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Concours B ENSA B - 0107B

BIOLOGIE Durée : 4 heures

L’usage de la calculatrice, d’abaques et de tables est interdit pour cette épreuve.

Si, au cours de l’épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d’énoncé, il le signale sur sa copie et poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives qu’ il a été amené à prendre.

L’épreuve comprend deux parties indépendantes comptant chacune pour la moitié de la note.

Première par tie : question de synthèse L’absorption des ions minéraux par les plantes : de la solution du sol au xylème. N.B. Il est rappelé aux candidats que la notation prendra en compte non seulement la clarté, la précision et la concision de l’exposé, mais également la qualité de l’expression, de l’ illustration et de la présentation.

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Deuxième partie : étude de documents

d’après Alboresi et al., Plant, Cell and Environment (2005) 28 : 500-512 L’ion nitrate est une source d’azote importante pour les plantes. Il est assimilé par réduction grâce à la nitrate réductase (NR) et d’autres enzymes conduisant en fin de compte à la production d’acides aminés et de composés azotés. Outre son rôle de nutriment, l’ion nitrate a un rôle de molécule signal qui, indépendamment de son assimilation, contrôle de nombreux aspects du développement et du métabolisme des plantes. Le but des expériences qui suivent est de mieux comprendre la relation existant entre l’ion nitrate et la dormance des graines chez l’arabette des dames (Arabidospsis thaliana).

Arabidospsis thaliana est un organisme modèle pour la plupart des études en biologie et génétique végétales (Figure 1). Les raisons de ce choix sont nombreuses. C’est une plante de petite taille (30-40 cm), au cycle développement court (5-6 semaines en conditions optimales), prolifique (plusieurs dizaines de milliers de graines par individu) et dont le petit génome a été totalement séquencé en 2000 (n = 5, environ 150 millions de paires de bases).

1 – Définir le terme de dormance et présenter les conditions environnementales conduisant à l’entrée et à la levée de dormance.

Nitrate, développement & germination

2 – Chez Arabidopsis thaliana deux gènes, nia1 et nia2, codent pour la nitrate réductase (NR) et contribuent de manière différentielle à l’activité NR totale de la tige feuillée. Pour étudier l’effet de l’alimentation en nitrate sur le développement, trois génotypes distincts sont cultivés et arrosés avec une solution nutritive contenant différentes concentrations de nitrate sous un régime de jour long, c’est à dire 16h lumière / 8h obscurité (Figure 2).

Les trois génotypes d’Arabidopsis thaliana étudiés sont : - un génotype sauvage (WT), - un génotype simple mutant (SM), muté dans le gène nia2, qui ne conserve que 30% de l’activité NR du sauvage, - un génotype double mutant (DM), muté dans les gènes nia1 et nia2, qui ne conserve que 10% de l’activité NR du sauvage, mais qui reste capable d’accumuler l’ion nitrate.

Quelle réaction catalyse la nitrate réductase ? Comparez le développement des différents plants étudiés, ainsi que leurs teneurs en nitrate. Expliquez en quoi l’analyse du comportement du mutant DM permet d’étudier le rôle de molécule signal de l’ion nitrate.

3 – L’effet de l’alimentation en nitrate des plantes mères sur la dormance des graines produites est étudié ensuite. Pour cela, la germination de graines WT, SM et DM, obtenues 3 semaines après pollinisation, est testée en suivant l’émergence de la radicule 7 jours après semis (Figure 3). Des expériences complémentaires permettent de montrer que la viabilité des graines utilisées lors de ces expériences est comparable, quel que soit le génotype dont elles sont issues.

Comparez les dormances des graines WT, SM & DM. Discutez la différence de dormance observée entre les graines DM produites sous 3 et 10 mM de nitrate. Formulez des hypothèses qui permettraient d’expliquer les différences de dormance observées.

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4 – Pour préciser ces résultats, des plantes mères WT sont cultivées pendant leur développement végétatif en présence de 10 mM de nitrate, puis en présence de 10 mM, 25 mM ou 50 mM de nitrate durant la phase de formation des siliques (Figure 4).

Commentez ces résultats. Que confirment-ils et que permettent-ils de préciser ?

5 – Le développement de l’embryon et la structure de la paroi de graines issues de plants WT et DM sont ensuite analysés par microscopie interférentielle et par microscopie à fond clair après coloration (Figure 5). Par ailleurs, une coloration aux sels de tétrazolium révèle une perméabilité comparable des téguments de ces graines. Enfin, la longueur, la largeur et le poids des graines issues de ces deux génotypes ne présentent pas de différence significative.

Faites un schéma légendé des observations microscopiques indiquées par * Ces résultats permettent-ils de préciser vos hypothèses précédentes ?

Nitrate, transport & accumulation

6 – Comme l’alimentation en nitrate des plantes mères affecte la dormance des graines, la teneur en divers métabolites des graines WT, SM et DM est analysée afin d’étudier le devenir du nitrate dans les graines selon le génotype de la plante mère (Figure 6).

Analysez ces résultats. Que suggèrent-ils à la lumière des résultats obtenus jusqu’à présent ? Quelles expériences complémentaires proposeriez-vous pour confirmer ces résultats ?

7 – Pour préciser ces résultats, l’influence de la composition du milieu de germination est étudiée en suivant la germination de graines WT issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM de nitrate (Figure 7a). Une analyse plus détaillée de l’effet du nitrate est réalisée ensuite en semant des graines WT, SM et DM, issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM de nitrate, sur des milieux de germination contenant différentes concentrations de nitrate (Figure 7b).

Commentez ces résultats. Quelles informations apportent les expériences conduites en présence de H2O, Gln et KCl ? Discutez l’effet du nitrate sur la germination des graines issues des différents génotypes.

8 – Chez A. thaliana le transport de nitrate au niveau des racines est assuré par un transporteur codé par le gène nrt, dont l’expression est induite par le nitrate. Dans un premier temps, la germination de graines WT est comparée à celle de graines produites par des plants NRT-M, mutés dans le gène nrt, qui présentent un transporteur à activité réduite (Figure 8).

Quelles informations apportent ces expériences ?

9 – Dans un deuxième temps, l’expression du gène nrt est suivie au cours du développement de la graine sur des plantes transgéniques (Figure 9a). Ces plantes transgéniques sont porteuses du gène rapporteur gus, codant pour la

�-glucuronidase (GUS), cloné en phase avec la partie codante du gène

nrt. Une telle construction permet l’expression de la protéine de fusion GUS-NRT sous la dépendance du promoteur du gène nrt. Le gène gus est appelé gène rapporteur, parce que la

�-glucuronidase

hydrolyse un substrat chromogène artificiel pour libérer un composé bleu-nuit qui colore tous les tissus végétaux où la

�-glucuronidase est exprimée, tout en permettant d’évaluer le niveau d’expression de

cette enzyme (Figure 9b).

Représentez schématiquement la construction issue du clonage. Expliquez en quoi ces expériences permettent de suivre l’expression du transporteur de nitrate. Où est exprimé le transporteur NRT ? Commentez ces résultats. Qu’en déduisez-vous ?

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Nitrate, dormance & signalisation

L’acide abscissique (ABA) et les gibbérellines (GA) jouent un rôle important dans le contrôle de la dormance et de la germination des graines. Les expériences qui suivent cherchent à préciser s’il existe un lien entre l’alimentation en nitrate des plantes mères et les voies de signalisation ABA et GA.

10 – Des tests de germination sont réalisés avec des graines immatures isolées au cours de leur développement sur des plantes mères cultivées en présence de 10 mM de nitrate (Figure 10). Il a été démontré que, chez A. thaliana, le développement des graines s’étale du 8ème au 21ème jour après pollinisation (JAP).

Analysez ces résultats. Qu’en concluez-vous quant à l’effet du nitrate sur la dormance ?

11 – Des tests additionnels de germination sont ensuite réalisés sur des graines dont la dormance a été levée par stratification en présence de différentes concentrations en ABA ou en présence de paclobutrazol (PBZ), un inhibiteur de la synthèse de GA (Figure 11).

En quoi consiste la stratification ? Rappelez les rôles de ABA et de GA dans les phénomènes de dormance et de germination. Comparez les effets de ABA et de GA sur la germination des graines WT et DM. Proposez des hypothèses permettant d’expliquer les résultats obtenus pour GA.

Conclusion - Résumer les principaux résultats de cette étude en un paragraphe récapitulatif.

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A B

C

A B

C

Figure 1 - Arabidopsis thaliana est une petite herbacée annuelle de la famille des Brassicaceae ( � , 2S+2S, 4P, 2E+4E, (2C) avec silique et graine exalbuminée (A : plante entière, B : fleur, C : silique).

3 mM NO3- 10 mM NO3

-

WT

SM

DM

(a) (b)

acti

vité

NR

(mm

olN

O2.

min

-1.m

g-1

)te

neu

r en

NO

3-

(nm

ol.m

g-1

)

WT SM DM0

100

200

300

0

5

10

15

20

3 mM NO3- 10 mM NO3

-

WT

SM

DM

3 mM NO3- 10 mM NO3

-

WT

SM

DM

(a) (b)

acti

vité

NR

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O2.

min

-1.m

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)te

neu

r en

NO

3-

(nm

ol.m

g-1

)

WT SM DM0

100

200

300

0

5

10

15

20

acti

vité

NR

(mm

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O2.

min

-1.m

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)te

neu

r en

NO

3-

(nm

ol.m

g-1

)

WT SM DM0

100

200

300

0

5

10

15

20

WT SM DM0

100

200

300

0

5

10

15

20

Figure 2 – (a) Analyse de plants WT, SM et DM, cultivés en présence de 3 mM ou de 10 mM NO3

-, 30 jours après le semis. (b) Activité NR et teneur en nitrate (au 30ème jour après semis) de feuilles de plants WT, SM et DM cultivés pendant 30 jours en présence de 3 mM (barres blanches) ou de 10 mM (barres noires) NO3

-.

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WT SM DM0

20

40

60

80

100

Ger

min

atio

n (

%)

WT SM DM0

20

40

60

80

100

Ger

min

atio

n (

%)

Figure 3 – Germination de graines WT, SM et DM issues de plantes mères cultivées en présence de 3 mM (barres blanches) ou de 10 mM (barres noires) NO3

-.

0 1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

Ger

min

atio

n (

%)

JAS0 1 2 3 4 5 6 7

0

20

40

60

80

100

Ger

min

atio

n (

%)

JAS Figure 4 – Courbes de germination de graines WT fraîchement récoltées produites par des plantes mères cultivées après la montée à fleur en présence de 10 ( � ), 25 ( � ) ou 50 mM (

�) NO3

-. La germination des graines est quantifiée à différents jours après semis (JAS).

6JAP 8JAP

WT

DM

(a) (b)

* * *

6JAP 8JAP

WT

DM

(a) (b)

* * *

Figure 5 – (a) Graines WT et DM observées en microscopie interférentielle aux 6ème et 8ème jours après pollinisation (JAP). (b) Sections de graines WT et DM matures observées en microscopie à fond clair après coloration au bleu de toluidine. Les graines WT et DM sont issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM NO3

-. Echelle = 100 � m.

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sac

(nm

ol.g

rain

e-1 )

aa(n

mo

l.gra

ine-

1 )N

O3-

(nm

ol.g

rain

e-1 )

0

0,5

1,0

1,5

2,0

0

0,5

1,0

1,5

0,3

0,2

0,1

0WT SM DM

sac

(nm

ol.g

rain

e-1 )

aa(n

mo

l.gra

ine-

1 )N

O3-

(nm

ol.g

rain

e-1 )

0

0,5

1,0

1,5

2,0

0

0,5

1,0

1,5

0,3

0,2

0,1

0WT SM DM

0

0,5

1,0

1,5

2,0

0

0,5

1,0

1,5

0,3

0,2

0,1

0WT SM DM

Figure 6 – Teneur en saccharose, en acides aminés totaux et en nitrate de graines issues de plantes mères de génotypes WT, SM et DM cultivées en présence de 10 mM (barres noires) ou de génotype DM cultivées en présence de 3 mM (barres blanches) NO3

-.

(a) (b)

H2O Gln KCl KNO3 WT SM DM0

20

40

100

80

60H2O

0,1 mM KNO3

1 mM KNO3

10 mM KNO3

Ger

min

atio

n (

%)

(a) (b)

H2O Gln KCl KNO3 WT SM DM0

20

40

100

80

60H2O

0,1 mM KNO3

1 mM KNO3

10 mM KNO3

Ger

min

atio

n (

%)

Figure 7 – (a) Germination de graines WT, issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM NO3-,

quantifiée 8 jours après semis sur agarose contenant 5 mM Gln, 10 mM KCl ou 10 mM KNO3. (b) Germination de graines WT, SM et DM, issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM NO3

-, quantifiée 8 jours après semis sur agarose contenant différentes concentrations en nitrate (0-10 mM).

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0 0,1 1 100

100

80

60

40

20

KNO3 (mM)

Ger

min

atio

n (

%)

0 0,1 1 100

100

80

60

40

20

KNO3 (mM)

Ger

min

atio

n (

%)

Figure 8 – Germination de graines WT ( � ) et NRT-M ( � ), issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM NO3

-, quantifiée 8 jours après semis sur agarose contenant différentes concentrations en nitrate (0-10 mM).

3 6 9 12 15 18 GS I

JAP

0

4

3

2

1

Act

ivit

é G

US

(nm

ol.m

in-1

.mg

-1)

(a)

(b)

3 6 9 12 15 18 GS I

JAP

0

4

3

2

1

Act

ivit

é G

US

(nm

ol.m

in-1

.mg

-1)

(a)

(b)

Figure 9 – (a) Coloration GUS de siliques (gauche ; échelle supérieure = 1 mm ; échelle inférieure = 100 � m) et d’embryons matures après 48h (droite ; échelle = 1 mm) d’imbibition sur agarose. (b) Activité GUS mesurée dans des siliques à différents stades de développement (3-18 jours après pollinisation – JAP), dans des graines matures sèches (GS) et dans des graines matures imbibées 24h sur agarose (I). Chaque mesure est réalisée de façon indépendante sur des graines issues de 4 plantes différentes.

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7 2219161310

JAP

100

80

60

40

20

0

Ger

min

atio

n (

%)

7 2219161310

JAP

100

80

60

40

20

0

Ger

min

atio

n (

%)

Figure 10 – Germination de graines immatures WT ( � ) et DM ( � ) issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM NO3

-. Les graines, isolées à partir des siliques à différents jours après pollinisation (JAP), sont semées sur agarose. La germination est quantifiée au 13ème jour après semis.

(a) (b)

0 0,1 1 10 100 0 1 10 100

100

80

60

40

20

0

ABA ( � M) PBZ ( � M)

Ger

min

atio

n (

%)

(a) (b)

0 0,1 1 10 100 0 1 10 100

100

80

60

40

20

0

ABA ( � M) PBZ ( � M)

Ger

min

atio

n (

%)

Figure 11 – Sensibilité à ABA (a) et à PBZ (b) de graines WT ( � , � ) et DM ( � ). Les graines WT sont obtenues à partir de plantes mères cultivées en présence de 10 ( � ) ou de 50 mM ( � ) NO3

-. Les graines DM sont issues de plantes mères cultivées en présence de 10 mM NO3

-. Les graines âgées de 2 mois sont semées sur agarose en présence de différentes concentrations en ABA ou en PBZ, puis sont stratifiées. La germination est quantifiée 7 jours après transfert en chambre climatisée à 25°C sous un régime de jour long.