettes sanguines ................................................................................................61

I.1. Origine ...................................................................................................................61

I.2. Morphologie des plaquettes...................................................................................61

I.2.1. La membrane ..................................................................................................62

I.2.2. Le cytosquelette..............................................................................................63

I.2.3. Le système des organelles ..............................................................................64

I.3. Physiologie des plaquettes.....................................................................................65

I.3.1. Adhésion plaquettaire.....................................................................................65

I.3.2. Activation et agrégation plaquettaire .............................................................66

I.3.3. Fonction hémostatique....................................................................................67

I.4. Métabolisme de l’acide arachidonique dans les plaquettes...................................68

I.4.1. La voie de la cyclooxygénase dans les plaquettes..........................................68

I.4.2. La voie de la 12-lipoxygénase dans les plaquettes.........................................69

II. Mécanismes d’activation des plaquettes .......................................................................69

II.1. Mécanismes de la formation des agrégats plaquettaires ......................................69

II.2. Activation induite par la thrombine .....................................................................70

II.3. Activation induite par le collagène ......................................................................71

II.4. Activation induite par l’ADP ...............................................................................72

II.5. Activation induite par le thromboxane A2 ...........................................................73

II.6. Activation induite par l’acide arachidonique .......................................................73

II.7. Autres voies d’activation......................................................................................74

MATERIELS ET METHODES........................................................................................75

Chapitre 1: Matériels..........................................................................................................76

I. Produits & fournisseurs ..................................................................................................76

9

II. Appareils ..........................................................................................................................77

Chapitre 2: Méthodes .........................................................................................................78

I. Séparation des énantiomères d’acides gras monohydroxylés par HPLC chirale ...........78

I.1. Préparation du diazométhane ................................................................................78

I.2. Méthylation des acides mono et dihydroxylés ......................................................78

I.3. Séparation des acides gras monohydroxylés par chromatographie chirale...........79

I.4. Hydrolyse des acides gras monohydroxylés méthylés ..........................................79

II. Biosynthèse des acides gras mono et dihydroxylés ......................................................80

II.1. Biosynthèse des acides gras mono et dihydroxylés .............................................80

II.1.1. Biosynthèse de la PDX et de ses isomères....................................................80

II.1.2. Biosynthèse des 8(±),15(S)-diHETEs...........................................................80

II.1.3. Biosynthèse du 5(S),12(S)-diHETE..............................................................80

II.1.4. Biosynthèse du 7(S),14(S)-diHDoHE...........................................................81

II.2. Extraction en phase solide des métabolites oxygénés..........................................81

II.3. Extraction liquide/liquide des métabolites oxygénés...........................................81

II.4. Analyse par CCM des acides gras mono- et dihydroxylés ..................................82

II.5. Analyse par HPLC des acides gras mono- et dihydroxylés .................................82

II.6. Analyse par UPLC des acides gras mono- et dihydroxylés .................................83

II.7. Analyse par GC-MS des acides gras dihydroxylés..............................................83

II.8. Analyse des acides gras dihydroxylés par UPLC-MS/MS ..................................84

II.9. Analyse par RMN de la PDX...............................................................................85

III. Isolement des plaquettes sanguines humaines .............................................................85

IV. Isolement des leucocytes polymorphonucléaires ........................................................86

V. Test d’agrégation plaquettaire.....................................................................................86

V.1. Mesure de l’agrégation des plaquettes sanguines humaines................................86

V.2. Inhibition de l’agrégation plaquettaire par différents acides gras mono

et dihydroxylés....................................................................................................87

V.2.1. L’agrégation plaquettaire induite par le collagène .....................................87

V.2.2. L’agrégation plaquettaire induite par l’acide arachidonique ......................88

10

V.2.3. L’agrégation plaquettaire induite par l’agoniste du récepteur

du thromboxane A2: l’U-46619 ......................................................................88

V.3. Recherche et quantification des icosanoïdes synthétisés par les

plaquettes activées en présence d’acide [1-14C] arachidonique..............................88

V.3.1. Extraction des métabolites ..........................................................................89

V.3.2. Séparation des métabolites par CCM..........................................................89

V.3.3. Recherche et quantification des métabolites...............................................89

VI. Analyse statistique des résultats ..................................................................................90

RESULTATS ET DISCUSSION.......................................................................................91

Première partie : Caractérisation d’un nouveau médiateur lipidique,

la Protectine DX (PDX), un isomère de la protectine D1..................92

I. Etude du métabolisme oxygéné du DHA .......................................................................92

I.1. Analyse chromatographique des métabolites dérivés du DHA.............................92

I.2. Recherche de la stéréochimie du carbone 17 du 17-HDoHE................................94

I.3. Analyse par UPLC des métabolites du DHA ........................................................96

II. Localisation des groupements hydroxylés sur la chaîne hydrocarbonée de la PDX ....97

III. Détermination de la géométrie des doubles liaisons de la PDX..................................98

III.1. Utilisation des données chromatographiques et spectrales.................................98

III.2. Techniques RMN..............................................................................................101

IV. Détermination de la stéréochimie du carbone 10 ......................................................107

IV.1. Utilisation de données chromatographiques.....................................................107

IV.2. Utilisation de l’UPLC couplée au SYNAPT HDMS équipé d’une interface de

mobilité des ions .........................................................................................................110

V. Confirmation du mécanisme de double oxygénation et de la stéréochimie du carbone

10 ................................................................................................................................112

VI. Conclusion de la première partie ...............................................................................114

Deuxième partie : Effet anti-agrégant de la PDX ..........................................................115

I. Effet de la PDX sur l'agrégation plaquettaire induite par le collagène ........................115

II. Comparaison de l’addition de la PDX avec celle de différents triènes conjugués .....116

11

III. Effet de la PDX et d'autres triènes conjugués sur l'agrégation plaquettaire induite par

l'acide arachidonique (AA) .................................................................................................120

IV. Effet de la PDX sur le métabolisme oxygéné de l’AA..............................................121

V. Effet de la PDX sur l’agrégation plaquettaire induite par l’U-46619.........................123

VI. Conclusion de la deuxième partie..............................................................................125

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES..........................................................................126

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................129

ANNEXE............................................................................................................................143

12

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX

Figure 1: Voies métaboliques des acides gras essentiels ...................................................25

Figure 2: Voies principales de libération de l’acide arachidonique .................................26

Figure 3: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique-voie de la cyclooxygénase .....29

Figure 4: Métabolisme d’oxygénation des acides gras polyinsaturés par les

lipoxygénases ......................................................................................................34

Figure 5: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique conduisant à la synthèse

des hépoxylines ...................................................................................................36

Figure 6: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique - voie de la 15-lipoxygénase. .40

Figure 7: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique conduisant à la synthèse

des lipoxines........................................................................................................42

Figure 8: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique - voie de la 5-lipoxygénase....44

Figure 9: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique - voie de la cytochrome

P450 époxygénase et de la cytochrome P450 ω-hydroxylase ............................46

Figure 10: Schéma montrant les différentes voies du métabolisme oxygéné du DHA.......48

Figure 11: Schéma montrant la biosynthèse de la protectine D1 ......................................52

Figure 12: Schéma montrant la biosynthèse de la marésine 1...........................................54

Figure 13: Schéma montrant la biosynthèse des resolvines E ...........................................56

Figure 14: Schéma montrant la biosynthèse des resolvines D...........................................60

Figure 15: Microphotographie de plaquettes.....................................................................62

Figure 16: Mécanisme de formation d’un caillot...............................................................67

Figure 17: Interactions des récepteurs plaquettaires avec les principaux ligands ...........70

Figure 18: Exemple de chromatogrammes (HPLC) montrant les différents

métabolites synthétisés à partir du DHA via la 15-LOX de soja......................93

Figure 19: Exemple d’utilisation d’une colonne chirale pour séparer les

énantiomères 17(S)- et 17(R)-HDoHE dérivés sous formes

d’esters méthyliques..........................................................................................95

13

Figure 20: Chromatogrammes UPLC typiques montrant les différents

métabolites synthétisés à partir du DHA via la 15-LOX de soja......................96

Figure 21: Spectre de masse de la PDX hydrogénée et dérivée sous forme

d’ester méthylique et d’éther triméthylsilyle ....................................................98

Figure 22: Exemple de séparation par HPLC de différents acides gras

dihydroxylés commerciaux ...............................................................................99

Figure 23: Spectres UV de différents acides gras dihydroxylés commerciaux

séparés par HPLC ........................................................................................101

Figure 24: Attribution séquentielle des protons et des atomes de carbone de la PDX

avec la technique IPAP hsqc-tocsy ...............................................................103

Figure 25: Techniques de RMN appliquées à la PDX pour la détermination

de la configuration de la double liaison C13-C14 .........................................106

Figure 26: Chromatogramme montrant la séparation par HPLC des

diastéréoisomères ...........................................................................................108

Figure 27: Chromatogramme montrant la séparation des

diastéréoisomères 10(R),17(S)-diHDoHE et 10(S),17(S)-diHDoHE

surchargés avec la PDX .................................................................................109

Figure 28: Analyse de la PDX et du 10(S),17(S)-diHDoHE par UPLC-HDMS

équipé d’une interface de mobilité d’ions ......................................................111

Figure 29: Spectre de masse de la PDX hydrogénée et dérivée sous forme Me-TMS ...113

Figure 30: L’inhibition dose-dépendante de la PDX sur l'agrégation plaquettaire

induite par le collagène. .................................................................................116

Figure 31: Effet de différents acides gras dihydroxylés sur l'agrégation

plaquettaire induite par le collagène..............................................................117

Figure 32: Effets de la PDX sur l'agrégation plaquettaire induite par l’U-46619..........124

Figure 33 : Exemple de séparation de différents acides gras dihydroxylés

commerciaux par chromatographie sur couche mince (CCM) ......................144

14

Tableau 1: Déplacements chimiques du 1H et du 13C et les constantes de couplage

des protons de la PDX ....................................................................................104

Tableau 2: Pourcentages d'inhibition observés en utilisant la PDX et d'autres

acides gras dihydroxylés sur l'agrégation plaquettaire induite par le

collagène.........................................................................................................119

Tableau 3: Pourcentages d'inhibition observés en utilisant la PDX et d'autres

acides gras dihydroxylés sur l'agrégation plaquettaire induite par l’AA ......121

Tableau 4: Effet de différents acides gras dihydroxylés comportant différentes

géométries de triènes conjugués sur les métabolites oxygénés

synthétisés à partir de l’AA via la cyclooxygénase et la 12-lipoxygénase .....122

15

AVANTS PROPOS

Publications scientifiques :

Chen P., Fenet B., Michaud S., Tomczyk N., Véricel E., Lagarde, M. and Guichardant M.

Full characterization of PDX, a neuroprotectin/protectin D1 isomer, which inhibits blood

platelet aggregation. FEBS Lett. 2009 sous presse.

.

Picq M., Chen P., Perez M., Michaud M., Véricel E., Guichardant M. and Lagarde M.

DHA metabolism: targeting the brain and lipoxygenation.

Molecular Neurobiology Special Issue Review 001, 2009.

Brevet:

Guichardant M., Chen P., Lagarde M., Véricel E.

Polyunsaturated hydroxylated molecule having an E,Z,E geometry and its use in therapy.

Application No./Patent No. 09164115.9 – 2104. Juin 2009.

16

Communications orales :

Chen P., Michaud S., Fenêt B., Tomsyck N., Lagarde M. and Guichardant M.

Characterization of protectin/neuroprotectin D1 isomers.

Inserm-Riken Lipidomics Unit (IRLU) 1st Meeting. June 2009, Lyon, France.

Chen P., Véricel E., Lagarde M. and Guichardant M.

PDX, a protectin D1 isomer, is a potent inhibitor of platelet aggregation. Comparison with

leukotriene B4 and other conjugated triene fatty acids.

GERLI, 6th LIPIDOMICS MEETING. July 2009, Rennes, France.

Chen P., Véricel E., Lagarde M., Guichardant M.

PDX, a PD1 isomer, is a potent inhibitor of platelet aggregation.

ICBL, the 50th Jubilee ICBL in 2009. September 2009, Regensburg, Germany.

Posters :

Chen P., Michaud S., Fenêt B., Tomsyck N., Lagarde M. and Guichardant M.

Characterization end effect of docosatrienes from docosahexaenoic acid on platelet

aggregation. The SFRBM 14th annual meeting, Indianapolis, USA, November, 2008

Chemistry and Physics of Lipids 149S (2007) S58-S59.

17

ABRÉVIATIONS

AA acide arachidonique

ADP adénosine-5’-diphosphate

AgOH acides gras monohydroxylés

ASA aspirine, acide acétylsalicylique

ATP adénosine-5’-triphosphate

BHT butylhydroxytoluène, 2,6-di-tert-butyl-4-méthylphénol

BSTFA N,O-Bis(triméthylsilyl)-trifluroroacétamide

cAMP 3’,5’-adénosine monophosphate cyclique

CCM chromatographie sur couche mince

Chirale-HPLC chromatographie liquide chirale à haute performance

COX cyclooxygénase

DHA acide docosahexaénoïque ou 22:6n-3

EPA acide eicosapentaénoïque ou 20:5n-3

GC chromatographie en phase gazeuse

GC-MS chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

GP glycoprotéine

HEPES acide [(hydroxyéthyl-2)-4-pipérazinyl-1]-2-éthane-sulfonique

HFBI Heptafluorobutyryl imidazole

HHT acide 12-hydroxy-heptadéca-5,8,10-triénoïque

HpETE acide hydroperoxy-eicosatétraénoïque

HPLC chromatographie liquide à haute performance

(‘‘high performance lipid chromatography’’)

LOX lipoxygénase

LTB3 leucotriène B3,

acide 5(S),12(R)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E-triénoïque

LTB4 leucotriène B4,

18

acide 5(S),12(R)-dihydroxy-eicosa -6Z,8E,10E,14Z-tétraénoïque

NS non significatif

PD1 protectin D1

PGs prostaglandines

PGI prostacycline

PL phospholipides

PMN leucocytes polynucléaires

PPP plasma pauvre en plaquettes

PRP plasma riche en plaquettes

RMN résonance magnétique nucléaire

TMS éther triméthylsilyle

TNFα “tumor necrosis factor α”

TX thromboxane

TxA2 thromboxane A2

TxB2 thromboxane B2

UPLC chromatographie liquide à ultra haute performance

UPLC-MS/MS chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la

spectrometrie de masse en tandem

U-46619 acide 9,11-didésoxy-9α,11α-méthanoépoxy-prosta-5Z,13E-diénoïque

vWF facteur de von Willebrand

SI standard interne

SEM erreur standard relative à la moyenne

SD déviation standard

sLOX lipoxygénase de soja

(±)5-HETE acide 5(±)-hydroxy-eicosa-6E,8Z,11Z,14Z-tétraénoïque

5S,12S-diHETE acide 5(S),12(S)- dihydroxy-eicosa-6E,8Z,10E,14Z-tétraénoïque

6-trans LTB4 acide 5(S),12(R)-dihydroxy-eicosa-6E,8E,10E,14Z-tétraénoïque

6-trans-12-épi LTB4 acide 5(S),12(S)-dihydroxy-eicosa-6E,8E,10E,14Z-tétraénoïque

8(R)-HETE acide 8(R)-hydroxy-eicosa-5Z,9E,11Z,14Z-tétraénoïque

19

8(S)-HETE acide 8(S)-hydroxy-eicosa-5Z,9E,11Z,14Z-tétraénoïque

8(S),15(S)-DiHETE acide 8(S),15(S)-dihydroxy-eicosa-5Z,9E,11Z,13E-tétraénoïque

(±)9-HODE acide 9(±)-hydroxy-octadéca-10E,12Z-diénoïque

(±)10-HDoHE acide 10(±)-hydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13Z,16Z,19Z-héxaénoïque

12-épi LTB3 acide 5(S),12(S)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E-triénoïque

12-épi LTB4 acide 5(S),12(S)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E,14Z-tétraénoïque

12-HETE acide 12-hydroxy-eicosa-5Z,8Z,10E,14Z-tétraénoïque

12-HpETE acide 12-hydroperoxy-eicosa-5Z,8Z,10E,14Z-tétraénoïque

(±)13-HODE acide (±)13-hydroxy-octadéca-9Z,11E-diénoïque

(±)14-HDoHE acide (±)14-hydroxy-docosa-4Z,7Z,10Z,12E,16Z,19Z-héxaénoïque

(±)15-HETE acide (±)15-hydroxy-eicosa-5Z,8Z,11Z,13E-tétraénoïque

15(S)-HETrE acide 15(S)-hydroxy-eicosa-8Z,11Z,13E-triénoïque

17(R)-HDoHE acide 17(R)-hydroxy-docosa-4Z,7Z,10Z,13Z,15E,19Z-hexaénoïque

22:3n-6 acide docosa-10Z,13Z,16Z-triénoïque

20

INTRODUCTION

21

De très nombreux travaux expérimentaux, épidémiologiques, cliniques, suggèrent que

la consommation alimentaire régulière d'acides gras de la série n-3 (AG n-3) pourrait être

associée chez l'Homme adulte à des effets « santé » bénéfiques dans des domaines aussi

divers que les maladies athéromateuses, immunologiques, inflammatoires et cancéreuses.

L’un d’entre eux, l'acide docosahexaénoïque (acide docosa-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-

-hexaénoïque (22:6 n-3) ou DHA) est l’acide gras majoritaire du cerveau et de la rétine.

Récemment des chercheurs de notre laboratoire ont montré qu’une consommation

modérée de DHA (200-400 mg/jour chez l’adulte en bonne santé) est optimale pour

obtenir des effets bénéfiques dans la prévention de maladies cardiovasculaires (Lavie CJ.

et al., 2009; Holub BJ., 2009), de diabète (Nkondjock A. & Receveur O., 2003) et de

l’athérosclérose (Imaizumi K, et al., 2000) ceci en se basant sur la mesure de plusieurs

paramètres, notamment sanguins. Le DHA aurait aussi un effet bénéfique sur les maladies

neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer (Cunnane SC. et al., 2009).

Les bénéfices du DHA peuvent s’expliquer par deux mécanismes :

i- soit via la compétion du DHA afin de limiter la conversion de l’acide

arachidonique (AA) en agents pro-inflammatoire comme les prostaglandines ou les

leucotriènes.

ii- soit par utilisation comme substrat alternatif pour synthétiser des leucotriènes

de la série 5 qui sont moins puissants que ceux de la série 4 qui dérivent de l’AA.

Récemment des études métabolomiques sur les médiateurs lipidiques ont montré que

le DHA était métabolisé en dérivés oxygénés multiples dotés de puissantes propriétés

anti-inflammatoires. Parmi les composés retrouvés notamment au niveau des exsudats

inflammatoires on a identifié des dérivés dihydroxylés (les protectines, notamment la

protectine D1, et les marésines) ou trihydroxylés (résolvines) formés à partir du DHA.

Toutes ces molécules possèdent des propriétés anti-inflammatoires puissantes.

Compte-tenu du grand nombre de doubles liaisons présentes sur la chaîne hydrocarbonée

du DHA, il existe un très grand nombre de possibilités d’insertion de l’oxygène sur la

molécule pour former des métabolites avec de nombreux isomères.

22

Le travail de cette thèse porte sur la caractérisation d’un isomère de la protectine D1,

que nous avons nommé PDX, capable d’inhiber l’agrégation des plaquettes sanguines

humaines.

La PDX a été préparée par oxygénation du DHA catalysée par la 15/ω-6-lipoxygénase

de soja. Dans une première partie nous avons caractérisé sa structure en utilisant des

approches physico-chimiques à haute performance (GC-MS, UPLC-MS/MS équipée

d’une interface de mobilité d’ions) et différentes techniques RMN. Nous avons ainsi

déterminé la position des groupements hydroxyles, la stéréochimie des carbones oxygénés

et la géométrie de chaque liaison du triène conjugué. L’utilisation d’18O2 a également

montré que sa synthèse se fait via un mécanisme de double oxygénation.

Dans une deuxième partie nous avons montré que la PDX peut inhiber l’agrégation

plaquettaire à des concentrations submicromolaires induite par le collagène ou l’acide

arachidonique. Nous avons trouvé également que la PDX inhibe dans les plaquettes

sanguines humaines la synthèse des prostaglandines sans altérer l’activité

12-lipoxygénase. La PDX inhibe aussi l’agrégation induite par l’analogue stable de la

prostaglandine H2 (U-46619) qui agit spécifiquement sur le récepteur du thromboxane A2.

Par ailleurs, nous avons montré que tous les composés dihydroxylés contenant un

triène conjugué et présentant une géométrie E/Z/E sont capables d’inhiber l’agrégation

plaquettaire, alors que ceux qui ont une géométrie E/E/Z, ou tout trans, sont inactifs. De

plus, la position du triène conjugué sur la chaîne hydrocarbonée de l’acide gras ainsi que

le nombre de doubles liaisons extérieures au triène n’affectent pas les propriétés

inhibitrices de ces composés.

23

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

24

Chapitre 1 :

Rappels sur les acides gras polyinsaturés et leur métabolisme

oxygéné

I. Acides gras polyinsaturés (AGPIs)

Les acides gras polyinsaturés (AGPIs) sont présents dans les membranes biologiques

et jouent un rôle nutritionnel important. En effet, en plus de leur rôle de lipides de

structure, ils interviennent comme précurseurs de nombreux composés oxygénés

biologiquement actifs.

On distingue deux familles AGPIs n-6 et n-3 encore nommés ω−6 ou ω−3 qui ne sont

pas interconvertibles. Elles sont ainsi appelées car la double liaison la plus proche du

groupement méthyle terminal est portée par le 6ème (n-6) ou le 3ème carbone (n-3) à partir

de cette extrémité. Les animaux et l’Homme sont capables de désaturer et d’allonger les

deux acides gras essentiels, l’acide linoléique (LA, 18:2 n-6) et l’acide α-linolénique

(α-LNA, 18:3 n-3) (Fig. 1).

Famille n-6 18:2 18:3 20:3 20:4∆6 ∆5Ε

linoléate γ-linolénate dihomo-γ-linolénate

arachidonate

Famille n-3 18:3 18:4 20:4 20:5 22:5

24:524:622:6

∆6 ∆5

∆6

Ε Ε

β-ox

α-linolénate stéaridonate eicosapentaénoate

docosahexaénoate

arachidonate Ε

Famille n-6 18:2 18:3 20:3 20:4∆6 ∆5Ε

linoléate γ-linolénate dihomo-γ-linolénate

arachidonate

Famille n-3 18:3 18:4 20:4 20:5 22:5

24:524:622:6

∆6 ∆5

∆6

Ε Ε

β-ox

α-linolénate stéaridonate eicosapentaénoate

docosahexaénoate

arachidonate Ε

Figure 1: Voies métaboliques des acides gras essentiels.

∆ et E : étapes catalysées respectivement par une désaturase et une élongase.

25

Parmi ces AGPIs, l’acide arachidonique (AA, 20:4 n-6) joue un rôle majeur dans les

processus conduisant à l’agrégation plaquettaire.

Il est localisé principalement dans les membranes, estérifié en position sn-2 des

phosphatidyléthanolamines, cholines et inositols (Marcus AJ. et al., 1969). Pour être actif,

il doit être libéré. Sa libération passe par l’activation de diverses phospholipases : la

phospholipase A2 cytosolique qui hydrolyse principalement les phosphatidylcholines et

éthanolamines et la phospholipase C, couplée aux diglycérides et monoglycérides lipases,

qui hydrolysent préférentiellement les phosphatidylinositols (Hofmann SL. & Majerus

PW., 1982 ; Hofmann SL. & Majerus PW., 1983 ; Yang HC. et al., 1996) (Fig. 2).

O

O

O

C

C

P O

OH

R2

R1O

O

O

X

PLA2

PLC

Glycérophospholipides Diacylglycérol + base phosphoryléePLC

Monoacylglycérol + R1 COOH

diglycéride lipase

GlycérophospholipidesPLA2

R2 COOH + lysophospholipide(AA)

COOH (AA)R2

monoglycéride lipase

X: cholineéthanolamineinositolsérine…

O

O

O

C

C

P O

OH

R2

R1O

O

O

X

PLA2

PLC

Glycérophospholipides Diacylglycérol + base phosphoryléePLC

Monoacylglycérol + R1 COOH

diglycéride lipase

GlycérophospholipidesPLA2

R2 COOH + lysophospholipide(AA)

COOH (AA)R2

monoglycéride lipase

X: cholineéthanolamineinositolsérine…

Figure 2: Voies principales de libération de l’acide arachidonique.

26

II. Métabolisme oxygéné des acides gras polyinsaturés (AGPIs) dans les

plaquettes sanguines

Une fois libéré, l’AA est métabolisé selon deux voies enzymatiques :

- la voie de la cyclooxygénase

- la voie de la 12-lipoxygénase

II.1 Voie de la cyclooxygénase

Il existe deux isoformes principales: la cyclooxygénase-1 (COX-1) et la

cyclooxygénase-2 (COX-2).

La COX-2 est une forme inductible qui n’est pas présente dans les plaquettes

sanguines. Elle est codée par un gène localisé sur le chromosome 1. Elle comporte 604

acides aminés ; sa masse molaire est de 70 kDa (Kujubu DA. et al., 1991).

Elle présente une grande homologie avec la COX-1, 60 % des acides aminés sont

identiques et en particulier les régions catalytiques (cyclooxygénase et peroxydase) sont

bien conservées. Elle n’est inhibée que partiellement par l’aspirine (Kurumbail RG. et al.,

1996).

On trouve aussi au niveau du cerveau une COX-3 constitutive qui serait une isoforme

de la COX-1 (Chandrasekharan NV. et al., 2002).

Seule la COX-1 est présente dans la plaquette. Cette protéine constitutive de 70 kDa

est composée de 600 acides aminés (Dewitt DL. & Smith WL., 1988).

La COX-1 possède un groupe hème. Elle est fixée à la membrane du réticulum

endoplasmique et à l’enveloppe nucléaire. Elle fonctionne en homodimère. Sa structure

tridimensionnelle comporte trois domaines distincts : un domaine EGF-like formé de

deux doubles feuillets β, un domaine de liaison à la membrane avec quatre hélices α dans

lequel se loge l’AA ou les Anti-inflammatoires Non Stéroïdiens (AINS) et le domaine

catalytique bifonctionnel.

27

Certains acides aminés essentiels liés à son activité ont été identifiés dans son site

actif. Il s’agit de l’acide glutamique 324 qui ionise l’arginine 120 qui lie l’AA ou certains

AINS. La tyrosine est nécessaire à l’activité catalytique dioxygénase ainsi que la sérine

530 qui peut être acétylée par l’aspirine, un inhibiteur puissant de cette enzyme. La

tyrosine 385 constitue avec l’arginine 120 un rétrécissement dans la zone médiane du

canal hydrophobe. La conformation active de l’enzyme est induite par des modifications

post transcriptionnelles qui impliquent la glycosylation des asparagines 68, 144 et 410

(Picot D. et al., 1994).

La COX-1 est fortement exprimée dans les plaquettes, les cellules endothéliales

vasculaires, l’estomac et les reins. Elle est bifonctionnelle, elle métabolise l’acide

arachidonique en endoperoxyde cyclique, la prostaglandine G2 (PGG2) (activité

cyclooxygénase), puis elle convertit la PGG2 en PGH2 (activité hydroperoxydase) (Dewitt

DL., 1991) (Fig. 3).

28

Acide arachidonique

Cyclooxygénase

PGG2

PGH2

TXA2

TXB2

12-HHT

Dialdéhydemalonique

PGE2

PGD2

PGF2α

COOH

COOHO

O

OOH

COOHO

O

OH

COOH

OH

O

O

O

HO

HO

HOHO

O

O

+

OHC CHOOH

HO

Acide arachidonique

Cyclooxygénase

PGG2

PGH2

TXA2

TXB2

12-HHT

Dialdéhydemalonique

PGE2

PGD2

PGF2α

COOH

COOHO

O

OOH

COOHO

O

OH

COOH

OH

COOH

COOHO

O

OOH

COOHO

O

OH

COOH

OH

O

O

O

HO

HO

HOHO

O

O

+

OHC CHOOH

HO

Figure 3: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique - voie de la cyclooxygénase.

29

La PGH2 est ensuite métabolisée selon trois voies :

La voie de prostaglandine synthase

La voie du thromboxane A2 et la voie de la formation du dialdéhyde

malonique

- La voie de la prostaglandine synthase

Dans la plaquette on trouve différentes prostaglandines synthases spécifiques qui

sont capables de convertir l’endoperoxyde PGH2 en prostaglandines F2α, E2 et D2

(Helliwell RJ. et al., 2004).

Les prostaglandines exercent des effets autocrines ou paracrines. Elles peuvent en

effet sortir des cellules et être transportées et affecter d’autres cellules. Elles interagissent

avec des protéines G membranaires couplées à des récepteurs. Suivant le type de cellule,

l’activation des protéines G peut activer ou inhiber la formation d’AMP cyclique. Cette

activation peut aussi activer la voie de signalisation des phosphoinositols et ainsi induire

la libération du calcium intracellulaire. Elles peuvent aussi au niveau du noyau activer des

récepteurs nucléaires : les ‘‘peroxisome proliferator activating response’’ (PPAR) et

activer ainsi des facteurs de transcription (Alfranca A. et al., 2006).

Elles provoquent ainsi de nombreuses réponses physiologiques rapides comme

l’agrégation plaquettaire, la relaxation/contraction des muscles lisses (PGF2α, PGE2), la

plasticité neuronale et la perméabilité vasculaire, les préventions et le soulagement des

ulcères gastriques (PGE2), le contrôle de l’inflammation et de la pression sanguine (les

PGE, PGA, PGF), la mobilité intestinale (les PGE, PGF), l’inhibition de la différenciation

adipocytaire ( PGF2α, PGE2), etc.

Certains travaux ont montré que l’activation nucléaire par certaines prostaglandines

inhibe la réplication virale (Santoro MG. et al., 1980) et la croissance tumorale (Song

MK. et al., 1995).

La PGE2, en particulier, induit les effets pro-inflammatoires puissants, y compris

l’induction de la fièvre et la suppression de la douleur. Elle active des récepteurs présents

sur les fibroblastes synoviaux et augmente l’expression de ‘‘vascular endothelial cell

30

growth factor’’ (VEGF) qui est un angiogène puissant (Ben-Av P. et al., 1995). Gross S.

et al. ont trouvé que la PGE2 peut quitter la plaque d'athérosclérose et activer EP3 sur les

plaquettes sanguines, EP3 est l’un des quatre types de récepteurs de la PGE2, impliqué

dans l’agrégation plaquettaire induite par les agonistes (Gross S. et al., 2007).

La PGE2 exerce aussi des activités anti-inflammatoires, telles que la suppression de la

prolifération des lymphocytes et l’inhibition de la production de certaines interleukines et

d'autres cytokines. Elle inhibe également l'action de la 5-lipoxygénase, impliquée dans la

synthèse des leucotriènes pro-inflammatoires, et stimule l'activité des lipoxines

anti-inflammatoires. Ainsi la PGE2 a un rôle dans l'initiation de la réponse inflammatoire

et dans sa résolution finale.

- La voie du thromboxane A2 (TXA2):

Cette enzyme convertit la PGH2 en thromboxane A2 qui est un puissant inducteur de

la vasoconstriction et de l’agrégation plaquettaire (Majerus PW., 1983).

Son expression, sa purification et sa caractérisation ont été décrites par Hsu (Hsu PY. et

al., 1999).

Ces auteurs ont montré que cette enzyme posséde un cytochrome P450, un ligand

thiolate, un domaine de liaison à l’oxygène ainsi qu’un domaine permettant la liaison d’un

ligand hydrophobe. Cette enzyme est aussi bifonctionnelle ; elle catalyse aussi le clivage du

noyau cyclopentane diol pour former l’acide 12-hydroxy-heptadéca- 5,8,10-triénoïque

(HHT) et du dialdéhyde malonique (MDA). Le TXA2 instable (durée de vie de 20 à 30 sec)

est rapidement converti en thromboxane B2 (TXB2). Le thromboxane A2 est aussi impliqué

dans la modulation de la cytotoxicité des cellules, dans la croissance des tumeurs et des

métastases, dans l’athérogénèse et la néovascularisation (Nakahata N., 2008). Le TXA2

intervient aussi dans les thromboses, dans les processus inflammatoires et dans les

mécanismes d’adhésion des plaquettes avec les neutrophiles (Chlopicki S. et al., 2003).

Son action passe par un récepteur TP qui est présent dans l’ensemble du corps humain et

31

plus particulièrement dans le thymus et la rate. Il existe deux isoformes TPα et TPβ. TPα est

prédominant dans les plaquettes (Habib A. et al., 1999).

Ces récepteurs ont en commun les 328 premiers acides aminés et diffèrent

exclusivement par leur groupement carboxyle-terminal. Ils appartiennent à la famille des

récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) qui ont été caractérisés dans les plaquettes

(Narumiya S. et al., 1991).

Une boucle externe sert de site de liaison pour des ligands et fait intervenir l’acide

aspartique. La région N-terminale glycosylée du TP intervient pour son ancrage à la

membrane plasmique. Les deux isoformes TPα et TPβ communiquent avec différentes

proteines G hétéro-dimériques pour conséquence un changement de la signalisation

intracellulaire. Le TP communique aussi avec des récepteurs tyrosine kinase comme les

récepteurs EGF pour moduler la prolifération et la différentiation des cellules.

Dans les plaquettes ce récepteur est activé à la fois par la PGH et par le TXA (Vezza 2 2

R. et al., 2002). Il communique principalement via G(q) and G(13), activant ainsi

respectivement la phospholipase C et RhoGEF (Nakahata N., 2008).

II.2 Voie de la 12-lipoxygénase

II.2.1 Mécanisme général des lipoxygénases

Les lipoxygénases sont des enzymes qui contiennent du fer non héminique (Kühn, H.

et al., 2005). Ce dernier est oxydé au cours de la réaction (Fe2+ Fe3+). Elles sont

largement répandues dans les règnes animal et végétal (Mack AJ. et al., 1987 ; Brash AR.

et al., 1997 ; Grechkin A., 1998 ; Kühn H. & Thiele BJ., 1999).

Elles catalysent la dioxygénation des AGPIs porteurs d’au moins un motif

1,4-cis,cis-pentadiène. Les lipoxygénases sont généralement cytosoliques. Elles

contiennent 665 acides aminés (76 kDa) et fixent l’oxygène sur les carbones C5

(5-lipoxygénase), C12 (12-lipoxygénase) et C15 (15-lipoxygénase) de l’AA. Six résidus

histidine servent à établir des liaisons de coordinence avec l’atome de fer et sont

conservés dans toutes les lipoxygénases animales (Ghen X-S. & Colin D., 1993).

32

Les lipoxygénases acceptent comme substrats les AGPIs libres ou estérifiés dans les

phospholipides membranaires ou les lipoprotéines. Elles exigent pour fonctionner la

présence dans le substrat d’un motif 1-cis,4-cis-pentadiène (Hamberg M., 1980). Leur

mécanisme réactionnel inclut trois étapes (Kühn H. et al., 1986a ; Kühn H. et al., 1999)

(Fig. 4).

a) L’atome de fer du site actif de la lipoxygénase , dans l’état Fe3+ capture un électron

d’un groupe méthylène bis allylique appartenant à une structure

1-cis,4-cis-pentadiène d’un AGPIs qui cède un proton à un groupe basique de

l’enzyme. On forme ainsi un radical alkyle libre. La stéréospécificité de

l’abstraction (R ou S) dépend de l’enzyme. En général, les lipoxygénases animales

ont une stéréospécificité S.

b) Après réarrangement, l’O2 s’additionne à ce radical alkyle libre pour former un

radical hydroperoxyle caractérisé par la présence d’un diène conjugué cis-trans qui

absorbe à λmax 235 nm.

c) Le radical hydroperoxyle reprend le radical H• précédemment capturé par l’enzyme

qui contient dans son centre actif du fer devenu Fe2+, pour donner un hydroperoxyde

et régénérer l’enzyme (Fe3+) active. L’hydroperoxyde est ensuite normalement

réduit par la glutathion peroxydase en acide gras monohydroxylé. Cette glutathion

peroxydase requiert du sélénium comme cofacteur et du glutathion comme

coenzyme.

33

Motif: 1,4-cis-cis-pentadiène

Abstraction d’un atomed’hydrogène

Réarrangement

Insertion de l’oxygène

Réduction(glutathion peroxydase)

Radical alkyle

Radical alkyle

Radicalhydroperoxyle

Hydroperoxyded’acide gras

Acide grasmonohydroxylé

R2 R1HH HH

H HH

HH

OO

OOH

•

•

OH

COOHH3C

R1 COO H

R1 COOH

R1 COOH

R1 COOH

R1 COOH

R2H3C

R2H3C

R2H3C

R2H3C

R2H3C

•

•H

OO

Motif: 1,4-cis-cis-pentadiène

Abstraction d’un atomed’hydrogène

Réarrangement

Insertion de l’oxygène

Réduction(glutathion peroxydase)

Radical alkyle

Radical alkyle

Radicalhydroperoxyle

Hydroperoxyded’acide gras

Acide grasmonohydroxylé

R2 R1HH HH

H HH

HH

OO

OOH

•

•

OH

COOHH3C

R1 COO H

R1 COOH

R1 COOH

R1 COOH

R1 COOH

R2H3C

R2H3C

R2H3C

R2H3C

R2H3C

•

•H

OO

Figure 4: Métabolisme d’oxygénation des acides gras polyinsaturés par les

lipoxygénases.

34

II.2.2 Rôle de la 12-lipoxygénase plaquettaire

Les 12-LOXs sont exprimées dans le cerveau, l'hypothalamus, l'hippocampe et la

ganglia de certains mammifères. Elles sont impliquées dans les syndromes

myéloprolifératifs. Les patients avec un déficit de 12-LOXs ont tendance à avoir des

épisodes hémorragiques. En plus, certaines études ont montré leurs implications dans

diverses pathologies : l'hypertension artérielle, le diabète, la polyarthrite rhumatoïde,

l'hypertrophie prostatique maligne et le cancer de l'utérus (Yoshimoto T. et al., 2002).

Il existe deux isozymes classiques chez les mammifères: 12(S)-LOX plaquettaire

(Chen XS. et al., 1994) et la 12(S)-LOX leucocytaire (Yoshimoto T. et al., 2002). Trois

nouvelles isoformes ont été ensuite découvertes dans l'épiderme : la 12(S)-LOX (Kinzig

A. et al., 1997), la LOX-3 (uniquement chez la souris) et la 12(R)-LOX (Sun D. et al.,

1988; Fürstenberger G. et al., 2007).

La 12(S)-LOX plaquettaire est présente essentiellement dans les plaquettes et

l’épiderme (Nugteren DH., 1975). Cette enzyme est localisée dans le cytoplasme, mais

aussi dans les microsomes des kératinocytes. La thrombine peut activer ces enzymes et les

transloquer du cytosol à la membrane (Funk CD. et al., 1992 ; Yoshimoto T. et al., 2002).

Elle utilise préférentiellement l’AA comme substrat.

La 12-lipoxygénase convertit l’AA en acide 12(S)-hydroperoxy-eicosatétraénoïque

(12-HpETE) qui est normalement réduit par la glutathion peroxydase en acide

12(S)-hydroxy-eicosatétraénoïque (12-HETE). La 12-LOX est activée par de faibles

quantités d’hydroperoxydes lipidiques (Kühn H. & Borchert A., 2002). En cas de

déficience en glutathion et/ou en présence d’hémine, le 12-H(p)ETE peut former des

hépoxylines A3 (acide 8(±)-hydroxy-11(S),12(S)-époxyeicosa-5Z,9E,14Z-triénoïque) et

B3 (acide 10(±)-hydroxy-11(S),12(S)-époxyeicosa-5Z,8Z,14Z-triénoïque) (Pace-Asciak

CR. et al., 1983) (Fig. 5).

35

COOH

H

H

O

H

H

HO

H

H

O

HO

COOH

+

HOO

COOH

COOH

HO COOH

Acide arachidonique

12-lipoxygénase

12(S)-HpETE

Glutathion peroxydase

12(S)-HETE

isomérase

Hépoxyline A3

Hépoxyline B3

COOH

H

H

O

H

H

HO

H

H

O

HO

COOH

+

HOO

COOH

COOH

HO COOH

Acide arachidonique

12-lipoxygénase

12(S)-HpETE

Glutathion peroxydase

12(S)-HETE

isomérase

Hépoxyline A3

Hépoxyline B3

Figure 5: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique conduisant à la synthèse

des hépoxylines.

36

Les hépoxilines (HXs) sont des acides gras monohydroxylés époxydés dérivés de

l’AA. Elles sont présentes dans un certain nombre d'organe. Elles ont des propriétés

pro-inflammatoires dans la peau, mais anti-inflammatoire dans les neutrophiles

polynucléaires. En outre, le HXA3 est maintenant connu pour être un important régulateur

de l'inflammation des muqueuses, en réponse à une infection bactérienne (Nigam S. et al.,

2007).

III. Autres lipoxygénases

III.1 Autres 12-lipoxygénases

La 12(S)-lipoxygénase leucocytaire est présente chez la souris, le rat, le lapin, le porc

et le veau. Ses propriétés enzymatiques sont identiques à celles de la 15-LOX-1 (voir §

III.2). L’Homme n’exprime pas cette 12-LOX particulière, mais possède une 15-LOX-1

(Yoshimoto T. et al., 2002).

La 12(S)-lipoxygénase de l’épiderme est exprimée dans la peau des murins. Elle est

peu efficace comparée à celle des plaquettes. Elle est capable de convertir l’AA en

12(S)-HETE et l'acide linoléique (LA) en acide 13(S)-hydroxyperoxy-octadécadiénoïque

(13(S)-HpODE), mais ses substrats privilégiés sont les esters méthyliques de l’AA et de

l’acide linoléïque (Siebert M. et al., 2001).

La 12(R)-lipoxygénase est faiblement représentée. Chez l’Homme, elle est localisée

dans la peau psoriasique et les amygdales, le poumon, les testicules, les glandes

surrénales, l'ovaire et la prostate. Cependant la 12(R)-LOX est très active dans le psoriasis

et dans les dermatoses prolifératives (Baer AN. et al., 1995; Boeglin WE. et al., 1998). Le

seul substrat connu de la 12(R)-LOX est l'ester méthylique de l’AA.

37

III.2 La 15-lipoxygénase

Les 15-lipoxygénases (15-LOX) regroupent deux isoformes (15-LOX-1 et

15-LOX-2). Elles convertissent l’AA en 15(S)-HpETE qui est réduit en 15-HETE par la

glutathion peroxydase. Leur distribution dans les tissus et leurs caractéristiques

enzymatiques sont différentes. Ainsi la 15-LOX-1 est exprimée dans les réticulocytes, les

éosinophiles, les macrophages, les cellules de l’épithélium trachéobronchial, la peau et le

colon (Funk CD., 1996 ; Kamitani H. et al., 1998). Elle est impliquée dans plusieurs types

de cancer comme celui de la prostate.

La structure de la 15-LOX de lapin crystallisée a été élucidée (Stinson AM. et al.,

1990 ; Gillmor SA. et al., 1997). Ces auteurs ont identifié en position C-terminale un

grand domaine catalytique contenant du fer non héminique et un plus petit domaine en

tonneau béta à l’extrémité N-terminale. Le site catalytique renferme des acides aminés

hydrophobes : Phe 353, Il 418, Me 1419, Ile 593 qui interagissent avec le substrat et

déterminent la spécificité n-6 de l’enzyme. En effet leur remplacement par des acides

aminés avec des chaînes moins encombrantes, comme l’alanine, transforme la

15-lipoxygénase en une enzyme fonctionnant comme une 12-lipoxygénase (Sloane DL. et

al., 1991 ; Borngräber S. et al., 1999). La profondeur du site actif est importante pour la

spécificité.

On trouve aussi de l’arginine positivement chargée à l’entrée du site actif. Ce dernier

interagirait avec le groupement carboxylique de l’acide gras (Gan QF. et al., 1996). Elle

convertit les acides linoléique (LA) et arachidonique (AA) respectivement en acide

13(S)-hydroperoxyoctadécadiénoïque (13(S)-HpODE) et en acide

15-(S)-hydroperoxyeicosatétraénoïque (15(S)-HpETE).

La 15-lipoxygénase de soja

La 15-lipoxygénase de soja contient 4 isoenzymes : L-1, L-2, L-3a et L-3b. Ces

isoenzymes monomériques (environ 10 kDa) ont été décrites par Shibata et al., (Shibata

D. et al., 1987 ; Draheim JE. et al., 1989 ; Kühn H. et al., 2005).

38

L’isoforme L-1 est spécifique de la position n-6 tandis que les isoformes L-2 et L3

sont moins spécifiques; elles insèrent une molécule d’oxygène généralement en position

n-6 de la chaîne mais aussi parfois en position n-9. Cette faible spécificité est confirmée

par le fait que ces lipoxygénases sont capables de faire des dioxygénations. Ainsi la

LOX-1 de soja est capable de former de l’acide

5(S),15(S)-dihydroperoxy-5,9,11,13-eicosatétraénoïque (5(S),15(S)-diHpETE) à partir de

l’AA (Bild GS. et al., 1977).

Les hydroperoxydes sont ensuite réduits par la glutathion peroxydase en acide gras

monohydroxylés correspondants (Fig. 6).

39

COOH

COOH

OH

COOH

OOH

Acide arachidonique

15(S)-HpETE

15(S)-HETE

15-lipoxygénase

Glutathionperoxydase

COOH

COOH

OH

COOH

OOH

Acide arachidonique

15(S)-HpETE

15(S)-HETE

15-lipoxygénase

Glutathionperoxydase

Figure 6: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique - voie de la

15-lipoxygénase.

40

Les lipoxines

Les lipoxines (LXs) sont des acides gras dihydroxylés dérivés de l'AA avec quatre

doubles liaisons conjuguées. Elles sont formées par les 15-lipoxygénases ou par les

5-lipoxygénases (Fig. 7).

L’AA est métabolisé en 15-HpETE (acide 15-hydroperoxy-eicosatétraénoïque) par la

15-lipoxygénase ou en 5-HpETE (acide 5-hydroperoxy-eicosatétraénoïque) par la

5-lipoxygénase. Le 5-HpETE est ensuite converti en LTA4 via la 5 lipoxygénase. Le

LTA4 est alors substrat d’une 12- et/ou d’une 15-lipoxygénase qui le transforme en acide

5(S),6(S)-époxy-15(S)-hydroxy-eicosatétraénoïque. Cet intermédiaire peut aussi être

formé directement à partir du 15-HpETE via la 5-lipoxygénase. Il est métabolisé par des

hydrolases spécifiques en lipoxine A4, acide 5(S),6(R),15(S)-

trihydroxy-eicosa-7E,9,E,11Z,13E-tétraénoïque ou en lipoxine B4, acide

5(S),14(R),15(S)-trihydroxy-eicosa-6E,8Z,10E,12E-tétraénoïque..

Les lipoxines sont également formées par coopération cellulaire en épi-lipoxines en

présence d'aspirine (Kühn H. et al., 1986b).

Les lipoxines dérivées de l’AA sont dotées de propriétés anti-inflammatoires. Elles

contrôlent la réponse inflammatoire dans des pathologies telles que l'asthme, l'arthrite, les

troubles cardiovasculaires, les affections gastro-intestinales, les maladies parodontales,

rénales et pulmonaires. Elles ont aussi un rôle de régulateur dans la réponse immunitaire

suite à une infection par des parasites (Serhan CN., 2005).

41

Acide arachidonique

COOH

OOH

COOHO

COOH

O(O)H

5-lipoxygénase5-lipoxygénase

5-lipoxygénase 15-lipoxygénase

15(S)-HpETE5(S)-HpETE

COO

O

OH

12-lipoxygénaseet 15-lipoxygénase

LTA4

OH

HO

COOH

OH

COOH

OH

HO OH

COOH

H

15(S)-époxytétraène

LXA4 LXB4

Lipoxines

Figure 7: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique conduisant à la synthèse

des lipoxines.

42

III.3 La 5-lipoxygénase

La 5-lipoxygénase (5-LOX) catalyse les deux premières étapes qui conduisent à la

biosynthèse des leucotriènes (LTs) connus pour être de puissants médiateurs de

l'inflammation et des réactions allergiques (Ford-Hutchinson AW. et al., 1980 ; Werz O.,

2002 ; Murphy RC. & Gijón MA., 2007). Elle contient un atome de fer non héminique lié

à 3 histidines.

Pour être active, la 5-LOX se lie avec une protéine “5-lipoxygenase-activating

protein” de 18 kDa qui est liée à la membrane. Elle est transloquée du cytoplasme au

niveau de la membrane. Cette protéine facilite aussi la liaison des AGPIs à la 5-LOX.

La 5-LOX convertit l’AA en l’acide 5-hydroperoxy-eicosatétraénoïque (5(S)-HpETE),

qui peut être soit réduit en l’acide 5(S)-hydroxy-eicosatétraénoïque (5(S)-HETE) via la

glutathion peroxydase soit converti par deshydratation en acide

5(S),6(S)-époxy-eicosa-7E,9E,11E,15E-tétraénoïque, appelé leucotriène A4 (LTA4)

(Rådmark O. et al., 1980).

Le LTA4 instable (demi-vie de 10 sec) est rapidement converti selon deux voies

enzymatiques (Fig. 8) :

1- la voie de la LTA4 hydroxylase conduit à la formation de l’acide

5(S),12(R)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E,14Z-tétraénoïque ou leucotriène B4 (LTB4) par

l’addition d’une molécule d’eau.

2- la voie de la LTC4 synthase (ou glutathion transférase II) convertit le LTA4 en

leucotriène C4 (LTC4) par l’addition de glutathion.

Le glutathion est ensuite clivé par la γ-glutamyltransférase pour former le leucotriène

D4 (LTD4). Le métabolite final, le leucotriène E4 (LTE4) est obtenu par perte de la glycine

sous l’action d’une dipeptidase.

Les leucotriènes C4, D4, E4 ont en commun une cystéine apporté par le glutathion et

trois doubles liaisons conjuguées. Ils sont regroupés sous le terme de cystéinyl

leucotriènes. La 5-LOX peut aussi convertir l’AA en lipoxines (LXs) (voir Fig. 7 dans §

III.2 ci-dessus).

43

COOH

COOH

OOH

COOH

OH

COOHO

COOH

C5H11

COOH

OHOH

OH

S Cys Gly

Glu

C5H11

COOH

OH

S Cys Gly

C5H11

COOH

OH

S Cys

Acidearachidonique

5-HpETE

LTA45-HETE

LTB4

LTC4

LTD4

LTE4

5-lipoxygénase

5-lipoxygénase Glutathionperoxydase

Glutathion-S-transférase

LTA4hydrolase

Gamma-glutamyltranspeptidase

Dipeptidase

Figure 8: Métabolisme oxygéné de l’acide arachidonique - voie de la 5-lipoxygénase.

44

III.4 Autres oxygénases

D’autres voies métaboliques d’oxygénation ont également été décrites pour l’AA et

notamment celle des monooxygénases (cytochrome-P450-époxygénases) qui conduisent à

la formation d’époxydes (Fig. 9). Ces acides époxy-eicosatriénoïques (EETs) sont ensuite

hydrolysés en acides dihydroxy-eicosatriénoïques par des époxydes hydrolases. Quatre

acides époxy-eicosatriènoïques (5,6-, 8,9-, 11,12-, et 14,15-EETs) ont été décrits pour

l’AA (Spector AA., 2009).

L'AA peut aussi être transformé par la cytochrome-P450-ω-oxygénase en acide

20-hydroxyeicosatétraénoïque (20-HETE) ou par le cytochrome-P450-ω-1 en acide

19-OH-eicosatétraénoïque (19-HETE).

Les cytochromes P450 oxygénases appartiennent à la famille des hémoprotéines. Elles

sont situées dans le réticulum endoplasmique de la plupart des cellules eucaryotes et

notamment au niveau du foie et de l’intestin. Leur mécanisme implique un clivage de

l'oxygène moléculaire et l'insertion d'un atome d'oxygène sur l’acide gras. Les

cytochromes P450 époxygénases métabolisent les acides gras endogènes : l'AA, l’EPA et

l’LA pour générer une série de médiateurs lipidiques époxydés capables d’affecter les

processus cellulaires de façon aiguë ou chronique.

45

Acide arachidonique(C20:4n-6)

cytochromeP450

époxygenases

5,6-EET

8,9-EET

Figure 9: Métabolisme oxygéné de

P450 époxygénase et de la cytochrome

ω-hydroxylase

20-HETE

19-HETE

11,12-EET

14,15-EET

l’acide arachidonique - voie de la cytochrome

P450 ω-hydroxylase.

46

IV. Métabolisme oxygéné des AGPIs de la série n-3

Récemment, des recherches en métabolomique fonctionnelle ont révélé la présence de

nouveaux médiateurs “specialized pro-resolving mediators ” (SPM) dotés de propriétés

anti-inflammatoires. Ces derniers synthétisés à partir des AGPIs, 20:5 n-3 et 22:6 n-3

comprennent les résolvines, les protectines et les marésines.

Dans ce chapitre nous nous sommes limités au métabolisme oxygéné du DHA qui

concerne les travaux présentés dans cette thèse.

IV.1 Les acides gras monohydroxylés dérivés du DHA

Le DHA est l’acide gras majoritaire dans le cerveau et la rétine. Il est estérifié en

position sn-2 des glycérophospholipides et plus particulièrement dans les formes

plasmalogène des phosphatidyléthanolamines (Bazan NG., 2003).

Le DHA n’est pas substrat des cyclooxygénases mais est un inhibiteur puissant de ces

enzymes. Il peut être métabolisé par les lipoxygénases (voir Fig. 10).

Parmi ces métabolites on trouve :

- les 11-HDoHE et 14-HDoHE formés via la 12-lipoxygénase (Bazan NG. et al.,

1984 ; Yergey JA. et al., 1986)

- les 4- HDoHE et 7-HDoHE générés par la 5-lipoxygénase (Lee TH. et al., 1984a ;

Whelan J. et al., 1990)

- le 17-HDoHE qui est le produit majeur synthétisé par la 15-lipoxygénase

(Sawazaki S. et al., 1994).

- une faible quantité de 13(S)-HDoHE qui proviendrait d’une synthèse abortée via

la cyclooxygénase-2 (Serhan CN. et al., 2002).

47

15-LOX et GPx peroxydase

DHA (C22:6 n-3) 17-HDoHE

5-LOX et GPx peroxydase

12-LOX et GPx peroxydase

4-HDoHE 11-HDoHE

14-HDoHE

Figure 10: Schéma montrant les différentes voies du métab

DHA. GPx : glutathion

7-HDoHE

olisme oxygéné du

48

Les acides gras monohydroxylés dérivés du DHA peuvent inhiber l’agrégation

plaquettaire induite par l’AA exogène, l’ADP ou le collagène. La comparaison de

l’inhibition de l’agrégation plaquettaire par différents acides gras monohydroxylés issus

de différents AGPIs a montré que l’inhibition de l’agrégation plaquettaire induit par l’AA

varie en fonction de la longueur de leur chaîne carbonée (22-C>20-C), de la position des

doubles liaisons (n-3 > n-6), et de leur nombre (6 > 5 > 4) (Karanian JW. et al., 1996).

IV.2 Les docosatriènes : protectines et marésines

Ces acides gras dihydroxylés bioactifs, dérivés du DHA, sont caractérisés par la

présence d’un triène conjugué.

IV.2.1 Les protectines

En plus du 17(S)-OH-22:6n-3, le DHA libéré des phospholipides membranaires par

l’action de la PLA2 est converti par la 15-LOX, non seulement en 17(S)-OH-22:6n-3 mais

aussi en acides gras dihydroxylés. La protectine D1 (PD1) a été mise en évidence pour la

première fois dans les cellules mononuclées activées et dans le cerveau. De ce fait, elle a

été aussi appelée neuroprotectine D1 (NPD1) (Mukherjee PK. et al., 2004; Hong S. et al.,

2005; Ariel A. et al., 2005 ; Serhan CN. et al., 2006). Sa structure a été caractérisée

comme étant l’acide 10(R),17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-hexa

énoïque (Serhan CN. et al., 2006).

La PD1 générée à partir du DHA endogène exerce un rôle protecteur, surtout

anti-inflammatoire (Hong S. et al., 2003 ; Mukherjee PK. et al., 2004), en réduisant

l'inflammation allergique respiratoire et l'hyperréactivités associées à l'asthme (Levy BD.

et al., 2007). Elle est augmentée lors des accidents vasculaires cérébraux. Elle limiterait

les lésions en inhibant l’infiltration leucocytaire et l'expression de gènes

pro-inflammatoires (Marcheselli VL. et al., 2003). Elle aurait aussi un rôle protecteur au

49

niveau de la rétine (Qin Q. et al., 2008) et dans la maladie d'Alzheimer (Lukiw WJ. et al.,

2005 ; Bazan NG. 2009).

La PD1 protège les cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine humaine du stress

oxydant (Bazan NG., 2005). De faibles concentrations de PD1 (50 nM) sont capables

d’inhiber presque complètement le stress oxydant engendré par de faibles concentrations

d’H2O2. Une étude montre que la PD1 contrecarre puissamment (IC50 < 5 nM), de façon

dose-dépendante, l'induction par les cytokines du gène promoteur de la COX-2

(Mukherjee PK. et al., 2004). La PD1 est également connue pour protèger le foie contre

les blessures nécro-inflammatoires en réduisant sensiblement l’expression de la COX-2 et

de la PGE2 (González-Périz A. et al., 2006).

Les résultats de Serhan et al. indiquent que la PD1 est un puissant anti-inflammatoire

non stéréosélectif (Serhan CN. et al., 2006). En effet, la PD1 :

(10(R),17(S)-11E,13E,15Z-diHDHA) est aussi efficace que son isomère :

10(S),17(S)-11E,13E,15Z-diHDHA pour inhiber l’infiltration des PMN dans le liquide

péritonéal de souris traitées au zymozan. La stéréochimie du carbone 10 n’est donc pas

importante pour son activité. Par contre, cette efficacité dépendait de la configuration des

doubles liaisons du triène conjugué. Ainsi la PD1 est plus efficace que l’isomère

10(S),17(S)-11E,13Z,15E-diHDHA > 10(R),17(S)-11E,13E,15E-diHDHA ≥

10(S),17(R)-11E,13E,15Z-diHDHA.

Un schéma, proposé par Serhan, montrant le mécanisme de la synthèse de la PD1 est

présenté dans la Figure 11.

Le DHA est métabolisé par une enzyme lipoxygénase-like en acide

17(S)-hydroperoxy-docosahexaénoïque (17(S)-H(p)DoHE) qui est ensuite converti en

16,17-époxyde. Ce dernier est alors transformé enzymatiquement en PD1. La formation

du 16,17(S)-époxyde ne passe pas par une cytochrome P450 époxydase (Graham-Lorence

S. et al., 1997) comme cela a été rapporté pour la synthèse des résolvines (Hong S. et al.,

2003). L’époxyde intermédiaire s’hydrolyse en milieu aqueux et forme un cation

50

carbonium intermédiaire. Il s’opère alors une délocalisation des charges le long du triène

conjugué (C-16 jusqu’à C-10) permettant ainsi l’attaque nucléophile par une deuxième

molécule d’oxygène. Ce mécanisme est identique à celui qui a été décrit pour la

leucotriène A4 hydrolase (Rudberg PC. et al., 2002 ; Haeggström JZ., 2004) dans la

synthèse des leucotriènes.

51

COOH

COOH

O(O)H

COOH

O

COOH

HO

OH

DHA (22:6n-3)

17(S)HpDoHE

15-LOX

époxydase

Conversionenzymatique

16,17-époxy-HDoHE

Protectine D1 (PD1)

10(R)

17(S)

COOH

COOH

O(O)H

COOH

O

COOH

HO

OH

DHA (22:6n-3)

17(S)HpDoHE

15-LOX

époxydase

Conversionenzymatique

16,17-époxy-HDoHE

Protectine D1 (PD1)

10(R)

17(S)

Figure 11: Schéma montrant la biosynthèse de la protectine D1.

52

Parallèlement Butovich a répété les expériences de Serhan CN. et al. et a identifié par

RMN un isomère de la PD1 : l’acide 10,17(S)-dihydroxy-docosa-

4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-hexaénoïque (Butovich IA., 2005).

D’autres docosatriènes tel que les 7,17(S)-diHDoHE et le 10,17(S)-diHDoHE, avec la

géométrie E/Z/E se sont révélés être des inhibiteurs de la 5-lipoxygénase recombinante

humaine en utilisant l’AA comme substrat. Les 7,17(S)- et 10,17(S)- diHDoHE pourraient

avoir des activités anti-inflammatoires et anti-cancéreuses (Butovich IA. et al., 2006).

IV.2.2 Les marésines

Les marésines ont été très récemment mises en evidence dans des exsudats de liquides

péritonéaux de souris contenant des macrophages. Ces nouveaux médiateurs issus du

DHA sont dotés de propriétés anti-inflammatoires et protectrices “proresolving”. Le

produit principal : la marésine 1 (MaR 1) ou acide 7(R),14(S)-dihydroxy-docosa-

-4Z,8,10,12,16Z,19Z-hexaénoïque, est un puissant médiateur, qui arrête l’infiltration des

PMN et stimule la phagocytose des macrophages. Un autre isomère 7(S),14(S)-diHDHA

de MaR1, est formé par un mécanisme de double lipoxygénation, et est moins puissant in

vitro et in vivo (Serhan CN. et al., 2009).

Un schéma de synthèse des marésines est présenté dans la Figure 12. Le DHA est

converti en acide 14(S)-hydroperoxy-docosahexaénoïque (14(S)-H(p)DoHE),

probablement via la 12-LOX. Le 14(S)-H(p)DoHE est alors converti enzymatiquement en

13,14-époxyde intermédiaire qui est hydrolysé, par une voie enzymatique via un cation

carbonium bioactif en 7,14(S)-diHDoHE. Le mécanisme proposé serait identique à celui

proposé pour la synthèse de la PD1 (Serhan CN., 2009).

53

DHA (C22:6 n-3)

12/15-LOX

14(S)-H(p)DoHE

époxydase

13,14-époxy-HDoHE

conversion enzymatique

Marésine 1 (MaR1)

Figure 12: Schéma montrant la biosynthèse de la marésine 1.

54

IV.3 Les résolvines

Ces composés di-et tri-hydroxylés dérivés des acides gras de la série n-3, ont été

appelés "résolvines". Elles sont formées lors de la phase de résolution de la réponse

inflammatoire aiguë, et impliquent des mécanismes de coopération cellulaire. Elles

agissent en stoppant l'entrée des neutrophiles vers les sites d'inflammation, et en réduisant

le volume des exsudats (Serhan CN. et al., 2002). On appelle les résolvines E (RvEs) les

dérivés formés à partir du 20:5n-3, et les résolvines D (RvDs) ceux qui formés à partir du

22:6n-3.

IV.3.1 Les résolvines E

Les résolvines E (RvEs) sont des inhibiteurs puissants pour le recrutement des

leucocytes (PMN) in vitro et in vivo, ils réduisent le nombre de PMN dans les exsudats,

réduisant ainsi l’inflammation (Serhan CN. et al., 2002). La résolvine E1 (RvE1), a été

caractérisée comme étant l’acide 5(S),12(R),18(R)-trihydroxy-eicosapenta

-6Z,8E,10E,14Z,16E-énoïque.

55

EPA (20:5n-3)

aspirine + COX2

18(R)-HpEPE

5-LOX (leucocytes)

5-LOXréduction

COOH

COOH

O(O)H

COOH

O(O)H

O(O)H

OCOOH

OH

COOH

OH

OH

OH

HO

OH

COOH

5,6-époxy-18(R)-hydroxy-EPE

5(S),18(R)-dihydroxy-EPE(Résolvines E2)

5(S),12(R),18(R)-trihydroxy-EPE(Resolvine E1)

EPA (20:5n-3)

aspirine + COX2

18(R)-HpEPE

5-LOX (leucocytes)

5-LOXréduction

COOH

COOH

O(O)H

COOH

O(O)H

O(O)H

OCOOH

OH

COOH

OH

OH

OH

HO

OH

COOH

5,6-époxy-18(R)-hydroxy-EPE

5(S),18(R)-dihydroxy-EPE(Résolvines E2)

5(S),12(R),18(R)-trihydroxy-EPE(Resolvine E1)

Figure 13: Schéma montrant la biosynthèse des résolvines E.

56

L’aspirine induit la formation de résolvine E1 (RvE1) par acétylation de la COX-2

dans les cellules endothéliales vasculaires qui génèrent stéréosélectivement à partir de

20:5 n-3 l’acide 18(R)-hydroperoxy-eicosapentaénoïque (18R-H(p)EPE). Cet

intermédiaire est converti en RvE1 via l’action séquentielle de 5-LOX leucocytaire et

aussi converti en résolvine E2 (RvE2) (Fig. 13).

L’activité des RvE1 implique une série de récepteurs couplés à la protéine G (RCPG)

(Arita M. et al., 2005a). Il a été montré qu’un récepteur orphelin, ChemR23 spécifique de

la RvE1 diminuait le facteur nucléaire (NF)-κB. La signalisation de RvE1 via ChemR23

passerait plutôt par les voies de phosphorylation intracellulaires que par la mobilisation du

calcium intracellulaire ou que par l'AMP cyclique, voies généralement impliquées par la

plupart des médiateurs pro-inflammatoires (Arita M. et al., 2005a ; 2005c ; Schwab JM. et

al., 2007).

Récemment, un autre récepteur RCPG spécifique des RvE1 a été identifié, comme

étant aussi le récepteur BLT1 du leucotriène B4 (Arita M. et al., 2007). L’interaction in

vivo RvE1-BLT1 a été démontrée en utilisant des souris déficientes en BLT1. Cependant

dans d’autres cellules le RvE1 se lie à deux récepteurs RCGP distincts pour contrôler

l’inflammation et promouvoir sa résolution.

In vitro, des concentrations nanomolaires de RvE1 réduisent considérablement les

migrations transendothéliales des PMN humains, les migrations des cellules dendritiques

et la production de l'interleukine-12 (Serhan CN., 2002; Arita M. et al., 2005a).

Dans plusieurs modèles animaux porteurs de maladies inflammatoires, les RvE1

protègent contre les lésions tissulaires médiées par les leucocytes et diminuent

l’expression excessive des gènes pro-inflammatoires (Arita M. et al., 2005a, 2005b;

Hasturk H. et al., 2006). La RvE1 synthétique bloque l’infiltration de PMN dans les

parodontites dans un modèle de lapin (Hasturk H. et al., 2006) et protège contre le

développement de colique induite par l'acide sulfonique 2,4,6-trinitrobenzène (Arita M. et

al., 2005b).

57

Récemment, il a été montré que le RvE1 réduit la néovascularisation dans la

rétinopathie induite par l'oxygène (Connor KM. et al., 2007) et améliore l’élimination des

PMN CD55-dépendante des surfaces épithéliales (Campbell EL. et al., 2007).

IV.3.2 Les résolvines D

Les résolvines D sont formées à partir du DHA, selon les mêmes mécanismes décrits

pour la synthèse des résolvines E. Elles sont appelées 17(S)-résolvines de la série D

(RvD1~4) (Fig. 14). La RvD1~4 est l’acide 7(S),8(R),17(S)-trihydroxy -docosa

-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-hexaénoïque.

Les cellules endothéliales humaines des micro vaisseaux traitées avec de l'aspirine,

sous hypoxie, produisent à partir du DHA le 17(R)-HDoHE qui est métabolisé via la

COX-2 acétylée en AT-résolvines (AT-RvD1~4). Ces molécules ont été également

trouvées dans le cerveau (Serhan CN. et al., 2002; Hong S. et al., 2003).

Les RvD1 et AT-RvD1 sont de puissants régulateurs des PMN humains et murins

(Serhan CN. et al., 2002). Ainsi, in vivo, dans la péritonite chez la souris, elles sont

équipotentes (avec des doses de l’ordre du nanogramme) pour limiter, de façon

dose-dépendante l’infiltration des PMN dans le liquide péritonéal de souris traitées par

injection intra péritonéale de zymosan. Dans les cellules microgliales, elles bloquent la

transcriptions de l’IL-1β induite par TNF-α (Hong S. et al., 2003).

La RvD1 est aussi générée en réponse à une ischémie/reperfusion bilatérale dans les

reins de souris. L'administration de RvDs, avant ou après l'ischémie, a entraîné une

réduction des lésions morphologiques et fonctionnelles du rein (Duffield JS. et al., 2006).

La fibrose interstitielle consécutive à une ischémie/reperfusion a également été réduite

chez les souris traitées avec les RvDs. Ces résultats montrent les propriétés

anti-inflammatoires et antifibrotiques endogènes des RvDs dans la protection des lésions

rénales aiguës.

Ces travaux font suite aux travaux des équipes de Bannenberg GL. et al. (Bannenberg

GL. et al., 2005) et de Duffield JS. et al. (Duffield JS. et al., 2006) qui montraient déjà

58

une réduction des neutrophiles mais aussi des cytokines pro-inflammatoires dans les

exsudats péritonéaux de souris.

59

DHA (C22:6n-3)

15-LOX

17S-H(p)DoHE

leucocytes 5-LOX leucocytes 5-LOX

7(S)-hydroperoxy, 17(S)-diHDoHE

4(S)-hydroperoxy,17(S)-diHDoHE

7(8)-époxy- 17(S)-diHDoHE

4(5)-époxy- 17(S)-diHDoHE

4(S),11,17(S)-triHDoHE Resolvin D3

7(S),8,17(S)-triHDoHEResolvin D1

7(S),16,17(S)-triHDoHEResolvin D2 4(S),5,17(S)-triHDoHE

Resolvin D4

Figure 14: Schéma montrant la biosynthèse des résolvines D.

60

Chapitre 2:

Rappels sur les plaquettes sanguines

I. Les plaquettes sanguines

I.1 Origine

Les plaquettes sanguines sont des cellules hématopoïétiques anucléées formées par

fragmentation cytoplasmique des mégacaryocytes de la moelle osseuse. Ces grosses

cellules médullaires proviennent de cellules totipotentes qui donnent aussi naissance aux

érythrocytes et aux leucocytes. Chaque mégacaryocyte produit environ un millier de

plaquettes. Environ 2/3 des plaquettes circulent dans le sang (130 000 à 400 000

plaquettes /µL), le reste est séquestré de façon réversible dans la rate. Chez l’Homme, leur

durée de vie dans la circulation sanguine est en moyenne de 8 à 10 jours. Les plaquettes

âgées sont détruites par les macrophages du système réticulo-histiocytaire de la moelle

osseuse et également par la rate et le foie (Blache D., 1992; Kuwahara M. et al., 2002 ;

Willoughby S. et al., 2002).

I.2 Morphologie des plaquettes

Au repos les plaquettes ont une forme discoïde (Fig. 15A) avec un diamètre de 2 à 4

µm. En réponse à une stimulation, elles changent de forme et deviennent sphériques, puis

elles émettent des pseudopodes qui s'allongent lors des stimulations (Kuwahara M et al.,

2002) (Fig. 15B).

61

A. plaquettes au repos B. plaquettes agrégéesA. plaquettes au repos B. plaquettes agrégées

Figure 15 : Microphotographie de plaquettes.

(Photographie obtenue par microscopie à balayage, d’après Kuwahara M et al., 2002)

I.2.1 La membrane

Les plaquettes sont constituées d’une membrane composée d'une bicouche de

phospholipides (PL) s'opposant par leur pôle hydrophobe. Leur répartition est

asymétrique. C’est le cas notamment des phosphatidylsérines (PS) qui sont transloquées

du feuillet interne au feuillet externe dans les mécanismes initiaux de la coagulation

plasmatique. Ce mécanisme intervient dans l’activation des facteurs de coagulation Xa et

Va (Lentz BR., 2003). Les phosphatidyléthanolamines (PE) et phosphatidylcholines (PC)

constituent des réservoirs important d’acide arachidonique (AA).

La membrane plasmique contient également des lipides neutres, des glycoprotéines et

du cholestérol libre qui assurent sa stabilité et sa rigidité. Sa surface comporte de

nombreuses invaginations qui forment le système canaliculaire ouvert, qui permet

l’expulsion des granules lors de l’activation plaquettaire.

Une grande variété de récepteurs transmembranaires sont localisés au niveau des

membranes. On trouve plusieurs récepteurs de la famille des intégrines (αΙΙbβ3, α2β1,

α5β1, α6β1, αvβ3) ; des récepteurs riches en leucine (“leucine rich receptor” : LRR)

comme les glycoprotéines : GP Ib–IX–V ; des récepteurs couplés aux protéine G

62

transmembranaire (RCPG) ; deux récepteurs de la thrombine : PAR-1 et PAR-4, deux

récepteurs à l’ADP : P2Y1 et P2Y12 ; deux récepteurs du thromboxane A2 (TxA2 ) :

TPα et TPβ ; des récepteurs de les prostaglandines : EP 1-4 pour la PGE2, DP pour la

PGD2, et IP1 pour la PGI2. On trouve aussi des protéines appartenant à la superfamille des

immunoglobulines : GPVI, FcγRIIA ; des récepteurs de lectine de type C comme par

exemple des P-sélectines, des récepteurs tyrosine kinase (RTK) tels que : le récepteur à la

thrombopoïétine, la protéine Gas-6, l’éphrine et des éphrine kinases. Divers autres

récepteurs ont aussi été mis en évidence : CD63, CD36, un ligand P-sélectine, un

récepteur de type TNF.

Actuellement, il est bien établi que la plupart de ces récepteurs jouent un rôle de

premier plan dans la fonction hémostastique des plaquettes en permettant des interactions

spécifiques et des réponses fonctionnelles avec des protéines vasculaires de l’adhésion et

avec des agonistes plaquettaires solubles. De plus certains de ces récepteurs sont

impliqués dans des fonctions encore mal connues telles que l’inflammation, la croissance

des tumeurs, le développement des métastases, et les défenses immunitaires...

I.2.2 Le cytosquelette

Sous la membrane plasmique, s’étend le cytosquelette formé de plusieurs systèmes

fibrillaires. Le cytosquelette est composé d’un faisceau de 8 à 24 microtubules (tubuline)

en périphérie interne de la plaquette (Italiano JE. Jr. & Shivdasani RA., 2003). Il sert à

maintenir la structure discoïde de la plaquette au repos. Il comporte aussi un réseau de

microfilaments d’actine partant dans le cytoplasme, et un cytosquelette composé de petits

filaments d’actine reliés à la membrane externe. Il régule les propriétés de la membrane

telles que ses contours et sa stabilité. Il intervient dans la contraction, la dégranulation, la

rétraction du caillot et l’émission des pseudopodes. On trouve aussi des filaments

intermédiaires de vimentine qui joueraient un rôle important dans le soutien et l'ancrage

de la position des organites dans le cytoplasme.

L’anneau microtubulaire formé de tubuline, présent à la périphérie de la plaquette,

sert au maintien de la forme discoïde des plaquettes non stimulées. Au cours de

63

l’activation plaquettaire, il y a redistribution des protéines du cytosquelette et

réorganisation des filaments d’actine, des granules s’associent à la myosine pour générer

l’activité contractile nécessaire à la sécrétion. Morphologiquement, la plaquette perd sa

forme discoïde pour adopter une forme sphérique avec projection de pseudopodes. En

plus de son rôle de charpente cellulaire, le cytosquelette se révèle être un lieu essentiel

pour la relocalisation de nombreux complexes protéiques de la signalisation.

A l’état basal, les microfilaments d’actine se présentent sous forme dépolymérisée

(monomère d’actine G) ou polymérisée (actine F), des protéines comme la profiline, la

thymosine béta-4 et la gelsoline limitent la polymérisation (Hartwig JH. & DeSisto M.,

1991). L’activation des plaquettes entraîne la polymérisation de l’actine (interviennent

également ‘‘actin binding protein’’ (ABP) et la myosine). Elle se traduit par : (1) une

modification de la forme (aspect sphérique, émission de fins filaments appelés

filopodes) ; (2) une redistribution des granules intraplaquettaires ; (3) une redistribution

de glycoprotéines (GP) de la membrane faisant intervenir également la spectrine et

l’actinine (les 2 GP principales Ib-IX et IIb-IIIa sont concernées).

I.2.3 Le système des organelles

Un système tubulaire dense (dense aux électrons), non connecté à la surface, est

considéré comme un reste du réticulum endoplasmique lisse des mégacaryocytes. Comme

toutes les cellules, le cytoplasme des plaquettes contient divers organites : un petit nombre

de mitochondries, de nombreux grains de glycogène, et plusieurs types de granules dont

des granules α et les granules denses qui sont spécifiques aux plaquettes et qui sécrètent

leur contenu lors de l’activation, ainsi que des lysosomes contenant des enzymes.

En microscopie électronique, on peut distinguer ces trois sortes de granules :

- Les granules denses contiennent de l'adénosine diphosphate (ADP) qui renforce

l’agrégation et les réactions de coagulation intervenant à la surface des plaquettes, de

l'adénosine triphosphate (ATP), de la sérotonine, du pyrophosphate, du calcium et du

magnésium.

64

- Les granules α, moins denses aux électrons et de taille supérieure, sécrètent un grand

nombre de protéines telles que le facteur von Willebrand (vWF), la β-thromboglobuline,

le facteur 4 plaquettaire qui sont synthétisés par les mégacaryocytes, le fibrinogène qui est

acquis par endocytose, d’autres protéines plasmatiques comme l’albumine, des IgG, des

protéines adhésives (thrombospondine) et des facteurs de croissance tels que le PDGF

‘‘platelet derived growth factor’’ (Italiano JE. Jr. & Battinelli EM., 2009). Ils contiennent

un facteur mitogène capable d’activer la prolifération, des fibroblastes, des antiprotéases

(antitrypsine, antiplasmine) et des facteurs de coagulation. De plus, la membrane de ces

granules contient un certain nombre de récepteurs tels que l’intégrine αIIbβ3, la

P-sélectine et la glycoprotéine IV.

- Les lysosomes contiennent diverses enzymes comme par exemple, les arylsulfatases,

les hydrolases, les phosphatases, la cathepsine G et la GP53 ou CD63, et des

microperoxysomes (catalase). Le cytoplasme plaquettaire contient aussi les enzymes du

métabolisme lipidique comme la peroxydase plaquettaire, la thromboxane synthase, la

12-lipoxygénase, une cyclooxygénase constitutive (COX-1), et une ATPase Ca et Mg

dépendante servant à la régulation du transport du Ca2+ intracellulaire.

I.3 Physiologie des plaquettes

Lorsque les plaquettes ne sont pas activées, elles circulent dans le sang sans adhérer à

l’endothélium vasculaire. Lorsqu’il existe une brèche vasculaire, les plaquettes sont

capables d’adhérer aux structures sous endothéliales. Cette adhésion s’accompagne de la

disparition des microtubules et de la forme discoïde. Elle conduit à la formation

d’agrégats plaquettaires, et induitent la formation de fibrine.

I.3.1 Adhésion plaquettaire

Les plaquettes viennent adhérer au sous-endothélium lorsque l’endothélium est lésé.

Certaines glycoprotéines de la membrane plasmique vont interagir avec des protéines

d’adhésion liées au sous-endothélium. Les glycoprotéines réceptrices des molécules

65

d’adhésion (facteur von Willebrand (vWF), fibronectine et fibrinogène) sont

respectivements les GP Ib, les GP Ic-IIa et les GP IIb-IIIa.

Le facteur vWF joue le rôle d’une «colle» entre le sous-endothélium et les

glycoprotéines de la membrane plasmique. Le complexe GP Ib-IX est exprimé de façon

constitutive à la surface des plaquettes au repos, il ne se lie au facteur vWF qu’après son

interaction avec la matrice sous-endothéliale. Cette liaison entraîne une activation des

filaments d’actine et une contraction des plaquettes avec la formation de pseudopodes. Ce

changement de forme implique la mobilisation du calcium membranaire, l’activation du

système contractile et la sécrétion des granules.

I.3.2 Activation et agrégation plaquettaire

Après adhésion, les plaquettes sont activées par le collagène sous-endothélial et par la

thrombine générée à leur surface (Tobelem G., 1989). L’activation plaquettaire entraîne la

contraction des microtubules et la libération du contenu des granules. Les granules denses

fusionnent avec la membrane et libèrent leur contenu, notamment l’ADP, qui est un

activateur secondaire (agent agrégant) qui va recruter d’autres plaquettes au niveau de la

lésion vasculaire. De plus, nombreux agents, tel que le thromboxnae A2, la sérotonine, le

“ platelet activating factor ’’ (PAF) sont aussi libérés par les plaquettes activées et vont

provoquer l’agrégation des plaquettes nouvellement recrutées. L’activation plaquettaire

entraîne aussi un changement conformationnel de la GP IIb-IIIa, qui est responsable de

l’agrégation plaquettaire par le fibrinogène (Shattil SJ., 1999). Le fibrinogène circulant va

former des ponts interplaquettaires de fibrine reliant ainsi les plaquettes agrégées pour

former le caillot.

Au cours de l’activation on observe la production de molécules

proagrégantes (endoperoxydes et thromboxane) synthétisées par la COX-1 (voir § II.1

dans Chapitre 1).

Les phospholipases catalysent le clivage des phopholipides (PL) membranaires et

génèrent ainsi des seconds messagers qui participent à la transduction de signaux

intracellulaires. L’AA est clivé des PL par deux voies majeures : la voie de la

66

phospholipase A2 (PLA2) (Apitz-Castro RJ. et al., 1979) et la voie de la phospholipase C

(PLC) (Banno Y. et al., 1995) qui fait intervenir les acyl-glycérol lipases.

I.3.3 Fonction hémostatique

L'hémostase est un processus qui permet l'interruption d'un saignement dû à une

lésion vasculaire. Il entraîne la vasoconstriction des vaisseaux, l'agrégation des plaquettes,

la synthèse de thrombine et de fibrine (Ferguson JJ., 2006).

Thrombine

AGREGATION

Fibrine

Hémostase

CaillotAgrégation plaquettaire

secondaire

primaire

COAGULATION Thrombine

AGREGATION

Fibrine

Hémostase

CaillotAgrégation plaquettaire

secondaire

primaire

COAGULATION Thrombine

AGREGATION

Fibrine

Hémostase

CaillotAgrégation plaquettaire

secondaire

primaire

COAGULATION

Figure 16 : Mécanisme de formation d’un caillot.

Le schéma de hémostase est indiqué dans la Figure 16. Le stade primaire est le

processus d’adhésion des plaquettes sur les sites de blessures, c’est la première étape de

l’hémostase qui se produit en quelques secondes pour stopper l’effusion du sang. Le stade

secondaire décrit les réactions de coagulation plasmatique qui aboutissent à la formation

de la fibrine. Ce processus prend plusieurs minutes. Il entraîne la consolidation du caillot.

Ces deux stades apparemment distincts, l'hémostase primaire et secondaire sont

étroitement liés. Ainsi, les plaquettes activées accélérent la coagulation du plasma, et les

67

produits de la coagulation stimulent l’agrégation plaquettaire. Dans les conditions

pathologiques, les plaquettes libérent diverses substances (ADP, sérotonine,

thromboxanes, etc.). Les plaquettes s’accolent les unes autres sous l'influence de la

thrombine et forment un caillot. Une fois l’activation plaquettaire enclenchée, l’agrégat

formé est pris en masse par la fibrine insoluble provenant de la coagulation plasmatique,

pour constituer le caillot. La rétraction est un phénomène tardif lent, qui serait sous la

dépendance de la thrombosthénine.

Une insuffisance des facteurs procoagulants conduit à un risque d'hémorragie et, par

contre, leur excès à un risque de thrombose ou d'embolie.

I.4 Métabolisme de l’acide arachidonique dans les plaquettes

L’acide arachidonique (AA) est l’AGPI majeur des membranes plaquettaires. Il

représente 20 % de la totalité des acides gras (Marcus AJ., 1969) et joue un rôle important

dans l’hémostase en tant que précurseur des icosanoïdes de la série 2.

Après sa désacylation des phospholipides, l’AA est rapidement métabolisé en divers

composés biologiquement actifs par la voie de la cyclooxygénase qui conduit à la

synthèse des prostanoïdes, et par la voie de la 12-lipoxygénase, qui forme les acides

12-hydroperoxy-eicosatétraénoïque (12-HpETE), et 12-hydroxy-eicosatétraénoïque

(12-HETE).

I.4.1 La voie de la cyclooxygénase dans les plaquettes

La voie de la cyclooxygénase conduit à la formation des prostanoïdes qui regroupent

les prostaglandines (PGs) et les thromboxanes (TXs) (voir § II.1 dans Chapitre 1).

La COX-1 convertit l’AA en endoperoxyde cyclique de prostaglandine, PGG2, qui est

réduit en PGH2 par une hydroperoxydase (Smith WL., 1989). L’endoperoxyde PGH2 est

le précurseur d’eïcosanoïdes biologiquement actifs. Il est transformé en tromboxane A2

(TxA2) par la thromboxane synthase.

Le TxA2 est responsable de l’activation plaquettaire, de l’accélération de leur

agrégation et de la constriction vasculaire nécessaire à l’hémostase ; il est également

68

capable de contracter les muscles lisses bronchiolaires. Le TxA2 (durée de vie < 1 min)

est stabilisé par hydratation en un produit inactif, le TxB2. La thromboxane synthase

catalyse aussi la production d’un acide gras hydroxylé, l’acide

12-hydroxy-heptadéca-5,8,10-triénoïque (HHT) et du dialdéhyde malonique (MDA) par

coupure du cycle cyclopentane de la PGH2.

I.4.2 La voie de la 12-lipoxygénase dans les plaquettes

Dans les plaquettes sanguines, seule la 12-lipoxygénase (12-LOX) est présente dans le

cytoplasme. Elle est transloquée à la membrane lors de l’activation des plaquettes (Ozeki

Y. et al., 1999), La 12-LOX catalyse la fixation d’une molécule d’oxygène sur le carbone

12 (n-9) de l’AA et donne l’acide 12-hydroperoxy-eicosa-5,8,10,14-tétraénoïque

(12-HpETE), qui est normalement rapidement réduit en son dérivé hydroxylé, le

12-HETE, par une glutathion peroxydase cytosolique GPx1.

II. Mécanismes d’activation des plaquettes

II.1 Mécanismes de la formation des agrégats plaquettaires

L’activation des plaquettes s’effectue par la liaison d’un agoniste à un ou plusieurs

types de récepteurs membranaires spécifiques. Il existe de nombreux activateurs

plaquettaires. Les agonistes physiologiques tels que l’ADP, le thromboxane A2, le

collagène, et surtout la production explosive de thrombine permettent le recrutement et

l’activation de nouvelles plaquettes, provoquant ainsi un emballement du processus

thrombotique au niveau de la lésion vasculaire (Rivera J. et al., 2009.).

La thrombine, le collagène et le TxA2 agissent chacun par l’intermédiaire d’un

récepteur membranaire qui leur est spécifique (Fig. 17).

69

Figure 17 : Interactions des récepteurs plaquettaires avec les ligands principaux.

II.2 Activation induite par la thrombine

La thrombine est une enzyme clé de l’hémostase. Elle active les plaquettes et induit la

sécrétion du contenu de leurs granules, la libération d’AA des phospholipides

membranaires, et la synthèse du TxA2 par les plaquettes activées, et aussi l’excrétion

d’ADP endogène.

Récepteurs de la thrombine

L’activation des plaquettes par la thrombine fait intervenir au moins quatre récepteurs

dénommés PAR (Protease Activated Receptor) dont deux sont exprimés par les plaquettes

humaines PAR-1 et PAR-4 (Kahn ML. et al., 1999), leur activation est suffisante pour

déclencher la sécrétion et l'agrégation plaquettaire.

70

La thrombine reconnait l’extrémité N-terminale du PAR-1 et coupe la liaison Arg

41-Ser 42 (Coughlin SR., 2000). Le rôle exact de PAR-4 dans l’activation plaquettaire à

l’état normal (PAR-1 est présent et fonctionnel) reste à préciser. ‘‘PAR1-activating

peptide’’ SFLLRN, ‘‘PAR4-activating peptide’’ AYPGKF, et la thrombine induisent

l'activation de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2), la libération d'AA à partir de

phospholipides membranaires et la génération de TxA2 dans les plaquettes humaines

(Shankar H. et al., 2006).

Le complexe GPIb-IX-V est un récepteur de haute affinité pour la thrombine. Celle-ci

reconnaît le domaine riche en leucine et la région comportant des tyrosines sulfatées de la

partie N-terminale de la sous-unité GPIbα. Il est vraisemblable que les trois récepteurs de

la thrombine, PAR-1, PAR-4, GPIb-IX-V, soient coactivés et agissent en synergie pour

activer les plaquettes.

II.3 Activation induite par le collagène

Le collagène du sous-endothélium est un agoniste plaquettaire puissant. Les

plaquettes exposées à l’endothélium lésé s’activent au contact des fibres de collagène. Il

agit de façon prédominante pour induire la biosynthèse des prostaglandines et de façon

moindre par l’ADP excrété.

Récepteurs du collagène

Le collagène se lie à plusieurs récepteurs comme les glycoprotéines GPIa-IIa, GPIV

et GPVI. L’adhésion des plaquettes au collagène peut se faire par des interactions

directes, via les glycoprotéines GPIa-IIa (également connues sous le nom d’intégrine α2β1

ou VLA-2) et GPVI, ou indirectes, via le vWF et la glycoprotéine Ib-IX (Clemetson KJ.

& Clemetson JM., 2001).

Une réponse complète au collagène requiert qu’il interagisse à la fois avec le

complexe GPVI et l’intégrine α2β1. L’α2β1 joue un rôle majeur dans l’adhésion des

plaquettes au collagène. La liaison du collagène à l’α2β1 est ainsi facilitée grâce à

l’activation initiale de GPVI ou par la stimulation d’autres agonistes (Watson SP. et al.,

71

2001). Bien que GPVI ait un rôle initial dans l’activation des plaquettes induite par le

collagène, on note qu’il a les différences importantes dans les événements intracellulaires

qui surviennent à la suite de la liaison du collagène et des ligands spécifiques à GPVI

(Jandrot-Perrus M. et al., 2000).

II.4 Activation induite par l’ADP

L'adénosine diphosphate (ADP) peut être libérée par les globules rouges et les

granules plaquettaires denses au niveau de la lésion vasculaire. L’ADP est considéré

comme un agoniste faible de l’agrégation, comparé à la thrombine ou au collagène. Il peut

provoquer selon les doses des agrégations réversibles ou irréversibles, avec un

phénomène de double vague. L’addition d’ADP aux plaquettes humaines isolées résulte

en un changement de forme, une agrégation réversible et l’absence de sécrétion.

Récepteurs de l’ADP

L’activation plaquettaire à l’ADP est accompagnée d’un influx rapide de calcium,

une activation de la PLCβ, la mobilisation des ions Ca2+ des pools intracellulaires,

l’inhibition de l’adénylate cyclase et l’activation de la phospholipase A2. Ces différents

messages résultent de l’activation d’au moins deux récepteurs à l’ADP : P2Y1 et P2Y12

(Gachet C., 2001).

P2Y1 et P2Y12 ont des rôles distincts au cours de l’agrégation plaquettaire. Ils

pourraient jouer des rôles séparés dans la thrombose. P2Y12 a longtemps été reconnu

comme une cible capable d’attirer les molécules antithrombotiques. Le récepteur P2Y12

qui est couplé à la voie G1, est essentiel pour l'agrégation et l'activation des intégrines. Il

est également important pour la sécrétion des granules denses. Par ailleurs, le récepteur

P2Y1 qui est couplé à la voie Gq, déclenche l'agrégation plaquettaire, mais cette

activation n'est pas suffisante pour induire une agrégation plaquettaire complète en

réponse à l'ADP (Hechler B. et al., 2005). Il est important pour induire le changement de

forme des plaquettes et pour initier l'agrégation via l'activation des intégrines.

72

II.5 Activation induite par le thromboxane A2

Le thromboxane A2 (TxA2), produit par les plaquettes activées, est prothrombotique.

Il stimule l'activation de nouvelles plaquettes, et amplifie l'agrégation plaquettaire.

Le TxA2 se lie avec des récepteurs membranaires spécifiques, les récepteurs TP, qui

appartiennent à la classe des récepteurs des prostanoïdes « P » qui possèdent une haute

affinité pour le TxA2 « T » (Narumiya S. et al., 1999). Ces récepteurs appartiennent à la

famille des récepteurs à sept domaines transmembrannaires couplés aux protéines G. La

famille Gq et G12 peuvent servir de médiateurs pour l'activité du récepteur TP.

Deux isoformes, TPα et TPβ existent chez l’Homme. Le mode de signalisation majeur

du récepteur TP est l’activation des β-isozymes de la phospholipase C, qui induit un

turnover des phosphatidylinositols et la libération du calcium ; au moins 9 protéines G

sont impliquées. La différence principale entre les deux isoformes du récepteur TP réside

dans la modulation de l’adénylyl cyclase, activée par TPα mais inhibée par TPβ (Kinsella

BT., 2001). La caractérisation moléculaire et fonctionnelle complète des récepteurs TP

n’est pas encore totalement élucidée.

L’U-46619 est un analogue stable de la PGH2 et un agoniste des récepteurs TP. Ses

propriétés sont sembables à celle du thromboxane A2. Il provoque le changement de

forme des plaquettes et leur agrégation (Coleman RA. et al., 1981).

II.6 Activation induite par l’acide arachidonique

L’AA exogène apporté aux plaquettes est transformé successivement en

endoperoxydes de prostaglandines et puis en thromboxane A2, qui sont capables de

provoquer l’agrégation plaquettaire (voir § I.4.1 ci-dessus). Les propriétés des

prostanoïdes dérivés sont très variables. Ainsi, les endoperoxydes cycliques de

prostaglandines, PGG2 et PGH2, et le TxA2 sont des agents proagrégants et

vasoconstricteurs (Hamberg M. et al., 1974). Par contre, HHT inhibe l’agrégation

plaquettaire induit par les homologues de la PGH2 (Croset M. & Lagarde M., 1983).

73

II.7 Autres voies d’activation

Les agents agrégants endogènes contenus dans les plaquettes peuvent déclencher

l’agrégation plaquettaire. D’autre agents sont susceptibles de provoquer l’activation

plaquettaire : l’adrénaline, la sérotonine, la ristocétine, les complexes immuns, etc. Outre

les récepteurs des agonistes, les principales voies d’activation plaquettaire aboutissent à

l’externalisation et à l’activation de la GP IIb/IIIa.

Les traitements anti-thrombotiques actuellement disponibles induisent des

saignements. Aussi notre travail vise à rechercher de nouveaux antiaggrégants

plaquettaires qui ne présenteraient pas ces inconvénients.

74

MATERIELS ET METHODES

75

Chapitre 1: Matériels

I. Produits & fournisseurs

Acide acétique, chloroforme, éthanol, méthanol : CarloErba

Acétonitrile, éther diéthylique, hexane, isopropanol : SDS

Acide arachidonique (AA), acide docosahexaénoïque (DHA) : Sigma-Aldrich

[1-14C]AA : Amersham Pharmacia Biotech

Acide (hydroxyéthyl-2)-4-pipérazinyl-1]-2-éthane-sulfonique (HEPES) : Merck

Aspirine (ASA): Prolabo

Borohydrure de sodium (NaBH4): Sigma-Aldrich

Collagène : Nycomed

Heptafluorobutylimidazole (HFBI) : Interchim

Leucotriène B4, 12-épi leucotriène B4, 6-trans-leucotriène B4, 6-trans-12-épi

leucotriène B4, leucotriène B3, 12-épi leucotriène B3 : Cayman

Lipoxygénase de soja (EC 1.13.11.12, Type 1-B) (sLOX) : Sigma-Aldrich

N,O-Bis(triméthylsilyl)-trifluroroacétamide (BSTFA) : Sigma-Aldrich

U-46619 : Cayman

8(R)- and 8(S)-HETEs, (±)10-HDoHE, 15-HETrE, 17(R)-HDoHE : Cayman 18O2 : Air liquide

76

II. Appareils

- Agrégomètre: Dual Aggro-meter, Chrono-log ; recordeur, Linseis L250E.

- Cartouches C18 : Chromabond.

- Centrifugeuse : GR 4.11, Jouan.

- Colonne chirale : 250 × 4,6 mm remplie avec des particules de silice de 5 µm

recouvertes de cellulose greffée avec du 5-diméthylphénylcarbamate, Chiral

Technologies Europe.

- Colonne Solgel 60 m × 0,25 mm ; épaisseur du film : 0,25 µm : SGE.

- Evaporateur rotatif : Rotavapor RE111, Büchi 461 Water Bath.

- Incubateur : Bioblock Scientific.

- Plaques de chromatographie sur couche mince (silica gel G60) (200×200×0,25

mm) : Merck.

- pH-mètre : HANNA Ph 210.

- Système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) : Agilent

Series 1100 ; colonne C18, Xbridge (3,5 µm, 4,6 mm × 100 mm), Waters.

- Système de chromatographie liquide à ultra haute performance (UPLC) :

Agilent Technologies 1200 ; colonne extend-C18, Agilent (1,8 µm, 3,0 mm ×

100 mm).

- Système de chromatographie liquide à ultra haute performance couplé à la

spectrometrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) : Waters SYNAPT

HDMS ; colonne C18, Acquity HDMS (1,7 µm, 1,0 mm × 100 mm).

- Système de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de

masse (GC-MS) : Agilent Technologies

- SPE Vacuum Manifold : Supelco VisiprepTM DL.

- Radiochromatographe : Sanyo DM5112CX ; Automatic TLC-linear analyzer,

Berthold ; Chromatography data system, LB511.

77

Chapitre 2: Méthodes

I. Séparation d’énantiomères d’acides gras monohydroxylés par HPLC

chirale

Ces molécules sont préalablement dérivées sous forme d’esters méthyliques afin de les

rendre plus hydrophobes et faciliter ainsi leur séparation sur colonne chirale.

I.1 Préparation du diazométhane

La méthylation des groupements carboxyliques libres s’effectue avec du

diazométhane. 10 grains d’hydroxyde de potassium (KOH) sont solubilisés dans un

mélange d’éther diéthylique/méthanol (3:6; v/v). Le diazométhane (gaz) est généré par

l’addition d’environ 10 g de N-Nitroso-N-méthyl-4-toluènesulfonamide utilisé comme

précurseur. Sa décomposition forme du diazométhane gazeux qui est piégé par barbotage

dans 30 mL d’éther diéthylique stabilisé par 10 % de méthanol. La solution devient jaune

et à saturation, elle est prête à être utilisée. La réaction est stoppée par l’addition d’acide

acétique.

La solution saturée en diazométhane peut être conservée à l’obscurité pendant environ

un mois.

I.2 Méthylation des acides mono- et dihydroxylés

Les acides gras mono- ou dihydroxylés sont dérivés en esters méthyliques avec du

diazométhane selon la réaction ci-dessous.

RCOOH + CH2N2 => RCOOCH3 +N2

Les 17(R)-HDoHE, 17(S)-HDoHE, 10(±)-HDoHE, 8(R)-HETE, 8(S)-HETE et

10(S),17(S)-diHDoHE (PDX) sont évaporés séparément à sec sous azote. Ils sont alors

méthylés pendant 15 min à température ambiante par l’addition d’un mL de la solution

d’éther saturée en diazométhane. Les échantillons sont ensuite évaporés sous azote et les

78

acides gras monohydroxylés méthylés sont repris par un mélange : hexane/2-propanol

(100:2; v/v) pour être analysés par chromatographie chirale

I.3 Séparation des acides gras monohydroxylés par chromatographie

chirale

La chromatographie chirale est réalisée sur une colonne Chiracel OD-H de 25 cm de

long avec un diamètre externe de 4,6 mm remplie avec des particules de gel de silice de 5

µm recouverte de cellulose tris (3,5-diméthylphénylcarbamate). L’élution est réalisée en

mode isocratique à 25 °C avec un mélange de solvants n-hexane/2-propanol (100:2; v/v)

(débit 1 mL/min). Les acides gras monohydroxylés méthylés sont détectés à 234 nm avec

un détecteur à barrette de diodes et collectés séparément. Ils sont évaporés à sec sous

azote avant d’être hydrolysés.

I.4 Hydrolyse des esters méthyliques d’acides gras monohydroxylés

Les esters méthyliques séparés par HPLC chirale sont hydrolysés avec 1 mL d’une

solution de potasse méthanolique à 10 %. Cette réaction s’effectue sous azote pendant 30

min à 60 °C. La réaction est stoppée en plongeant les tubes dans la glace et par l’addition

de 1 mL d’eau. Les échantillons sont acidifiés à pH 3 avec de l’acide acétique concentré

et les acides gras monohydroxylés sont extraits par 2 mL d’éthanol et 6 mL de

chloroforme. Après agitation et centrifugation (5 min à 200 g). On récupère la phase

organique qui est évaporée à sec sous azote. Les acides gras monohydroxylés sont repris

par 100 µL d’un mélange choloroforme/éthanol (2:1; v/v) avant d’être chromatographiés

sur une plaque de silice (voir Matériels et Méthode § II.4).

79

II. Biosynthèse des acides gras mono et dihydroxylés

II.1 Biosynthèse des acides gras mono et dihydroxylés

II.1.1 Biosynthèse de la PDX et de ses isomères

PDX et ses isomères sont préparés à partir de l’acide docosahexaénoïque (DHA) ou

acide 10(±)-hydroxy-docosahexaénoïque (10(±)-HDoHE) ou acide 17(±)-hydroxy-

docosahexaénoïque (17(±)-HDoHE). Les réactions sont effectuées sous atmosphère

normale ou sous 18O2.

Les substrats sont évaporés et dissous dans 100 µL d’éthanol. Ils sont ensuite dilués

dans 48 mL de tampon borate de sodium 0,02 M, pH 9,0. Environ 10 mg d’enzyme :

15-lipoxygénase de soja (EC 1.13.11.12, type 1-B) est mis en solution dans 2 mL de

tampon borate à 0 °C.

L’enzyme ainsi préparée est ajoutée progressivement (5 min) au milieu réactionnel

contenant les acides gras solubilisés dans le tampon borate. La réaction s’effectue à 0 °C

pendant 30 min. Elle est stoppée par l’addition de 10 mg de borohydrure de sodium

(NaBH4) apporté dans 2 mL de tampon borate. La réduction dure 15 min dans la glace. Le

mélange réactionnel est alors acidifié à pH 3 avec de l’acide acétique.

II.1.2 Biosynthèse des 8(±),15(S)-diHETEs

Les 8(±),15(S)-diHETEs sont préparées à partir de l’acide

8(±)-hydroxy-eicosa-5Z,9E,11Z,14Z-tetraénoïque (8(±)-HETE) avec la 15-lipoxygénase

de soja. Le procédure est décrite au § II.1.1 dans « Matériels et Méthodes ».

II.1.3 Biosynthèse du 5(S),12(S)-diHETE

La suspension plaquettaire (voir § III dans « Matériels et Méthodes ») est préchauffée

pendant 5 min à 37 °C, puis incubée pendant 10 min avec 10 µM de 5(S)-HETE apporté

dans 20 µL d’éthanol. La suspension plaquettaire est acidifiée à pH 3 avec de l’acide

chlorhydrique (1 M). Les dérivés oxygénés formés sont extraits avec de l’éther

80

diéthylique. La phase organique est évaporée à sec et le résidu lipidique est repris dans

100 µL d’éthanol avant d’être analysé par HPLC ou UPLC.

II.1.4 Biosynthèse du 7(S),14(S)-diHDoHE

La suspension de leucocytes polynucléaires (PMN) (voir § IV dans « Matériels et

Méthodes ») est préchauffée 5 min à 37 °C, puis incubée avec 10 µM de 14-HDoHE

apporté dans 20 µL d’éthanol. Les leucocytes sont alors activés par 10-6 M d’ionophore

calcique (A23187) pendant 10 min avec une agitation douce. La suspension est alors

acidifiée à pH 3 avec de l’acide chlorhydrique (1 M) et les dérivés oxygénés formés sont

extraits avec de l’éther diéthylique. La phase organique est évaporée à sec et l’acide gras

dihydroxylé formé est repris dans 100 µL d’éthanol pour être analysé par HPLC ou

UPLC.

II.2 Extraction en phase solide des métabolites oxygénés

L’échantillon acidifié à pH 3 est déposé sur une cartouche de silice greffée C18 (phase

solide) préalablement lavée successivement avec 5 mL d’éthanol et 10 mL d’eau distillée

afin d’éliminer les impuretés résiduelles. Les acides gras mono- et dihydroxylés sont

élués avec 5 mL d’éthanol. L’échantillon est alors séché sous azote. Le résidu est repris

par 200 µL d’éthanol et stocké sous azote à -20 °C.

II.3 Extraction liquide/liquide des métabolites oxygénés

L’échantillon est acidifié à pH 3 par de l’acide acétique puis extrait par trois volumes

d’éthanol et six volumes de chloroforme. Après décantation on récupère la phase

chloroformique inférieure. La phase organique est evaporée sous vide. Le résidu est repris

par 1 mL d’éthanol et stocké à -20 °C sous azote.

81

II.4 Analyse par CCM des acides gras mono- et dihydroxylés

Les acides gras mono et dihydroxylés sont séparés selon la méthode décrite par

Guichardant M. et al., (Guichardant M. et al., 1998). L’élution est réalisée avec un

mélange de solvants : hexane/éther diéthylique/acide acétique (25:75:1; v/v/v). Les

standards de migration sont révélés en UV après pulvérisation d’une solution de

dichlorofluorescéine (2 mg dans 100 mL d’un mélange eau/éthanol (5:95; v/v)) sur la

plaque. Les lipides apparaissent sous la forme d’une tâche jaune fluorescente. Les zones

de silice correspondant aux acides gras monohydroxylés (AgOH) et dihydroxylés (diOH)

(même référence frontale que celles des standards chromatographiés sur la même plaque)

sont grattées séparément. Les produits sont extraits de la silice 3 fois par 2 mL de

méthanol. Les échantillons sont centrifugés à 600 g pendant 5 min à température ambiante

sous azote. La phase organique supérieure est récupérée dans un tube conique et évaporée

à sec sous azote.

II.5 Analyse par HPLC des acides gras mono- et dihydroxylés

Les acides gras mono et dihydroxylés sont séparés par chromatographie liquide à

haute performance (HPLC). La séparation est réalisée sur une colonne de silice greffée

C18 (Waters Xbridge, 4,6×250 mm, 3,5 µm) thermostatée à 40°C dans un four. L’élution

utilise un gradient constitué de deux solvants A et B à un débit de 1 mL/min. L’éluant A

est un mélange acétonitrile/eau (1:9; v/v) acidifié à pH 3 par de l’acide acétique. L’éluant

B est de l’acétonitrile. L’éluant A est pompé seul pendant 5 min, puis le solvant A est

remplacé progressivement par l’éluant B pour atteindre 30 % à 10 min, 40 % à 30 min, 60

% à 50 min et 100 % de B à 65 min. L’élution se poursuit avec l’éluant B seul pendant 15

min puis la colonne est rééquilibrée avec le solvant A. Les acides gras mono et

dihydroxylés sont détectés avec un détecteur à barrette de diodes respectivement λ = 234

nm (longueur d’onde correspondant au λmax des diènes conjugués) et 270 nm (longueur

d’onde correspondant au λmax des triènes conjugués).

82

II.6 Analyse par UPLC des acides gras mono- et dihydoxylés

L’échantillon est analysé par chromatographie liquide à ultra haute performance

(UPLC). La séparation est réalisée sur une colonne de silice greffée C18 (Agilent

Extend-C18, 3,0×100 mm, 1,8 µm) dans un four thermostaté chauffé à 65°C. Le gradient

est réalisé avec deux éluants : le solvant A est un mélange acétonitrile/eau (1:9; v/v)

acidifié à pH 3 par de l’acide acétique et le solvant B est de l’acétonitrile. Le débit utilisé

est de 1,4 mL/min. Le gradient démarre avec 100 % de solvant A puis le solvant B est

pompé progressivement par atteindre 30 % à 1,2 min, 35 % à 3,6 min, 50 % à 9,0 min

et100 % de B à 10,0 à min. L’élution se poursuit avec l’éluant B seul pendant encore 2

min puis la colonne est rééquilibrée progressivement avec le solvant A. Les acides gras

mono et dihydroxylés sont détectés comme précédemment respectivement λ = 234 nm et

270 nm.

II.7 Analyse par GC-MS des acides gras dihydroxylés

Les molécules séparées par HPLC sont collectées séparément. Le solvant est évaporé

sous azote. Elles sont alors méthylées pendant 15 min à température ambiante par

l’addition d’un mL d’une solution d’éther diéthylique saturée en diazométhane (voir § I.1

dans « Matériels et Méthodes »). Les échantillons sont évaporés sous azote et repris dans

500 µL de méthanol. Les molécules sont ensuite hydrogénées en faisant barboter un flux

d’hydrogène pendant 5 min en présence de quelques grains d’oxyde de platine (PtO2). Le

méthanol est récupéré après une centrifugation de 5 min à 900 g et évaporé à sec sous

azote. Le résidu est traité par 100 µL de bis-(triméthylsilyl)-trifluoroacétamide (BSTFA)

pendant 30 min à température de 60 °C afin de convertir les groupements hydroxylés en

éthers triméthylsilyles (TMS).

Les molécules ainsi dérivées sont injectées dans un chromatographe en phase gazeuse

couplée à la spectrométrie de masse (quadripôle) (GC-MS) Agilent Technologies équipé

d’une colonne DB17-MS (Agilent Technologies) 60 m x 0.25 mm avec un film de phase

stationnaire de 0,25 µm et d’un injecteur split-splitless porté à 230 °C. L’hélium est utilisé

comme gaz vecteur avec un débit de 1,2 mL/min. La température du four est maintenue à

83

55 °C pendant 4 minutes puis elle augmente jusqu’à 260 °C à raison de 20 °C/min puis

jusqu’à 300 °C à raison de 8 °C/min. Elle est maintenue à 300 °C pendant 15 min avant

de redescendre à 55 °C pour une nouvelle analyse. Les molécules sont analysées par

spectrométrie de masse (MS) en mode impact électronique (EI). L’énergie des ions est de

70 eV. La source, le quadripôle et la ligne de transfert sont chauffés respectivement à 100

°C, 150 °C et 280 °C. L’acquisition des ions est réalisée sur la gamme de masses 100 à

650 m/z.

II.8 Analyse des acides gras dihydroxylés par UPLC-MS/MS

Les acides gras dihydroxylés synthétisés à partir du DHA sont analysés sur un

système Waters® SYNAPT™ HDMS™ utilisé en mode MS et couplé directement à un

système Acquity® UPLC® équipé d’une colonne C18 (HDMS ™, 1,0 mm×100 mm, 1,7

µm). La séparation est effectuée à 40°C avec un débit de 0,25 mL/min. La phase mobile

est un mélange acétonitrile/eau (contenant 0,1 % d'acide formique), qui est remplacé

graduellement (gradient linéaire) pour atteindre 100 % d'acétonitrile (contenant 0,1 %

d'acide formique) après 6 min. Le SYNAPT HDMS a été étalonné avec du formiate de

sodium et l’acquisition des spectres a été faite sur une plage allant de 50 à 1000 m/z avec

une fréquence de 10 spectres/sec.

La mobilité des ions des molécules ont été mesurée sur le système SYNAPT HDMS

doté d’une interface permettant de différencier des ions de même masse en fonction de

leur mobilité respective, en mode HDMS avec une pression d’azote de 0,5 mbar. Cette

séparation est basée sur le fait que des isopodologues qui diffèrent par la configuration de

leurs doubles liaisons ne présentent pas la même mobilité. Les échantillons sont dissous

dans le méthanol et dilués dans un mélange méthanol/eau (50:50; v/v) contenant 0,1 %

d'acide formique avant d’être infusés dans la source à un débit de 10 µL/min. Les

échantillons sont ionisés en mode “electrospray ionization ” (ESI). L’ionisation est

facilitée par l’addition d’un électrolyte : l’acétate de sodium ajouté à l’éluant juste avant

son entrée dans la source. Cet appareil est équipé d’un quadripôle et d’un analyseur temps

84

de vol. Il permet de faire de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Les données

sont traitées avec les logiciels MassLynx ™ et Driftscop™.

II.9 Analyse par RMN de la PDX

Les spectres obtenus en résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été réalisés au

centre commun de RMN de Lyon. Ils ont été enregistrés à 25°C sur un spectromètre

Bruker DRX500 équipé d’une sonde TXI de 5 mm. La PDX est mise en solution dans 450

µL de méthanol deutérié (CD3OD). Les abréviations t et m signifient respectivement

triplet et multiplet.

III. Isolement des plaquettes sanguines humaines

Les plaquettes sanguines humaines sont isolées selon la technique de Mustard JF. et

al., (1972) modifiée par Lagarde M. et al., (1980). Brièvement, le sang, prélevé à partir de

donneurs volontaires sains, est réparti dans des tubes plastiques de 50 mL et centrifugé à

200 g pendant 17 min à 20 °C. Le culot contenant les globules blanc et les érythrocytes

est conservé pour isoler les leucocytes polymorphonucléaires (PMN) (voir § IV dans

« Matériels et Méthodes »).

Le surnageant, correspondant au plasma riche en plaquettes (PRP) est prélevé puis

acidifié à pH 6,4 par l’acide citrique 0,15 M avant d’être réparti par fraction de 7 mL dans

des tubes plastiques à ailettes pour être centrifugés à 900 g pendant 12 min à 20 °C. Pour

chaque tube, le surnageant est enlevé délicatement et le culot plaquettaire est remis en

suspension dans 5 mL d’une solution Tyrodes HEPES (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM,

MgCl2 1,0 mM, NaHCO3 12 mM, NaH2PO4 0,41 mM, HEPES 5 mM, et glucose 5,5 mM,

pH 7,35). La suspension plaquettaire (environ 2 ~ 5 × 108 plaquettes/mL) peut être

conservée à -20 °C en tant que source enzymatique de 12-lipoxygénase.

85

IV. Isolement des leucocytes polymorphonucléaires

Les leucocytes polynucléaires (PMN) sont isolés à partir du culot obtenu lors de la

préparation des plaquettes (voir § III dans « Matériels et Méthodes »).

10 mL de dextran (5 %) préparé dans du sérum physiologique (NaCl 9 ‰) sont

ajoutés dans chaque tube contenant les culots (globules rouges, leucocytes et monocytes).

Ils sont agités légèrement puis inclinés à 45° pendant une heure et demie à température

ambiante pour sédimenter les globules rouges. La phase supérieure est collectée dans

quatre tubes plastiques de 50 mL et centrifugée à 700 g pendant 5 min. Le surnageant de

chaque tube est alors enlevé et les culots de leucocytes contaminés par des globules

rouges sont traités séparément par 21 mL d’eau distillée pendant 20 secondes afin de lyser

les globules rouges. 4 mL de chlorure de sodium (45 g/L) sont immédiatement ajoutés

pour restaurer l’osmolarité de la suspension leucocytaire. La suspension est centrifugée à

700 g pendant 5 min, et le surnageant est enlevé. Les culots de leucocytes sont

resuspendus dans une solution Tyrodes HEPES (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2

1,0 mM, NaHCO3 12 nM, NaH2PO4 0,41 mM, HEPES 5 mM, CaCl2 2mM et 0,1 %

glucose, pH 7,35) contenant 2 mM de CaCl2. La suspension leucocytaire peux être

stockée pendant un mois à -20 °C , l’activité 5- lipoxygénase est conservée.

V. Test de l’agrégation plaquettaire

Les plaquettes humaines sont isolées du sang de donneurs sains à jeun de graisses,

n’ayant pas pris de médicament depuis 10 jours. Comme décrit au § III dans « Matériels

et Méthodes », les plaquettes sont préparées et remises en suspension dans la solution de

tyrode-HEPES (pH 7,35) pour tester les effets de différents agonistes sur l’agrégation

plaquettaire. Ces tests doivent être effectués dans la journée.

V.1 Mesure de l’agrégation des plaquettes sanguines humaines

L’activité plaquettaire est testée en mesurant la capacité des plaquettes à s’agréger les

unes aux autres en présence de différents agents inducteurs (collagène, acide

arachidonique (AA) et/ou analogue de la PGH2 : l’U-46619). L’agrégation plaquettaire est

86

mesurée avec un agrégomètre Chrono-log à double piste, équipé d’un enregistreur. Cette

technique est basée sur la méthode de Born GV., (1962). L’appareil enregistre la

diminution de la turbidité de la suspension plaquettaire au cours de l’agrégation en

détectant la transmission d’un faisceau lumineux traversant la cuve contenant la

suspension plaquettaire. L’intensité du faisceau lumineux traversant la cuve contenant la

suspension plaquettaire est réglé sur ‘‘0’’ et sur ‘‘100’’ pour celui qui traverse la cuve

contenant la solution de tyrode HEPES utilisée pour suspendre les plaquettes. L’appareil

est thermostaté à 37°C. L’action d’un champ magnétique sur un barreau aimanté placé

dans la cuve, permet une agitation d’environ 1000 tours/min. Cet appareil permet de

mesurer séparément deux agrégations indépendantes déclenchées à quelques secondes

d’intervalle.

V.2 Inhibition de l’agrégation plaquettaire par différents acides gras

mono et dihydroxylés.

Les plaquettes sont préchauffées à 37 °C pendant 1 min, puis incubées avec les

molécules à tester pendant 1 min. L’éthanol est utilisé comme contrôle. L’agrégation est

déclenchée par l’ajout de l’inducteur. La cinétique de l’agrégation plaquettaire est

enregistrée durant 4 min. La concentration d’inducteur est ajustée pour obtenir environ

70-75 % d’agrégation (courbe contrôle). Le pourcentage d’inhibition est calculé par la

différence entre le pourcentage d’agrégation de la courbe contrôle et celui obtenu en

présence des molécules à tester.

Différents inducteurs ont été utilisés pour induire l’agrégation plaquettaire : le

collagène, l’acide arachidonique et l’U-46619.

V.2.1 L’agrégation plaquettaire induite par le collagène

Le collagène est préparé à 4 ng/µL dans une solution contenant 5 % glucose. Son pH

est compris entre 2,7 et 2,9. Le volume de la solution de collagène est ajusté pour obtenir

pour les plaquettes contrôle environ 70 % d’agrégation. En pratique de 5 µL à 20 µL de

87

cette solution sont ajoutés dans 400 µL de suspension plaquettaire, soit une concentration

finale de collagène comprise entre 0,05 ng/µL et 0,20 ng/µL selon les donneurs.

V.2.2 L’agrégation plaquettaire induite par l’acide arachidonique

1 µM à 2 µM d’acide arachidonique (AA) sont nécessaires pour obtenir environ 75%

d’agrégation avec la suspension plaquettaire servant de contrôle. L’AA est apporté dans

l’éthanol (1 µL) dans 400 µL de suspension plaquettaire. L’éthanol est toxique pour les

plaquettes. Le volume d’alcool apporté à la suspension plaquettaire ne doit pas excéder

1/200ème en volume.

V.2.3 L’agrégation plaquettaire induite par l’agoniste du récepteur du

thromboxane A2 :U-46619

Les concentrations finales d’U-46619 utilisées pour obtenir environ 75% d’agrégation

(contrôle) varient en fonction des donneurs de 0,02 ng/µL à 0,04 ng/µL.

Les plaquettes sont préincubées avec 2 × 10-4 M d’acide acétylsalicylique (ASA)

(inhibiteur de COX) pendant 4 min à 37 °C ou avec de l’éthanol. Elles sont ensuite

incubées pendant une minute avec la molécule à tester ou avec de l’éthanol (contrôle). 1

µL d’U-46619 est ajouté pour induire l’agrégation plaquettaire.

V.3 Recherche et quantification des icosanoïdes synthétisés par les

plaquettes en présence d’acide [1-14C] arachidonique

L’acide [1-14C] arachidonique (activité spécifique : 2,072 Bq/mmol) permet de

quantifier les métabolites oxygénés formés à partir du AA exogène et de déterminer

simultanément les activités de la 12-lipoxygénase et de la cyclooxygénase plaquettaire

(Lagarde M. et al., 1977).

Dans un premier temps on recherche la concentration d’acide arachidonique capable

d’induire une agrégation d’environ 75 %. L’acide [1-14C] arachidonique est dilué dans

l’éthanol pour obtenir une solution à 1,85 µBq/µL (50 nCi/µL). On ajoute de l’acide

arachidonique froid pour obtenir une concentration de 1 µM, capable d’induire

88

l’agrégation. Les plaquettes sont pré-chauffées à 37 °C pendant 1 min, puis incubées avec

les molécules à tester pendant 1 min. L’agrégation est induite par l’ajout d’environ 1 µM

d’AA radioactif. Un échantillon contrôle est réalisé, dans les mêmes conditions avec le

même volume d’éthanol qui sert de véhicule pour les molécules à tester.

V.3.1 Extraction des métabolites

Après 4 min les échantillons (400 µL) sont acidifiés à pH 3 avec HCl 3N et extraits

par 1,2 mL d’éthanol et 2,4 mL de chloroforme contenant 5×10-5 M de BHT

(antioxydant).

Les échantillons sont décantés au froid une nuit. La phase organique inférieure est

transférée dans un autre tube et évaporée à sec sous azote. L’extraction est répétée une

fois. Après évaporation à sec sous azote les résidus lipidiques extraits sont repris dans un

mélange éther diéthylique/méthanol (90:10; v/v) pour être séparés par CCM.

V.3.2 Séparation des métabolites par CCM

Les métabolites oxygénés formés à partir de l’AA radioactif exogène sont séparés par

CCM en réalisant deux migrations successives avec des solvants de polarités croissantes.

La première migration utilise un mélange de solvants : hexane/éther diéthylique/acide

acétique (60:40:1; v/v/v) (Lagarde M. et al., 1985) pour séparer notamment l’acide

12-hydroxy-heptadécatriénoïque (HHT) formé par la voie de la cyclooxygénase et l’acide

12-hydroxy-eicosatétraénoïque (12-HETE) synthétisé via la 12-lipoxygénase. Une

deuxième migration est alors réalisée dans le même sens pour séparer les différents

icosanoïdes et en particulier le thromboxane B2 synthétisé par la cyclooxygénase avec

comme éluant le mélange de solvants : éther diéthylique /méthanol/ acide acétique

(90:1:2; v/v/v).

V.3.3 Recherche et quantification des métabolites

Les produits oxygénés ont été visualisés et quantifiés avec un radioscanner TLC

Berthold Analyzer (LB511, Berthold, Bad Wildbad, Allemagne). La radioactivité de

89

chaque composé séparé par CCM est exprimée en pourcentage de la radioactivité totale

déposée sur la plaque.

VI. Analyse statistique des résultats

Les valeurs présentées dans les figures et dans les tableaux sont la moyenne ± SEM

de n expériences indépendantes (n ≥ 4). Les analyses statistiques sont effectuées à l’aide

du test t de Student. Les variations sont considérées comme significatives si la valeur de P

est inférieure ou égale à 0,05.

90

RESULTATS ET DISCUSSION

91

Première partie : Caractérisation d’un nouveau médiateur lipidique, la Protectine DX

(PDX), un isomère de la Protectine D1

I. Etude du métabolisme oxygéné du DHA

I.1 Analyse chromatographique des métabolites dérivés du DHA

Le DHA a été métabolisé par la 15-LOX. Les métabolites formés ont été extraits puis

analysés par HPLC (Fig. 18) et UPLC (Fig. 20) selon les procédures décrites au § II.5 &

§ II.6 dans « Matériels et Méthodes ».

Le métabolite principal élué à 51,6 min (Fig. 18A) présente un spectre UV

caractéristique des acides gras monohydroxylés avec une absorption maximum à 235 nm

qui signe la présence d’un diène conjugué. Son temps de rétention correspond à celui du

17(R)-HDoHE standard analysé dans les mêmes conditions.

Un autre composé, élué à 35,4 min, a été détecté à λ = 270 nm (Fig. 18B) ainsi que

cinq autres composés mineurs plus polaires (temps de rétention plus court) indiqués par

des flèches sur le chromatogramme. Ces derniers n’ont pas été identifiés du fait de leur

trop faible quantité. Le spectre UV de tous ces composés comporte un pic principal à λ =

270 nm avec un épaulement de chaque coté, caractéristique de la présence d’un triène

conjugué. Ne connaissant pas encore la structure de ce composé principal, nous l’avons

appelé PDX.

Son spectre UV (Fig. 18B encadré) montre un pic avec une absorption maximale à λ

= 270 nm, porteur de deux épaulements à λ = 260 nm et λ = 280 nm, qui indique la

présence d'un triène conjugué dans sa structure. En outre, on note que l’épaulement de

gauche est plus élevé que celui de droite. Cette même dissymétrie est également retrouvée

dans les spectres UV d’autres acides gras dihydroxylés comme le 8(S),15(S)-diHETE ou

le 5(S),12(S)-diHETE qui présentent une géométrie E/Z/E des doubles liaisons de leur

92

triènes conjugués. Cette observation suggère que la géométrie des doubles liaisons du

triène conjugué de la PDX est vraisemblablement aussi E/Z/E.

min0 10 20 30 40 50 60 70

mAU.

0

500

1000

1500

2000

2500

51.6

nm200 250 300

mAU

0

500

1000

1500

200017-OH-22:6

λ= 235 nm

min0 10 20 30 40 50 60 70

mAU.

0

500

1000

1500

2000

250035.4

nm200 250 300

mAU

0

100

200

300

400 260 280

270

PDXλ= 270 nm

A

B

minorcompounds

min0 10 20 30 40 50 60 70

mAU.

0

500

1000

1500

2000

2500

51.6

nm200 250 300

mAU

0

500

1000

1500

200017-OH-22:6

λ= 235 nm

min0 10 20 30 40 50 60 70

mAU.

0

500

1000

1500

2000

250035.4

nm200 250 300

mAU

0

100

200

300

400 260 280

270

PDXλ= 270 nm

A

B

minorcompounds

Figure 18 : Exemple de chromatogrammes (HPLC) montrant les différents

métabolites synthétisés à partir du DHA via la 15-LOX de soja.

Pour les conditions opératoires se reporter au § II.5 dans « Matériels et Méthodes ». (A)

acides gras monohydroxylés (λ= 235 nm) ; (B) acides gras dihydroxylés (λ = 270 nm).

93

I.2 Recherche de la stéréochimie du carbone 17 du 17-HDoHE

Le composé monohydroxylé formé à partir du DHA a été isolé par HPLC (voir § I.1

dans « Résultats et Discussion » ci-dessus). Il a été identifié comme étant du 17-HDoHE

car il a le même temps de rétention et le même spectre UV que le 17(R)-HDoHE

commercial analysé dans les mêmes conditions. Leurs spectres UV sont superposables et

montrent un maximum d’absorption à λmax = 235 nm caractéristique de la présence d’un

motif diène conjugué dans la molécule. La stéréochimie du carbone 17 a été établie en

comparant les temps de rétention du 17-HDoHE synthétisé à partir du DHA avec celui du

17(R)-HDoHE commercial. Ils ont été analysés sous forme d’ester méthylique par HPLC

sur une colonne chirale (Fig. 19) (voir § I.3 dans « Matériels et Méthodes »). Les deux

énantiomères méthylés sont parfaitement séparés et le 17-HDoHE formé à partir du DHA

coélue avec le 17(S)-HDoHE (Tr = 19,1 min), le 17(R)-HDoHE étant élué à 15,2 min.

Le métabolite monohydroxylé formé à partir du DHA est donc le 17(S)-HDoHE. La

stéréochimie S du carbone 17 est en accord avec les données de la littérature. En effet, il a

déjà été montré que la 15-LOX de soja synthétise de l’acide

13(S)-hydroxyoctadécadiénoïque (13-HODE) à partir du 18:2n-6 et de l’acide

15(S)-hydroxyeicosatétraénoïque (15-HETE) à partir de l’AA (Funk MO. et al., 1976).

Dans nos conditions, le rendement de conversion du DHA par la 15-LOX de soja est

estimé à 10 % pour les dérivés monohydroxylés (17(S)-HDoHE) et 3 % pour les dérivés

dihydroxylés (PDX).

94

min10 12 14 16 18 20 22

mAU.

05

101520253035

15.2

19.1

17(S)-diHDoHE-Me

17(R)-diHDoHE-Me

40

min10 12 14 16 18 20 22

mAU.

05

101520253035

15.2

19.1

17(S)-diHDoHE-Me

17(R)-diHDoHE-Me

40

Figure 19 : Exemple d’utilisation d’une colonne chirale pour séparer les

énantiomères 17(S)- et 17(R)-HDoHE dérivés sous formes d’esters méthyliques.

Pour les conditions se reporter au § I.3 dans « Matériels et Méthodes ».

95

I.3 Analyse par UPLC des métabolites du DHA

Un exemple de chromatogramme obtenu par UPLC est présenté dans la Figure 20.

On observe une résolution analogue à celle obtenue avec l’HPLC mais les temps

d’analyse sont 6 fois plus courts (10 min au lieu de 60 min). La sensibilité de détection est

multipliée par un facteur 5 par rapport à l’HPLC classique (0,02 contre 0,1 nmole pour

l’HPLC). Cette technique permet en plus de sa rapidité une économie de solvant. Elle a

été couplée avec succès avec le Synapt HDMS équipé d’une interface permettant de

séparer les ions m/z en fonction de leur mobilité. (voir § II.4.1 dans « Résultats et

Discussion »).

min2 4 6 8 10

mAU

0

200

400

600

5.6

0

minorcompounds

min2 4 6 8 10

mAU

0

200

400

600

800

1000

0

λ= 235 nm

A

λ= 270 nm

B

9.8

nm225 250 275 300 325

mAU

0

200

400

600 260 280

270

PDX

nm225 250 275 300 325

mAU

0200400600800

1000 17-OH-22:6

min2 4 6 8 10

mAU

0

200

400

600

5.6

0

minorcompounds

min2 4 6 8 10

mAU

0

200

400

600

800

1000

0

λ= 235 nm

A

λ= 270 nm

B

9.8

nm225 250 275 300 325

mAU

0

200

400

600 260 280

270

PDX

nm225 250 275 300 325

mAU

0

200

400

600 260 280

270

PDX

nm225 250 275 300 325

mAU

0200400600800

1000 17-OH-22:6

nm225 250 275 300 325

mAU

0200400600800

1000 17-OH-22:6

Figure 20 : Chromatogrammes UPLC typiques montrant les différents métabolites

synthétisés à partir du DHA via la 15-LOX de soja.

96

Pour les conditions opératoires il faut se reporter au § II.6 dans « Matériels et

Méthodes ». (A) acides gras monohydroxylés (λ= 235 nm) ; (B) acides gras dihydroxylés

(λ = 270 nm).

II. Localisation des groupements hydroxylés sur la chaîne hydrocarbonée de

la PDX

La PDX purifiée par HPLC a été méthylée au diazométhane, hydrogénée et dérivée

sous forme d’éther triméthylsilyle (voir § I.2 dans « Matériels et Méthodes »). Le spectre

de masse (Fig. 21) obtenu par GC-MS en mode impact électronique fait apparaître des

fragments caractéristiques à m/z : 515 (M-15, perte de CH3), 459 (M-71, perte de

CH2+-(CH2)3-CH3), 369 (M-(71+90)), 359 (M-171, perte de CH2-(CH2)7-COOCH3), 273

(pic basique, Me3SiO+=CH2-(CH2)8-COOCH3), 173 (Me3SiO+=CH-(CH2)4-CH3) et 73

(SiMe3).

Ce résultat nous permet d’affirmer que la PDX est le 10,17(S)-diHDoHE.

97

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

m/z-->

Abundance273

73 173

369129

459515

359

459

273 359

173

515OSi(CH3)3

OSi(CH3)3

COOCH3

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

m/z-->

Abundance273

73 173

369129

459515

359

459

273 359

173

515OSi(CH3)3

OSi(CH3)3

COOCH3

Figure 21 : Spectre de masse de PDX hydrogénée et dérivée sous forme d’ester

méthylique et d’éther triméthylsilyle.

Le spectre est analysé par GC-MS en utilisant le mode d’ionisation, impact électronique.

III. Détermination de la géométrie des doubles liaisons de la PDX

La détermination précise de la géométrie des doubles liaisons de la PDX et en

particulier de celles du triène conjugué est cruciale car elle permet de savoir si la

structure de la PDX correspond à celle de la PD1 (acide

10(R),17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-hexaénoïque) (Serhan CN. et al.,

2006) ou à celle de la molécule décrite par Butovich (acide

10,17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-hexaénoïque) (Butovich IA., 2005)

ou à une autre molécule.

III.1 Utilisation des données chromatographiques et spectrales

Pour caractériser la PDX, on a comparé les temps de rétention et les caractéristiques

spectrales (UV) de différents acides gras dihydroxylés (diOH) commerciaux que l’on a

analysés par HPLC dans les mêmes conditions.

98

Liste des acides gras dihydroxylés analysés :

Standards (diOH) Acides Leucotriène B4 (LTB4) acide 5(S),12(R)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E,14Z-tétraénoïque 12-épi LTB4 acide 5(S),12(S)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E,14Z-tétraénoïque 6-trans LTB4 acide 5(S),12(R)-dihydroxy-eicosa-6E,8E,10E,14Z-tétraénoïque 6-trans-12-épi LTB4 acide 5(S),12(S)-dihydroxy-eicosa-6E,8E,10E,14Z-tétraénoïque 8(S),15(S)-diHETE acide 8(S),15(S)-dihydroxy-eicosa-5Z,9E,11Z,13E-tétraénoïque

Les diOH sont relativement bien séparés par HPLC malgré leur polarité proche. Dans

notre système, ils sont tous élués avant 40 min (Fig. 22). Le 8(S),15(S)-diHETE est élué

en premier. La PDX apparaît plus polaire que les leucotriènes ; elle est éluée avant eux.

La géométrie des doubles liaisons du triène conjugué des isomères 6-trans LTB4,

6-trans-12-épi LTB4 est E/E/E. Celle du LTB4 et du 12-épi LTB4 est Z/E/E. On observe

que les composés qui possèdent la même géométrie Z/E/E ou tout trans sont mal résolus

mais se séparent bien entre eux.

min30 31 32 33 34 35 36 37

mAU.

0

20

40

60

80

100

31.6 33.3

34.0

34. 3 34.8 35.1

8(S),15(S)-diHETE 6-trans LTB4

LTB4

12-épi LTB4

PDX

6-trans-12-épi LTB4

min30 31 32 33 34 35 36 37

mAU.

0

20

40

60

80

100

31.6 33.3

34.0

34. 3 34.8 35.1

8(S),15(S)-diHETE 6-trans LTB4

LTB4

12-épi LTB4

PDX

6-trans-12-épi LTB4

Figure 22 : Exemple de séparation par HPLC de différents acides gras dihydroxylés

commerciaux.

Pour les conditions opératoires se reporter au § II.5 dans « Matériels et Méthodes ».

99

Analyse spectrale des acides gras dihydroxylés séparés par HPLC :

On observe (Fig. 23A) que les composés : PDX, 8(S),15(S)-diHETE (commercial) et

le 5(S),12(S)-diHETE, synthétisé à partir du 5(S)-HETE en utilisant les plaquettes

sanguines comme source enzymatique de 12-lipoxygénase, ont des spectres UV

similaires. Ceci s’explique par le fait que pour toutes ces molécules ont en commun une

géométrie E/Z/E des doubles liaisons de leur triène conjugué. La forme de ces spectres

(Fig. 23A) est caractéristique avec un pic à λmax = 270 nm avec un épaulement à gauche à

260 nm plus élevé que celui de droite à 280 nm. Le LTB4 et le 12-épi LTB4 qui ont tous

les deux une géométrie de leur triène Z/E/E ont des spectres UV identiques (Fig. 23B),

mais contrairement aux triènes qui ont une géométrie E/Z/E des doubles liaisons de leur

triène conjugué, les épaulements de gauche et de droite sont pratiquement au même

niveau. De même le 6-trans LTB4 et son isomère 6-trans-12-épi LTB4 qui présentent une

géométrie de leur triène E/E/E ont des spectres UV identiques ; les épaulements de

gauche et de droite sont aussi pratiquement au même niveau (Fig. 23C) comme nous

venons de le montrer avec le LTB4 et ses isomères (Fig. 23B). Ainsi l’observation des

spectres UV du 6-trans-12-épi LTB4 (E/E/E.) et du 12-épi LTB4 (Z/E/E) ne permet pas de

les différencier (Fig. 23D).

En pratique l’analyse des spectres UV de composés contenant un triène conjugué

permet seulement de différencier les composés, avec une géométrie E/Z/E des doubles

liaisons des triènes conjugués, des autres triènes avec les géométries Z/E/E ou E/E/E.

Ces résultats suggèrent que la géométrie des doubles liaisons du triène conjugué de la

PDX serait trans, cis, trans (E/Z/E).

100

nm200 240 280 320

mAU.

0

400

800

1200

5(S),12(S)-diHETE(6E,8Z,10E)

8(S),15(S)-diHETE(9E,11Z,13E)

nm200 240 280 320 360

mAU.

0

20

40

60

LTB4

12-epi LTB4(6Z,8E,10E)

nm200 240 280 320 360

mAU.

0

10

20

30

40

50

6-trans (-12-epi) LTB4

(12-epi) LTB4

360

A B

nm200 240 280 320 360

mAU.

0

10

20

30

40

50

6-trans LTB4

6-trans-12-epi LTB4(6E,8E,10E)

C D (6E,8E,10E)

(6Z,8E,10E)

PDX

nm200 240 280 320

mAU.

0

400

800

1200

5(S),12(S)-diHETE(6E,8Z,10E)

8(S),15(S)-diHETE(9E,11Z,13E)

nm200 240 280 320 360

mAU.

0

20

40

60

LTB4

12-epi LTB4(6Z,8E,10E)

nm200 240 280 320 360

mAU.

0

10

20

30

40

50

6-trans (-12-epi) LTB4

(12-epi) LTB4

360

A B

nm200 240 280 320 360

mAU.

0

10

20

30

40

50

6-trans LTB4

6-trans-12-epi LTB4(6E,8E,10E)

C D (6E,8E,10E)

(6Z,8E,10E)

PDX

Figure 23 : Spectres UV de différents acides gras dihydroxylés commerciaux séparés

par HPLC.

III.2 Techniques RMN

Une analyse préalable par RMN du proton montre une structure similaire à celle

décrite par Butovich (Butovich IA., 2005; Butovich IA. et al., 2006). Cependant l’analyse

du spectre RMN du proton ne permet pas d’élucider la géométrie des doubles liaisons du

triène. Nous avons donc vérifié sa structure par une attribution séquentielle des protons et

des atomes de carbone (RMN 2D) et confirmer la configuration Z ou E des différentes

doubles liaisons en mesurant leurs constantes de couplage. Cependant le haut degré de

symétrie du cœur de la molécule a conduit à de sérieuses difficultés.

101

La détermination structurale a été réalisée en utilisant une expérience HSQC-TOCSY

à haute résolution et l’attribution a été faite en évoluant par l’une ou l’autre extrémité de

la molécule à travers les systèmes de spins. Cependant les systèmes de spins 11-12-13 et

14-15-16 au centre de la molécule, présentés dans la matrice 2D à haute résolution (Fig.

24), étaient impossibles à distinguer (on observe exactement les mêmes déplacements

chimiques pour les protons et les atomes de carbone), ce qui révèle une structure

symétrique du segment triène.

Nous avons utilisé une expérience modifiée de HSQC-TOCSY (IPAP hsqc-gpsp)

(Ronald C. et al., 1992) pour augmenter la résolution des systèmes de spin AB, et un

temps de mélange de 30 ms est utilisé pour obtenir plus de renseignements de ces

cross-pics très proches. A ce stade, l'attribution de tous les protons et atomes de carbone

confirme le résultat des travaux antérieurs de Butovich (Butovich IA., 2005; Butovich IA.

et al., 2006).

102

Figure 24 : Attribution séquentielle des protons et des atomes de carbone de la PDX

avec la technique IPAP hsqc-tocsy.

Cette représentation 2D est la superposition de deux matrices: la somme et la différence

des hsqc-tocsy en-phase IP et AP. Les régions vides sont coupées pour augmenter la

résolution du tracé. Ns= 16, le temps domaine td2= 2048, td1= 2048, traitement domaine

si2 = 2048, si1= 2048 avec la prédiction linéaire.

103

Tableau 1: Déplacements chimiques du 1H et du 13C et les constantes de couplage des

protons de la PDX.

1H 13C Numéro d’atome δ (ppm) Constante de couplage

Hz δ (ppm)

1 N.D. 2 2.347 m 34.298 3 2.39 m 23.022 4 5.406 m 128.300 5 5.409 m 129.047 6 2.822 t, J(6,5)=J(6,7)=5.35 25.704 7 5.467 m 130.009 8 5.461 m 125.516 9 2.4 m, J(9,10)=6.5 35.350 10 4.198 J(10,11)=6.3, J(10,12)=1.3 72.043 11 5.757 J(11,12)=15 137.127 12 6.747 J(12,13)=11, J(12,14)=-0.8 125.476 13 5.991 J(13,14)=11, J(13,15)=-0.8 128.966 14 5.995 J(14,15)=11 128.985 15 6.741 J(15,16)=15, J(15,17) =1.3 125.476 16 5.744 J(16,17)=6.3 137.066 17 4.174 J(17,18)=6.5 72.142 18 2.320 m 35.210 19 5.387 m 124.446 20 5.493 m 133.674 21 1.2 J(21,22)=7.05 20.667 22 0.983 7.5 13.518

Les déplacements chimiques du 1H et du 13C ainsi que les constantes de couplage des

protons de la PDX. sont mesurés à 25 °C dans CD3OD. Pour les systèmes de spin AB,

les valeurs ont été affinées par simulation spectrale.

104

Toutefois, les données de RMN présentées dans le Tableau 1 montrent que le

carbone de la fonction carboxylique ne figure pas dans le spectre 13C, et reste donc

indéterminé.

Dans une deuxième étape, nous avons mesuré les constantes de couplage H-H dans le

triène conjugué. Les constantes les plus faciles à élucider étaient J11, 12 et J15,16 en raison

du caractère AX de système de spins. Un simple spectre du proton avec un

homodécouplage multisite (Hammarstroem A. & Otting G., 1994) de H13-H14 et

H10-H17 conduit à J11,12 = J15,16 = 15Hz (Fig. 25A), démontrant le caractère E de ces

deux doubles liaisons.

La mesure de la constante J13,14 est plus difficile à obtenir en raison des effets de

second ordre entre H13 et H14, et la superposition de signaux de carbone. Toutefois, nous

avons réussi à obtenir une bonne mesure par la méthode SAPHIR (Vatele JM. et al.,

1988) (Fig. 25B).

Le cœur de la méthode est basé sur la dissymétrie introduite dans une expérience

HSQC acquise sans effectuer le découplage entre 13 C numéro 13 et le proton 13. Ainsi la

constante de couplage mesurée J(13C13-H13) est de 15,8 Hz alors que J(12C14 –H14) est

nulle supprimant ainsi l’effet de second ordre. L’homodécouplage de tous les autres

protons durant l’acquisition conduit à un simple doublet donnant une constante de

couplage JH13-H14 à 11Hz correspondant donc à une double liaison de géométrie Z.

Finalement nous avons confirmé ce résultat grâce à une simulation de la partie

centrale de la molécule avec le simulateur de spin Bruker Daisy (Fig. 25C). Dix spins ont

été pris en compte et le spectre simulé obtenu est très superposable au spectre

expérimental certifiant ainsi la détermination de la structure.

Cette étude RMN permet de conclure que la géométrie des doubles liaisons du triène

conjuguée de la PDX est 11E,13Z,15E.

A ce stade on peut affirmer que la PDX est l’acide

10,17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-hexaénoïque.

105

1JCH

3J13,14

A

B

C

4.14.25.45.55.75.86.06.76.8f1 (ppm )

5.96.06.1f2 (ppm)

f1(p

pm)

1JCH

3J13,14

A

B

C

4.14.25.45.55.75.86.06.76.8f1 (ppm )

5.96.06.1f2 (ppm)

f1(p

pm)

f1(p

pm)

Figure 25 : Techniques de RMN appliquées à la PDX pour la détermination de la

configuration de la double liaison C13-C14.

(A) Zooms des signaux de H11 et H16 : en bas, spectre du proton normal et en haut

spectre avec homodécouplage simultanément de H13-H14 et H10-H17; (B) Mesure par

HSQC SAPHIR de la constante de couplage J( H13-H14) dans le système AB. HSQC sans

106

découplage du carbone a été utilisée lors de l'acquisition et homodécouplage simultané

de H12-H15 (6,73 ppm) et H11-H16 (5,73 ppm). La constante de couplage mesurée était

de JH13,H14 = 11Hz; (C) Comparaison entre le spectre simulé (fenêtre supérieure) et le

spectre expérimental (fenêtre inférieure). La portion du spectre (6,8-4,1ppm)

correspondant à la partie centrale de la molécule incluant le motif triène et les deux

groupes hydroxyles a été simulée avec le simulateur de spins DAISY BRUKER (fenêtre

supérieure) et comparée au spectre acquis (fenêtre inférieure). La région n’apportant pas

information ont été effacée avec l’outil de coupe du logiciel de traitement MestReNova.

IV. Détermination de la stéréochimie du carbone 10

IV.1 Utilisation de données chromatographiques

Pour cette étude, nous avons synthétisés différents acides gras dihydroxylés (diOH)

avec une stéréochimie des carbones asymétriques bien définie.

Le 8(R),15(S)-diHETE et le 8(S),15(S)-diHETE ont été préparés respectivement à

partir du 8(R)-HETE et 8(S)-HETE commerciaux via la 15-lipoxygénase (voir § II.1.2

dans « Matériels et Methodes »). Cette biosynthèse avait déjà été réalisée par Maas RL. et

al. (Maas RL. et al., 1981). Ces auteurs avaient montré que la stéréochimie du carbone 15

était S et que la géométrie des doubles liaisons du triène conjugué était E/Z/E. La

séparation par HPLC de ces deux diastéstéréoisomères (Fig. 26A) montre que le

8(S),15(S)-diHETE est élué avant le 8(R),15(S)-diHETE.

Nous avons alors appliqué la même méthode et synthétisé le 10(R),17(S)-diHDoHE et

le 10(S),17(S)-diHDoHE à partir respectivement du 10(R)-HDoHE et du 10(S)-HDoHE.

Ces composés ont alors été séparés par HPLC (Fig. 26B). Nous savons par ailleurs

(données RMN) que la géométrie des doubles liaisons du triène conjugué de ces

diastéréoisomères est E/Z/E comme celle des diastéréoisomères 8(R),15(S)-diHETE et

8(S),15(S)-diHETE utilisé ci dessus. Nous avons donc identifié (Fig. 26B) le composé

élué à 36,7 min comme étant le 10(S),17(S)-diHDoHE par analogie avec le

8(S),15(S)-diHETE qui était élué en premier. L’autre composé élué à 37,1 min est donc le

10(R),17(S)-diHDoHE.

107

min0 10 20 30 40 50

mAU.

0

200

400

600

33.8

8(S),15(S)-diHETE(E/Z/E)

20:4n-6

8(S)-HETE

sLOX sLOX

8(R),15(S)-diHETE

34.3λ= 270 nm

(E/Z/E)

10(S),17(S)-diHDoHE 10(R),17(S)-(E/Z/E) (E/Z/E)

min10 20 30 40 50

mAU.

0

100

200

300

400

36.737.1

10(R),17(S)-diHDoHE-

10(S)-HDoHE

sLOXsLOX

8(R)-HETEA

B10(R)-HDoHE

22:6n-3

λ= 270 nm

min0 10 20 30 40 50

mAU.

0

200

400

600

33.8

8(S),15(S)-diHETE(E/Z/E)

20:4n-6

8(S)-HETE

sLOX sLOX

8(R),15(S)-diHETE

34.3λ= 270 nm

(E/Z/E)

10(S),17(S)-diHDoHE 10(R),17(S)-(E/Z/E) (E/Z/E)

min10 20 30 40 50

mAU.

0

100

200

300

400

36.737.1

10(R),17(S)-diHDoHE-

10(S)-HDoHE

sLOXsLOX

8(R)-HETEA

B10(R)-HDoHE

22:6n-3

λ= 270 nm

Figure 26 : Chromatogramme montrant la séparation par HPLC des

diastéréoisomères.

Les diOH sont dérivés à partir du 8(R)-, 8(S)-HETE ou les 10(R)-, 10(S)-HDoHE

séparément (voir § II.1.1 et § II.1.2 dans « Matériels et Méthodes »).

(A) 8(R),15(S)-diHETE et 8(S),15(S)-diHETE ; (B) 10(R),17(S)-diHDoHE et

10(S),17(S)-diHDoHE .

108

Nous avons ensuite analysé par HPLC le 10(R),17(S)-diHDoHE et le

10(S),17(S)-diHDoHE comme cela a été réalisé dans l’expérience précédente (Fig. 26B)

avec une surcharge de PDX.

On observe (Fig. 27) que la PDX coélue avec le 10(S),17(S)-diHDoHE. Ces résultats

indiquent que la stéréochimie du carbone 10 de la PDX est S.

min10 20 30 40 50

mAU.

0

200

400

600

800

37.3

37.8

10(R),17(S)-diHDoHE10(S),17(S)-diHDoHE

PDX

nm200 250 300

Norm.

0

100

200

300

400

PDX

10(R),17(S)-diHDoHE10(S),17(S)-diHDoHE

DHAsLOX

+

min10 20 30 40 50

mAU.

0

200

400

600

800

37.3

37.8

10(R),17(S)-diHDoHE10(S),17(S)-diHDoHE

PDX

nm200 250 300

Norm.

0

100

200

300

400

PDX

10(R),17(S)-diHDoHE10(S),17(S)-diHDoHE

nm200 250 300

Norm.

0

100

200

300

400

PDX

10(R),17(S)-diHDoHE10(S),17(S)-diHDoHE

DHAsLOX

+

Figure 27 : Chromatogramme montrant la séparation des diastéréoisoméres

10(R),17(S)-diHDoHE et 10(S),17(S)-diHDoHE surchargés avec la PDX.

La PDX est dérivée du DHA par la sLOX ; le 10(S),17(S)-diHDoHE et

10(R),17(S)-diHDoHE sont dérivés de 10(R/S)-HDoHE. Pour les conditions opératoires

se reporter au § II.5 dans « Matériels et Méthods ». Encadré : spectres de la PDX et des

10,17-diHDoHE en RP-HPLC.

109

IV.2 Utilisation de l’UPLC couplée au SYNAPT HDMS équipé d’une

interface de mobilité des ions

La stéréochimie du carbone 10 de la PDX a aussi été confirmée en utilisant un

nouveau système UPLC-MS/MS équipé d’une interface de mobilité d’ions. Cet

instrument est capable de discriminer les isopodologues. Ces ions qui ont le même rapport

masse/charge diffèrent par leur structure. Leur conformation différente modifie leur

mobilité et permet leur séparation.

Nous avons analysé la PDX et le 10(S),17(S)-diHDoHE avec ce système voir § II.8

dans « Matériels et Méthodes ».

Le spectre de masse du PDX (Fig. 28A) est superposable à celui du

10(S),17(S)-diHDoHE. L’ion principal m/z 383 correspond à l'adduit avec le sodium

[M-Na]+. Il apparaît (Fig. 28B) que les mobilogrammes de l’ion m/z 383 de la PDX et du

10(S),17(S)-diHDoHE sont parfaitement superposables suggérant que ces deux molécules

ont des conformations identiques donc des structures très proches.

110

A

B

10(S),17(S)-diHDoHE

m/z200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950

0

100 383.3

384.2

384.7

383.3

384.2385.3

%

100 383.3

384.2

%

0

100

m/z378 380 382 384 386 388 390

%%

PDX

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 9500

100

contaminant

%

0

10020 40 60 100

%

0

100383.3

383.2

Scan20 40 60 80 100 120 140 160 180

120 130 140 150 160 170 180 190

Scan50 60 70 80 90 100 110 120%

100

Overlay of10(S),17(S)-diHDoHE and PDX

mobilogrames

10(S),17(S)-diHDoHE

PDX

0m/z378 380 382 384 386 388 390

0

0

A

B

10(S),17(S)-diHDoHE

m/z200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950

0

100 383.3

384.2

384.7

383.3

384.2385.3

%

100 383.3

384.2

%

0

100

m/z378 380 382 384 386 388 390

%%

PDX

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 9500

100

contaminant

%

0

10020 40 60 100

%

0

100383.3

383.2

Scan20 40 60 80 100 120 140 160 180

120 130 140 150 160 170 180 190

Scan50 60 70 80 90 100 110 120%

100

Overlay of10(S),17(S)-diHDoHE and PDX

mobilogrames

10(S),17(S)-diHDoHE

PDX

0m/z378 380 382 384 386 388 390

0

0

Figure 28 : Analyse de la PDX et du 10(S),17(S)-diHDoHE par UPLC-HDMS équipé

d’une interface de mobilité d’ions.

(a) Spectre de masse de la PDX et du 10(S),17(S)-diHDoHE; (b) mobilogrames de l’ion

m/z : 383 de la PDX et du 10(S),17(S)-diHDoHE.

Toutes ces données (RMN, chromatographiques) montrent que la PDX synthétisée à

partir du DHA via la 15-lipoxygénase de soja (sLOX) est l’acide

10(S),17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-hexaénoïque. La stéréochimie S

des carbones 10 et 17 suggère que la biosynthèse de la PDX par la sLOX s’opère via un

mécanisme de double oxygénation. Cette molécule correspond à celle partiellement

décrite par Butovich (Butovich IA. et al., 2006) mais est différente de la PD1 qui est

l’acide 10(R),17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-hexaénoïque (Serhan et

al. (Serhan CN. et al., 2006). La PD1 serait formée via un mécanisme d’époxydation

111

(Hong S. et al., 2003) suivi d’un réarrangement moléculaire identique à celui déjà décrit

dans la littérature pour la synthèse des leucotriènes.

Pour confirmer ce mécanisme, nous avons réalisé la synthèse de la PDX sous

atmosphère d’18oxygène. Dans le cas d’un mécanisme de double oxygénation, deux

atomes 18O doivent être incorporés dans la molécule et un seul dans le cas d’un

mécanisme avec époxydation, le deuxième venant de l’eau.

V. Confirmation du mécanisme de double oxygénation et de la stéréochimie

du carbone 10

La PDX est synthétisé soit dans les conditions normales, soit sous atmosphère d’18O2

(voir § II.1 dans « Matériels et Méthodes »).

La Figure 29A montre les ions caractéristiques de la PDX déjà décrits dans le

paragraphe II dans « Résultats et Discussion » pour localiser l’insertion de l’oxygène sur

la chaîne hydrocarbonée. (m/z : 515 (M-15, perte de CH3), 459 (M-71, perte de

CH2+-(CH2)3-CH3), 369 (M-(71+90)), 359 (M-171, perte de CH2-(CH2)7-COOCH3), 273

(pic basique, Me3SiO+=CH-(CH2)8-COOCH3), 173 (Me3SiO+=CH-(CH2)4-CH3) et 73

(SiMe3). Le spectre de masse de la PDX synthétisée sous atmosphère d’18O2 (Fig. 29B)

révèle un décalage de 2 ou de 4 unités de masse des fragments décrits ci-dessus. Ce

décalage indique une insertion d’un atome 18O au niveau des carbones 10 et 17 (m/z : 519

et463 au lieu de 515 et 459 et 371, 275, 175 et 131 au lieu de 369, 273, 173 et 129).

Ce résultat indique clairement que deux atomes 18O ont été insérés dans la PDX

confirmant ainsi le mécanisme de double oxygénation. Ce dernier est en accord avec la

stéréochimie S du carbone 10.

112

A

B

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

m/z

Abundance

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

463

275 363

175

51918OSi(CH3)3

COOCH3

27573175

131371

463519

363.3

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

Abundance

459

273 359

173

515

COOCHCOOCH3

m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

273

73 173

369129

459515

359

18OSi(CH3)3

OSi(CH3)3

OSi(CH3)3

A

B

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

m/z

Abundance

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

463

275 363

175

51918OSi(CH3)3

COOCH3

27573175

131371

463519

363.3

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

Abundance

459

273 359

173

515

COOCHCOOCH3

m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

273

73 173

369129

459515

359

18OSi(CH3)3

OSi(CH3)3

OSi(CH3)3

Figure 29 : Spectre de masse de la PDX hydrogénée et dérivée sous forme Me-TMS

La PDX est synthétisée à partir du DHA par la sLOX dans : (A) des conditions normales ;

(B)sous atmosphère d’ 18O2.

113

VI. Conclusion de la première partie :

Toutes ces données (GC-MS, RMN, chromatographiques, UPLC-MS/MS) montrent

que la 15 lipoxygénase de soja synthétise en plus de l’acide 17(S)-HDoHE, l’acide gras

dihydroxylé : l’acide 10(S),17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-hexa-

énoïque appelé PDX. Ce composé est différent de la PD1 qui est l’acide

10(R),17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-hexaénoïque.

Nous allons dans une deuxième partie étudier l’effet inhibiteur de la PDX sur

l’agrégation des plaquettes sanguines.

114

Deuxième partie:

Effet anti-agrégant de la PDX

Les plaquettes sanguines jouent un rôle pivot dans le développement des thromboses

et des maladies cardiovasculaires. En effet l’agrégation plaquettaire intervient dans la

formation du thrombus qui peut en grandissant conduire à l’occlusion des vaisseaux.

Aussi la découverte de nouveaux inhibiteurs est très importante pour la prévention et le

traitement de nombreuses maladies athérothrombotiques. Les effets bénéfiques des acides

gras n-3 et notamment ceux du DHA sur le plan cardiovasculaire sont bien connus. Des

études épidémiologiques montrent depuis longtemps que les populations esquimaudes qui

consomment beaucoup de produits marins riches en n-3 ont un taux d’incidence de

maladies cardiovasculaires très faible par rapport aux autres populations (Smith DL. et

al., 1989).

Par ailleurs le DHA est le précurseur de dérivés oxygénés appelés résolvines.

Celles-ci sont de puissants agents anti-inflammatoires qui pourraient aussi avoir un rôle

anti-agrégant. Dans cette deuxième partie nous rapportons les résultats obtenus sur l’effet

anti-agrégant de la PDX et cet effet a été comparé avec celui d’autres acides gras

dihydroxylés.

I. Effet de la PDX sur l'agrégation plaquettaire induite par le collagène

Nous avons étudié l’effet de la PDX et d’autre acides gras dihydroxylés sur

l’agrégation plaquettaire.

L'agrégation plaquettaire est induite par le collagène en absence (contrôle) ou en

présence de différentes concentrations de PDX. (voir § V.2.1 dans « Matériels et

Méthodes »). On observe que la PDX inhibe l’agrégation plaquettaire induite par le

collagène à des concentrations submicromolaires. Cette inhibition observée (Fig. 30) est

115

dose-dépendante. Ainsi, 25 % et 70 % d'inhibition ont été observés lorsque la suspension

plaquettaire était incubée respectivement avec 0,3 µM et 1 µM de la PDX.

0 1 2 3 4 Time (min)

100

80

60

40

20

0

Plat

elet

agg

rega

tion

(%)

Control

PDX 0.3 µM

PDX 1 µM PDX 3 µM PDX 10 µM

0 1 2 3 4 Time (min)

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

0

Plat

elet

agg

rega

tion

(%)

Control

PDX 0.3 µM

PDX 1 µM PDX 3 µM PDX 10 µM

Figure 30 : Inhibition dose-dépendante de la PDX sur l'agrégation plaquettaire

induite par le collagène.

L’agrégation entraîne une augmentation de la transmission de la lumière qui est

enregistrée pendant 4 min. Les tracés sont la moyenne d’au moins quatre expériences

indépendantes.

II. Comparaison de la PDX avec différents triènes conjugués

Nous avons ensuite recherché si la géométrie des doubles liaisons du triène conjugué

était impliquée dans le mécanisme d'inhibition de l'agrégation plaquettaire induite par le

collagène ou l’acide arachidonique. Pour cela nous avons testé différents composés avec

différentes géométrie E/Z/E, Z/E/E ou E/E/E des doubles liaisons de leur triène.

Les composés avec la géométrie E/Z/E tels que le 10(R),17(S)-diHDoHE (un isomère

de la PDX) et le 8(S),15(S)-diHETE sont aussi efficaces que la PDX pour inhiber

116

l’agrégation plaquettaire. Par contre, le LTB4 et son isomère le 12-épi LTB4, qui ont une

géométrie Z/E/E n'ont aucun effet sur l'agrégation plaquettaire induite par le collagène, et

ce même à des concentrations relativement importantes (10 µM) (Fig. 31).

Ces résultats impliquent que la géométrie E/Z/E des doubles liaisons du triène

conjugué est cruciale pour l'inhibition de l'agrégation plaquettaire induite par le collagène.

0 2 4 6 8 10 µM

Inhi

bitio

n (%

)

8(S),15(S)-diHETEPDX

10(R),17(S)-diOH-22:6

LTB4

12-epi LTB4

E/Z/E

Z/E/E

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 µM

Inhi

bitio

n (%

)

8(S),15(S)-diHETEPDX

10(R),17(S)-diOH-22:6

LTB4

12-epi LTB4

E/Z/E

Z/E/E

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Figure 31 : Effet de différents acides gras dihydroxylés sur l'agrégation plaquettaire

induite par le collagène.

La concentration de collagène a été ajustée pour obtenir une agrégation d’environ 70 %

qui sert de contrôle. L'agrégation a été suivie pendant 4 min. Chaque valeur représente la

moyenne ± SEM de quatre déterminations.

Dans le Tableau 2A, l’acide 10(S),17(S)-dihydroxy-docosa-11E,13Z,15E-triénoïque

(10(S),17(S)-diOH-22:3) a été préparé à partir du 22:3n-6 via la 15-lipoxygénase de soja.

Ce composé a la particularité de ne pas posséder de double liaison en dehors de celles du

117

triène conjugué. La géométrie de ses doubles liaisons conjugées est E/Z/E comme dans

la PDX. On observe que ce composé inhibe l’agrégation induite par le collagène aussi

efficacement que la PDX. On en déduit que les doubles liaisons extérieures au triènes

conjugés en E/Z/E ne sont pas impliquées dans le mécanisme d’inhibition. Seul le motif

triène avec la géométrie E/Z/E est nécessaire et suffisant.

Pour le vérifier, nous avons comparé l’effet du LTB3 et du 12-épi LTB3, qui ne

possèdent que trois double liaisons conjuguées Z/E/E avec le LTB4 et le 12-épi LTB4. Le

Tableau 2B montre que ces quatre molécules ne présentent pas d'effet d’inhibiteur.

Nous avons aussi observé que l’isomère 6-trans (E/E/E) du LTB4 est aussi inactif.

(Tableau 2B).

Ce résultat montre que la présence d’un motif triène conjugué E/Z/E est essentielle

pour obtenir un effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire induite par le collagène.

En outre, nous observons (Tableau 2A) que aussi bien le 7(S),14(S)-diHDoHE

(dérivé du 14(S)-HDoHE par la 5-lipoxygénase) et le 5(S),12(S)-diHETE (dérivé du

5(S)-HETE par la 12-lipoxygénase), qui ont en commun un motif triène E/Z/E mais

positionné différemment sur la chaîne, inhibent l’agrégation plaquettaire induite par le

collagène aussi efficacement que la PDX. On en déduit que la position des doubles

liaisons du triène conjugué sur la chaîne n’est pas importante pour obtenir un effet

inhibiteur.

Par ailleurs, la comparaison des trois isomères : LTB4 (acide

5(S),12(R)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E,14Z-tétraénoïque), 12-épi LTB4 (acide

5(S),12(S)-dihydroxy-eicosa-6Z,8E,10E,14Z-tétraénoïque) et 5(S),12(S)-diHETE (acide

5(S),12(S)-dihydroxy-eicosa-6E,8Z,10E,14Z-tétraénoïque) révèle que seul le

5(S),12(S)-diHETE qui possède le géométrie E/Z/E des doubles liaisons du triène

conjugué est capable d’inhiber l’agrégation plaquettaire.

Le LTB4 ne modifie pas l’agrégation plaquettaire induite par le collagène (Tableau

2), ni celle induite par l’AA (Tableau 3) comme cela a déjà été rapporté dans la littérature

118

(Lee TH. et al., 1984b ; Croset M. et al., 1988). Ces auteurs ont en effet montré que

l'agrégation plaquettaire induite par le 9-méthano-analogue de PGH2 n’était pas inhibée

par le LTB4, mais inhibée par le 5(S),12(S)-diHETE. Nous confirmons aussi que le

5(S),12(S)-diHETE inhibe l’agrégation plaquettaire induite par le collagène (Tableau 2)

et l’AA (Tableau 3).

En conclusion, la présence d’un triène conjugué avec la géométrie E/Z/E est

nécessaire pour obtenir un effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire induite par le

collagène ou l’AA. Par contre, les composés contenant un motif triène avec les

géométries Z/E/E ou E/E/E de leurs doubles liaisons sont inactifs. En outre, la position du

triène et la présence d’autres doubles liaisons sur la chaîne ne sont pas importantes pour

cette inhibition.

Tableau 2: Pourcentages d'inhibition observés en utilisant la PDX et d'autres acides

gras dihydroxylés sur l'agrégation plaquettaire induite par le collagène.

A.

E/Z/E Inhibition (%) PDX 10(R),17(S)-

diHDoHE 10(S),17(S)-diOH-22:3

7(S),14(S)-diHDoHE

8(S),15(S)- diHETE

5(S),12(S)- diHETE

1 µM 56.1 ± 6.2 ** 70.1 ± 9.4 ** 63.8 ± 4.6 ** 39.0 66.5 ± 6.8 ** 74.9 ± 10.7 **

B. Z/E/E E/E/E Inhibition

(%) LTB4 12-épi LTB4 LTB3 12-épi LTB3 6-trans LTB46trans- 12-épi LTB4

1 µM 3.5 ± 2.5 3.9 ± 2.1 4.4 ± 5.4 0.6 ± 3.7 5.7 ± 6.4 1.8 ± 2.8

Les plaquettes ont été incubées à 37 °C sous agitation continue, puis stimulées par 0.05 ~

0.15 ng/mL de collagène. La concentration de collagène est ajustée afin d’obtenir

environ 70 % d’agrégation en absence d’inhibiteur (contrôle). Chaque résultat

représente la moyenne ± SEM, (n ≥ 4) ; ** P <0,01 vs contrôle.

119

Ces expériences réalisées avec le collagène ne nous permettent pas de savoir si cette

inhibition résulte d’une inhibition de la libération de l’AA par les phospholipases ou si

cette inhibition résulte de l'inhibition de la cyclooxygénase. Pour répondre à cette

question nous avons étudié l'agrégation plaquettaire induite par l’AA (voir § III dans 2e

partie de « Résultats et Discussion ») en présence d’AA radioactifs (voir § IV dans 2e

partie de « Résultats et Discussion »). Ce dernier a été ajouté afin de faciliter la détection

et la mesure des métabolites oxygénés.

III. Effet de la PDX et d'autres triènes conjugués sur l'agrégation

plaquettaire induite par l'acide arachidonique (AA)

Le Tableau 3 montre que la PDX, ainsi que son isomère 10(R) qui contiennent le

triène conjugué avec la géométrie des doubles liaisons E/Z/E inhibent significativement

(p< 0,01) l'agrégation plaquettaire induite par l'acide arachidonique (AA). L'agrégation

plaquettaire est significativement diminuée de -26 % en présence de 0,3 µM de PDX et de

-78 % avec 1 µM de PDX.

En outre le 8(S),15(S)-diHETE qui possède la même géométrie E/Z/E que la PDX

inhibe significativement (P <0,01) l’agrégation à 0,3 µM et à 1 µM. Par contre, les LTB4

et 12-épi LTB4 qui portent un triène conjugué avec la géométrie des doubles liaisons

Z/E/E sont inactifs à ces mêmes concentrations.

Ces résultats montrent que la géométrie des triènes conjugués en E/Z/E est également

requise pour l’inhibition de l’agrégation plaquettaire induite par l’AA. De plus on observe

que la stéréochimie du carbone 10 est indépendante de l’effet inhibiteur observé.

120

Tableau 3: Pourcentages d'inhibition observés en utilisant la PDX et d'autres acides

gras dihydroxylés sur l'agrégation plaquettaire induite par l’AA.

E/Z/E Z/E/E Inhibition (%) PDX 10(R),17(S)-

diHDoHE 8(S),15(S)- diHETE LTB4 12-épi LTB4

0.3 µM 25.7 ± 9.2 * 36.4 ± 13.4 * 56.4 ± 9.9 ** 5.1 ± 4.6 -2.5 ± 1.6

1 µM 78.9 ± 5.6 ** 72.5 ± 9.7 ** 61.0 ± 10.5 ** 2.1 ± 3.2 -9.8 ± 2.5

Les plaquettes ont été incubées à 37 °C sous agitation continue, puis stimulées par 1 ~

1.2 µM de l’AA. La concentration de l’AA est ajustée afin d’obtenir environ 70 %

d’agrégation en absence d’inhibiteur (contrôle). Chaque résultat représente la moyenne

± SEM, (n ≥ 4); ** P <0,01 vs contrôle.

IV. Effet de la PDX sur le métabolisme oxygéné de l'acide arachidonique

(AA)

La suspension plaquettaire a été incubée avec de l’acide arachidonique exogène (AA)

radioactif (Voir § V.2.3 dans « Matériels et Méthodes »), en présence ou en absence de

d’acides gras dihydroxylés à 1 µM. Nous avons ensuite mesuré (radioactivité) des

différents métabolites oxygénés issus des voies cyclcooxygénase et 12-lipoxygénase. Les

données sont rassemblées dans le Tableau 4.

Nous observons que les deux principaux produits de la voie de la cyclooxygénase, le

thromboxane B2 (TxB2) et l’acide 12-hydroxy-heptadéca-5,8,10-triénoïque (HHT) sont

significativement diminués (P <0,01) d'environ 50 % lorsque les plaquettes ont été

incubées en présence de la PDX ou par son isomère 10(R),17(S)-diHDoHE.

Ce résultat indique que la PDX et/ou son isomère (10(R) inhibent la voie de la

cyclooxygénase.

121

On constate que la PDX et son isomère 10(R),17(S)-diHDoHE ne modifient pas la

formation de l’acide 12-hydroxy-éicosa-5,8,10,14-tétraénoïque (12-HETE), qui est formé

par la 12-lipoxygénase. L’inhibition de la cyclooxygénase est également observée avec le

8(S),15(S)-diHETE qui possède une géométrie E/Z/E de son triène conjuguée. Par contre,

le LTB4 (Z/E/E) a aucun effet.

Ces résultats indiquent que la voie de la cyclooxygénase est inhibée par les molécules

qui possèdent les triènes conjugués avec la géométrie E/Z/E de leurs doubles liaisons

tandis que la voie de la 12-lipoxygénase n’est pas modifiée. Par contre, les autres

molécules avec la géométrie Z/E/E comme le LTB4 sont inactifs.

Tableau 4: Effet de différents acides gras dihydroxylés comportant différentes

géométries de triènes conjugués sur les métabolites oxygénés synthétisé à partir de

l’AA via la cyclooxygénase et la 12-lipoxygénase.

E/Z/E Z/E/E % of control PDX 10(R),17(S)-diHDoHE 8(S),15(S)-diHETE LTB4

TxB2 44.7 ± 7.3 ** 51.9 ± 5.7 * 54.1 ± 5.5 ** 107.4 ± 9.1

HHT 43.1 ± 7.7 ** 54.8 ± 4.7 * 63.4 ± 9.9 ** 98.7 ± 18.5

12-HETE 82.0 ± 6.4 92.7 ± 14.4 114.0 ± 1.9 105.4 ± 2.9

Les plaquettes ont été incubées avec 1,3 ~ 2 µM de [1-14C]AA pendant 4 min à 37 °C.

Le contrôle a été ajusté afin d'obtenir 70 % d'agrégation. Les lipides plaquettaires ont été

extraits et séparés par CCM, et la radioactivité des métabolites issus du AA a été mesurée

par radiochromatographie (voir § V.3.3 dans « Matériels et Méthodes »). Les valeurs

calculées des différents métabolites mesurés dans les échanitillons contrôle sont : TxB2:

1,85 ± 0,2 nmol/109 pl; HHT: 0,94 ± 0,2 nmol/109 pl; 12-HETE: 0,84 ± 0,1 nmol/109 pl.

Toutes les valeurs sont la moyenne ± SEM, d’au moins 4 déterminations. ( n ≥ 4. * P

<0.05, ** P <0,01 vs contrôle).

122

V. Effet de la PDX sur l’agrégation plaquettaire induite par l’U-46619

Les thromboxanes sont considérés comme des vecteurs importants dans la genèse des

désordres thromboemboliques, ainsi l'inhibition de l’agrégation plaquettaire médiée par

les thromboxanes peut expliquer en partie la réduction de l'incidence dans les maladies

occlusives vasculaires.

L’U-46619 est un analogue stable de l’endoperoxyde prostaglandine H2 qui est

capable d’induire l’agrégation plaquettaire en se fixant sur le récepteur du thromboxane

A2 (Coleman RA. et al., 1981).

L'agrégation plaquettaire induite par l’U-46619 est inhibée par la PDX (1 µM). Cette

inhibition est maintenue lorsque les plaquettes ont été pré-traitées par l'aspirine montrant

ainsi que le mécanisme d’agrégation et l’inhibition ne fait pas intervenir la

cyclooxygénase (Fig. 32).

L’inhibition par la PDX de l'agrégation plaquettaire induite par U-46619 pourrait

s’expliquer par une compétition entre l’U-46619 et la PDX au niveau du récepteur du

thromboxane A2/PGH2.

123

A.

Time (min)

100

80

60

40

20

00 1 2 3 4

Plat

elet

agg

rega

tion

(%)

Control

Control + ASA

PDX 1 µM + ASA

PDX 1 µM

Time (min)

100

80

60

40

20

0

100

80

60

40

20

00 1 2 3 4

Plat

elet

agg

rega

tion

(%)

Control

Control + ASA

PDX 1 µM + ASA

PDX 1 µM

B.

0

20

40

60

80

100

Control PDX Control+ ASA

PDX+ ASA

Plat

elet

agg

rega

tion

(%)

**

**

0

20

40

60

80

100

Control PDX Control+ ASA

PDX+ ASA

Plat

elet

agg

rega

tion

(%)

**

**

Figure 32: Effets de la PDX sur l'agrégation plaquettaire induite par l’U-46619.

400 µL de suspension plaquettaire ont été pré-incubés avec ou sans 2×10-4 M de

l'aspirine (ASA) pendant 4 min et activés par 0,05 ng/mL de l’U-46619, en présence ou en

absence de 1 µM de la PDX. L'agrégation plaquettaire a été suivie pendant 4 min.

124

Chaque valeur est la moyenne ± SEM de quatre expériences indépendantes qui ont été

répétés trois fois. ** P <0,01 vs contrôle.

(a) Effet inhibiteur de la PDX sur l'agrégation plaquettaire induite par l’U-46619. Les

plaquettes ont été pré-traitées avec ou sans l'ASA; (b) Les plaquettes pré-traitées avec

l’ASA ont été activées par l’U-46619 afin d'obtenir une agrégation d’environ 75% (74,6 ±

2,1%). La même expérience a été réalisée en utilisant des plaquettes pré-traitées avec

l’ASA (à gauche) ou sans l'ASA (à droite), et traitées ou non par la PDX (1 µM).

VI. Conclusion de la deuxième partie

En résumé, la PDX inhibe l'agrégation plaquettaire en agissant à la fois sur la voie de

la cyclooxygénase et sur le récepteur du thromboxane A2.

Swann PG. et al. ont montré que le DHA pouvait inhiber directement l’agrégation

plaquettaire induite par l’U-46619 avec une IC50 = 2,2 µM (Swann PG. et al., 1989). La

PDX serait donc environ trois fois plus puissante pour inhiber le récepteur du

thromboxane A2. D’autres travaux, O’Keefe SF. et al. rapportent l’inhibition par le DHA

de l’agrégation plaquettaire induite par AA avec une IC50 de 5,6 µM (O’Keefe SF. et al.,

1990) alors que pour la PDX, l’IC50 est inférieure à 1 µM, confirmant ainsi la plus grande

efficacité de la PDX par rapport au DHA pour inhiber l’agrégation plaquettaire.

125

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

126

CONCLUSIONS

Nos travaux ont permis de caractériser un isomère de la protectine D1 (PD1), l’acide

10(S),17(S)-dihydroxy-docosa-4Z,7Z,11E,13Z,15E,19Z-hexaénoïque qui est synthétisé à

partir du DHA via la 15-lipoxygénase de soja (sLOX). Il peut aussi être produit à partir de

l’acide gras monohydroxylé, 17-HDoHE, avec cette même enzyme.

Cette molécule diffère de la PD1 au niveau de la stéréochimie du carbone 10 qui est S

pour la PDX et R pour la PD1. La géométrie des doubles liaisons du triène conjugué est

E/Z/E dans la PDX et E/E/Z dans la PD1. La synthèse de la PDX fait appel à un

mécanisme de double oxygénation alors que celui de la PD1 passe par une étape

d’époxydation.

Nous avons aussi montré que la PDX inhibe l’agrégation plaquettaire à des

concentrations submicromolaires. Elle inhibe la cyclooxygénase (COX-1) mais pas la

12-lipoxygénase. La géométrie E/Z/E des doubles liaisons du triène conjugué est requise

pour obtenir l’inhibition. Les acides gras dihydroxylés qui contiennent un motif triène

Z/E/E ou E/E/E n’ont pas d’effet. La position du triène conjugué sur la chaîne carbonée

ne semble pas importante. Ainsi le 5(S),12(S)-diHETE et le 8(S),15(S)-diHETE inhibent

de façon similaire l’agrégation plaquettaire. La présence d’autres doubles liaisons

extérieures au triène ne modifie pas les propriétés inhibitrices de la molécule. En effet

l’acide 10(S),17(S)-docosatriénoïque est aussi efficace que la PDX pour inhiber

l’aggrégation plaquettaire. La stéréochimie du carbone 10 (R/S) ne change pas les

propriétés inhibitrices de la molécule.

La PD1 ne devrait pas compte tenu de sa structure (géométrie des doubles liaisons

du triène conjugué : E/E/Z) inhiber l’agrégation plaquettaire.

127

PERSPECTIVES

Cette molécule à été synthétisée in vitro, il nous faut maintenant la rechercher dans

des tissus biologiques.

Nous allons aussi vérifier si l’inhibition observée pour la cyclooxygénase plaquettaire

(COX-1) se vérifie aussi pour la COX-2 en utilisant un autre modèle de cellules et en

inhibant la COX-1 par de l’aspirine.

Nous pouvons aussi étudier le mécanisme d’inhibition observé au niveau du

récepteur du thromboxane A2/PGH2. Nous pouvons par exemple essayer de répondre aux

questions suivantes :

Les deux récepteurs TPα et TPβ sont-ils inhibés de la même manière ?

S’agit-il d’une inhibition par compétition avec l’U-46619 ?

Sachant que la PD1 est un puissant agent anti-inflammatoire, il est intéressant de

vérifier si la PDX possède aussi cette propriété.

Nous pouvons aussi rechercher si d’autres composés dihydroxylés porteurs d’un motif

triène E/Z/E, synthétisés à partir d’autres acides gras polyinsaturés, sont aussi des

inhibiteurs de l’agrégation plaquettaire. Nous comparerons leurs propriétés avec celles de

la PDX. Il serait aussi intéressant de tester des molécules dihydroxylées possédant un

triène conjugé avec la géométrie Z/Z/Z.

La PDX est synthétisée à partir du DHA qui est l’acide gras majoritaire dans le

cerveau et la rétine. Il apparaît donc intéressant de tester si cette molécule peut améliorer

certaines maladies neurodégéneratives comme cela a déjà été rapporté pour la PD1.

128

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

129

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142

ANNEXE

143

On observe que tous les diOH ont des références frontales proches (Fig. 33

ci-dessous). La PDX est légèrement plus polaire que les isomères du LTB4 .Le

17-OH-22:6 qui est relativement plus apolaire migre plus que les diOH. Nous pouvons

donc utiliser en mode semi-préparatif la CCM pour isoler les acides mono et dihydroxylés

présents dans les extraits lipidiques.

LTB4

12-epi LTB4

6-trans LTB4

6-trans-12-epi LTB4

PDX

17-OH-22:6

LTB4

12-epi LTB4

6-trans LTB4

6-trans-12-epi LTB4

PDX

17-OH-22:6

Figure 33 : Exemple de séparation de différents acides gras dihydroxylés

commerciaux par chromatographie sur couche mince (CCM).

L’élution est réalisée avec un mélange de solvants : hexane/éther diéthylique/acide

acétique (25:75:1 ; v/v).

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