C O D A - C E R V A Centrum voor Onderzoek in ... · Titel/Titre : Dosage par HPLC-MS/MS de...

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C O D A - C E R V A Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie Centre d’Etude et de Recherches Vétérinaires et Agrochimiques

SOP/MYC/ANA/05 Vnr : 06 Datum/Date : 22/03/13 Pg 1/11 Titel/Titre : Dosage par HPLC-MS/MS de mycotoxines dans les céréales et produits dérivés après extraction par un mélange eau/acétonitrile

Auteur Kwaliteitsverantwoordelijke Responsable Qualité

Technisch verantwoordelijke Responsable technique

Naam / Nom

Ph. Debongnie

K. Knapen Ph. Debongnie

Doel / Objet : Cette instruction décrit l’extraction par un mélange eau/acétonitrile et le dosage par HPLC-MS/MS des mycotoxines DON (déoxynivalenol), ZEN (zéaralénone), T-2 et HT-2, OTA (ochratoxine A), AfB1, AfB2, AfG1, AfG2 (aflatoxines B1, B2, G1 et G2)

Toepassingsgebied / Domaine d’application : Cette instruction s’applique aux céréales et produits dérivés.

Bestemmelingen / Destinataires : zie distributielijst / Voir liste de distribution

Aantal copies in omloop / Copies en circulation : 4

Historiek / Historique

Vnr

Datum vrijgave

Date d’application

Reden(en) wijziging / Motif(s) de changement

01 02 03

04

05

06

02/06/09 11/12/09 25/02/11

14/12/11

14/12/12

22/03/13

Eerste editie / Première édition Na opmerkingen BELAC audit / Suite aux remarques de l’audit BELAC

‘standard additions’ veranderd door 13C internal standards , uitbreiding toepassingsgebied / ‘ajouts dosés’ remplacés par étalons internes 13C, extension du

domaine d’application Na opmerkingen BELAC audit + vereenvoudiging van de bereiding van extracten en toevoeging van een 2de LC-MS methode / Suite aux remarques de l’audit BELAC +

simplification de la préparation des extraits et addition d’une 2e méthode LC-MS Na opmerkingen BELAC audit + opgeven van de 1ste LC-MS methode / Suite aux

remarques de l’audit BELAC + abandon de la 1e méthode LC-MS Uibreiding tot nieuwe matrix en moleculen en integratie van de instructies voor de

bereiding van HPLC solventen na verwijdering van de SOP/MYC/PRE/01 / extension à de nouvelles matrices et molécules et intégration des instructions de préparation

des solvants HPLC suite à l’élimination de la SOP/MYC/PRE/01

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SOP/MYC/ANA/05 Vnr : 06 Datum/Date : 22/03/13 Pg 2/11 Titel/Titre : Dosage par HPLC-MS/MS de mycotoxines dans les céréales et produits dérivés après extraction par un

mélange eau/acétonitrile

1. Objet Cette instruction décrit l’extraction et le dosage par HPLC-MS/MS de mycotoxines dans les céréales et produits dérivés après extraction par un mélange eau/acétonitrile. 2. Domaine d’application Cette instruction s’applique aux céréales et produits dérivés. 3. Définitions, abréviations, références et normes 3.1. Définitions Les définitions de la Décision 2002/657/CE sont d’application. La validation de la méthode pour de nouvelles matrices et/ou molécules est basée sur les « profils d’exactitude » (Standard NF V03-110:2010) 3.2. Abréviations AfB1 aflatoxine B1 AfB2 aflatoxine B2 AfG1 aflatoxine G1 AfG2 aflatoxine G2 ACN acétonitrile DON déoxynivalénol FA ac. formique HAc acide acétique HPLC high-pressure liquid chromatography HPLC-MS/MS HPLC couplée à un détecteur MS permettant d’isoler des ions de rapport m/z donné

puis de fragmenter ceux-ci en vue de séparer et doser les principaux fragments HPLC-PDA HPLC couplée à un détecteur PDA permettant de mesurer directement la concentration de

certaines toxines dans les solutions-mères HT-2 mycotoxine HT-2

LC liquid chromatography m/z rapport masse / charge MeOH methanol MS mass spectrometry OTA ochratoxine A T-2 mycotoxine T-2 v/v volume/volume ZEN zéaralénone ESI electro-spray Ionisation SRM selected reaction monitoring ccn app concentration apparente CRM certified reference material QC quality control 3.3 Références et normes Directive 96/23/CE du Conseil, du 29 avril 1996, relative aux mesures de contrôle à mettre en œuvre à l'égard de certaines substances et de leurs résidus dans les animaux vivants et leurs produits et abrogeant les directives 85/358/CEE et 86/469/CEE et les décisions 89/187/CEE et 91/664/CEE

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Décision européenne 2002/657/CE, portant sur les modalités d'application de la directive 96/23/CE en ce qui concerne les performances des méthodes d'analyse et d'interprétation des résultats,” Official Journal of the European Union L221/8-36 (17/08/2002) Règlement 2005/856/EC de la commission du 06/06/2005 modifiant le règlement 2001/466/EC en ce qui concerne les toxines du Fusarium, Official Journal of the European Communities L143/3 (07/06/2005) Règlement No 2006/401/CE de la commission portant fixation des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse pour le contrôle officiel des teneurs en mycotoxines des denrées alimentaires ; Official Journal of the European Communities L70/12 (09/03/2006) Règlement No 2006/576/CE de la commission concernant la présence de déoxynivalénol, de zéaralénone, d’ochratoxine A, des toxines T-2 et HT-2 et de fumonisines dans les produits destinés à l’alimentation animale ; Official Journal of the European Communities, L229/7 (23 /08/2006). Règlement CE N°1881/2006 de la CE portant fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denrées alimentaires, Official Journal of the European Communities L364/5 (19/12/2006) Règlement N° 1126/2007 de la commission modifiant le règlement N° 1881/2006 fixant les niveaux maxima pour certains contaminants dans les aliments en ce qui concerne les toxines de Fusarium dans le mais et produits à base de mais. Official Journal of the European Communities, L255/14 (28/09/2007). Procedure ESTIMATING MEASUREMENT UNCERTAINTY IN QUANTITATIVE CHEMICAL ANALYSIS, FASFC (3/11/2008) LAB P508 Measurement Uncertainty-V.01-en Norme ISO-5725 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results An Alternative Method Validation Strategy for the European Decision 2002/657/EC, Joris Van Loco and Hedwig Beernaert, Proceedings of Euro Food Chem XII: Strategies for Safe Food 2003, 1, 91 -94 Norme NEN-7779 Environment – measurement uncertainty, Febr. 2008 Approche globale et harmonisée de la validation, 2006, Max FEINBERG, http://www.paris.inra.fr/var/metarisk/storage/fckeditor/file/2006%20SpectAna%20Feinberg%20Validation.pdf AFNOR. 2010. Standard NF V03-110:2010. Protocole de caractérisation en vue de la validation d’une méthode d’analyse quantitative par construction du profil d’exactitude [Protocol of characterization for the validation of a quantitative method of analysis by construction of an accuracy profile], AFNOR, Paris PRO/5.5/01 : contrôles internes PRO/5.7/01 : archivage PRO/4.3/01 : gestion des fournitures SOP/MAT/MAIN/04 : Sauvegarde des données générées par l’UPLC-MS/MS SOP/MYC/CON/01 : Contrôle par HPLC-PDA des concentrations de toxines dans les solutions de référence 4.Principe La première étape de la préparation des extraits dépend de la nature des échantillons : - Echantillons solides : Les mycotoxines sont extraites d’un sous-échantillon par agitation dans un mélange

d’acétonitrile, d’eau et d’acide acétique (ACN-eau-HAc 80 %-18%-2% v/v). Le rapport (ml solvant extraction par g échantillon) est typiquement de 4 pour une farine de céréales, mais peut être adapté si l’échantillon « boit » plus ou moins de solvant.

- Echantillons de bière : après dégazage un sous-échantillon est dilué (1:3) par un mélange d’acétonitrile et d’acide acétique (ACN-HAc 98%-2% v/v)

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Dans les deux cas le mélange est ensuite centrifugé (et filtré si nécessaire), puis un aliquot (40 μL) du surnageant est mélangé avec une solution (10 μL) d’étalons internes (mêmes molécules mais marquées au carbone 13). Le facteur de dilution final est donc de 5 (mL d’extrait final par g ou mL d’échantillon). Les toxines sont séparées sur une colonne de type C-18 par élution en gradient et leurs adduits H+, Na+ et/ou NH4

+ sont détectés en MS/MS en ESI mode positif. L’ « effet matrice » (influence de la matrice sur la réponse du détecteur MS/MS par « ion suppression » ou « ion enhancement ») est corrigé grâce aux étalons internes (ajoutés aux solutions de références de la même manière qu’aux extraits). Les principales caractéristiques de la méthode HPLC-MS sont : - colonne HSS T3 (C-18), gradient linéaire, A = eau/FA 0.1%/formiate d’ammonium 10 mM, B = MeOH/FA

0.1%/formiate d’ammonium 10 mM, 40°C, adduits H+ (DON, ZEN, aflatoxines et OTA) ou NH4+ (HT-2, T-2)

Contrôles de 1e ligne lors de chaque série d’analyses : - pour les échantillons de sous-matrices déjà validées (reprises dans le document SOP/MYC/ANA/05/DOC07 : résultats des validations sur différentes sous-matrices en annexe 5) : 6 sous-échantillons d’une farine de blé, dont 5 supplémentés à des niveaux de concentration différents. - pour les échantillons de sous-matrices pas encore validées, la même procédure est appliquée à ces échantillons (s’il y a plusieurs échantillons de la même sous-matrice dans la même série, on peut se contenter d’appliquer cette procédure à 2 de ces échantillons). - bières : pour chaque type de bière analysée lors d’une série (blonde, brune, aux fruits, …), 6 sous-échantillons d’une de ces bières, dont 5 supplémentés à des niveaux de concentration différents. La mesure MS/MS à l’aide d’un détecteur ‘triple quadrupôle’ est basée sur le ‘Selected Reaction Monitoring’ (SRM) : le premier quadrupôle sélectionne comme ‘ions précurseurs’ les ions ayant un rapport m/z donné, le second fragmente les ions retenus par le premier, le troisième sélectionne et mesure les ‘ions fragments’ ou ‘ions produits’, ayant un second rapport m/z donné. Pour diminuer encore le risque de ‘faux positif’, deux de ces ‘transitions’ sont mesurées pour chaque analyte (‘Muliple Reaction Monitoring’ ou ‘MRM’) et le ‘rapport ionique’, c.-à-d. le rapport entre les surfaces des pics chromatographiques correspondant à ces deux transitions, est vérifié. La décision 2002/657/CE précise dans quelles limites ce rapport ionique peut s’écarter de celui obtenu, dans les mêmes conditions HPLC-MS/MS, avec une solution de référence de l’analyte recherché. Cette décision précise également le nombre de ‘points d’identification’ nécessaire. Elle attribue 4 points d’identification à la combinaison d’1 ion précurseur et 2 ions produits (1 + 2 x 1.5 = 4), ce qui est suffisant non seulement pour les substances du ‘groupe B’ de la directive 96/23/EC (médicaments vétérinaires et contaminants, dont les mycotoxines : minimum 3 points d’identification) mais aussi pour le ‘groupe A’ (anabolisants et substances interdites : minimum 4 points). Une sélection de fragments caractéristiques a été proposée par la fonction “autotuning” dans le software MassLynx. L’autotune a proposé 3 fragments. Cette proposition a été vérifiée par un tuning manuel, dans laquelle on a examiné le spectre MS2. Pour chaque molécule, le choix des 2 transitions s’est basé sur les principes suivants : - la transition à utiliser pour la quantification (‘quantifier’) était celle qui donnait le fragment détecté avec la plus

grande intensité, sauf si la réaction correspondante était une (1) simple perte d’eau (Δm/z = -18) - la seconde transition (‘qualifier’) a été sélectionnée selon les principes suivants : les fragments des 2 SRM ne

pouvaient pas provenir exclusivement de la même partie de la molécule et le rapport signal-bruit pour chaque fragment devait être ≥ 3.

Les transitions ainsi sélectionnées sont les suivantes : Pour AfB1 : quantifier : 313 (AfB1-H+) → 241 (-72) qualifier : 313 (AfB1-H+) → 213 (-100) Pour AfB1 13C : quantifier : 330 (13C -AfB1-H+) → 301 (-29) Pour AfB2 : quantifier : 315 (AfB2-H+) → 259 (-56) qualifier : 315 (AfB2-H+) → 243 (-72) Pour AfB2 13C : quantifier : 332 (13C -AfB2-H+) → 303 (-29) Pour AfG1 : quantifier : 329 (AfG1-H+) → 243 (-86) qualifier : 329 (AfG1-H+) → 200 (-129)

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Pour AfG1 13C : quantifier : 346 (13C -AfG1-H+) → 257 (-89) Pour AfG2 : quantifier : 331 (AfG2-H+) → 285 (-46) qualifier : 331 (AfG2-H+) → 217 (-114) Pour AfG2 13C : quantifier : 348 (13C -AfG2-H+) → 259 (-89) Pour DON : quantifier : 297 (DON-H+) → 249 (-48, perte de CH2O + H2O) qualifier : 297 (DON-H+) → 203 (-94, perte de CH2O + 2H2O+ CO) Pour DON 13C quantifier : 312 (13C-DON-H+) → 263 (-49, perte de CH2O + H2O) Pour HT-2 : quantifier : 442 ((HT-2)-NH4

+) → 263 (-179) qualifier : 442 ((HT-2)-NH4

+) → 215 (-227) Pour HT-2 13C: quantifier : 464 (13C-HT-2-NH4

+) → 229 (-235) Pour OTA : quantifier : 404 (OTA-H+) → 239 (-165) qualifier : 404 (OTA-H+)→ 358 (-46) Pour OTA 13C : quantifier : 424 (13C-OTA-H+) -→ 250 (-174) Pour T-2 : quantifier : 484 ((T-2)-NH4

+) → 305 (-179) qualifier : 484 ((T-2)-NH4

+) → 215 (-269) Pour T-2 13C: quantifier : 508 (13C-T-2- NH4

+) → 322 (-186) Pour ZEN : quantifier : 319 (ZEN-H+) → 283 (-36, perte de 2H2O) qualifier : 319 (ZEN-H+) → 187 (-132, pertes inconnues) Pour ZEN 13C: quantifier : 337 (13C-ZEN-H+) → 199 (-138)

5.Paramètres de validation Voir dossier de validation 6.Fournitures 6.1. Petit matériel de laboratoire cylindres gradués en verre tubes de centrifugation en polypropylène ou en téflon agitateur rotatif seringues filtres à seringues (p.ex. Millex) compatibles mélange ACN-eau cônes à usage unique pour pipettes automatiques (5mL, 1mL, 200μL, 100μL, 20μL,10μL) fioles ambrées pour HPLC, avec inserts env 200 μL, bouchons et septa agitateur de type « vortex » gants de protection (nitrile) Eppendorf de 2 mL pour centrifugation 6.2. Réactifs spécifiques Pour l’extraction :

Solvants et réactifs commerciaux qualité analytique : eau, ACN, ac. acétique (HAc), MeOH, formiate d’ammonium Solvant d’extraction : ACN 80% - HAc 2% - H2O 18% v/v

Solvants nécessaires pour l’analyse par HPLC-MS/MS : Méthanol pour LC-MS Acide formique pour LC-MS Formiate d’ammonium pour LC-MS Acetonitrile pour LC-MS

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Isopropanol qualité ULC-MS Acétone qualité LC Acide phosphorique qualité LC

Colonne Acquity UPLC HSS T3 1.8 μm-2.1x100mm

Pour la désinfection du matériel contaminé : eau de javel 10% v/v (conservation :1 semaine)

Tous ces réactifs sont conservés à température ambiante (25 +/- 10°C), sauf l’acide formique (frigo, 5°C+/-3°C) et le formiate d’ammonium (surgélateur, <-16°C) Pour la préparation des solutions de référence et des échantillons dopés : - solutions concentrées (typiquement 500 mg/L) des toxines et du diuron - solutions des toxines sous forme 13C 6.3. Matériel de référence Matériaux de référence certifiés, reçus dans le cadre de tests d’aptitude ou achetés Solutions de référence certifiées 7.Equipements HPLC-MS/MS centrifugeuse frigo (5°C+/-3°C) surgélateur (<-16°C) balance pipettes automatiques (1mL, 200μL, 100μL, 20μL, 10μL) purificateur d’eau (milli Q) 8.Instruction 8.1. Préparation des solutions-stocks mono- et multi-toxines a) Toxines sous forme 12C: Pour chaque toxine, une nouvelle solution-stock mono-toxine (typiquement 500 mg/L) doit être préparée si l’ancienne est épuisée. Le schéma détaillé de préparation des solutions multi-toxines est donné dans le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC01: préparation des étalons et des solutions servant à supplémenter des échantillons » (annexe 1). Brièvement :

Une solution-stock multi-toxines « multi1 » contenant 10 mg/L de DON, T2, HT2 et ZEN et 1 mg/L d’AfB1, AfB2, AfG1, AfG2 et OTA est préparée par mélange d’aliquots des solutions stock mono-toxine (dans ACN), puis dilution de ce mélange de manière à obtenir la même composition finale en solvants que pour l’extraction (ACN 80, HAc 2%). A partir de cette « multi 1 », trois autres solutions « multi 2 » à « multi 4 » sont préparées par dilutions successives au 1 :10, 1 :8 et 1 :10 dans le solvant d’extraction (ACN 80%, HAc 2%). Les solutions « multi 1 » et « multi 2 » servent à supplémenter les échantillons de contrôle. Les solutions « multi 3 » et « multi 4 » servent à préparer les solutions de référence pour l’HPLC-MS/MS (de 1 à 100 μg/L DON, T-2, HT-2 et ZEN ; de 0.1 à 10 μg/L OTA et aflatoxines).

Sur instruction du responsable technique, d’autres toxines (p.ex. nivalénol, fumonisines etc) peuvent être ajoutées à la solution « multi 1 » et donc aux solutions de référence et échantillons supplémentés, à condition que les chromatogrammes des solutions de référence et les résultats sur les échantillons supplémentés montrent que ces nouvelles toxines n’interfèrent pas avec les précédentes.

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En particulier, du diuron, un herbicide total stable, facilement mesurable par HPLC-MS et non susceptible d’être présent dans les échantillons, est ajouté aux solutions multi-toxines et donc aux solutions de référence et de dopage. En cas de résultats insatisfaisants pour les mycotoxines dans les sous-échantillons dopés (p.ex. manque de linéarité), le diuron permet de vérifier si les dopages et extractions ont été effectués correctement, auquel cas les résultats insatisfaisants pour les mycotoxines doivent être dus à des problèmes spécifiques à celles-ci, le plus souvent lors de l’étape de quantification par le détecteur MS.

b) Vérification des concentrations des toxines sous forme 12C: Chaque fois qu’une nouvelle solution-stock mono-toxine est introduite, et au minimum une fois par trimestre, les concentrations sont vérifiées par HPLC-PDA (SOP/MYC/CON/01). Si l’écart avec la concentration nominale est significatif (supérieur à +/- 5%), un facteur de correction correspondant doit être est introduit dans les calculs de concentrations. Si l’écart dépasse +/- 25%, la concentration doit être réajustée. c) Toxines sous forme 13C (étalons internes) :

Une solution-stock multi-toxines « multi 13C» est préparée en mélangeant des aliquots des solutions commerciales et en diluant ce mélange de manière à obtenir la même composition finale en solvants que pour l’extraction. Les concentrations varient en fonction des toxines (typiquement : 250 μg/L DON ; 125 μg/L HT2 et T2 et ZEN; 50 μg/L OTA ; 2.5 μg/L AfB1, AfB2, AfG1 et AfG2). Le schéma détaillé de préparation est donné par le même document « SOP/MYC/ANA/05/DOC01» que pour les toxines 12C. La concentration exacte de la solution multi-toxines 13C est peu importante du moment que la même solution est utilisée pour tous les extraits et solutions de référence d’une même série. 8.2. Préparation des échantillons de contrôle et extraction a) Echantillons non liquides :

Les détails de la réalisation de chacune des étapes ci-dessous doivent être notés sur le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC02 : rapport d’extraction des échantillons secs (farines etc.)» (voir annexe 2) - noter les n° des fiches de préparation des solvants et des solutions multi-toxines sur le document: - sous-échantillons non supplémentés : dans des bouteilles de centrifugation en téflon ou en polypropylène, peser 5(+/-0.02) g (sauf instruction contraire du responsable technique) de chaque échantillon à analyser et noter le n° de l’échantillon et le poids pesé - contrôles et sous-échantillons supplémentés : dans des bouteilles de centrifugation en téflon ou en polypropylène, peser 5 x 5(+/-0.02) g (sauf instruction contraire du responsable technique) du matériau de contrôle habituel (« FB », farine de blé) et de chaque échantillon de matrice nouvelle (c.-à-d. pour laquelle la méthode n’a pas encore été validée, cfr doc « SOP/MYC/ANA/05/DOC07 : résultats des validations sur différentes sous-matrices ») et, pour chacun de ces sous-échantillons, noter le poids pesé - supplémenter en toxines ces sous-échantillons de contrôle et de validation, en suivant les instructions reprises sur le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC01 : préparation des étalons et des solutions servant à supplémenter des échantillons » (voir annexe 1) puis laisser reposer environ 1 heure; noter pour chaque sous-échantillon quelle solution « multi » a été utilisée et quel volume a été ajouté - ajouter à chaque sous-échantillon, supplémenté ou non, le solvant d’extraction (4 mL /g en général ; dans les rares cas où l’échantillon absorbe tellement de solvant qu’on n’obtient pas une suspension homogénéisable, doubler ce rapport); noter sur le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC01 » les volumes ajoutés s’ils diffèrent du rapport 4 mL/g habituel. - mélanger pendant environ 1 h à l’aide d’un agitateur rotatif

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- laisser décanter - transférer environ1.8 mL du surnageant dans un eppendorf et centrifuger 10 minutes à 13000 t/min - si nécessaire, filtrer les extraits à l’aide d’un filtre-seringue - de chaque surnageant, transférer 40 μL dans une fiole HPLC à insert contenant déjà 10 μL de la solution 13C et mélanger soigneusement à l’aide du ‘vortex’ (facteur de dilution final = 5 mL/g) - garder les eppendorfs contenant les extraits bruts centrifugés au congélateur (< -16°C) ou, à défaut, au frigo -(5°C ± 3°C) pendant deux semaines pour éventuelle réanalyse. b) Echantillons liquides (bières) : Les détails de la réalisation de chacune des étapes ci-dessous doivent être notés sur le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC08 : rapport de préparation des échantillons de bière » (voir annexe 6) - noter les n° des fiches de préparation des solvants et des solutions multi-toxines sur le document: - dégazer : transférer 200 à 400 mL de l’échantillon dans un berlin en verre, le couvrir d’un parafilm percé d’une

série de petits trous, placer sur un agitateur orbital, ajuster la vitesse pour avoir une agitation vigoureuse tout en évitant que la bière n’atteigne le parafilm, et laisser agiter pour la nuit ou jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de mousse à la surface de la bière

- sous-échantillons non supplémentés : transférer 200 μL dans un eppendorf - sous-échantillons supplémentés : transférer 5 x 200 μL dans des eppendorfs, les supplémenter en toxines en suivant les instructions reprises sur le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC01 : préparation des étalons et des solutions servant à supplémenter des échantillons » (voir annexe 1), laisser reposer environ 10 minutes et noter pour chaque sous-échantillon quelle solution « multi » a été utilisée et quel volume a été ajouté - ajouter à chaque sous-échantillon, supplémenté ou non, 0.6 mL de mélange ACN :HAc 98 :2, vortexer, laisser reposer environ 10 minutes - centrifuger 10 minutes à 13000 t/min, - si nécessaire, filtrer les extraits à l’aide d’un filtre-seringue - de chaque surnageant, transférer 40 μL dans une fiole HPLC à insert contenant déjà 10 μL de la solution 13C et mélanger soigneusement à l’aide du ‘vortex’ (facteur de dilution final = 5 mL d’extrait final par mL de bière) - garder les eppendorfs contenant les extraits bruts centrifugés au congélateur (< -16°C) ou, à défaut, au frigo (5°C ± 3°C) pendant deux semaines pour éventuelle réanalyse. 8.3. Préparation des solutions de référence et des blancs de solvants Le schéma détaillé de préparation des solutions de référence (12C et 13C) et de dopage des sous-échantillons de contrôle est donné dans le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC01: préparation des étalons et des solutions servant à supplémenter des échantillons » (annexe 1). 8.4. Analyse HPLC-MS/MS - si nécessaire, préparer des solvants frais :,

- phase mobile A : eau UPLC ou MilliQ + 0.1% acide formique + 10 mM ammonium formiate - phase mobile B : MeOH UPLC + 0.1% acide formique + 10 mM ammonium formiate - strong needle wash : acetone / MeOH / isopropanol / eau / acide phosphorique (25/25/25/23/2) - weak needle wash : eau UPLC ou MilliQ + 0.1% acide formique

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- seal wash : eau UPLC ou MilliQ / MeOH (90/10) Notes :

ne PAS ajouter de la phase mobile A ou B au cours d’une série d’injections ! purger (‘prime’) après tout changement ou addition de solvant quantités nécessaires par injection :

A : 6 mL ; B : 6 mL ; strong wash : 1.2 mL ; weak wash : 2 mL - noter sur le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC03 rapport d’analyse HPLC-MS/MS et de traitement des résultats » les numéros des fiches de préparation des solvants utilisés - contrôles avant injection de la série : injecter un blanc de solvant (1 ou 2 fois), puis une solution de référence

« niveau 100 » (100 μg/L DON etc, 10 μg/L OTA-aflas) (3 fois), puis à nouveau un blanc de solvant (2 fois) ; intégrer les chromatogrammes, exporter les résultats dans le fichier «LCMS_controls_.xltx» et vérifier à l’aide des graphiques de ce fichier que ses critères sont respectés en ce qui concerne :

les temps de rétention les surfaces des pics (surface / pg) les formes des pics (rapports hauteur/surface) les RSD des rapports (surface pic 12C par pg 12C / surface pic 13C par pg 13C) le ‘carry-over’ (surface des éventuels ‘pics fantômes’ dans les chromatogrammes des blancs de

solvant)

- compléter la section ‘controls before series’ du document SOP/MYC/ANA/05/DOC03

- dans le logiciel HPLC, remplir la liste d’injections (volume : 5 μL) selon le modèle suivant : Blanc de solvant (solvant d’extraction) Etalons, par ordre de concentration croissante Blanc de solvant Contrôles : extraits de farine blanche puis de farines blanches supplémentées, Blanc de solvant Pour chaque échantillon «à valider » : extrait ‘normal’ (5 g non supplémentés) extraits de validation (5 g supplémentés), par ordre croissant de concentration Blanc de solvant Extraits d’échantillons de sous-matrices déjà validées Blanc de solvant Etalons (au minimum les 2 solutions de référence les plus concentrées), par ordre de concentration croissante Blanc de solvant

- compléter cette liste en indiquant dans les colonnes correspondantes :

- pour chaque étalon, les concentrations en 12C et 13C (μg/L) - pour chaque extrait, le facteur de dilution final (mL/g) et la concentration en 13C (μg/L) - pour chaque extrait d’échantillon dopé, indiquer aussi la concentration ajoutée (12C, en μg/L, soit donc la concentration en μg/kg ajoutés divisée par le facteur de dilution)

- exécuter la liste d’injections complète.

8.5. Traitement des résultats L’intégration des chromatogrammes, les corrections pour effet matrice et les calculs des concentrations dans les extraits et dans les échantillons sont réalisés à l’aide du logiciel HPLC. Les résultats sont ensuite transférés dans le template Excel ‘SOPMYCANA05_CALC’, afin de faciliter la visualisation des résultats bruts (surfaces de pics) et calculés, et la compilation (p. ex. pour l’étude de la reproductibilité des contrôles et l’estimation de l’incertitude de mesure pour de nouvelles matrices). Le détail des opérations à réaliser en pratique et des précautions à prendre (p.ex. pour la compatibilité de format des données numériques entre le logiciel HPLC et le template Excel) est décrit dans le document « SOP/MYC/ANA/05/DOC06 : instructions détaillées pour le traitement des résultats » (voir annexe 4).

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8.6. Validation des résultats Le responsable technique prend connaissance des rapports et valide ou non les résultats. Les critères d’acceptation des essais sont détaillés dans le document PRO/5.5/01/DOC02. Pour les sous-matrices qui n’ont pas encore été testées (par des séries d’analyses d’échantillons supplémentés à 5 niveaux) sur au moins 6 échantillons différents, les résultats peuvent être validés uniquement pour les échantillons sur lesquels une telle série d’analyse a été effectivement été réalisée. Après 6 séries, le domaine de validité et l’incertitude de mesure sont estimés pour cette sous-matrice, et les échantillons suivants peuvent être validés sur base des contrôles de première ligne sur la sous-matrice de référence (farine de blé).

9.Mesures spécifiques de sécurité Manipuler les solutions de mycotoxines avec des gants et travailler sous hottes ventilées. Jeter les « disposables » ayant été en contact avec des solutions de mycotoxines, dans les poubelles spéciales prévues à cet effet. Nettoyer à l’eau de javel tout le matériel non-jetable et les surfaces ayant été en contact avec des solutions de mycotoxines. 10.Contrôle interne Comme indiqué au § 8.4, les contrôles avant injection de la série permettent de vérifier :

- que les temps de rétention sont sous contrôle, - que le système est suffisamment sensible en valeur absolue (l’encrassement progressif du système et la

qualité et la fraîcheur des solvants peuvent faire chuter fortement cette sensibilité), - que les pics ont une forme correcte (une détérioration de la colonne LC peut la détériorer) - que la répétabilité des surfaces de pic (après correction par la surface du pic de l’étalon interne 13C

correspondant) est satisfaisante - que le ‘carry-over’ reste dans des limites acceptables

La linéarité de la réponse est ensuite vérifiée grâce aux injections des solutions de référence de concentrations croissantes.

La fiabilité quantitative de la méthode globale, dans un domaine de concentration donné, est vérifiée par les contrôles de première ligne (voir § 5 et 8.6). Les résultats des contrôles positifs sont compilés dans des ‘control chart’ et des ‘accuracy profiles’ qui permettent de vérifier et au besoin corriger l’estimation du ‘recovery’ et de l’incertitude de mesure. Les autres critères d’acceptation des résultats sont détaillés dans le document « PRO/5.5/01/DOC02 : critères d’acceptation des essais ». 11.Rapport interne La réalisation des différentes étapes du travail de préparation et d’extraction est enregistrée dans les fiches de production (PRO/4.3/01/DOC02) et dans les documents « SOP/MYC/ANA/05/DOC02 : rapport d’extraction des échantillons secs (farines etc) » (voir annexe 2) et SOP/MYC/ANA/05/DOC08 : rapport de préparation des échantillons de bière » (voir annexe 6) . Les originaux (version papier) de ces documents sont conservés par leurs auteurs, des versions scannées sont placées sur le serveur du service, et une copie papier est transmise au responsable technique. Les résultats bruts générés par le logiciel HPLC sont sauvegardés selon la SOP/MAT/MAIN/04.

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Les détails de la réalisation de l’analyse HPLC-MS sont notés par l’analyste dans le document « SOP/MYC/ANA05/DOC03 : rapport d’analyse HPLC-MS/MS et de traitement des résultats ». Les concentrations mesurées dans les extraits, telles que calculées par le logiciel HPLC, sont enregistrées dans le rapport d’analyse produit à l’aide du logiciel HPLC (fichier .qld) Ces données sont ensuite importées dans le template Excel ‘SOPMYCANA05_CALC.xltx’ afin de produire des graphiques permettant de visualiser les tendances des résultats, et imprimer (.pdf) un rapport détaillé dans lequel chaque étape des calculs peut facilement être retracée et vérifiée. Les pages reprenant les résultats finaux (μg/kg et rapports ioniques) et les calculs de ‘recovery’ des séries d’échantillons supplémentés sont imprimés sur papier et transmises au responsable technique.

Ces différents fichiers (.doc, .qld, .xls et .pdf) sont placés sur le serveur du service. Le responsable technique ajoute ses éventuelles remarques au document « SOP/MYC/ANA05/DOC03 » et au rapport final papier. 12.Annexes Annexe 1 : SOP/MYC/ANA/05/DOC01/V01 : préparation des étalons et des solutions servant à supplémenter des échantillons Annexe 2 : SOP/MYC/ANA/05/DOC02/V06 : rapport d’extraction des échantillons secs (farines etc) Annexe 3 : SOP/MYC/ANA/05/DOC03/V04 : rapport d’analyse HPLC-MS/MS et de traitement des résultats Annexe 4 : SOP/MYC/ANA/05/DOC06/V01 : instructions détaillées pour le traitement des résultats Annexe 5 : SOP/MYC/ANA/05/DOC07/V01 : résultats des validations sur différentes sous-matrices Annexe 6 : SOP/MYC/ANA/05/DOC08/V01 : rapport de préparation des échantillons de bière

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Annexe 1 :

SOP/MYC/ANA/05/DOC01/V01: Préparation des étalons et des solutions servant à supplémenter des échantillons NUMERO DE VERSION

DATE D’APPLICATION

SIGNATURE RESPONSABLE TECHNIQUE

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Annexe 2 :

SOP/MYC/ANA/05/DOC02/V06 : rapport d'extraction des échantillons secs (farines etc)page 1 / ..

date : remarques :

n° solv. extrn (ACN 80% - HAc 2% - H2O 18%)

n° soln multi-tox C12 DON etc

n° soln multi-tox C12 Enniatins-Beauvericin

n° soln multi-tox C13

échantilllonsdopages : extraction : final :

n° µL s

oln

mul

ti-to

x aj

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s

nive

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tox

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(1 o

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1 h

mL

solv

. ext

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mL/

g)

agite

r env

. 1 h

cent

rif. a

liquo

t ds

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10'

130

00

10 µ

L m

ulti-

C13

da

ns in

sert

+ 40

µL

extra

it

vorte

xer

nature éch. (matrice),remarques

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

initiales analyste :

g pe

sés

(sau

f exc

. : 5

g)

(noter dans les cases correspondantes : poids des éch., détails des dopages, et toute MODIFICATION (p.ex. mL solv. = 40) ; à la fin de chaque étape, parapher en bas de page la case correspondante )

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Annexe 3 :

SOP/MYC/ANA/05/DOC03/V04: Rapport d’analyse HPLC-MS/MS et de traitement des résultats

column/prefilter :Type serial nr / remarks

Column HSS T3

Prefilter UPLC Column In-Line Filter, Waters

Solvents (*) :composition minimum lot nr / remarks

A H2O + 0.1% FA + 10 mM AF 6 mL/injB MeOH + 0.1% FA + 10 mM AF 6 mL/inj

SNW acetone / MeOH / IPA / H2O / PA (25/25/25/23/2)

1.2 mL/inj

WNW H20 + 0.1% FA 2 mL/injSeal wash H2O + 10% MeOH 50 mL

(*) check the validity and volume of solvents - do not add solvents A/B during series - prime after any solvent chang

methods (*) :Inlet method : SOP05_v MS tune file (.ipr) : SOP05_vMS method (.exp) : SOP05_v processing method (.mdb) : SOP05_v(*) check in "MS Tune" window that measured temperatures and gas flows are close to those set in method

controls before series : lot nrok ? remarks

retention timespeak areas (per pg)peak shapes (height/area)RSD (12C / 13C) (peak areas per pg)blancos/carry-over

series name (.spl) :

remarks :

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Annexe 4 : SOP/MYC/ANA/05/DOC06/V01: Instructions détaillées pour le traitement des résultats NUMERO DE VERSION

DATE D’APPLICATION

SIGNATURE RESPONSABLE TECHNIQUE

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Annexe 5 :

SOP/

MYC

/AN

A/0

5/DO

C07/

V01

: ré

sulta

ts d

es v

alid

atio

ns s

ur d

iffér

ente

s so

us-m

atri

ces

p.…

ccn ds blancos

niveau

1niveau

2niveau

3niveau

4niveau

5conclusion

suivi

sous‐matrice

analyte

nbe pts

min

max

ccn ajoutée

recov moyen

RSD

ccn ajoutée

recov moyen

RSD

ccn ajoutée

recov moyen

RSD

ccn ajoutée

recov moyen

RSD

ccn ajoutée

recov moyen

RSD

validée ? (Y/ )

MU, k=2 (%)

MU min, k=2 (µg/kg)

limite de rapportage

date

paraphe

concl revues après

nouvelle(s) série(s) ? (Y/ )

Remarques :

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Annexe 6 : SOP/MYC/ANA/05/DOC08/V01 : rapport de préparation des échantillons de bière

page 1 / ..

date : remarques :

n° solv. extrn (ACN 98% - HAc 2%)

n° soln multi-tox C12 DON etc

n° soln multi-tox C12 Enniatins-Beauvericin

n° soln multi-tox C13

échantilllonsdopages : extraction : final :

n° déga

zage

mL

bièr

e (s

auf e

xc. :

0.2

)

µL s

oln

mul

ti-to

x aj

outé

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nive

au m

utli-

tox

ajou

tée

(1 o

u 2)

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mL

solv

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8% A

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2%

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L)

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10 µ

L m

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C13

da

ns in

sert

+ 40

µL

extra

it

vorte

xer

nature éch. (matrice),remarques

1

2

3

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5

6

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initiales analyste :

(noter dans les cases correspondantes : détails des dopages et toute MODIFICATION ; à la fin de chaque étape, parapher en bas de page la case correspondante )

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