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THE5E

présentée à

L"UER DES SCENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE DE L"UN1VERS1TE LOU1SPASTEUR DE STRASBOURG

pour obtenir

LE GRADE DE DOCTEUR ES SCIENCES

PAR

JEAN-PAUL GEIGER

MAITRE DE RECHERCHES DE L"ORSTOM

ASPECTS PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DES INTERACTIONSHOTE-PARASITE DANS LE CAS 0" HEVEA BRAS/l/ENS/S ET DEDEUX PARASITES RACINAIRES: R/6100PORUS ll6HOSlIS ET

PHElllNUS NOXIUS.

Soutenue le 20 décembre 1985 devant la Commission d·Examen:

M. J.H.M. J.M. B.M. L.M. B.M. A.

WEILCHEVAUGEONFRITIGHIRTHMONTIESRAVISE

Président

Examinateurs

C~t(r21IINIVERSIT~ lOUIS PASTEUR

STRASBOURG 1

l

Edition FEVRIER 1985

LISTE DES PROFESSEURS. MAITRES DE CONFËRENCES

DIRECTEURS ET MAITRES DE RECHERCHE C.N.R.S. ET I.N.S.E.R.M.

Président Professeur H.DURANTON

Vice·Présidents Professeur M.ROOS

Professeur C.CONRAUXM.de Rech. A.CORET

Présidents Honoraires Professeur G.OURISSONProfesseur P.KAR LIProfesseur F.MARCOUX

Secrétaire Général Monsieur G.KIEHl

U.E.R. DES SCIENCES MeDICALES

U.f.R. des Sciences Médicales

U.E.R. des Sciences Biomédicales

Oov~n. hononinn: J.CALLOI . J.CLAVERT. F ISCH M.OORNER

DirecteurDirecteur

Jean·Marie MANTZJean SCHWARTZ

P'oless~unhonol1lÎrM: A BASSET· P.BEVER. p. BUCK - J.CALLOT. J.CLAVERT. E.FORSTER· G.GREINER - ....JUNG T.KAMMERER P MA"'OEL ~ METZGER.A .. ,;HME'R· ~.ROHMER . E SCHNEEGANS· J SEROR F.STEPHAN. J.VEORINE A.V('EGTLlN· J.WAFHER G WINC~.LER.

r"Jfe-neun:... ~ DLOFF Chi""~I' QIt.....I.N APQOSIO A",-IOI"1" P' O'oanoort~'f'CARON HiItOI('lQI'L A..c;.'~t.4 Rhum4Inl''OltI

A~.e. rZENSC"'lAGER An"'nrrlll" p.J1"nIOQ'Qul"

M.eIE~TZ eot":U~II"I""Oi,.!tprN...."")~P BLOC" Aod''''''9''R aIJ'lCH Ph.r.-, .... '''0\1'8A q '" :'<.E L H60.11Io'''''Q'e. Gl1tro-enfi r olMreC· ~QLLACk U'o'C'Ç"A BRINI ()cI1ul"""'DQie• eCI.QNNE R CI.n,":NtI ophtslmolno'OJPF 9r.1':Ht-lEIT Neu'Nh"uf"Qi.C B'JRlJrtAPO Clin .. , ç:l'oph't"hJlie de h tul)1!fculP CHA,..eON eHX"'UW.

J C"'~8RON Phy,·Cl\JII' b1o't"'OlQueU Cl..fA~PY Sro,...,atnlC"gl'A C"'~U"'ONT M6d L~al••• "-lkl.Soc....'" COLLARO Clintqu, rwutnlogiaueC CONflAUX 0.0 R''''', L.'Vnpolog'.P Oi: LLE N9ACH G..,.nl!ocol "ObuAtnau.lo4 [lOPfIE fi Chn Médical. BR.eBTINGER P1vchÎarriil! infantile",. F ..aRE HIScC"logl4"L FINCKE R Clin m$d.cal. B Card.ologlaR GA"JOAR Clin. gyné<ol.., oM.é"ic,',P.G"'UTHIER·L.. FAVE An...né.;ologi.J p.GERHARO Opt,,,'mologi.J.GqENIE A Cn;n.o.gi.Ilt""a"E.GflOSSHMIS Chn.de"'lA.ol .• ,Syph,hg.""n'QU'P HA BE RE V Pny,lol09"

J.HERIINL HOLLENOERJ.L.IMBSM'MLERFISC"L.'SR"'ELO.JAECKH.JAHNM.JE5f. lJ.JUIFP KAnLiBKELL~"F.KEMPF1 KEM?FTT KIENR KIENYA.kIA"IJ.G.KORITI<EM KREMERO.KUR TZG.LANGV.LE GALJ.M.LEVVJ.M MANTZF.MARCOUXJ.MAPESCAUXCn.MARXS.MAVERJ.MEHLG.METHLIN

M~ el ChH.ltxoèrim.er .:::ompar.tot"Ch"utyle drgesr1ve et llfnéralePhe'rT'lfl("olog,P'MktPl"lrl~ in'''tn.RHrlurll'lon f()nc,ionM'lI~

Pllo'C~I2'rrre d'Adul,e,Ch·n.."gl. ~n~'all!

PIl6('l"t")J""'9tPRHd",'c.ltol'l fonctionnelleP'cSut"" et Pu4ricultureN'tu.('tnl,..,.uo1ogIIJC1îl'l OVn#lcoi 't obu6'rtceleA Plorl.("Ir\Qle

O'th~l,! el T,aumatologleP.raSII,:,It'qu·PD'hol. ~t Clin Sll'ruol. chfrVII'C"lor.!l'AnJ'llom'e nnrMe!ttPars,'!ol. et D.Hhologle tropical!N"utolog.p011"00. et treumetolooieAnllrnl'Tlll~ pelhoJogiqu!P&dta,,,!. G~nl!o\lque médic81~

Réanlmelion rNkjiceleM4d,crnl) du JrsveilHlt:olog'ePhYIlologleHtmurologieMédeCine du travailPhY\IQ~e biologique·

BMP2R MINCI<;G MORANDF.OBERLINGJ.C (,TTE NIE .·"L1PPER nFo'IAL'OP REVll LEP REYSJ Hq TERE l'lJfC,F.LJ.V RUet', RUMPLE A".SACRE ZPSAllVAGEGSAVAG SCflA~ FE.SC~VINGT

J SCHWARTZ.. S'BILL YH.SICKL.SINr.ERo STORC\<J.O.TEMPEG.VINCENOONA.WACKENHEIMJ P WAL TEAP.WAFlTERJ.P.WEILLO.WILLAROJ P WITZ

ç:lt-vs1'J1ogilt BPOIIOUé-eBectérrol Virol Immunol.9'\nChl'urgie th",&CIQueiVill,,,rlj., du M"Ç1

AMt"'Jlhé,iolcp,,,A"acomi" pach''llogiQueGVMco1ogil! "1 ot:"sté'tiaueEndocrin.,1 ~tabo\ ,t Nut",\Chir,g4n. Hôp.L.PMre,,;r. ColrnllrGynkol et Obt tfltrlQUePr'leumolOQI~ ph t1tlologleB,·,I'09i.. m&-dlcaleEmbryol. rt Morohol 9"n4r.'~

Carti1oloçu.Ct'lIrurgre in'antlleCt,.,urgi. 9'i~releP~V'iolt)Qle

CI'n chlt,orthop el tr9um.l.d'8(1u'ratPhfll'macol." ~~cine e'll'périmtnta1eChniQU!' chll'\lrgrce1e AAt)a10mnt l!1 orgenoot~CllnlO\Je P1ychialr1QUe d'AduhetCtr"IQue médi,;a1e AFUenimarion rnkficeleBloc"imieRodiologi.Rod,ologi.RadIologieG.1S11 (,HIn ,trol.el hVdrol. thtraD'tuuq.JeP~(haHil!, Génth,que Méd'C6leChi,urgie thoraciaue

Prole.."urs conventionMI: G LECLERC (Cnim. o.g 1· A.PETROVIC IPny,;olaç:i>l

~I\"" d~ Conlér~nce. Agré~. :5 eAB l N OrthoP4<ll4" et TrflumatolOQieP BAREISS MédeClnr Inl!lrneP BOURJA T Redl('livgl~

C.BqECHENMACHER c..'d,olng,.J.M.BROGAPD Méodecln~ interneC BURSZTEJN PI!<lC'-Plycni."i.J CINQUALBAE Uroloq••A.CONS 1ANTINESCO pn'·"Q". Il,010lliQ'''J P.OUPEVRON AneSlnél·cloq;.e EI5ENMANN Ch'rurg'f' reroîl)-vasculairf'J FL4.MENT Opn ••h·,oloqi.J GEISERT Pkl,."i•• G~né';QU' mkjic."P GERLINGER Emb,,<olog,.G HJl..r.JPTMANN Immuno1ovie (opr biollE I..H= j ("1 Ol"rr'1p·· .,. " n'''''C....

A.JAEGERP.KEHRR.KEILINGJ.KEMPFG KLOTZF.KUN 1 ZMANNJ.M.LANGO.MAITROTJ.L.MANOELC.MAAESCAUXJ.MA AESeAUXJ MARKJ.MESSE il

IC.ME'I'€q1-: M"l'Il"'L

R~C1nimalio~~ic"fe

Orthopédie el traumatologieCBnd,olog,!Biochimie010 'n'.'o-l ....yn;o}og:QueMlkiec,"~ interneMaladies du sanoNcure-chit"Jrg ' !Biochlml~

N!'Ufolo'iileChirurgl! !r.'n~r.lle

BÎochlmu"Pèdlarrie. gén+liQue ~dlcale

Chi'I"U~g'~ g+\nti'üle901elér ' n1egle

1J.M MOSSAROG.OsE ArMPA1R1SG PAULIroi PINGETM.AOOSJ.P.SCHIEBERG.SCHLAëOE RJ L SCHLIE NGE FIC.STOLLJ.TONGIOJ.M.WARTERAWILK

Cll1d1ologie el maladie, vMCulairœVirologiePlVchiatrie d adultesP·ll!!umol09l~ohtilîol':'l4'JieEndOCtlnologie et rnaledi", rno!labo:J:Hitlologir.Pt'iysiologieGV"écol09U~ el obit~triQue

M~~Clne internePl!orlie,tie. GénârlQue ~ojiC'al.,

RatiloJog'eN.urol'l9ieS'Omolologie

II

Mail... de Con"l'Incet Auoci': J.H.JAEGER 10nh~j.l.

Mal'trft de Con"...ncn Conwnlionn4a: A.MALAN CPhy.iolOllIl ,...p'1101r1' • J.J. VOGT IThermopl!y.ioIOlli.1

Dirwc:tlun de RKherche: M..J"'COs· IB,och,mi.' .....PETROVIC· (Phy"ologi.l.

Meil,... cM rwcherche :

A.M.AUBERTIN' Vi,olOlli.D.AUNIS' Neu'ochiml.J.P.CAZENAVE' Hlrnool_~e8El • Nl'Urochimi.J.M.fGLy • B'O/OllI. molklulli,..L.FREVSZ· Neu'ochlmieM.GAUTHERIE • Tna'molagi. blo....dIClI.G GOMBOS • Neu,odlim.., I.H.S.E.R.M. • C.N.R.s.

K.HAFFENoSTENGER •G.LECLERC'G.RESEL •R.RECHENMANN'L SARLIEVE'M.SENSENBRENNER'J.STEVENIN·

Endoc,'noIogi.Chimie orglnlQu.NeurOChimieBlophv•. do...Von.......n..NWlochlmitNeurochimi.8io1ogl. malk.11 callul.i,.

C.5TOCK·DAMGE· "hy.lolOllieJ.VELLY. ,.hormeeolagi.M.VE RGNES' Neu,ophv.1ologi.N.VIRMAUX·COL/N • Neu,och,mieJ.J.VOGT· The,mophYllologi.A.WA.KSMAN • Neu,ochimi.

U,E.R. 0' ODONTOLOGIE

Directeur Robert FRANK

ProfeSieun :

M.DOCOR FRANk

,. I(LEW...NSK y

Odontologi. conN""''''', ."dodon.teSd.nce, blOIOrgtQUft IBlochimlrl.lmmunoJOQ••• Hillo'OQi•• Emb'Y~OQi•• G'~Uqu••An..oml' PllhnlogIQll'. BKlt,,(J'''Qle. Ph.rmlCQlogl'"Pl'odnnlol~,. I

J·LITZLER

J.L.LACOSTE

PrOlhftt' 'pra In conIOlnl•• Idj,;,.ftl'~r1i.ll•. prOI" compth•• p,of"'hem.a,lIo-t.c'".Qnhopkil. Ôlnro-'KI.I.

Pro'....un de p,emier grade:

C.AL LE MAN'" Odoonlo'Oll'. con..",...ndodon". R.H ......G101 BAS' l'''N P'o....... CprolhtM con,Olnl,. >rii.

,,"'''"11•. pr<"hl'" compll,.. M.L ANGE Rpto.My m.alllo-fec••I.

C.,SOLENDE R O..Mll4d•• denlo foclol.A.COMTE Odoon,olOQI' con••",...ndodon". M.LEIZE

Ch..u,g•• bucc.i•. Pllhol.•, Ihl,-eo.. ".NICOLASAnelth'1Iologi. " ,bnim'IionP,o'hl'" tp,olhhl conjoln,•. adj. J..J.ROTHp.ro ••U•• p,olh6.. compl".. A.SCHLIENGERprolh.w m•• iIIo-bci.l.

.Idem.Jo5OMMERMATER

ChilU'VI, bucc~I•• poelho!... In.tnp••Al\ftIn.tI'olOQI' It ,'..nimlhonP.,odonlologl'"D,MM, Ipraln'" conjOint'. IÛjOln••p.ni.lI•• prolht.. campl.I•• prOU"l.u"".iIlOotc••I.P'dodontl'

Prol_un de deuxiime grade:

P.CAHEN P'....n'ion. 'pidlmioIOQi•• Iconomi. d. I~ S.nll.Odoon'olOllI. lluel.

J ".CI1ARLIER Onhopfdi. clenlo-llCill.

Uall,.. de rwd>wche '.No5.E.R.M.: A.BELCOURT 1000nlolOlli.1

IB.KAESS

H.TENENBAUM

Chirurgi. buccal•• po.hol .•, lhO,.p.•Annt'tWliologi•• r r'.nirt'4cion'llodonlolOQ.,

U.E.R. DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES

Directeur Alexis GAIRARD

Phlrmacl. ,,""niqu.Biochimi.PI,...hofOlli.VlloIOllI.Biochimie pnenn-..riquePh~rmeci.goltniqueP"'rmecodynami.Bectt,iolOll"Chlmi. orvanique

C.MATHISP.METAISS.PESSONP.POINDRONA.STAHLA.STAMMJ.C.STOCLETD.VIOONC.G.WERMUTH

Phermec:ie chimiquePh.,macil chimiqueM~lhêmalique'

PherrnacolOlli.Chimil Ql!nt'.I. el miM,.leChimie .n.lytiqu.Phy.iqu.ToxicolOIIi.ImmunolOlli.

LJUNGJ.C.KOFFELH.LAMIY.LANDRYC.LAPPP.LAUGELG.LAUSTRIATA.LUGNIERJ.MALGRAS

''''rlNcOllnoeieBiolo;i. Clllu'"i,..BOllniqu.Toxicologi.BioctimÏ41Ph.rm.ocodynamiePhy.iolOllilPhysique .1 bioplly.ÎqueChimi. organiqueChimie Inllytique

Doyena honorai,es: P.OUOUENOIS· M.HASSELMANN· G.OIRHEIMER. P.METAIS.

Pro'asseun honorai"",: P.CORDfER. J.P.EBEL· G.GAZET du CHATELIER· M.HASSELMANN· P.JAEGER· Jo5CHREIBER

Pro'eueun :

R.ANTONJ.J.BEFORTR.CARBIENERG.DIRHEIMERG.FER"RDJ.L.FRESLONA.GA/RARDD.GERARDM.GOELDNERC.HASSELMANN

Prof_r 6m4tiu: J.scHREISER.IChimie or~niquel.

Owv6d1caun: M.KRISTENSEN IHygil", nutrllion Il d...t.lqu.l.

Prof_r auoc~: R.MILLER IPh.rm8Codyn.-nlel.

Prof_, convention",: R.I1EINTZ CPhlll11\lCOCint.ic;uol • B.ROTHoSCHECHTER IPharmacodynlmi.l.

"'"'lUe ch recherche: I.No5.E.R.M.: J.BIETH IEn....moI011iel.

U.E.R. DES SCIENCES HUMAINES

U.E.R. de GéographieU.E.R. des Scie~ces du Comportement et de "Environnement

Directeur Henri VOGTDirecteur Philippe ROPARTZ

G'oQrephie$cienCIIS do "6duca.ionGIoQ"'IlhieGok.;'-eohil

Pro'-n hononl"..: E.JUILLARD· R.RAYNAL.

Prof_n:J.M.AVENARDL.LEGRAtIDP.LIMOUZIN".MICHEL

1

A.MOLESH.NONNH.REYMONO

Psychologil lOCi.leGtOll'>j>hi.G"'q' .phi.

1

A.TABOJRET·IŒUER P....choIOllI.M.TARDY Prycho-ptd'9'lllllJ.TRICART ~eo/1l. . .H.VOGT G40Q'eo/1ie phytiQU.

MII'\ de ConUr_ Conwntlonoh: JJ'.BAUER IP.... cho-pI<.Il\lOUi.l.

Oi''"01 ' de U4.·h.r~".: C N.R.S : S RIMBERl IGI"II"1'h Il1.

A~~".,. 0. r.<.hercM C.N.R.S.. J ~ ,",ARTIN IGlogr.p/".I.

III

U.E.R. DES SCIENCES ËCONOMIQUES

Directeur Michel DEVOLUY (Chargé de l'intériml

Doyen. honorairM; P.CHAMLEY· J.P.FITOUSSI R.DOS SANTOS FERREIRA. J.L.GAFFARO.

Profeueuri honoraire.: A CHABERT· P.CHAMLEY.

Profeueuri ;P.ARTZtIERF.BILGERP COHENOET

MalhémAtlquesSculncel econam~quesSr.18nc-e1 Economique,

[

.DOS SANTOS FERREIRA Sc••nco. EconomiquOi.J.DURANO Science, EconomIques

G.KOENIG ScienCe! Economiques IJ J.08RECHTP?ONCETJ.THEPOT

Sciences de 9I'ldonScienC1t~ d4 gestionSciences de gestion

P'ofllUellrl tlmtlritn: A.CHABERT (Science. EconomiQuesl . P.CHAMLEY IScienc.. Economiqu",1.

Profeueurs associés: W.HILOENBRANO. J.P.VIAL.

PTof~ur conventionné: R.UHRICH IEc.,6g.'1 ou,op.1.

Chargo!s de conférences: J.ARROUS· R.ERBES.

U.E.R. DES SCIENCES EXACTES

MathématiquesScienœs de la MatièreSciences de la Vie et de la TerreSciences du Comportement et de "EnvironnementEcole d'Application des Hauts PolymèresEcole Nationale Supérieure de ChimieObservatoirePhysique du GlobeEcole Nationale Supérieure de PhysiqueI.U.T.

C" • ·n, hono'airp., : P I.ACROU TE J H VIVIEN. G MILLOT.

Directeur Daniel BERNARDDirecteur Henri BENOITDirecteur Thierry JUTEAUDirecteur Philippe ROPARTZDirecteur Morand LAMBLADirecteur Marc DAIREDirecteur Alphon~ FLORSCHDirecteur Roland SCHLICHDirecteur Gilbert SUTTERDirecteur Michel GENEVAUX

P'ofp.ssp.urs honoraires: J BRE'IE T . Mm. M BRINI . J BYE· H.C ARTAN . C.CHABAUTY. A.CHRE TIEN. A DE LIJZARCHE . J.OENY . Mil- A.GAGNIEU Mil. S.GI LLE Tr.' . "ESE R . S.GOROOETZIO L HIR TH . R HOCAR r P JOL Y . P.LACROlJTE . R.LeCOLAZET . G LEYE E . P.L·HERI TlE R . A.L1CHNEROWICZ . A.MAILLA RD· G.MILLDTl ',. ,L· G REEB· A.ROCHE A ROHMER. J P ROTI-IE L.SACKMANN· Ch SAORON· H SAUCIER· F SCHALLER F STUTi'ISKY·1-I '1ILLAT J.H.VIVIEN· EI.WOLFFJ ~"J':'1E R 8.WURTZ.

P _ .·"eurs:A ~U:.ER

Ji' AOL()F~R .' "MBRUSTERP... ~NE RVA.ANISSIANG BAR8ANCONF i3E'=KEnN BEFrJR rG BELLlARllC 9ENeZRAo aE~i~JEOUI"l

H R~NOI rP ,!c'I'tENISTEo l:iEPNAROJ C.BERNIE RJ l\OI'lNINv'II'UI.MIGERJ F BOUTOT1 Il'1<)551'5R BROUILLARDç 9VqG~Rb,F'

H 9'JR"IAGF.

'" CARAHCARAl'lJLR CEPFPCHARTIERP.CHEVALLIERA CLAUSSA COCHE1.4 OAIREH OANANE DANIELM OAUNEJ OEH .. NOJ.DEMUYNCKJ.P OESCLESJ.F OUF OUROG DUNOYER dt

SEGONZAC Irl'r.lH.DURA'ITONJ P EBE LJPE!lERHARTB EHRESMANNV EPNJFARAUTP FEOEPLIN

Ailfon'ln,'p'

ChlrTlIe "lJl"I~'lIr'!

P"V"OU~M;1tr~m"\1IQues

Analyse ~llJ-Ji"eure

.\1;'1lh~'n(llfIrI1l~'

Ph"'lfltJP. l-'llhAM\~l'f111e

Bloch,rr"eBOliU'lnu",Oe,",,;Jl0 rh'lnll!

M.l'hAIII.lli'lue.PhY\lcoch.",.e ","il-=.IO",O'9hY11"'~"9If1 "'!Q~!olle

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~,~~~~~ued'!J Flu.des 16~1;~sBg~EGO. CJ,''''"J qé,,4,=-I'! el chlt",ie 01,'0''$. ta: ~tCQJNM'!c.1n'QU~ t.lUonnelle '19 NANOPOULOSld~tJGéol"9'. B 08RECHTPhv,'ou. ) 03BORNPhV"'QU. IEOSfERfAG..... alh~rnill'Qlle. lOTTENChi""! D~V";HlU. OUTl G.OUnrr,sOl'1M-1rhém,ll,QI,e. J ..., F ~tJLUS

QPIIlJul!'.oh..".aram er mol~c. [Jp

PRRI(.~~',~IRSOph.., 1. du s(ll 'fi c fl "allngr<10hÎl!! l ' ~8~lanlf:ue J UUEHLPhY"flU! IP QIM"JEUNChimie ah'o'':lflue C RnAE RTG4onh'llu-t'Je ,nlerne P RCP4,R TZ(;h',,"I~ lJ'ganlQue J ROUXM,clch,,,I',ç''! IG SCHIFF\1ANNB,,_·('l,iml,! g~nétlc:ue A SCHM 1fTt\trronmn,e P SCHM ITT

V'''''''9'' J.P SCHWINGM.tr~mariou.. M J.SCHWINGPhys nucl 9t t"ofpusc.el théo.ohvs J.C: SENSM;n~r.'09" M SIESY.INO8'0<:h·m.. G SOLLAOIEChimie 30pl. !t g4n1e chimi(lue J SOMMERZool""i. S.SORIN8'0109'. végé ..,. __ G SUTTERInformatl(lufO t.pplifluée IC TANIEL4,NBloloO!!! .,. TARDYChlr':"II. qen ......I. J f=' R A ISSEM.cmb.o'''9'' J.J. THIEBOLOChm'It ICall"ge de Frsnee! D.VIAUOCh,rf'llt ~pol 8l chimie de. ""'at~r. R.VOLTZ

;~~7'~t1c1. '" cOfpu.culaire 'b~j~,~tCh,,...,,,, pt-\,uQue lIun IR.·/-J'EISSCh.m.. P L.WE"IDELZoall')Ql'! 81 :cologis !9 WILL1l'T'ItT"U no''''''l 1" je ''-''INTERC~f')lnçlS lC ',vIPPLERPh'v"'Qu.

Malhl!,.,..lJIÎQUSIPhY!illJlogis animaleG4"I~i.InlormalldueChImiePhv.iQue théoriQUI!~1a,h~l'TlaIlOU"1 fPrahltbllllts "( SUtlhUQU8SMf!..:anrQueChimieElectr. et E1&CtratBchn'(lutParhal<':'Qllt rnol.n.t .. irl!' v~"~rAI4'Chll'!,ieCh-mi. 9'ln<!,.I.Mrtrhêf'T'lSflQUel Qlén"r81.,.."I,Vllolog,lt Jnirnl)l.Crllml'Chimie Ofg.eniQu. IIUT)Ph\'liQ\l.Psycho-Ohy sia109itBormlQu.M3thémAliQultfPhyStClutFs,,'cho·physial.et phyrial.du camp.ChimieChimie pny,lqv4l'PhYl.nuel et ca'DUIC.lt IhtO'r.phy•.PhysiQUeChimie "f9al'liQ\JeChimÎe <1ppliquNMothém.r1qu",P~y IIQV. 6htc:tronillU.Chimie licol ft chimi. dfl mal4TI~J1It

GoIoIO<l"Cklmi•BioIOO'. 8nimaJ.~l)rh6rTunlQultt

Physlq\J' Ih'oriqu.8inc"limlt9h·tl lQUIChlm,ePhy.iqulPN:::ho-phytÎolOoQleChuT'''"Phy,icoch.de'I H~.HJ Poly"""'""

. :

Prnf..-un 6TYMrit:n: G.GLAESER fM.th.l· L.HIFITH IMlcrab.ol''9,.1 R.LECOLAZE r 1Phv, ~~ GlObo)· GMILLOr (Gé~l"qi.P'I'on'oIOQ'.1.

Prnf_r Idlolrrt: JoSl TTLE FI IGéOIO<j1t1.

IV

Profltueun Anoci', :

Z.AKCASUK.BHATTP.BIRDH BJELKHAGENC.CAMACHOP.CARSKYM.CONSTANTIN

Op'iquo phYliquoPnYliquo nuc'6.i" (n'oriquoChlmi. mintrai.Elecrroniqui 1. Ellcttoc4IchniqUIMalh6m,liqu••ChimieChimie oroanique

J.GROVEST HOFMOKLA.KORANYIG.LETTAA.MELFIP.MEYRUEIS

Cnimlo min6r.loPhysique nucl••i,. 1. cOfpuiC1Jlai,..Malh6mattqul'Malh6matiqu8IG4ochimi. .Robotiqu. productiqui

L.MEZZA·BASSOJ.L.MORAN·LOPEZI.SATAKEH.SCHMIEOH.UMEMURAH YEH

BiocnlmloPnYliquoM81h6m81iqul.PnYliquoMOln'mo'iquotGjochimia

Profen.un cononntionnoh : P.DEJOURS IPhy.iol.tolpir.1 . Y.NAKATANI ICnimi.1 • P.SMIGIELSKI IPnYliqual.

Anronomft adloinb : A.FLORSCH . A.F RESNEAU Id6•.1 . M.JASCHEK.

Physiciens .djoinb (Physique du Globel : P.HOANG TRONG IG60phy,iQu. in •.I· R.MONTIGNY IG60phYliqu. in'.I.

O.ntCtllun de recherche C.N.R.S. :

P ALBRECHT ChimÎGJ.F.BIELLMANN ChimÎGS.CANOAU PhysiquoP.OEJOURS PhYliolO\lI. mpi",oi"M.FRANCK·NEUMANN Chim.. organiquoJ.HOF FMANN 81010\110 animal.A.KNIPPE R PhYliQuo nuet. el corpusculoi"A.KOVACS PhYllcochlmi. macromoléculair.

Maftrws de recherche C.N.R.S. :

J.LAHAYEG.MAIREJ.MARCHALA.J.P.MEYERP.A.MEYERA.PORTEP.REMPPR.SCHLICHP SIFFERT

Coordin.tion '1 cacely..Chimi.PhYlicochimÎ. macromolkulair.Phy.iquo des lolidaoMalh6ma.iqu,"Bi03logÎ. cellul.ir.PhYlicochiml' mecromolkula,r.G.ophysiQu, matinePhYliQU' nucl. '1 corpulcuhlirw

A.SKOULIOS Phylicochimie ........omolkulli,..M.VAN REGENMORTEL VirolO\lioR.VAROOUI Phylicodlimlo macromo'kuloi'"A.VEILLARO Chimie molkuloi,..R ZANA PhYlicochimi. mecromolkuloi,..W S.ZHOU Altr••n"ïronn'mln, plan4ui,..A ZUKER PhYllqu. ,h6"';quo

L PINCK VirolO\lIOP POIX Cn,mi.J.POUYET BiophyllquoB REES Chim..J.REINBOL T Bioc/'limlOP REMY B,ochimioK RICHAROS VltoIO\l"J RICHERT PhYSIQUe nuc:l~elre Ih.lorl~

J RINGEISSEN pn~.,qu.

O.ROH F RI TSeH Pn~ IQmorph~n6..J.P.RQTH(.Oir lraA!d\J PhYIIC:OCnlm141 macromolkulalreJ.P SAUVAGE Cn,mOl phy,iQu,R.SCHANTZ PhYI.oIO\lOl _olçoltol.F SCHEIBLING PhYllque nuc:l~elre et carpu.cul.. l....F SCHUBE R Chiml' organ'QuoN,SCHULZ PhYliqu. nucl6att. el corou\CUl ..ireC SCHWAB PhYllqu.o SCRIVENER Sc. phYl. pou.l'ln",n,aurR SELTZ PhYIIQU' nucI6_"e Il corpuw:ullHIB.SIFFERT Coord,nallon a' c..aly..P SIMPSON Bio o,gan""",,/~_.

C.SITILER GoIo/0918A.SOLLAOIE Ch,mlO

lM e.STOeCKEL Biol (Je. InleraClIonl cillul.. ir"C.STRAZ/ELLE Ph~"cochimi8mocromolkuloiro

'IM SUFFERT PhYSIque nucléair. I! co'puloC'Ul.".J.C.THIERRY Cn.miaK. T RAOAE PhYlicochlmls aromlQ\.l' Il ionlQulJ.P.VIVIEN Ph'1liQua nuc'.al,.11 corpuw:ule."P WAGNER Ph'1l1qUI nucl'air. Il COtpuh."\.Ila'AG.WA LTE R PhYliQue nucl6eire ee corpu..eul .."eF...... EBER Géuloçio

J.Cn.ABBEJ J.ANOREE ASLAN.DESH.BARREAUF BECKG BECKJ P BECKJ P BEHRM.BENAROH BRAUNP BRAUNSTEING.BURKAROM.C.CAOEVILLEH CALLOTF CANOAUJ.CHEVELLIERM R.CHEVALlIERN.CLAUERJ P COFFINA.CORETM.CRO.SSIAUXE.CROUSEC.OECKERo OISOIERJ.OOUBINGERF.OURSTR EHRBURGERS.EL KOMQSSJ.FLECKB.FRANCOISJ.FRANÇOISE FRANTAJ.M.FRIEOTB.FR.T1GR.FUCHSJ.C•.JALINY.GALLOTJ.GANGLOFFJ.P.GERBERR GIEGEC GIGOT

PhYhCoch.d" inltreel.l' tnt.rl.atPhYllcochimi, mecromolkul,irllPhysiqui nucllair. Il corpcncutair.pn.lo..Ep,"6mul.Hil.<Ho Sc.,, TachPhYllqIJ' nuel6.ir••• corpucaJl.. ireBiOChlm...PhYllolOQleChimieChimie quantlQu,PhYIIQl.Ie nuc16.ir. el corpuscula"eChlml'Biocnlml. Il'o*lalePhYlique dal IOlidelChimiePhYlicoc:nlm" macromolkuJairePhYliqu. nucl'eitl e' corpulO.llaulI8io10Q1' CllIu,.. i...G.."O\I;'PhYS1QU" l'ua6Hlr.. e. corpuKulaH.PhyuQuePhysique nucl'ai ... ee corpuKulaireBllxhimle "~I.leChimie Ih~riQUI " macromo"c.PhYlique nucl,.îre et corpusculaireG6olUQI8Phytloloçil ..~taleCoordinallon .t catalysepnYliqu.VirolngiePhYllcochimÏt' macromolkulaitlPhYllcochimie macromolkulair.Phytlcocnimie molécule"ePhyslcoch êJasln.aract.at in.errac...Vlroh~le

BiophYllquePhysicochimla macromol.cul.iraPhysicoc:himi. macromolkulaireBiochlmiaPhysiQUe nucl.altl a' corpulculaireBiochimi.Virologie

H GIRAROP GRAMAINJ B GRUNH.GUILLEYF.HAASJ HERZF HIBOUL HILAIREGJENNERG KAUFMANNG KEITHH.KESSLERJ.P.KINTZINGERBKOCHE.KOCHANSKI

M LAGUEUXB.LANGJ.LANGP.LAURENTC.LERAYR LEVYF.LEYENOECKERJ.L.LOOAYB.LOnB.LUUA MALANE.MARCHALP MARTINOTYJ C MEROINGERC .MIOSKOWSKI

o MORAST.MULLERG.MUNSCHYE.PAPIRERHPAOUETMPATYP.PEVETC.PICOT

PhYliolOQI. r..piraloirePhYllcochlml, macrornol6culairePn~lIQUo

Bllxhimie, Biologie "'0'...1.PhYllqua nUcl6Jir. al &:orpuSC\llalAPh-"llcochlmul macromcltculaltlPhY'IQue nucl~;lIti

Chlmu. physlqu.Chlml.ChlmllBiochlml'Mac~riiu. ino.ganiQUIlChlmi.PhYliol~l'Slf'\.Ict ., d'in.m.mol~cul..Ch,mle de ccordinecionBiû ot'Qanumetid4t".CrISIi'lilo9r~phie

PhYllcochlmle macromol.culairePhYliol. ctJmpar" des r4-gulelion.Phyliot. compar" dei réou1arion.PhYSIqueChimiaMach'maIÎQua.PhYlicocniml' macromul~c:ulaireChimla organiquePhyuologle rsspiratol,ePhyllcoch. molêcul.at m3cromol.Sc. PhYliQu, pour nn~nieurPhYllqU. nucl••ir.Chimie

ChlmlaPhYSique nuchhlre el corcusculalrePhysiquaChimia Ih'or. it macromal.G6010\li.Physlqu. nuc" ...,e ee corpusculairaZoologi.Physicochimi. "",croml.culaire

J.P.WENIGERM.WESTPHALJ C.I'lITïMANNJ.WITZR.NOLFFJ.P ZIELINGERL.ZILLIOX

ZOOlogieG60phYI,qU.Chimie th~or. et macromot.Biol09il celluill"ChÎmilPhysiqueM6c.n.qu. dei Flu'dao

v

A mon Epouse

A mes enfants

A mes Parents

VI

Les recherches dont les résultats seront présentés ci-dessous, ont étéeffectués dans le cadre du programme "Pourridiés de l'Hévéa". Ce programme atoujours beneficié du soutien de la part de l'ORSTOM et des Autorités de la Côted'Ivoire. Que Monsieur le Ministre de l'Education Nationale et de la RechercheScientifique de la Côte d'Ivoire et Monsieur le Directeur Général de l'ORSTOI'1 mepermettent de leur exprimer ici mes plus vifs remerciements.

Je remercie Messieurs les Professeurs J. CHEVAUGEON, L. HIRTH etJ.H. WEIL, les Dr B. FRITIG, B. MONTIES et A. RAVISE de l'honneur qu'ils me fontde juger ce travail et de l'intérêt qu'ils ont manifesté au cours de sa réalisationdepuis de nombreuses années et à de maintes occasions: initiation etdéveloppement du programme, soutien budgétaire, stages en leur laboratoire,conseils judicieux ...

Mes remerciements vont également:- à C. BOISSON qui durant de longues années a réalisé, à Adiopodoumé, des

travaux sur le Pourridié blanc de l'Hévéa, ainsi qu'au regretté M. GOWON qui aguidé mes premier~ pas à l'ORSTOM.

- à Monsieur le Professeur Y. BOULANGER et au Dr F. FAS lOLO qui onteffectué certaines analyses (composition en aciden aminés et Finger prints) sur

. 1es peroxydases. ,- à Messieurs les Directeurs de l'iRCA, de la SAPH (Société Africaine des

Plantations d'Hévéa) et de la SOGB (Société des Hévéa de Grand Béréby) qui m'onttrès largement ouvert l'accès aux plantations

- à mes collègues de l'''Equ'ipe Fomes": B. HUGUENIN, M. NICOLE, D. NANDRIS,B. RIO; à KOUASSI KONAN, préparateur au Laboratoire, au dévouement et à ladispon,ibilité exemplaires.

- à tous mes amis d'Adiopodoumé et à tous ceux qui, en Côte d'Ivoire ou enFrance, ont contribué à la réal isation technique du présent manuscrit.

· VII

SOMMAIREAVANT- PROPOS

INTRODUCTION

A- L'hévéaculture: situation générale et importance économique desdeux agents pourridiés R. lignosuset P noxius.1. Quelques données économiques2. L'Hévéa - mode de plantation3. Eléments de pathologie

B- Objectif des recherches: démarche adoptée1. Objectif et cadre général de l'étude2. Choix des enzymes à étudier3. Progression adoptée: étapes et objectifs intermédiaires

MATER1EL ET METHODES1 - Matériel végétalIl - Les parasitesIII - Mesure des activités enzymatiques; expression des et

présentation des résultats1V - Puri fi cat i on des enzymes, contrâ1e de pureté et détermination

du pH isoélectriqueV - Dégradation du boisVI- Autres techniques analytiques

RESULTATS

3

3

3

45

12

12

1314

17

17

19

24

26

28

38

CHAPITRE 1: Modif"ications de quelques activités enzymatiquesaccompagnant l'attaque parasitaire significationde ces perturbat ions. 39

1- Perturbations accompagnant l'attaque parasitaire 39

11- Origine des enzymes des tissus parasités 43

1. Comparaison entre activités enzymatiques mesurées in vivo(pivot d'Hévéa) et in vitro (filtrat de culture) 43

2. Répartition spatiale des activités enzymatiques 45

3. Vérification en électrophorèse de l'origine de certaines enzymesdes tissus parasités. 49

111- Discussion et conclusion 51

VIII

CHAPITRE Il: l'AGRESSION PARASITAIRE; ROlE DES ENZYMESEXCRETEES PAR lES PARASITES

- Moda1i tés de l'excrétion des enzymes1. Excrétion en fonction du temps de culture2. Estimation du taux d'excrétion de quelques enzymes3. Inductibi1ité des enzymes extracellu1aires

Il - La dégradation des polyosides1. Action des filltrats de culture de R. lignosf./s et P noxif./s sur

la sciure de bois d'Hévéa2. Le complexe ce11u101ytique de R. lignosus et P noxius3. Le complexe pectino1ytique4. Les hémicellu1ases· . .5. Purification partielle et détermination de quelques caracté­

ristiques physicochimiques des enzymes excrétées par P noxius6. Remarques sur l'équipement enzymatique des deux champignons

111- La dégradation de la lignine: rôle de la laccase1. Purification des laccases de R. lignosus et de P noxif./s

a) Identification des enzymes dans les filtrats de cultureb) Purification des laccases excrétées par R. lignosusc) Purification de la laccase de Pnoxiusd) Propriétés physicochimiquese) Discussion

2. Effet de la laccase L1 de R. lignosussur la lignine thiog1yco1iquea) Matériel et méthodes'b) Résultatsc) Discussion

1V - Dégradation d'autres macromolécules1. Les estérases2. Les protéases3. Enzymes recherchées mais non identifiées dans les filtrats de

culture et les extraits tissulaires.V - Discussion

CHAPITRE III: REACTION DE l'HEVEA A l'AGRESSIONPARASiTAI RE: lA STIMULATION DE L'ACTI VITEPEROXYDASIQUE: SI GNI FI CATION

- Effet de l'infection sur l'activité peroxydasique des tissus1. Variation de l'activité totale2. Spécificité de la réaction au niveau des isoperoxydases

55

55

5559

61

67

67

72

79

86

86

97

103

109

109109

110

113

116119

119

. 121

131

133

133

133

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136

139

141

141

143

IX

Il - Purification et caractéristiques physicochimiques des enzymes P2aextraites, respectivement, de tissus parasités et de tissus deréaction 155

1. Purification des enzymes 155

2. Détermination des principales caractéristiques physicochimiques 159

111- El éments de régul at ion 163

1. Mécanisme présidant à l'augmentation de l'activité del'isoperoxydase P2a 163

2. Aspécificité au niveau de l'agent pathogène responsable de laréact i on de l'Hévéa 164

1V- Discussion 166

CHAPITRE IV: MODALITES DE LA DEGRADATION DES TISSUS, INVITRO ET IN VIVO, PAR R. LIGNOSUS ET P. NOK/VS 169

- Dégradation, in vitro, de bûchettes de bois d'Hévéa; natureligninolytique de P noxius 169

1. Effet comparé de R. lignosus, P noxius et Antrodia sp., sur 1,"perte en poids" des bûchettes et sur la dégradat ion de".! a 1ignine 169

2. Effet d'une source nutritive exogène sur l'aptitude de -':,Y"

R. lignosus et P noxius à dégrader le bois _ '173

3. Evolution de la composition monomérique de la lignine.Oesbûchettes 173

Il - Effet de l'infection de pivots d'Hévéa par R. 1ignosus etP noxius 177

1. Variat ions du taux de 1ign ine dans 1es di fférents types de tissus 177

2. Effect de l'infection sur la composition monomérique de la ligninerésiduelle 181

111- Contrôle histologique et cytologique des modalités de l'infection par Rlignosus et P noxius 181

1. In vitro (bûchettes infectées) .' _ 181

2. In vivo (tissu racinaire de plantules inoculées artificiellement) 183

1V- Discussion 185

"

CONCLUSION GENERALE

BI BLIOGRAPHIE

189

197

AVANT - PROPOS

Les travaux qui font l'objet du présent mémoire ont été réalisés dans lecadre de l'ORSTOM, Institut Français de Recherche Scientifique pour leDéveloppement en Coopération, ayant vocation à effectuer des recherches enliaison étroite ave.c le développement des Pays d'accueil.

C'est dans ce contexte que le Laboratoire de Phytopathologied'Adiopodoumé (Côte d'Ivoire) a développé notamment un programme sur lesmaladies racinaires de l'Hévéa. Généralement un matériel d'étude est choisi enfonction d'un objectif scientifique à atteindre. Dans le cas présent la démarcheest inverse: c'est le matériel végétal qui est imposé pour des raisonséconomiques. En effet les couples Hévéa-agents de pourridiés ne sont choisispour les possibilités d'étude qu'ils offrent dans le domaine des interactionshôte-parasite, mais au contraire ces études ont été entreprises avec pourobjectif final la sauvegarde de l'Hévéa.

Dans cette optique deux axes de recherches ont, entre autres, étéenvisagés:

- recherche de marqueurs de l'infection (en relation avec le problème de ladétection, si possible précoce, des arbres infectés en plantation)

- recherche de marqueurs de "résistance" (en relation avec le problème dela détection et , éventuellement de la sélection, d'arbres résistants ou tolérantsà la maladie).

Cependant, au fur et à mesure de l'avancement des travaux, il est apparuque les couples Hévéa- R lignosus et Hévéa- P noxius pouvaient constituerdes modèles applicables à d'autres couples hôte-parasite résultant de laconfronlation d'une espèce ligneuse avec un agent pathogène colonisant le bois.Par ailleurs, au plan fondamental, l'étude des mécanismes biochimiquesimpliqués dans les relations hôte-parasite (ou présidant à leur établissement),chez de tels couples, était, et demeure encore, peu avancée. Enfin, toujours dansce même domaine, la comparaison entre l'activité de deux agents pathogènesdifférents, R lignosus et P noxius, pouvait conduire à préciser le rôle decertaines activités enzymatiques dans le processus pathogénique.

C'est cet aspect particulier des recherches qui sera privilégié ici et quiservira de guide tout au long de notre exposé.

3

INTRODUCTION

Hevea brasi/iensis est une Euphorbiacée qui, depuis le début du siècle,suscite un vif intérêt au plan économique en raison de sa haute productivité enlatex, principale source du caoutchouc naturel. Par rapport aux autres plantes àlatex, l'hévéa présente deux avantages considérables: d'une part le latex estrécolté après une saignée de l'arbre (encoche au niveau du tronc) et non aprèsbroyage de la plante et extraction des molécules de polyisoprène et, d'autrepart, la production peut être augmentée par stimulation à l'aide d'un composéchimique générateur d'éthylène. Oans les conditions actuelles de conduite desplantations les arbres sont exploités durant 20 à 25 ans.

A lOHEVEACULTURE: SITUATION GENERALE ET IMPORTANCEDE DEUX AGENTS DE POURRIDIE: RIGIOOPOnUsll6NOSUS ET PHElllNUS NOXIUS

1. QUELOUES DONNEES ECONOMIQUES.

Bien que l'Hévéa soit d'origine amazonienne, sa culture s'est trèsrapidement étendue à de nombreuses zones équatoriales et tropicales humides ~:"

notamment aux pays asiatiques. En 1982 les superficies plantées de par lemonde représentaient environ 7,5 millions d'hectares dont 92,4% en Asie (dont·78% pour la t'1alaisie, l'Indonésie et la Thaïlande), 6,9% en Afrique et seulement0,7% en Amérique latine. Ces plantations produisent au total environ 3,75millions de tonnes de caoucthouc dont 93,5% par l'Asie, 4.9% par l'Afrique et1,5% par l'Amérique latine.

La contribution ivoirienne à cet ensemble demeure minime: 0,67% dessurfaces plantées (43 000 ha en 1984 dont 26 600 t en saignée) et 0,9% de laproduction (35 000 t de caoutchouc-crêpe) pour un revenu global de 150millions de Francs français environ (sources IRCA et APROMAC (*).

Implantée en Côte d'Ivoire dans les années 50,l'hévéaculture s'est surtoutdéveloppée depuis le début des années 70. Cette intensification s'est traduitepar l'augmentation des surfaces plantées et l'amélioration de la productivitédes plantations': séiection"de clônes haut-producteurs en latex, optimisation deJ'exploitation des arbres, protection phytosanitaire des périmètres hévéicoles.

C'est dans ce dernier contexte que s'insèrent les recherches sur lesinte~actions hôte-parasite entre J'Hévéa et deux de ses principaux parasites

(*) 1RCA: 1nstitut de Recherches sur le Caoutchouc en Afrique; APROMAC: Association des Producteurset Manufacturiers de Cooutchouc .

4

racinaires J Rigidopor(Js lignos(Js et PlJellin(Js l}oxi(J5, dont les principauxrésultats seront présentés ci-après,

2. L"HEVEA - MODE DE PLANTATION., .

,~'Hévéà est un arbre de tai Ile moyenne à fleurs monoïques. Son systèmeracinaire J partie de l'arbre 'qui' nous intéresse en prioritéJ comporte un pivot de3 à 5 m de longue~r et des racines plagiotropes disposées' en couronne àqueIques dizaines de centimètres sous le collet et" communément désignéessous le terme de "p lateau racinaire".

A,ctuellement la très g~ande majorité des plantations est consituéed'arbres greffés. La partie aérienne J issue du 'greffon J a une origine clônaledéte"rminée. L.es différents èlônes utilisés sont sélectionnés pour descaractères tels que productivité en latex J architecture de la couronne J densitéfoliaire J 'résistance à la casse au vent... 'Ces clônes sont tous issus d'unevingtaine de plants seuls survivants des quelques 70.000 graines récoltées auBrésil il y a une centaine d'années. Les 7J 5 minions d'hectares d'Hévéa plantésdans le monde proviennent de ces vingt plants après multiplication etcroisements divers.

La partie souterraineJ provenant du développement du porte-greffe J estissue de la germination d'une graine. Cette graine est elle-même issue J dans la'très grande majorité des casJ de fécondation croisée. En pratique seul legéniteur femelle est connu. On dit des graines collectées sous les arbres d'unclône X qu'elles appartiennent à la famille illégitime X. Il en découlenécessairement qu'un lot de graines d'une famille illégitime donnée esthétérogène au plan du patrimoine génétique; il en va de même pour lesporte-greffes (et"donc pour le système racinaire des hévéas prélevés enplantat ion) qui en' sont issus. En plantation l'hétérogénéité génétique desporte-greffes est encore amplifiée du fait, que J les graines mises en germoirregroupent des lots appartenant à plusieurs familles illégitimes, On dit de lapopulation de plantules qui en résulte J qu'elle est issue de graines "tout venant".Ainsi J en plantation J la structure génétique d'une popUlation de porte-greffesest hétérogène et exclue J par le fait même J toute notion de "1 ignée isogénique".La technique du bouturage permettrait théoriquement· de réduire cettehétérogénéité; en pratique elle est cependant inapplicableJ le système racinairedéveloppé à partir d'un rameau ne comporte J " en effet J pas de pivot J organeessentiel assurant.un ancrage correct de l'arbre et donc une résistance efficacecontre les tornades. Nous verrons plus loin l'incidence de cette situation surl'interprétation des résultats de~ analyses biochi!TIiques.

Une dernière. remarque' concernant· les' porte-greffes : .Ie choix desfamilles .illégitimes repose sur des caractères tels que compatibilité entre "greffon et porte-greffes J qualité générale de l'enracinement...; la résistance auxparasites n'est pas prise en compte. . ,. '. '

• ·f. • ....

5

3. ELEMENTS DE PATHOLOGIE

a) Situation générale

L'Hévéa est sensible à de nombreux parasites, la plupart d'originecryptogamique. Lors d'inspections phytosanitaires effectuées en 1949-50 et1952 sur les plantations d'Hévéa du Cameroun et de J'ex-A.E.F., SACCAS (1953 aet b) recensait 75 champignons différents, dont 44 parasites susceptibles deprésenter un danger réel ou potentiel pour cet arbre.

D'après les informations disponibles,. parfois très anciennes, sur l'étatsanitaire des plantations, dans les régions suivantes : Vietnam <BOUYCHOU,1954), Ceylan (actuel Sri Lanka) (MURRAY, 1930), Malaisie (HILTON, 1959 ;SHARPLES, 1936), Indonésie et Malaisie (DIJKMAN, 1951), Afrique Equatoriale(SACCAS, 1953a et b ; PICHEL, 1956), il apparaît que la plupart des espècesnuisibles se rencontrent dans toutes les régions hévéico1es d'Asie ou d'Afrique.Il n'en demeure pas moins que leur incidence économique es~ très variable d'uncontinent à J'autre ou même parfois d'une région à J'autre distantes de quelquesdizaines de ki lomètres seulement.

Ainsi, en Afrique, alors que Armi/arie//a me//e8 sév,it au Congo, 'ceparasite est quasiment inconnu en Côte d'Ivoire. De même PtJe//inus fJoxiusne se manifeste qu'occasionnellement dans les p1antatiooQs de la régiond'Abidjan, alors qu'iJ provoque des dégâts non négngeables.sur les périmètresdu Sud-Est et du Sud-Ouest du pays. En revanche Rigidoporus /igfJOSUS estprésent, à des degrés divers, dans la plupart des zones hévéicoles du monde.

A l'opposé, l1icrocyc/us u/e/; responsable de la "MaladieSud-Américaine des FeuiJ les" demeure, pour le moment, cantonné en Amériquelatine. Ce parasite, véritable fléau de l'hévéaculture, provoque la défoliationtotale et répétée des arbres entrainant rapidement leur mort. Il a interdit,jusque très récemment, tout développement conséquent des plantations auBrésil.

Parmi les autres parasites les plus communs sur Hévéa on peut citerCo//etotricum l7eveae responsable d'une maladie foliaire (anthracnose) trèssévère - sur les plantations du Cameroun; He/minthosporium hevea&également sur feuille, parfois Phythopl7tl7ora pa/mivora sur fruit WECLERTet NANDRIS, 1981) ; ce dernier est également responsable de graves altérationsdu panneau de saignée. '

Cependant, de façon très générale, les dégâts les plus sérieux enregistréssur les plantations africaines sont dûs à des maladies racinaires imputables àdes agents de pourridiés (voir déFinition ci-dessous) tels que Rigidoporus/ignosusJ Pl7e//inus' noxius, 6a/Joderma pSé'udoierr&U/71, Ustu/i!7~zonata, Ami/arie//a me//ea, Spl7aerostyibe repens. En Fait ces parasitesexistent en forêt naturelle.où.un équilibre semble s'être établi entre eux et les

~-~- ,

- ... :-._n

6

Figure 1 - Vue aérienne d'une plantation d'Hévéa; l'attaque par les agents depourridié provoque la mort des arbres et la formation de clairières ausein de la plantation.

7

multiples essences forestières, les unes sensibles, les autres tolérantes ourésistantes. Le plus souvent il existe dans une telle forêt de nombreux foyersponctuels qui se développent de façon dramatique à la faveur de l'installation àgrande échelle (généralement plusieurs milliers d'hectares d'un seul tenant),après abattage de la forêt, d'une culture monospécifique sensible que constitueune plantation d'Hévéa. Ainsi, comme le signalait déjà SHARPLES (1936), laconnaissance de l'''antécédent parasitaire" (densité des foyers, nature desagents pathogènes) permet de préjuger, dans une certaine mesure, du devenir dela future plantation, au plan sanitaire. L'expérience prouve,. en effet, que lesprécautions prises au moment du défrichement de la forêt (les souches etracines sont extirpées, rassemblées en endains puis brûlées) limitentsimplement le "risque parasitaire" sans jamais l'éliminer totalement.

b)Les pourridiés de rHévéa en Côte d"lvoire.

Bien que la plupart des agents de pourridiés cités plus haut puissent êtrerecensés en Côte d'Ivoire, les dégâts les plus importants infligés auxplantations d'Hévéa sont imputables à Rigido,Oorus lignosuset à PlJellinusnoxius.

La répartition géographique de ces champignons est loin d'être uniformeet la distribution des foyers au sein d'une même plantation est le plus souventhétérogène. Certains secteurs peuvent se réveler totalement indemnes, tandisque d'autres supportent des taux de pertes annuels atteignant, voire dép.assant j

3%. Ces taux, parfois très élevés, sont dûs pour partie à l'existence d'unemultiplicité de foyers primaires (en 1959, CHEVAUGEON recensait dans uneforêt proche d'ABIDJAN 50 à 110 arbres ou arbustes, par hectare, envahis parR. lignosus) susceptibles de constituer autant de foyers primaires aprèsabattage de la forêt et installation de la plantation d'Hévéa, et; pour partiè, àl'extension ultérieure de la maladie à partir de ces derniers. Cette extension·conduit à la formation de clairières grossîèrement circulaires, s'agrandissantplus ou moins rapidement au fi 1des ans (fig. 1).

Au cours du présent travail nous serons amenés à cîter un troisièmeparasite, 5pIJaerostylbe repens, n'entraînant généralement pas la mort del'arbre mais induisant très fréquemment la formation de tissus réactionnels.

1°. Eléments de nomenclature.

Le terme "pourridié" désigne un syndrôme pathologique caractérisé parune attaque du système racinaire conduisant à une altération des tissuscorticaux ou des tissus ligneux entraînant) la plupart du temps, ledépérissement puis la mort de l'arbre.

fréquemment l'appellation "pourridié" est étendue, abusivement à l'agentresponsable de la maladie. Ainsi R. lignosus est improprement appelé

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"Pourridié blanc de l'Hévéa" alors qu'i 1 conviendr:-ait de dire "agent du pourridiéblanc... ".

Ces parasites provoquent une pourriture du bois qui peut être de deuxtypes:

. - pourriture blanche: elle résulte d'une décompositfon de la lfgnine dubois; celui-ci adopte un aspect crémeux lorsque les tissus sont très dégradés.Les champignons 1fgnivores, (qu'i ls soient parasites ou saprophytes)décomposent également, au moins partiellement, la fraction polysaccharidique.

- pourriture brune : elle résulte de la dépolymérisation de la seulefraction polysaccharidique du bois. La lignine peut cependant être modifiée(déméthylation par exemple). Les résidus tissulaires prennent alors une teintebrune plus ou moins intense suivant le degré d'élimination des polysidespariétaux.

A noter qu'il n'existe aucune relation entre la "couleur" du pourridié etcelle de la pourriture. Ainsi, comme nous le verrons plus loin, PlJellinusnoxius, agent du pourridié brun (aspect des symptômes externes) provoque unepourriture blanche (teinte des tissus dégradés).

2- Ridigop.orus lignosus (KI.) Imazeki.

* Position taxonomique

Ce Basidiomycète de la famille des Polyporacées est un parasite racinairelargement répandu 'dans les zones équatoriales et tropicales humides. Trèspolyphage, il s'attaque non seLllement à des plantes cultivées (théier, cacaoyer,caféier, hévéa,...) mais également à de très nombreuses essences forestières(CHEVAUGEON, 1959).

Au plan taxonomique on relève que, par le passé, le champignon a étéclassé parmi les genres ': Polyporus, Rigidoporus, Leploporus et Fomes.Dans les années 20 la classification du champignon étaft à ce point incertainequ'en 1923, PETCH écrivait "... In any case, the rubber root disease fungus of theEast is not P (Polyporus) microporus, and if Lloyd's identification of thelatter with the real r: (Fomes) lignosus Klotzsh is correct, it cannot be F.1ignosus. The conclusion would appear to be that none of the names which havebeen app1ied to the rubber root di sease fungus is the ri ght one, and that i t isreally an unnamed species". alJoi qu'il en soit J'agent responsable du pourridiéblanc de l'Hévéa est encore fréquemment désigné sous le nom de Leptoporuslignosus (KI.) Heim ex Pat ou Fomes lignosus (KI.) Bres. Cette dernièredénominàtion demeure d'usage très courant dans le milieu hévéicole. Pour notrepart nous le désignerons sous le nom de Rigidoporus lignosus (KI.) Imazekiqui lui est. actuellement attribué par les spécialistes du Cl"11 (CommonwealthMycological Institut).

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* Développement du champignon in vitra

La morphogénèse du thalle du champignon s'effectue en plusieurs étapescaractérisées, chacune, par une forme mycélienne spécifique (BOISSONJ 1968aJ

b et d, 1972). Le mycélium de type A qui se développe essentiellement au seindu milieu de culture, se révèle capable de croître en anoxie partielle. Danscertaines conditions ces hyphes peuvent se différencier en filaments de type B,à croissance rapide, qui ne se développent qu'à la surface du milieu de culture.Ces filaments peuvent se rassembler pour former des structures agrégées:palmettes, cordonnets et rhizomorphes.

Mycélium A et B se distinguent non seulement par leurs caractèresculturaux et morphologiques mais également par ceux de leur métabolismeglucidique (BAREYRE et BOISSON, 1969) et par leur capacité à excréter desenzymes (GEIGER, 1975; 1977). Concernant ce dernier aspect, nous avons, eneffet, pu montrer que seules les hyphes de type A sont capables d'excréter desenzymes susceptibles d'intervenir dans la dégradation des polymères pariétaux

.de la cellule végétale. In fine, les résultats de ces études morphogénétiques etbiochimiques indiquent que la transformation, réversible, d'une·, formemycélienne en une autre, est un évènement fondamental non seulement au plande la capacité de survie du champignon mais également à celui du processuspathogénique. Nous en avons déduit que la forme mycélienne B est spécialiséedans la dissémination du parasite (grâce surtout aux structures agrégées qui endérivent) et que seules les hyphes de type A sont réellement infectieux (GEIGER,1975).

Ces observations, aIl iées à celles effectuées sur les conditionsd'infection "au champ", devaient conduire, ultérieurement, à la mise au pointd'un système d'infection artificielle (NANDRIS et aL, 1983) en plaçant lesystème "inoculum-racine de plantules d'Hévéa" dans des conditionsasphyxiques (humidité volumique du sol portée artificiellement à 21 % contreseulement 8 à 10% en conditions naturelles). Cette procédure favorise latransformation du mycélium B en hyphes A infectieux et conduit à unaccroissement considérable du taux de réussite de l'infection.

* Développement in vivo : diagnose et principales étapes de lapathogénèse.

En plantation (ouen forêt naturelle) la présence de R. ligno5u3 sur lesracines est révélée par les rhizomorphes blanc-beige, légèrement orangéslorsqu'i Is sont âgés. '

L'apparition de symptômes foliaires ("racornissement" et jaunissementdes feui lles) est tardive et-' annonce la mort prochaine de l'arbre.L'idendification de l'Jgent pathogène est 'faci 1i tée par la présence sur desarbres (gravement atteints, ou morts) de carpophores jaune-orangéscaractéristiques, disposés en console à la base du tronc.

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La contam inat ion des arbres (et, par conséquent; ·l'extension des foyers),se fait soit par contact direct avec une racine 'infectée ou un débris ligneuxco Ionisé, faisant office d'inoculum,' soit par contact avec un rhizomorphe duchampignon. De' nombreuses observations-effectuées en plantation révèlent que,dans la majorité 'des cas, la contamination des pivots a lieu à des niveauxsi tués très en profondeur· dans 1e sol (--) 80 cm' pour des terrains sab leux,10-20 cm en terrain argileux; suggérant l'influence favorable de conditionsasphyxiques dans l'attaque parasitaire). Cette particularité rend très délicatela détection précoce et le traitement des arbres malades <DECLERT, 1960 ;MARTIN, 1964; MARTIN et Du PLESSIX, 1965; NANDRIS et al. 1984).

L'examen de coupes longitudinales de pivots partiellement colonisés parR. /ignosus permet d'observer très nettement le front de progression duchampignon dans le bois; celui-ci est caractérisé par une teinte brune trèsprononcée. En avant de ce front, -les tissus non envahis sont beige-clairs, enarrière, dans la zone la plus anciennement atteinte, le bois est blanchâtre.

Ainsi R. lignosus, pourri.dié blanc de rHévéa (couleur desrhizomorpohes courant sur les racines contaminées) provoque une pourritureblanche du bois, indice, théoriquement, de la nature lignivore duchampignon.

Enfin, dans quelques rares cas on observe la formation de tissusréactionnels tendant à circonscrire la zone des tissus infectés. Nous verronsplus loin l'intérêt et,la signification d'une telle réaction.

3" Phellinus noxius (Corner) G.H. Cunn.

"* Position taxonomiaue.

.' Basidiomycète de la famille des Polyporacées, ce parasite très polyphage,présent dans toutes les zones tropicales, a été décrit sous diversesdénominations: Hymenocl7aeta noxia Berk., Pyropo/yporus /amaensisMur., Fomes /amaoensis (MurrJ Sacco et Frott., Fomes noxius Corner,Pl7e//inus noxius(Corner) G.H. Cunn.. Dans le passé une controverse animées'était développée à propos de l'identité de l'agent du pourridié brun: Fomesnoxius (synonyme : Pl7e//inus noxius (PEGLER et WATERSTON, 1968) ouFomes /amaensis. D'après MURRAY (1930) et ROGER (1951), c'est ce dernierqul'seralt responsable des dégâts sur Hévéa; SACCAS (1953b ; 1975)) et.DIJKMAN (1951)· notamment considèrent 'l"es deux dénominations commesynonymes, s'opposant en cela à l'opinion"de taxinomistes tels Que FIDALGO(1963). " '.

- : En 1932, CORNER concluait Qu'il.existe ~ien deux champignons distincts(malgré une. très-grande ress"emblance,' responsable de-la con.fusion). classéssous le même nom: d'une part-le "vrai" Fomes Jamaensis,:saprophyte banal,et, d'autre part, le "vrai" parasite responsable du pourridié brun de l'Hévéa (et

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d'autres plantes arbustives) qu'il appela Fomes noxius. Cette dénomination aété adoptée par la suite par.de nombreux pathologistes (HILTON, 1959; PICHEL,1956; inter alii). Enfin en 1975 THOROLD écrivait "Because of this confusednomemclature, and since P. lamat!nsis a.nd P. noxius are separatedmicroscopically, and as they are possibly not separable pathologically, 1t isconvenient to consider thern together here (P. noxius sensu lato )".

Pour notre part, Fomes noxius étant considéré comm'e synonyme dePlJellinus noxius par les spécialistes du C.M.!. (PEGLER et WATERSTON,1968), nous adop terons ce tte dernière dénominat ion pour J'agen t du pourridiébrun de J'Hévéa.

* Biologie du chamoignon.

Le développement in vitro de ce champignon a été peu étudié. Seule a étéréalisée la détermination de J'optimum de croissance en fonction de latempérature et du pH du milieu. A noter que les cultures sur milieu gélosé ousur buchettes de bois adoptent un aspect particul ier caractérisé par la présencede plages ocres irrégulières, séparées par de fines lignes brun-:foncé.. La margede la culture est constituée par un mycélium duveteuKbeige: Enf.in nous n'avonsjamais observé la production de rhizomorphes par P. noxius.

* Dévelopoement in vivo, diagnose.

L'attaque par P. noxius se distingue très facilement de celle de R.lignosus par la présence d'un manchon irrégulier formé de particuiesterreuses et de graviers agglutinés, maintenus en place par un réseau mycéliensecrétant des substances mucilagineuses. La teinte du manchon estgénéralement brun à ocre (d'où J'appellation "pourridié brun"), mais en faitdépend de la nature du sol. Les attaques anciennes se traduisent par laformation,'à la surface du manchon, d'une pellicule fine et fragile de colorationnoire. L'infection peut gagner non seulement J'ensemnble du système racinairemais également le collet de J'arbre. Sur Delonix regia, dans les IlesMariannes, on a pu observer J'envahissement du tronc jusqu'à 2 m au-dessus ducollet (HODGES et TENOR/a, 1984). En raison de l'absence de rhizomorphes lacontamination d'arbre à arbre se fait par contact direct entre une racine saineet une racine infectée ou un débris ligneux contaminé faisant office d'inoculum.C'est pourquoi J'extension des foyers à P. .noxius est très généralementbeaucoup plus lente que celle des clairières à R. lignosus. Par contre ilsemble que, au niveau individuel, J'attaque par le premier de ces parasites soitbeaucoup plus foudroyante que celle dûe au second.

L'examen d'une coupe longitudinale d'un pivot parasité révèle qu'à un stadeprécoce de l'infection les tissus ont une teinte brun-orangée. Les tissus les plusdégradés sont cassants; ils sont parcourus par de fines lignes brun-foncé à noirdélimitant des logettes. A ce stade qui n'est généralement atteint quO après la

12'

mort de l'arbre J la pourritur~ est dite alv~olaire. La teinte des tissus est beigeun pev plus prononcée que ce.lIe du bois attaqué par R lignos(js.

L'ensemble de ces symptômes est systématiquement décrit par tous lespathologistes qui ont observé le pourridié brun sur diverses essencesarbustives cultivées. Il est donc très vraisemblable que dans tous les cas '11s'agisse du même parasite:

D'après ROGER (1951) et 5ACCAS (1975), le champignonresponsable du pourridié brun de l'Hévéa (et d'autres plantes arbustives)occasionne une pourriture brune des tissus. Ce champignon est donc àclasser parmi les agents non 1ignivores. Cependant nos observations sur lateinte adoptée par les· tissus très atteints} ainsi que la description desdégradations tissulaires occasionnées par ce parasite sur Oelonix regia nenous permettent pas d'être aussi affirmatif.

B. aBJECT1F DES RECHERCHES ET DEMARCHE ADOPTEE.

. ,. aBJECT 1f ET CADRE GENERAL DE l'ETUDE.

Comme nous venons de le voirJ les observations effectuées in vivorévèlent que R lignosus et P. noxi(js diffèrent par les symptômes J

notamment intratissu1aires J qu'ils provoquent sur un même hôte, l'Hévéa.Nous avons mis cette situation à profit pour tenter de mettre en évidence

des corrélations entre le comportement parasitaire des deux champignons etdes différences d'ordre biochimique induites dans les tissus de l'hôte. Dans cecadre J l'étude a été 1imitée aux enzymes intervenant dans les phénomènesd'agression parasitaire et de réaction de l'hôte (la nature des activitésenzymatJques prises en considérat ion sera précisée plus loin).

Ces recherches sur les interactions hôte-parasite ont été réal isées surdes pivots d'arbres adultes prélevés en plantation. Ce matériel permet d'étudierles évènements· tels qu'i ls se déro~lent effectivement dans la nature et doncd'éviter l'écueil d'un travail réalisé en milieu trop contrôlé conduisant à desrésult~ts non directement transposables "sur le terrain". Par ai lleurs ces pivotsconstituent une source d'échanti lIon disponible toute l'année.

Les expérimentations exécutées in vitro (caractérisation etdétermination du rôle de différentes enzymes) ont été réalisées dans le but de 'préciser ou de cqnforter.les résultats entregistrés in vivo. .

Dans' un cadre p1~s généra1 ces recherches présenta ient Ufl. intérêtsupplémentaire du fait de la rareté des données disponib.les sur les interactionst1ôte-parasite.dans le cas d'hôtes fortement 1ig'nifiés et. de parasites dégradantle bois (JOHANSSON et UNESTAM; 1982). ... . Notons enfin qu'au moment où nous abordions cette étude aucune· donnée. - . . .... .

d'ordre. biochimique n'était disponible sur les couples H~yé~- Rlignos(js . et

13

Hévéa- P. noxius . Seuls les résultats que nous avions précedemment àcquissur les enzymes excrétées, in vitro, par R.' lignosus pouvaient offrir unebase de travai 1.

En définitive nous avons estimé que les deux couples réunissaient desconditions devant permettre d'atteindre in fine l'objectif suivant: vérifiersi des différences d"équipement enzymatique existant au niveau destissus attaqués par des parasites permettaient d"expliquer (ou deprévoir) des différences de comportement parasitaire. Enfin,parallèlement à nos recherches, des études histo-cytologiques étaient réalisées(M. NICOLE, 1984) sur les 'mêmes couples hôte-parasites (plantules infectéesartificiellement) permettant ainsi de comparer et confronter résultatsbiochimiques et observations en microscopie..

2. CHO1X DES ENZYMES A ETUD1ER.

La réalisation de l'objectif que nous venons de définir repose pour unepart sur l'étude des variations de l'équipement enzymatique (hôte etchampignon). Dès lors était pos~ un problème fondamental: quelles enzymes etpourquo i? ' -,

D'emblée nous étions placés devant un choix à effeétuer,' pour deuxraisons : d'une part les enzymes intervenant dans la path~génèse ou lesréactions de l'hôte ne sont pas toutes connues, d'autre part tecFlhiquement nousne pouvions étendre nos investigations à plus d'une dizaine d'èntre elles. Ceciétant précisé, il convenait de définir les bases du choix.

De manière très générale, il eût été satisfaisant de fonder cette étude surune analyse d'enzyme-clefs, à condition d'être en mesure de défin'ir clairementcette notion. Au plan théorique, si l'on considère l'intervention des enzymesdans la pathogénèse, les enzyme-clefs seront celles susceptibles de laconditionner (virulence ou résistance) ou de la moduler (agressivité outo lérance). En pratique toute enzyme jouant le rôle de facteur 1im itant dansl'expression du pouvoir pathogène apparait cOfDme occupant une position clef,quel que soit son rôle réel au plan purement enzymatique. Ainsi, dans le cas desinteractions hôte-parasites entre certaines races de Colletotrichuff,lindemuthianu!ll et des variétés de haricot, c'est la capacité du champignon àexcréter une a-galactosidase qui, "conditionne son pouvoir pathogène(ALBERSHEIM et al., 1969; ENGLISH et ALBERSHEIM, 1969), alors que, a priorI;on aurait pu penser qu'un tel rôle serait plutôt dévolu à une polyosidase.

Cette observation montre que toute spéculation a priori quant àl'importance de telle ou telle enzyme dans la pathogénèse est vaine et que toutchoix comporte une part d'aléa.

En pratique nous avons choisi de tester des enzymes témoignantde la capacité des champignons à dégrader les principaux polymères

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pariétaux '; CM-:-cellulase, .pectinase,-, b-glucosidas.e, a- et t;»-galactosidases. La laècase a été choisie comme témoin de l'aptitudeà dégrader la lignine, ceci après analyse bibl,iographique et vérification deson rôle potentiel (voir chapitre III), Enfin, nous avons intégré à cetteliste, la phosphatase acid.eenzyroe universellement répandue, susceptiblede constituer. un marqueur des variations enzymatiquesintratissulaires.

Toutes ces enzymes font partie de ce ,qu"il est possible de définir commele pool des enzymes d'agression, En ce qui concerne l'aspect réaction,nous avons focalisé les recherches sur les peroxydases, certainesd'entre elles étant responsables de la polymérisation des unités debase de la lignine (GROSS, 19,77) et, par conséquent, de la synthèse dupolymère, que cette synthèse soit impliquée dans le processus normal delignification d'un tissu ou dans celui d'une lignification réactionnellefréquemment induite à la suite d'une agression d'origine parasitaire (voirchapitre III).

A l'occasion d'investigations plus ponctuelles, réalisées le plus souventin vitro, d'autres activités enzymatiques ont été étudiées ou simplementrecherchées : xylanase, laminar'inase, protéase (enzymes reconnues commeparticipant à la pathogénèse (DOUX-GAYATet a1., 1978; PEGG et YOUNG, 1981;.·RABENANTOANDRO et a1., 1976 ; ESQUERRE-TUGAYE, 1972), cellobiase,cellobiose hydrolase, activités enzymatiques appartenant au complexecellulolytique excrété par des champignons (HIGHLEY, 1981).

Enfin, seules les enzymes ·solubles· ont été prises enconsidération. Concernant les enzymes d'agression ce choix est justifié par lefait que les observations, au microscope, de coupes de tissus envahis par R./ignos(Js ou p. noxi(Js ont révélé que la dégradation des parois intervenait à

une certaine distance des filaments mycéliens, traduisant l'action de "facteurs"extr.acellulaires, diffusibles. Une telle action à distance prévaut pour d'autreschampignons tels que SporotriclJ(Jm p(J/ver(J/ent(Jm par exemple (RUEL et a1.,1981);.elle avait d'ailleurs déjà été présentie il y a cent ans par De BARY (1886;cité par BIRD, 1982)

Concernant la lignification il semblerait que puissent être impliquées desperoxydases liées au parois ou des peroxydases solubles (GRISEBACH, 1977).Cependant dans le cas d'une lignification réactionnelle, en réponse à une attaqueparasitaire (OHGUCHI et a1., 1974), ou même dans le cas de la lignification destissus au. niveau çles greffes ..(QUESSADA et MACHEIX, 1984), les enzymessolubles sembl~nt jouer un r:ôle fondamenta1.

3.PROGRESSION ADOPTEE: .ETAPES ET OBJECTIFS INTERMEDIAIRES."

, , ., . _... ":.' .'" ,.'. :.

. ,

Les recherches ont été menées en plusieurs étapes au cours desque1!esnous,avons tenté de répondre aux questions _suivantes:.

, 15

a) L'attaque parasitaire induit-telle des perturbations au niveaude l'équipement enzymatiques de l'hôte? Lesquelles? Existe-t-il

des caractéristiques spécifiques permettant de différencier une ~ttaque par R.lignoslIs d'une infection par P nox/lIs? Quel1~ est la signification de cesperturbations : réaction de l'hôte ou élément du système d'agression' desparasites (origine des enzymes des tissus parasités: hôte ou champignons) ?SLlr la base des différences d'équipement enzymatique peut-on prévoir desdifférences de comportement parasitaire (aux niveaux tissulaires etmoléculaires) entre R. lignosus et P noxills ?

b) Les enzymes étudiées sont-elles susceptibles de particioer àla pathogénèse ; en particulier interviennent-elles effectivement

dans la dégradation des polymères pariétaux? Quelles sont les modalitésd'excrétion?

Au cours de cette partie de l'étude, et après avoir défini quelquesmodal ités de l'excrétion d'enzymes, plusieurs aspects seront abordés:

, - la vériflcation de l'aptitude des filtrats de culture,.. à dégrader lesubstrat naturel (sciure de bois d'Hévéa), preuve que:'::~'le complexemultienzymatique des deux champignons est effectivement suscèptible d'agir invi~ ;:

- l'identification précise de certaines activités enzymatiques (plus,particulièrement celles participant à la cellulolyse et à la' pect~iholyse) dans lebut de préciser et de comparer les potentialités réelles des deux'organismes enmatière de dégradation des polymères naturels. Une étude plus complète sera,de plus, réalisée sur les enzymes excrétées par P noxiû's..

- le rô le effectif de la (ou des) laccase(s) dans la "transformation" de lalignine. Au cours de cette étude nous avons considéré que la laccase étaitcapable de dépolymériser la lignine (ou au moins de participer à la dégradationde ce polymère). En pratique il existe 'une controverse à ce sujet entredifférentes "écoles". Divers rôles sont avancés: polymérisation oudépolymérisation de la lignine, détoxification des mi 1ieux, régulation de labiosynthèse d'autres enzymes, etc... Il était donc essentiel, dans l'optique denotre étude, de démontrer que la laccase est réellement capable de dégrader lepolymère (même si elle ne joue pas exclusivement ce rôle).

Les résultats intermédiaires sont comparés à ceux enregistrés pourd'autre organismes. En effet, .contrairement à la situation qui prévaut in vivo,les informations disponibles in vitro, sur les conditions physiologiques etbiochimiques de la biodégradation du bois sont extrèmement riches. Ceciprovient du fait que, outre J'intérêt présenté par ces recherches au planfondamental, l'activité déployée dans ce domaine est stimulée par lesapplications potentielles à 'court terme et les retombées écon'omiques qu'ellessont susceptibles d'entrainer 'dans' des' domaines tels que: dépollution,économies d'énergie, valorisation desrésidus·(des industries du bois en général,

. 16

de J'industrie papetière en parti~ulier, résidus agricoles, paille des céréalesnotamment)...

c) Quelles sont les modalités de la réaction de J'Hévéa en ce quiconcerne J'activité peroxydasique ? Quelle est la significationpotentielle de cette réaction?

Seront abordés, dans ce chapitre, les problèmes liés à la varia~ilité de laréponse de J'hôte au plan de J'activité peroxydasique globale et la déterminationd'une caractéristique commune à chacune de ces réponses: la stimulation d'uneisoenzyme spécifique. Une étude approfondie de J'isoenzyme extraite des tissusparasités et des, tissus réactionnels sera réalisée afin de confirmer J'origine(l'Hévéa) de cette isoenzyme. Seront également étudiés des aspects liés à labiosynthèse de l'enzyme et à sa particifation potentielle à la biosynthèse de la1ignine.

d) Que lles sont les dégradations effectuées Dar les parasites invitro (bûchettes de bois stérilisées) et in vivo (dans les tissus de J'hôte)?

Existe-t-il une différence entre les modalités de J'agression par R. lignosuset P noxius? Existe-t-j] effectivement une 1ignification de réaction? Enfin,existe-t-i 1une concordance entre les résul tats de J'analyse chimique et ceux del'étude histo-cytologique?

. L'objectif de cette partie est double:- vérifier, par voie chimique et par J'observation cytologique, la nature

des dégradations infl igées par R. 1ignosuset P noxius aux tissus du bois.- Effectuer une 'synthèse des données acquises et vérifier s'il existe

effectivement une corrélation entre les différents résultats (équipementenzymatique <-:--) nature des altérations tissulaires et ce lJulaires).

,e) Conclusion générale:

.les différences d'équipement enzymatique existant entre R. 1ignosus et

P noxiusUissus parasités et filtrats de culture) permettent-elles d'expliquerla spécificité du processus pathogénique qu'ils développent respectivement?

Ces quatre groupes de questions déterminent la structuration du présenttravai 1en quatre chapi tres: ...

- Modifications de J'équipeme~t e~zymaÙque des tissus racinairesinduites par l'infection; signification de ces perturbations.

- L'agression parasitaire; rôlé des enzymes excrétées par les pàrasites.-'Réactions de J'Hévéa à l'agression parasitaire; signification.- Modalités spécifiques de la dégradation. des ti'ssus, .In. vitro et, in

vivo. Corrélation: équipem'~nt enzymatiqùe du parasite -. comportementparàsitaire. .

. ...-

17

: ,'MATERIEL ET METHODES

1. MATER1EL VEGETAL

1. Origine et prélèvement des tissus; extraction desenzymes.

Toutes les ana)yses ont été réalisées sur des 'pivots adultes (4à 8 ans)prélevés en plantation et donc infectés naturellement. De 'ce fait et pour lesraisons indiquées plus haut, 'l'origine génétique ne peut, sauf exception, ê~rè

précisée.

Dans tous les cas, seuls les tissus lignifiés du xylème sont étudiés. Ilssont prélevés à l'aide d'un ciseau à bois sur des pivots adultes préalablementsectionnés ,en deux parties égà1es dans le sens de la longueur. . ' _,'~

Les copeaux de bois sont r~duits en sciure par un br.oy~ge trê,frêPide et àsec (broy'eur à couteaux Gondard, tamis à trous de 2mm de diamètre):_.Ma1gré l,abrièveté du temps de broyage et le fait qU'aucune élévation de ,température

'.<"~

notable n'ait été observée au niveau de la sciure recueillie, 'il est pos$.'ib1e que lechoc des couteaux sur les tissus puisse provoquer un accroi~sement detempérature localisé et éventuellement entraîner une inactivation locale desprotéines enzymatiques. Il en résulterait globalement une sous-estimation desactivités enzymatiques des tissus. Nous pensons néanmoins ,que cette situation,au cas où elle se produirait, n'affecterait pas la validité des conclusions que noustirons des résultats dans la mesure où elles reposent sur une, étude comparativedes activités enzymatiques extraites de tissus broyés dans des conditionsidentiques. Cette sciure est ensuite mise à macérer dorant une nuit et à 4°C dansun tampon phosphate de sodium (0,0125 M à pH 6) à raison de 5 ml par gramme detissu (poids frais). Après macération, les extraits sont récupérés par filtration

, sur verre fritté de porosité 1, puis centrifugés durant 15 minutes à 20 000 g. '

2. Echant j 11onnage

Des essais préliminaires ont révélé une.. variabilité importante desactivités enzymatiques d'un arbre ~ l'autre, même pour des, 'individus voisins,d'âge identique et ayant eu une croiss~nce dans des conditions climatiques etpédologiques similaires. Cette va~iabilité èst vr~isemblablement dûe au fait queles pivots provienneJ:)t de graines issues de' fécondations "illégitimes" etpossèdent donc des patrimoines génétiques différents. .: ,"

. Se posait donc de façon cruciàle -le problème du 'témoin sain". Nous avonspal ié à cette situation en n'analysant que des pivots partiellement envahis p'ar

18

• ,jt

Figure 2 - Pivots d'Hévéa tronçonnés dans le sens de la longueur: aspect etlieu de prélèvement des différents types de tfssus: a) 5: tissus sains ­SF: tissus proches du front de progressfon du parasfte - PF: tfssusparasftés du front - P: tissus parasftés élofgnés du front. b) tissusparasités de type alvéolàfre ( uniquement en cas d'attaque par Pnoxius). c) tissus réactfonnels.

19

les champignons et comportant une zone de tissus sains et une zone de tissusparasités. En effet une étude préliminaire (GEIGER et a1., 1976) sur la répartitionde des activités laccase et peroxydase au sein de pivots avait montré que lestissus de la partie saine des pivots ne subissent pas de perturbation notable auniveau de leur équipement enzymatique. POLIr chaque pivot ce tissu peut donc êtrelégitimement considéré comme un témoin par rapport auquel seront caractériséesles perturbations qualitatives et quantitatives existant dans les tissusparasités. ,

La répartition spatiale des enzymes au sein des pivots n'a également étéétudiée que sur des pivots d'arbres adul tes. Dans ce cas, et pour chaque pivot, leséchantillons suivants ont été analysés (Fig. 2a, b et d.

"* Tissus sains (5) : prélevés très en avant du front de progressiondu parasite, (Témoin).

'* Tissus sains du front (SF) : pré levés au voisinage du front deprogression.

'* Tissus parasités du front (PF)."* Tissus parasités (P):: prélevés très en arrière du front (tissus

"très anciennement" colonisés).* Tissus parasités de type alvéolaire (PA): prélevés dans d~s

zones où les tissus sont très dégradés et présentent cet aspectcaractéristique (Fig. 2b; en cas d'infection par P llO/dus uniquement).

Pour certaines études, nous avons également analysé~:' des: tissusréactionnels (R) (Fig. 2c) que l'on observe, occasionnellement, sl!r des pivotsattaqués par R. li(Jnosus et, très fréquemment, à la suite d'une attaque- . ,

corticale par 5phaerostylbe repens.

II. LES PARASITES.

1. Origine

Les souches de Rigidoporus lignosus et de Phellinus noxiu.5régulièrement utilisées au cours de ce travail ont été isolées sur des pivotsprovenant respectivement de la plantation de J'IRCA (région d'Abidjan) et de laplantation de la 50GB (Société des Caoutchoucs de Grand-Béréby; Sud-Ouest de laCôte d'Ivoire). Elles sont répertoriées en mycothèque sous la dénomination RLst; PN st. Au cours de certains essais nous avons mis en oeuvre une secondesouche de R. Ilgnosus(RL 68) en provenance du Gabon.

Enfin lors des comparaisons du pouvoir de dégradation du bois par lesdeux agents pathogènes nous avons introduit à tit.re de témoin un agent depourriture brune du bois de sciage, An/rod/a sp., qui nous,a été fourni par leCTFT (Centre Technique Forestier Tropical; Nogent/Mamet

21

2. Conditions de culture

a) Entretien des souches en mycothèque

Les souches des champignons sont conservées sur milieu malté (2%) etgélosé (2%) en tube à essais (d= 18cm). Elles sont repiquées sur mi 1ieu neuf tousles trois mois.

b) Cultures sur sciure d"Hévéa

Dans le but de comparer leurs capcités respectives en matière deproduction d'enzymes extracellulaires, les deux champignons sont cultivés sursciure de bois d'Hévéa (10 9 pour 100 ml d'eau, en Erlenmeyer de 250 ml ;stéril isation 45 minutes à 120°C).

Ce milieu a été choisi parce que le plus proche possible du substrat queles champignons uti 1isent durant leur déve loppement parasitaire.

c) Culture sur -bouillon de sciure d"Hévéa-

Ce milieu dérive du précédent. Après autoclavage de la sciure (100 9 pour1 1 d'eau), le milieu est filtré sur verre fritté. Le filtrat est réajusté au volumeinitial; le "bouillon" qui en résulte est utilisé comme milieu de culture(100ml/Erlenmeyer de 250m]) après une nouvelle stérilisation de 45 mn à 120°.

Ce milieu est mis en oeuvre soit pour la production d'enzymes soitlorsque l'expérimentation nécéssite la récupération du mycélium (comparaisonentre activités intra- et extracellullaires).

Enfin le bouillon de sciure d'Hévéa peut être gélosé et réparti en boîtesde Pétri dans le but soit de constituer des précultures soit d'estimer lacroissance mycélienne sur un substrat naturel.

d) Cultures sur -bûchettes d"Hévêa-

Elles sont effectuées sur des bûchettes (L : 5 cm, 1: 1,5 cm, épaisseur: 3mm) tai llées dans le pivot sain d'un Hévéa adulte. Ces bûchettes sont introduitesdans des tubes de Roux de 2 cm de diamètre à raison de trois bûchettes par tube.L'humidité est assurée par addition d'un volume d'eau suffisant pour remplir leréservoir inférieur du tube et atteindre un niveau correspondant à environ 114 dela hauteur des bûchettes. L'ensemble est stéri 1isé par autoclavage durant 45minutes à 120°C. Après refroidissement, les bûchettes sont ensemencées à l'aided'un implant mycélien prélevé sur une préculture en milieu malté et gélosé.

Ce milieu, aussi proche que possible du substrat naturel, a été mis enoeuvre d'une part pour estimer le pouvoir dégradatif des champignons, d'autrepart pour estimer l'évolution de la production en enzymes durant une longuepériode de culture.

L'influence d'un milieu nutritif sur la capacité des champignons à

22

Tableau 1

Croissance radiale journalière (en mm) des souches de R. /ignosus (Lst etL68) et de P noxius (Nst).

Souches et mil i eux J2 J3 J4 J5de cu.lture

Lstl 91ucose* 5,9 9,3 11, 1 14,1Lstl hévéa* 9,6 10,3 Il,4 14,8

L68/ glucose* 7,7 8,5 9,2 10,6L68/ hévéa* 8,0 10,4 Il,4 Il,2

Nstl glucose* 10,6 14,2 9,6Nstl hévéa* 13,5 .1 5,2 12,8

* glucose: milieu minimum glucosé et gélosé; hévéa: mllieu bouillon de sciured'hévé,a gélosé.

", ... : .. "1, •• ",: .. -. ..

23

dégrader le bois est vérifiée dans des conditions différentes: les buchettes debois, de même taille que les précédentes, sont placées dans des Erlenmeyercontenant soit des billes de verre (diamètre 1 cm) + 30 ml d'eau (les bûchettessont déposées sur les billes de manière à éviter qu'elles ne flottent sur l'eau),soit 50 ml de milieu malté (2%) et gélosé (2%). Dans ce dernier cas les buchettessontautoc1avées séparément et déposées sur le milieu après solidification decelui-ci.

3. Estimation de la croissance mycélienne.

la plupart des m!lieux de culture utilisés ne permettent pas de comparerla croissance des deux. champignons et donc de rapporter une activitéenzymatique à une telle croissance. Il était donc important de vérifier si les deuxagents pathogènes présentaient des aptitudes comparables dans ce domaine.Cette comparaison a été réalisée en cultivant R. lignosus et P. noxius sur lesdeux milieux suivants:

- milieu boui lion de sciure d'Hévéa gé losé- milieu minimum gé10sé et glucosé (composition: par litre de milieu:

NaN03 : 2 g; KH2P04 : 0,8 g ; K2P04 : 0,2 g ; Mg S04: 0,5 g ; KC1 : 0,5 g; FeS04:

1mg ; thiam ine : 0,5 mg ; asparagine 1 g ; glucose: 20 g).

les résultats révèlent qu'après un "démarrage" plus rapide de la part deP. noxius durant les trois premiers jours de culture, les vitesses de croissancejournalières évoluent de manière comparable chez les deux souches étudiées (Rlst et PN st)

4. Préparation des fi) trats de culture et des extraitsmycéliens.

les filtrats de cuiture sont prélevés par filtration sur verre fritté deporosité N" 1, puis centrifugés durant 15 minutes à 20 000 g.

les extra i ts mycé1iens sont réa 1isés par broyage des tha 11 es(préalablement rincés à l'eau disti111ée et essorés entre des feuilles de papierfiltre) dans une solution tamponnée de phosphate mono- et dipotassique O,0125Mà pH 6. le broyat est centrifugé durant 15 minutes à 20.000 g. Le surnageantconstitue l'extrait à analyser.

lors des essais ayant pour but d'apprécier le taux d'excrétionenzymatique et le taux d'enzymes liées ioniquement aux parois, la procéduresuivante est adoptée:

- Filtration du milieu de culture --) lavage du mycélium ·par du tamponphosphate 0,125 M pH 6---) lavage du mycél ium par le même tampon additionnéde NaCl (0,75 M final) broyage du mycélium (tampon phosphate de sodium 0,0125M pH 6) et enfin lavage du résidu de broyage par la solution NaC1 0,75 M.

24

Toutes ces solutions sont filtrées, centrifugées et testées pour lesdifférentes activités enzymatiques. Pour chacune d'entre elles la proportion del'activité contenue dans chaque· fraction est expr'imée en pour cent de l'activitétotale (somme des activités de toutes les fractions).

III. MESURE DES ACTIVITES H~ZYMATlaUES; EXPRESSION ETPRESENTAT1ON DES RESULTATS.

1. Tests enzymatiques et expression des résultats.

Les activités enzymatiques suivantes : phosphatase acide (Pase)Œ.C.3.1.3.2), b-glucosidase (b-glu) <E.c. 3.2.1.20), a- et b-galactosidase (a- etb-gal) Œ.C. 3.2.1.22 et E.C. 3.2.1.23) sont testées, à 30°C,. dans un milieuréactionnel (volume final: 1 ml) tamponné à pH 4,5 (tampon acétate de sodium0,05 M) contenant les substrats (p-nitrophényl phosphate et p-nitrophénylglycosides correspondants) à une concentration finale égale à 0,02 M. La réactionest arrêtée par addition de 4 ml de solution tamponnée Tris-glycine à pH Ilpermettant de révéler le p-nitrophénol libéré au cours de la réactionenzymatique. Les activités sont exprimées en nano-moles de substrattransformé par minutes et par gramme de tissus frais (ou par ml de filtrat deculture).

CM-cellulase Œ.C. 3.2.1.4) et pectinase (E.c. 3.2.1.15) sont testées à pH4,6 (Tampon citrate de sodium 0,025 M) selon la méthode viscosimétriQue d'unepart et la technique basée sur la mesure du pouvoir réducteur du milieuréact ionne 1d'autre part.

La première est réalisée à l'aide d'un viscosimètre d'Ostwald plongé dansun bain-marie thermostaté à 30°C, contenant le mil ieu réactionnel (vo lume final:8 ml) suivant: CM-cellulose à 0,4% ou polypectate de sodium à 1%, filtrat deculture ou extrait enzymatique: volume variable. Les résultats sont exprimés enAR(activité relative) par gramme de tissus frais (ou par ml de filtrat de culture);AR = 1It50 ; (t50 = temps, en minute, nécessaire pour observer une réduction de

50% de la viscosité du milieu réactionnel).Le dosage des sucres réducteurs 1ibérés au cours de l'hydrolyse du

polymère est effectué dans un milieu réactionnel (volume final: 2 ml) contenantles substrats à une concentration égale à0,05% pour la CM-cellulose et 0,1 %pourle polypectate de sodium.La réaction est arrêtée par addition de 2 ml de réactif àl'acide dinitro-sal icyl iQue (ONS). Ce mélange est porté à 100° durant 5 minutes,puis refroidi dans un bain glacé. La Densité Optique (DO). est mesurée parspectrophotométrie à 540 nm . L'activité enzymatique est exprimée en jlmoles dusucre monomère libéré par gramme de tissus frais (ou par ml de filtrat decul ture) pa~ heure.

. Xylanase Œ.C. : J et laminarinase CE.C. J sont testées' par laméthode au ONS (suëres réducte'urs) dans les conditions identiques à celles

, .'

25

décrites ci-dessus (concentration en substrat: 0,2%),Cellobiase <E.c. 3.2.1.20 et exoglucanase <E.c. 3.2.1.74: 1A-b-D-glucane

g'lucohydrolase; ou E.C. 3.2.1.91: 1,4-b-D-glucane cellobiohydrolase) sont testéesdans un mil ieu réactionne1 tamponné à pH 4,6 (tampon citrate de sodium O,025M)contenant respectivement du cellobiose à O,02M ou de l'Avicel (cellulosemicrocristall ine insoluble) à 1%. Les sucres réducteurs libérés à partir del'Avicel sont dosés par la méthode au ONS. Lorsque la composition du milieuréactionnel est analysée par chromatographie en couche mince (CCM) de silice, laconcentration du tampon est ramenée à 0,001 M; (des concentrations plusélevées en tampon citrate provoquant des "traînées" sur la plaque).

Les activités cellobiose oxydase et cellobiose quinone oxydoréductasesont mesurées, respectivement selon la technique de AYERS et AYERS (1978) etde WESTERMAK et ERIKSSON (1974 a et b) utilisant du cell.obiose pour la premiereet du cellobiose et de la 3,5-ditertiobutyl-o-benzoquinone pour la seconde.

L'activité peroxydasique <E.c. 1.11,1.7) est testée à températureambiante en milieu tamponné (phosphate de sodium : 0,05 M à pH 6; volume final:5 ml) qmtenant du gaïacol à 0,2% et de l'eau oxygénée à 0,1%. Le tempsd'incubation est généralement égal à 1 minute. Pour la mesure des 'activitésspécifiques la réaction est toujours effectuée sur un· mi 1ieu préparéextemporanément. et le déroulement de la réaction (DO 420nm) est enregistré;

l'activité est calculée il partir de la portion 1inéaire du graphe. Lorsque l'onrecherche l'effet des ions calcium sur l'activité peroxydasique, l'inçubation estréalisée dans un tampon Tris-maléate 0,051'1 à pH 6,8. . "

L'activité laccase <E.C. 1.10.3.2) est mesurée dans les mêmé~ conditio'nsque celle de la peroxydase (en l'absence d'eau oxygénée). Celle de';·'I? lignosu.5est testée en milieu tamponné à pH 6, tandis que celle de P nox'ius est mesuréeen milieu acétate 0,05 M à pH 4,5 .

Les activités laccase et peroxydase sont exprimées en 00420 X 1000 par

gramme de tissus frais (ou par ml de milieu réactionnel ou par 00402) p.ar

minute.

Dans tous les cas les témoins sont obtenus par des "réact ions" arrêtéesau temps: t =0, ou à partir de milieux contenant des enzymes thermoinactivées(10 minutes à 100°),

2. Présentation des résultats.

Dans certains cas et pour faciliter les études comparatives nous avons'adopté une présentation sous forme d'histogrammes. Ceux-ci sont construitsselon les principes suivants:

Pour chaque activité enzymatique,. la hauteur des· "colonnes"correspondant aux différents types de tissus, est proportionnelle, à l'activitéenregistrée dans l'extrait du tissu en question; cette hauteur est calculée par

26

référence à l'activité maximale enregistrée (quelle que soit la nature du tissu). àlaquelle on affecte l'indice 100. Cette présentation permet de comparer lestissus les uns aux autres, ceci pour chaque type d'activité enzymatique. En outre,pour chaque type d'enzyme,nous indiquons la valeur effective de l'activité(exprimée dans les unités définies plus haut) correspondant à l'indice 100.

Cette technique de présentation est adoptée pour les figures 4a, b et 6a,b(Chapitre 1 ).

. Enfin, un mode de présentation similaire est utilisé pour comparer entreelles (et par type de tissus et de filtrat de culture) les quatre activitésenzymatiques: phosphatase acide, b-glucosidase, a- et b-galactosidase dont lesactivités sont exprimées dans la même unité (Fig. 5 ; Chapitre 1).

IV. PURIFICATION DES ENZYMES, CONTRplE DE PURETE ET·DETERMINATION DU pH ISOlECTRIOUE.

Nous n'en présentons ici que les aspects généraux; au cours de certainespurifications des variantes spécifiques ont pu être introduites; elles serontalors mentionnées dans le texte ou la légende des figures.

1. Purification

a) -Batch- DEAE-Cellulose

La. première étape de purification consiste généralement en uneadsorption des protéines sur de la DEAE-Cellulose (Watman DE52). Dans ce butune faible quantité de cet échangeur d'ions est ajoutée directement au filtrat deculture. Après 30 minutes de contact sous agitation douce, la DE 52 est récupéréepar filtration sur verre fritté. Ces opérations sont renouvelées jusqu'à adsorptionde toutes les activités enzymatiques.

Les lots de DE52 sont alors rassemblés et lavés par une solutiontamponnée (phosphate de sodium 0,0125 M à pH 6). Les enzymes sont ensuiteéluées par une solution tamponnée de force ionique élevée (phosphate de sodium0,0125 M à pH 6, NaCI 0,5 M). L'élution est renouvelée à 3 reprises afin derécupérer le maximum des activités enzymatiques initiales. Cette étape présenteun double intérêt: concentration des enzymes et élimination d'une grande partiede la pigmentation brune originelle.

. Après centrifugation de réluat total, celui-ci est concentr'é parfiltration sur un ultrafiltre AMICON PM 10 (seules les molécules d'un PoidsMoléculaire (PM) <10 000 D -traversent. cette membrane),. puis lavé à deuxreprises, avec, concentration intermédiaire,. par. une ·so lution tamponnée(phosphate de ·~odium '0,0125 M pH 6 .ou Tris-Hël. 0,0 125 M à pH 8,4). Cetteopérat.i0n rerr:tplace la .dia.lY~~ concentrante classique, elle ,permet à la foisd'éliminer une partie sLÎpplémeritairê aes pigments, de concentrer la solution

2ï

enzymatique et d'amener celle-ci à des conditio~s de pH et de force ioniquecompatib les avec la suite des opérations.

b> Chromatographie sur colonne de OEAE-cellulose

La solution enzymatique est déposée au sommet d'une colonne deDEAE-Cellulose (d : 2 cm} h : 18 cm) équ'ilibrée dans le tampon phosphate desodium 0}0125M à pH 6 ou Tris-HCI O}O 125 Mà pH 8}4. L'élution est réal isée parun gradient linéaire en force ionique croissante (volume des fractions = 4}5 ml;débit: 50ml/h).

c) Chromatographie sur hydroxyapatite

Cette étape de purification est réalisée sur une colonne (d: 1}5 cm} h: 8cm) contenant un mélange (3 : 1 ; P/P) d'hydroxyapatite et de Cellulose <WatmanFI)} équi 1ibrée avec un tampon phosphate de sodium 0}01 M à pH 6. Les protéinessont éluées par étapes successives à l'aide des solutions tamponnées: phosphatede sodium pH 6 : 0}01 M puis 0}03 M et enfin 0}05 M. (La chromatographie surcolonne d'hydroxyapatite n'est utilisée que pour la purification des deux laccasesde R. / ignosus ). .::.

d) Filtration sur gel de Sephadex - estimation du PM desenzymes

EII e est réa1isée en co1onnes de ge1de Sephadex G50} G75} G1OO} G150 ouG200 (d : 1}8 cm} h : 100 çm)} préalablement équil ibrées avec un tamponphosphate de sodium 0.05 M à pH 6 (volume des fractions: 1} 1ml; débit: 8 à 20ml/h suivant la nature du gel). Cette étape permet} soit de purifier les enzymes;soit d'en déterminer le poids moléculaire (ANDREWS} 1964). Dans ce dernier cas·la colonne est étalonnée au moyen de molécules de PI'1 connu: sérum albumine"bovine (BSA) : 68 000 D ; ovalbumine (OVB ) : 43 000 D ; anhydrase carbonique(ANH) : 31 000 D; cytochrome c (Cyt c): 12 500 D; vitamine B12 (B 12): 1735 D;o-diphénol (ONP): 139 D.

2. Contrôle de pureté des enzymes - Estimation des PM(gel de polyacrylamide)

Ce contrôle est effectué par électrophorèse en gel d'amidon (SMITHIES}1955; SHÂW and PRASAD} 1970) ou en gel de polyacrylamide (7}5 %; ïrîs-HCI 0}2M à pH 8}5) en conditions dénaturantes (WEBER et OSBORNE} 1969) ou· nondénaturantes (DAVIS} 1964). L'activité laccase est révélée en plongeant-Ie geldans le milieu réactionnel (gaïacol à 0}2 % } 3- Amino-9-éthyl carbazole à 0}03%} } CaCI 2 : q}OO 1M} dans un tampon acétate de sodium 0,05 M à pH 5). L'activité

peroxydasiqu~ est ~évélée de 'la même manière en' préseÎlc~ d'eau oxygél1ée (Ô} (%)". '. ' .~'

28

L'activité des glycosidases est révélée selon la technique de COLAS et ATTIAs(1975) à l'aide des dérivés 6-brorno-2-naphtyl-a (ou b) D-galactoside (ou a- (oub- )-D-glucoside). L'act ivi té phosphatase acide et 1eucyl am inopept idase sontrévélées selon les techniques de SHAW et PRAsAD (1970). Les zymogrammes sontfixés à l'acide acétique à 5%.

La révélation des protéines est effectuée par coloration à l'aide d'unesolution de Bleu de Coomassie à 0,1 %dans l'acide acétique à 5%..

Le PM des peroxydases natives a été déterminé par électrophorèse surplaque de gel de polyacrylamide (gradient en polyacrylamide : 4 --) 30%) enprésence des protéines suivantes: tyroglobuline: 670000 D; catalase: 240 OOD ;ceruloplasmine: 150 000 D et BsA : 68 000 D., soit par f"iltration sur gel desephadex G200.

Le PM des enzymes en conditions dénaturantes (gel de polyacrylamide +

sDs) est estimé par référence à celui de proté'ines marqueurs mises à migrerdans les mêmes conditions: 3-phosphoglycéraldéhyde kinase (PGK) : 47 000 D ;alcoo1 deshydrogénase (ADH) : 35 000 D ; trypsine inhibiteur du .soja (sTI) : 21000 D; lysozyme (LYS): 14400 D.

3. Détermination du pH isoélectrique parélectrofocalisation en veine liquide.

. L'électrofocalisation en veine liquide a été effectuée à l'aide d'unecolonne LKB 810 (volume utile: 110 ml) contenant 4 ml d'un mélange d'ampholines '"permettant l'établissement du gradient de pH désiré stabilisé par un gradientlinéaire de concentration en saccharose (5 à 45%). Chaque expérimentation est· , _conduite durant 3 jours à 4°C, sous une tension de 400 V. Des fractions de 1,2 mlsont récoltées et sur chacune d'elles sont mesurés le pH (à températureambiante) et l'activité enzymatique.

V. DEGRADATION DU BOIS

] Matériel végétal

.' a) Etude in vitro

Les études de dégradation du bois. sont réalisées sur des .bûchettesplacées en tubes de. Roux ou dans des fioles d'Erlenmeyer selon les techniquesdéjà décrites. Sur ces cultlJres sont effectuées: .:

* L'estimation de la perte en poids, mesure rendant compte du pouvoirdégradatif global des différents champignons.; . :.'" .

* La détermination du taux de lignine dans les résidus de bûchette ..* La composition monomérique de la 1ignine du résidu de bûchette;" ce

dosage effectué dans le but de déterminer les modifications éventuelles dûes à la

29

dégradation du. polymère par les agents pathogènes. Pour toutes ces mesures letémoin est constitué par des bûchettes stérilisées non inoculées.

b) Etude in vivo

Seuls le dosage de 1ignine et l'analyse de la composit ion monomériquesont effectués sur les tissus prélevés sur des pivots adultes naturellementinfectés en plantation. Pour les raisons indiquées précédemment les études sontréalisées sur des pivots partiellement colonisés; pour chaque pivot, l'échantillonde tissus sains S tient 1ieu de témoin et donc de base de comparaison pour lesautres types de tissus: SF (tissus sains proches du front de progression desparasites), PF (tissus infectés prélevés au niveau du front) et P (tissus infectéséloignés du front). Les échantillons de tissus sont prélevés selon la techniquedéjà indiquée, puis séchés durant 48 h. à 4S°C.

2. Méthodes analytiques

a) Estimation de la perte en poids

L'aptitude à dégrader le bois est estimée par la perte de ,"matière sèche"des bûchettes, en fonction du temps de culture. Les mesures de poids sec sontréal isées sur les bûchettes, débarrassées de leur .gangue mycélienne, aprèsséchage en étuve à 4S0( durant 48 heures. (ette procédure est préférée à celle duséchage classique à 10SO( afin d'éviter toute éventuelle moditication chimiquedes polymères pariétaux par un chauffage trop long et trop intense des résidus debûchettes, ceux-ci étant ulterieurement utilisés pour les dosages de lignine.L'humidité résiduelle de telles bûchettes est inférieure à S%. Les résultats sontexprimés en pourcentage de "perte en poids" par rapport au P. S. (4S0) initial desbûchettes, diminuée de 'ce Ile correspondant à la perte résultant de l'autoclavagedes buchettes (estimation faite sur un lot témoin).

b) Epuisement du bois en substances extractjbles

Après séchage ,les échant ilions de tissus (bûchettes ou t issûsracinaires) sont broyés (broyeur à couteaux) de manière à obtenir une sciure dontles particules ont une ta"i11e inférieure à 60 mesh. (elle-ci est débarrassée des"extractibles" selon la procédure suivante: extraction à l'eau chaude (9S0(, 12 h),puis à l'oxalate d'ammonium à 0,5 %(85°(, 24 h), enfin au carbonate de sodium à2 %(85°(,8 heures); dans tous les cas les extractions sont réalisées àTaison deSO ml de solution par gramme de sciure. Après la dernière extraction, la sciureest rincée à l'eau chaude jusqu'à neutralité, puis séchée à 4S0(. et enfinréextraite au Soxhlet successivement par un mélange alcool-benzène (1/2 ;V/V), puis par l'alcool à 95% durant 8 heures. Le résidu constitue, après séçhage,le matériel sur lequel seront réalisés les dosages de lignine et la déterminationde composition monomérique de celle-ci. -.

. '.

, . ­, ~,.ft ••

,'31

c) Dosage de la lignine

la Considérations générales sur la méthodologie

Différentes méthodes de dosage de la lignine ont été utilisées par diversauteurs, parmi lesquelles les plus connues sont:

- le dosage de la "lignine de Klason" (ou lignine sulfurique; méthodegravimétrique) ;

- la digestion du bois par le bromure d'acétyle suivie d'un dosagespectrophotométrique de la solution obtenue;

- le dosage par extraction quantitative à l'acide thioglycolique(gravimétrie).

Chacune de ces méthodes présente des avantages et des inconvénientsparmi· ces derniers on peut citer:

* Concernant le dosage de la lignine de Klason: la formation éventuelle'deproduits de condensation avec les protéines et d'autres composés du bois,conduisant à une surestimation du taux de lignine; ou bien, au contraire, laprésence dans le bois de lignines solubles dans l'acide sulfurique à 72%, laproportion de cette lignine échappant ainsi au dosage peut varier en fonction de,.l'origine du bois ou de son degré d'altération par les pathogènes et, de ce fait,' ,',introduire une nouve lle source d'erreur.

* La méthode au bromure d'acétyle nécessite de travai 11er sur unmatériel parfaitement débarrassé des "extractibles" de nature phénolique quiconduirait à une surestimation des quantités de lignine. Par ailleurs ce dosagen'est pas très précis; la variabilité des résultats est telle qu'elle entraîne lanécéssité de multiplier les prises d'essais (5 à 6 par échantillon) pour obtenirune valeur moyenne fiable. . .

*La méthode à l'acide thioglycoliaue présente l'inconvénient de greiferun composé organique sur la lign'ine (substitution des hydroxyles de la chaînelatérale des unités phénylpropanes par le groupe (-S-CH2-COOH); c'est cettesubstitution qui rend la lignine soluble dans les solutions alcalines). Le taux degroupements substituables varie suivant le type de lignine et,vraisemblablement, suivant le type ou l'intensité de l'altération subie par lamacromolécule au cours de l'attaque parasitaire. La variation du nombre moyen degroupes thioglycoliques par monomère de la lignine se, répercuteraautomatiquement sur les mesures pondérales de la lignine ainsi extraite,

Cependant, .d'après VANCE et al. (1980), l'utilisation de cette techniquemérite d'être développée. En effet elle ne provoque pas de condensation entre lalignine et les autres polymères de la paroi. Par ailleurs d'après LAI et SARKANEN(1971) elle conduit à l'isolement ,d'une lignine, certes modifiée ch'imiquement,mais respectant le mieux possible la composition monomérique de lamacromolécule natureIle. .

Les résultats des dosages étant relativement homogènes, il est possiblede réduire le nombre de prises d'essais par échantillon (2 ou 3),

32

Tableau 2

Analyse de la lignine du bois: résultats comparatifs des dosages effectuéspar trois techniques différentes:

. .A - Dispersion des résultats en fonction de la technique de dosage

Techniques de dosage

Bromure d'acétyle Klason

Nombre de répétitions 5 4par échanti11~n

27 20,528,2 22,228,4 19,3

S 28,8 21,929,9

M 28,5 !: 1 21,0! 1,3

29,6 19,729,3 22,2

SF 29,5 23,629,8 21, 130,2

M 29,7:0,4 21,7:t1,6

LTG

3

22,323,321,7

22,0 !0,3

22,221,821,9

22,0 ::0,2

B - Taux de lignine: résultats comparatifs fournis par les trois techniques:

.Bromure d'acétyle Klason LTGPivot. A

S 28,6 21,0 20,9SF. 29,7 21,6 21,6PF 29,5 27,1 22,0P 27,9 20,6 18,2

Pivot BS 29,4 22,2 22,2PF 31.,6 23,8 23,6P . 340';- . 24,0 25,0,

Les résultats sont exprimés en pourcentage de 1ignine calculé par rapport aupoids de matière sèche de l'échantillon. S: tissus sains; SF tissus sa"ins dufront de progression du parasïte; PF: tissus paràsités du front; P: tissusanciennement colonisés.

" - "

33

Les tableaux 2 A et B présentent les résultats d'une comparaison entreles trois méthodes de dosages. Onnote en particulier la grande homogénéité desdosages par l'acide thiog1ycolique (Tab1. 2a). Le Tableau 2b montre que lesrésultats enregistrés par les trois techniques sont qualitativement comparab les(les variations "évoluent dans le même sens") ; en revanche les valeurs'quantitatives et l'amplitude .des var.iations diffère dans des proportionsconsidérables d'une méthode à -l'autre. Enfin la technique de K1ason et celle àl'acide thiog1ycolique conduisent à des résultats quantitatifs comparables, alorsque la méthode au bromure d'acétyle fournit des valeurs nettement plus élevées.

Toutes ces considérations nous ont conduit à choisir la méthode baséesur l'extraction par l'acide thioglycolique pour,.les dosages de lignine effectuésau cours de ce travai 1.

2° Dosage de la lign'ine par extraction quantitative à l'acidethiog1yco1ique. '

La lignine est extraite quantitativement à partir de 2S0 mg de sciure 60mesh (débarassée des extractibles) dans les condit1ons suivantes: extraction parun mélange de 0,4 ml d'acide thioglyco1ique et 5 ml d'HC1 durant-5 heures à 90°e.

. Cette suspension est filtrée sur verre fritté n° S ; le résidu'est lavé à l'eau, puisremis en suspension dans S ml de NaOH 2 ~ durant 24 heures à températureambiante. Elle est ensuite filtrée sur verre fritté nOS et le résidu lavé à deuxreprises par 5 ml d'eau. Filtrat et eaux de lavage sont regroupé's dans un tube à ~f

centrifuger préalablement pesé (tare), amenés à pH I,S par une solution d'HC1 SNentraTnant la floculation de la lignine thioglyco1ique.. ~I:;

Le floculat est centrifugé (10 minutes à IS 000 G) et le culot" est lavé àdeux reprises par S ml d'eau. Le culot obtenu après la dernière centrifugation estséché à 80°C durant 48 heures et pesé. Le résultat est exprimé en pourcentage delignine (sous sa forme thiog1ycolique) par rapport au poids sec de matériel initial(P.S. à 10SoC estfmé sur échantillon du matériel préalablement séché à 45°Cdurant 48 heures puis porté 48 .heures à 10S0e). Il est à noter que cette 1igninethiog1ycolique est soluble non seulement en milieu alcalin mais également dansune solution de phosphate de sodium à pH 6.

d) Composition monomérique de la lignine

1° Technique

* Oxydation au nitrobenzène alcalin

L'analyse monomérique est réalisée après oxydation de la sciure aunitrobenzène a1ca1'in qui provoque la rupture de la molécule et 1ibère les.

34

Ffgure 3 - Enregistrement graphique d'une séparation par HPLC des aldéhydesde la série benzoïque. A) composés témoins; B) échantillon obtenu paroxydation au nftrobenzène d'une sciure de tissus S.

313nm

I~c

280nm

A B1 , 'Ii: fI? ~.n

1 .' ,1

1<l': .

Iii::.1:;

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Il 1

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1: .'• 1 JI

~~j\i, :1"i::;J~

L'enregistrement est effectué en. parallèle à deux longueurs d'onde: 313 et280nm. B- p-hydroxybenzaldéhyde; 5- syrlngaldéhyde; Va vaniline; S'" acidesyrlngfque; X- composé non identifié.

35

monomères sous la forme d'aldéhydes de la serIe benzoïque; l'analyse esteffectuée dans les conditions suivantes (technique dérivée de celle de HARTLEY(1971» : 250 mg de sciure débarassée des extractibles sont mis en suspensiondans un mélange de 0,5 ml de nitrobenzène et de 5 ml NaOH 2 N. L'oxydation esteffectuée, sous agitation intermittente, durant 3 h à 160°C, dans un tube en acierinoxydable hermétiquement bouché. La suspension est alors refroidie, puis f'iltréesur verre fritté W 3 et le résidu est lavé par 3 x 5 ml d'eau, puis par 2 x 20 mld'ether. Filtrat et solutions de lavage sont versés dans une ampoule à décanter etextraits par 2 x 40 ml d'éther de manière à éliminer l'excès de nitrobenzène. Puisla phase aqueuse est amenée à pH 2,5 par une solution d'HCl 5 N, saturée en NaClet enfin extraite à deux reprises par 60 ml d'éther. La phase éthérée estrecueillie et filtrée sur Na 2S04 anhydre. Enfin le solvant est évaporé sec et le

résidu repris par 3 x 2 ml de méthanol pur.

* Identification et dosage quantitatif des aldéhydes de la sériebenzoïque

L'analyse monomérique est réalisée sur cette solution méthanolique. Lesaldehydes de la série benzoïque, résultant de l'oxydation de la lignine sontséparées en HPLC (High Performance Liquid Chromatography) sur colonne "c" 18" àl'aide d'un appareillage WATERS, dans les conditions suivantes: gradient: deméthanolS ---> 45% (dans de l'acide acétique à 1 %) ; débit: 1 n1l1mn ; tempsd'établ issement du gradient : 15 minutes ; standard interne : T7(=3,4,5-triméthoxybenzaldéhyde) à 0,5 mg par ml de solution injectée; volume dela prise d'essai: 5 à 10 ~ 1. .

Les essais (Fig. 3) révèlent que l'oxydation au nitrobenzène effectuée surla sciure extraite conduit à un nombre réduit de composés phénoliques parmilesquels prédominent la vaniline et la syringaldéhyde. A noter l'absence quasitotale de p-hydroxybenzaldéhyde et la présence d'un composé X, non identifié,élué entre le pic S et le standard T7. Dans quelques rares échantillons le pic Xétait aussi important que les pics S ou V. Enfin les conditions d'élution proposéesont toujours été respectées, le simple changement de débit (1 --> 2 ml/mn)provoque la superposition des pics S et V.

La pureté des pics V et surtout S est appréciée grâce à l'enregistrementde la DO à 280 et 313 nm ; le rapport 313/280 (rapport de la "hauteur" des pics)fournit une bonne indication à ce sujet. Lors d'une analyse portant sur 20échantilions de sciure provenant de différents types de tissus (S, SF, PF et P) lesvaleurs ci-dessou's ont été calculées pour le rapport 0°313/00280 :

,.

.....'

Tableau 3 - Composition roonomérique de la lignine: v~riab1lité au n1veç:lu desrendements de l'oxyd~tion de la sciure au nitrobenzène; stabilité desrapports S/V.

, ,Pivot 1 Pivot 2 Pivot 3

(R. UgnosusJ • (P• noxiusJ. (sa in)

v* S* SjV v* S* S/V v* S* . S/V

.1 2~41 4~79 L98 2~57 4~3 L67 2~0 4~7 2~35

2 2~86 5~34 1~87 2~85 4~78 1~68 2~32 5,56 2~39

TS 3 2~3 5~5 2~39- - - - - -4 - - - - - - 2~0 4,8 ' . 2,40

1 2~65 5~0 1~89 2 ~ 1 4 ~ 19 1~98 - - -TSF 2 2~83 5~3 1,87 2~78 5~76 2~07 - - -

,..

1 1~85 3~27 1J7 2 ~ 19 4~89 2~23 - - -TPF 2 2,94 5~2 Ln 2~24 5~23 2~33 - - -

,

1 1~82 2~57 1,41 L97 3,74 1~89 - - -TP '2 2~65 4~0 1~50 2~5 4~68 1~87 - - -

* Valeurs exprimées en pourcentage par rapport au poids sec (105°) de sciure.

37

Rapport:00313/00280

V 5 T7

Echantillons de sciure (*) 0,69 1,19 0,480,01 0,06 0,00

Etalon expérience 1 0,69 1,38 0,45expérience 2 0,68 1,35 0,49

On note que la syringaldéhyde est légèrement contaminée par un composéentraînant la réduction du rapport 0°313/0°280' Les pics (Fig. 3) sont cependant

très symétriques et la dispersion des valeurs du rapport est faible indiquant quela contamination du pic 5 est dans tous les échantillons. Les conclusions desétudes comparatives ne seront donc pas affectées' par cette légère (etsystématique) contamination de la syringaldéhyde.

2- Expression des résultats

Les résultats sont exprimés uniquement sous la forme du rapport S/V,(rapport molaire) indiquant des variations relatives entre ces deux monomères.La p-hydroxybenzaldéhyde (6) n'a pas été prise en consIdération,quantitativement elle est toujours néglIgeable par rapport aux deux autresaldéhydes (0,6 à 1%par rapport à la somme: B + V + 5).

Nous n'avons pas cherché à exprimer les quantités d'aldéhydes parrapport au poids de sciure soumis à l'oxydation en raison des incertitudesconcernant les rendements et la reproductibilité de la réaction d'oxydation.

Concernant ce dernier aspect il convient de noter (Tableau 3) que lesrésultats d'analyse d'un même échantillon sont souvent dispersés (surtout dans lecas d'échanti lIons de tissus parasités), alors que les rapports S/V sont aucontraire très homogènes. Ceci signifie que si les rendements de l'oxydation sontvariables, par contre ces variations sont identiques pour 5 et V. Il en résulte queles variations des rapports S/V enregistrées pour différents types de tissus ontune réelle signification.

38

V. AUTRES TECHNIQUES ANALYTIQUES

1. Séparation des oses et oligosides par chromatographie surgel de silice

La séparation des sucres résultant de la dégradation de la 1ignoce11u1osepar les filtrats de culture de R. /ignosus et P. noxius (milieu réactionnel:1ignocellu1ose 1 ro en suspension dans un tampon citrate 0,0125 t1 pH 4,6 + filtratde culture en Quantité variable) est réalisée par chromatographie sur plaque degel de s'i1ice de 0,25 mm d'épaisseur (precoated TLC plates 5ilica gel 60 ; Merk).Volume de dépôt: 10 III du milieu réactionnel, 5 III pour les sucre-témoins ensolution à O,OIM dans de l'eau distillée. Solvant de migration: propanol-eau:85/15 (v/v) (l'acide galacturoniQue migre très peu dans ce système) ou Butanol ­acide acétique-eau : 4/2/3.' Révélation des chromatogrammes : aprèspulvérisation du révélateur (diphény1amine à 1 % dans de l'acétone: 100 ml + 1ml d'aniline + 10 ml d'acide orthophosphoriQue 85 %) les plaques sont chauffées à105 0 C. durant 5 à 10 minutes. Les sucres sont révé1és sous forme de spotsbleu-foncé sur fond blanc.

2. Finger-print trypsique des protéines des peroxydasespurifiées

Les peroxydases purifiées sont dialysées contre de l'acide acétique à0,5% puis lyophy1isées. L'hydrolyse par la trypsine est réalisée dans lescond i t ions su ivantes: deux ,add i t ions, à deux heures d' interva 11 e, d'une Quant i té de.trypsine correspondant à 1/50 du poids de protéine à hydrolyser; tempsd'hydrolyse total: 4h en tampon ambic 0,001 M à 3rc. L'hydro1ysat est 1iophy1 isépuis repris par 20 III d'acide acétique à 10%. Dépot sur la plaque: 10 Ill, suivid'une séparation bidimentionnelle: 1: électrophorèse sous 400 V durant 90 mndans le sytèrrie : pyridine 1°ml + ac. acétique: 20 ml + acétone: 75 ml + eau: 395ml. 2: chromatographie dans le système: pyridine: 100 ml + ac. acétique: 30 ml +

n-butano 1: 150 n11 + eau: 120 ml. .

39

"

CHAPITRE 1

MODIFICATIONS DE QUELQUES ACTIVITES ENZYMATIQUESACCOMPAGNANT L'ATTAQUE PARSITAIRE; SIGNIFICATION DE CES

PERTURBATlONS.

L'objectif de cette premiere approche est triple:

- effectuer un inventaire des pertubations accompagnant l'agression desracines d'Hévéa par R. lignosus et P. noxius;

- vérifier si ,les perturbations induites au niveau des tissus de l'hôte sontspécifiques de chaque parasite;

- préciser la signification probable de ces perturbations, enzymes de"réaction" de l'Hévéa ou enzymes d'''agression'',. en déterminant l'origine de cesenzymes présentes dans 1es tissus paras i tés.

. -1. PERTURBATIONS ACCOMPAGNANT L'ATTAOUE PABASITA~RE.

Cette investigation s'avérait indispensable du fait qU'aucune donnéen'était disponible, dans ce domaine, sur les couples Hévéa-R. lignosus ou P.noxius. De manière plus générale ce type d'étude n'a été effectuéqu'exceptionnellement dans le cas de couples hôte-parasites où l'hôte est unorgane ou un tissu lignifié de plante arbustive et le parasite un agent depourriture du bois. Ainsi SHAIN (1971) aborda l'étude de la répartition de lalaccase selon la nature des tissus (sain, réactionnel ou nécrotique) pour le coupleEpicea-Fomes annosus. JOHANSSON et THEANDER (1974) étudièrent larépartition des activités: 0- et p-diphénoloxydases et peroxydase chez le mêmecouple hôte-parasites. Enfin WOODS et HOU"IE (1974) montrèrent que l'activitépectinolytique était beaucoup plus active dans les tissus de l'aulne parasités parCeratocystis ulmi que dans les tissus sains correspondants. Cependant dans latrès grande majorité des cas les recherches effectuées in vivo sur des organeslignifiés de plantes arbustives attaquées par des agents pathogènes concernaientdes modifications de l'équilibre ionique (SHAIN, 1971 ; JOHANSSON et THEANDER,1974) ou phénolique (SHAIN et HILLlS, 1971), l'effet d'''extractibles'' surl'activité d'e~zymes excrétées par des agents pathogènes (JOHANSSON et aL,1974; CERNY, 1973 ) ou l'action fongitoxique de tels extractibles (HUBBE5 et McGAULEY, 1976; JENG et aL, 1983; POPOFF et ELGERSMA, 1973) et la formation du

'.

.-~.

Figure 4 - Comparaison des activités enzymatiques présentes dans différentstypes de tissu (a) et filtrats de culture (b).

(a) Tissus de Pivot adulte

Pax

48571

: .".· .".

Lace

458..·.·.........'..........··········..·o 0 :: .'.

Pect

30

:11

00 ? Iii00 + :::

~gal CMCell

23,5 2065

olgal

94

(b) Filtrat de Culture

~ glu

48

11,1 10.6 30, 1 4,4 194 2 ,9

....

....

+. ..L N

S R L N

Pase

o

100

Q)

>-co-Q)...

'Q).-> 100.-.....u

c:x:

50

(8): S= tissus sains; R= tissus de réaction; L=tissus parasités par R. lignosus; N= tissusparasités par P. noxius,' nombre de répétitions:S: 8; R: 6; L: 3 (sauf pour l'octivité peroxydesique(Pax): 21 b); N: 8. (b): L= filtrot de culture de R.lignosus; N=filtrat de culture de P. noxiusNombre œrépétitions: L: 3; N: 4.

·.41

\"bois hum ide" (WORRAL et PARI"IETERJ 1982). On note enfin des tentatives ayantpour but de corréler activités enzymatiques testées in vitro et pouvoirpathogène de certaines souches de champignons (SVALDI et a1.J 1981 ; ELGERSMAJ1976).

Concernant les coup les Hévéa- R 1ignosus et Hévéa- P noxius, nousavons entrepris de comparer l'équipement enzymatique de quatre types de tissus;tissus sains (S)J tissus parasités par R -;ignosus (L)J tissus parasités par Pnoxius(N) et tissus réactionnels (R) formés par l'Hévéa en réaction à l'infectionpar R lignosus ou plus fréquemmentJ par 5pIJaerostylbe repens. Les tissus(R) ne sont pas colonisés par les parasites. Cependant du fait des conditionsparticulières de leur" formation ils sont susceptibles d'être le siège deperturbations biochimiques et donc de se différencier d'un tissu sain "normal".Enfin l'analyse des' perturbations a été effectuée pour les huit activitésenzymatiques suivantes phosphatase acide b-g1ucosidaseJ a- etb-ga1actosidaseJcarboxymethy1-ce11u1aseJpectinaseJ laccase et peroxydase.

Résultats

L'histogramme (Fig. 4a) révèle queJ de manière très globaleJ les tissusparasités sont plus "riches" en activités enzymatiques que les tissus sains ouréactionnels. Cette différence se situe non seulement au plan quantitatif maiségalement Qualitatif: .

* Au plan qualitatif: trois enzymes (CM-cellulaseJ pectinase et1accaseJ dont on peut présumer l'incidence majeure dans le déroulement de lapathogénèseJne sont présentes ( ou dosables) Que dans les tissus parasités.

* Au plan quantitatif :' à l'exception de la phosphatase etJpartiellementJ de la b-glucosidaseJ le niveau d'activité des enzymes des tissusinfectés est très supérieur à celui des enzymes homologues extraites des tissussa ins ou réact ionne1s.

D'autres comparaisons sont possib les:

a) Tissus sains --) tissus de réaction

Les activités enzymatiques des extraits de tissus réactionnels sontinférieures à celles des extraits de tissus sains. Si l'on considère lesphosphatases et les glycosidases comme des témoins d'une activité lytiQueJ ilparaît logique que les tissus de réactionJ en pleine extensionJ soientJ moins quetout autreJ le siège d'altérations de ses polymères structuraux.

De même l'augmentation de l'activité de la peroxydase peut s'expliquerdans la mesure où cette enzyme participe (ceci reste néanmoins à démontrer) à lasynthèse de la fract ion 1ignine des parois de ces tissus.

• -f';,-,

~..'

42

b) Tissus parasités par R. lignosus-:--->. tissus parasités par P noxiu5.

De manière très générale et si l'on excepte le cas des phosphatases,l'activité de l'ensemble des enzymes hydrolytiques est plus élevée dans lestissus parasités par P. noxius que dans ceux infeçtés par R. lignosu5. Cettedifférence est particulièrement nette pour les activités. a-galaètosidaseCM-cellulase et pectinase. En revanche la situation est totalement inversée en cequi concerne les enzymes à caractère oxydasique : laccase et peroxydase.

Les résultats enregistrés au cours de cette approche globale montrentdonc clairement que 1"agression pe:trasitaire provoque, au sein des tissusde l'Hévéa, une perturbation de l'équipement enzymatique à la fois auxplans qualitatif et quantitatif. L"ampntude de cette perturbation estfonction de :

- la nature de .J"activité enzymatique- et, pour chacune de ces activités, de 1"identité de ragent

pathogène infectant.

Cette corrélation entre les modifications métaboliques identifiées dansles tissus et l'agression parasitaire ne permet cependant pas, à ce stade, depréciser la signification, des perturbations. L'augmentation de l'activitéenzymatique dans les tissus infectés peut en effet avoir deux originesdifférentes ayant des implications opposées au plan du processus pathogénique:

. - Réaction de l'hôte: s'il en est ainsi, l'accroissement des activitésenzymatiques où l"'apparition" d'enzymes nouvelles résulterait respectivementd'une stimulation de la biosynthèse d'enzymes initialement présentes dans lestissus sains, ou de l'induction de la biosynthèse de protéines originellementreprimée dans ces tissus. Les enzymes concernées pourraient participer auxmécanismes de défense de l'hôte contre le parasite notamment en dégradant lespolymères de structure de la paroi mycélienne. Un tel mécanisme a en effet étémis en évidence dans le cas de la b( 1->3)-:-glucanase (PEGG, 1977 ; WARGO, 1975).

- Excrétion, dans les tissus de l'hôte, d'enzymes produites par le parasite: ces enzymes participeraient alors à la pathogénèse en dégradant les po lymèresdes tissus envahis.. C'est l'hypothèse la plus fréquemment proposée et vérifiée(ALBERSHEIM et al, 1969).

Le cas de certaines b-( 1->3)-glucanases illustre parfaitement cettedualité: synthétisée par la plantule de tomate, elles dégradent les b-:( 1-> 3)­glucanes du parasite Vert icilliu.m alboatrum ~P.EGG et YOUNG, 1981; YOUNG etPEGG, 1981 L; synthétisées par Colletotric/7um 'Iagenarium, elles dégradentles glucanes des tissus du melon (RABENANTpAN.l~RO ,et a/.,~ 1976). '.

C'est pourquoi. il était indispensable de vérifier,' par :des méthodesdirectes ou indirectes, l'origine des enzymes présentes dans les tissus parasités.

. ,

43

II. ORIGINE DES ENZYMES PRESENTES DANS LES TISSUSPARASITES.

Cette vérification a été conduite en plusieurs étapes. Les deux premières(la comparaison entre le niveau d'activité des enzymes des tissus parasités· etcelui des filtrats de culture et l'examen de la répartition spatiale des enzymes ausein des pivots) permettent d'apporter une réponse partielle à la question. Latroisième, réservée aux cas litigieux, consiste en une comparaison directe, parélectrophorèse, des enzymes respectivement extraites des tissus parasités et decelles contenues dans les filtrats de culture des champignons.

1. COMPARAISON ENTRE ACTIVITES ENZYMATIQUES MESUREESIN VIVO (PIVOT O'HEVEA) ET IN VITRO(FJLTRAT DE CULTURE).

L'information la plus significative fournie par l'analyse des tissusracinaires réside dans le fait que certaines enzymes sont exclusivementprésentes dans les tissus parasités. L'hypothèse la plus vraisemblable est queces enzymes sont synthétisées par le parasite et non par l'hôte:lEncore fallait-ilvérifier que les champignons soient bien capables d'en effectuer la~biosynthèse.

La figure 4b montre que ces enzymes (CM-cellulaset pectinase etlaccase) sont bien excrétées ill vitro par les parasites. De plus les capacitésd'excrétion manifestées par R ligllosus et P Iloxius reflètent ·les niveauxd'activité enregistrés, pour les trois types d'enzymes, dans les tissus parasitésrespectivement par ces agents pathogènes.Ainsi l'activité laccase est bien plusélevée dans les cas (filtrat de culture et tissus parasités) où se trouve impliquéR ligllosus, que dans ceux impliquant la présence de P. llox!Us. La situation estinversée pour les activités CM-cellulase et pectinase.· .

Ces deux observations, absence des trois enzymes des tissus sains ethomologie entre tissus parasités et ·,filtrats de culture, suggèrent quel'augmentation de l'activité des CM-CellUlase, pectinase et laccase des tissusinfectés ne résulte pas d'une manifestation réactionnelle de l'hôte mais d'uneexcrétion par les parasites des protéines enzymatiques correspondantes.

Les quatre activités enzymatiques: phosphatase, b-glucosidase, a- etb-galactosidases, .sont présentes dans les tissus sains (Fig. 4a) et. dans lesfiltrats de culture (Fig. 4b). Les enzymes correspondantes des tissus parasités·peuvent donc avoir pour origine soit l'hôte, so(t le parasite (soit les deux en casde coexistence des deux types d'enzyme).

Cependant la comparaison des niveaux d'activité relatifs des quatreenzymes suivant leur provenance: '.

\.

44

Figure 5 - Etude comparative de l'activité des phosphatases acides, a- etb-galactosidases et ~-glucosidasesdans: les, tissus sains, les extraits de

, tissus infectés respectivement par R. lignos{/s et P. noxi{/s et lesfiltrats de culture des mêmes champignons.

Tissus de Pivot, adulte

infectés par sain

100

50

Q)

>-~Q)... 0

R.lignosus

47,3

28

17,8

P. noxius

94 225

30

Fi Itrat de Culture

100.4)->.--(,)<

50

, 0

R.lignosus

8

2,2 ,

0,9

P. noxius

30,1

@Ii:::.:::...................:-:.:-:-::::::::::

11,1 10,6 ~?{

.It~ 4,4.......... ...:~?? ~~r~

D Pase

• ~ glu

..... ••••••• A 1::=:::: ,.. 9 a

45

- Tissus parasités par R. lig/7oSUS (--) filtrat de culture deR.Iig/7osusJ

- Tissus parasités par P /7oxius (--) filtrat de culture de P /7oxius'

révèle une très nette simi litude entre tissus parasités et filtrats deculture homologues. L'histogramme (Fig. 5), réalisé à partir des donnéesrecueillies pour les quatre activités enzymatiques mesurées selon des méthodessimi laires (activités exprimées dans les mêmes unités), fait clairementapparaître cette homologie. Il est à noter, en outre, que l' a-galactosidaseconstitue, en première approximation, un caractère spécifique et distinctif de A/7oxius, tant en culture pure qu'au niveau des tissus infectés.

De façon plus générale, on remarque également que, chez P noxius,l'activité des hydrolases est prédominante par rapport à l'activité laccase;comme déjà signalée. cette "balance" est inversée pour R. lifl/70SUS.

L'ensemb le de ces données nous conduit à penser que les activitésenzymatiques des tissus paras1tés sont d'origine fongique. Au plan desproportions relatives de ces différentes activités les extraits de ces tissusconstituent en quelque sorte une empreinte de celle des filt~ats de culturehomologues. :-

2. REPARTITION SPATIALE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES• ,,~ ..~,t.

Afin de conforter cette hypothèse, nous avons étudié la répartitionspatiale des différentes activités enzymatiques dans des pivots partiellementenvahis par R. lig/7oSUS ou P /7oxius. Cette étude a été réalisée en analysantdifférents types de tissus prélevés dans des zones caractéristiques des pivots(Fig. 2).

a) Pivot partiellement colonisé par P noxius.

L'histogramme (Fig 621) révèle au moins trois types de situations suivantl'activité enzymatique considérée.

Le plus fréquemment on observe une augmentation progressive desactivités selon la séquence: tissus de type 5 --) SF --) F --) P --) PA ;c'est-à-dire: tissus sains --) tissus les plus anciennement envahis. Les activitésenzymatiques concernées par ce schéma sont les suivantes: b-galactosidase,CM-ce lIulase, pectinase et, à un moindre degré, a-galactosidase, b-glucosidaseet laccase. Notons que les tissus sains ne contiennent· ni CM-cellulase, nipectinase, ni laccase, en accord avec les résultats évoqués plus haut.

Une telle répartition des activités enzymatiques est en faveur d'une"relève", dans les tissus parasités, des enzymes originellement synthétisées parl'hôte dans les tissus sains; cette relève est assurée par les enzymes excrétées

E..!.9~re 6 - Répartition spatiale des activités enzymatiques.,

Tissus de Pivot adulte partiellement envahis, par

'@glu

88·

()( gal

127

( a) P. n 0 x i u s

~ gal CMCell44 6240

Peet

168

Laee

90

Pox

10100

00 00 :: +

89

++++

(b) R. 1ignosus

21

00++ 00 ? ?

225..

0011 +

67500

s== tissus sains; SF'" tissus sains proches du front de progression duparasite; PF= tissus parasitésprélevés au niveau du front; P tissus parasités pélevés dans une zone anciennement colonisé8; PA=tissus œtype alvéolaire.

47,:' ~.,

par le parasité:~\:ett~.~yp~,~D~se é~~ d'autant PI~s vrai'se,~b,lable q~e, les tissus detype alvéolaire J ·siège,:dé.$·,actiyi~és les plus, élevées J ·sont de toute éVldencemorts. Ils son't'· pàr', cOr)'~equent',incapàbles d'une réact~on exigeant notamment1'1ntégrlté du système re?ponsat>1~ de la biosyn,thèse protéique. '

.' '~. ~'..' . '..t: '. . .' ,~ .

Un seco~d type< de sltuatlo'n co~cerne là Phosphatase ; ici le gradientd'activité est inversé; l'activité diminue suivant la séquence tissus S --)tissus A. On peut donc estimer que l'activité phosphatase des tissus parasitésreprésente simplement une activité résiduelle du pool enzymatiqueoriglnellement synthétisé par l'hôte et non renouvelé après attaque par lesparasites.

, Enfin le cas des pe~oxydases est tout' à fait partlculler pUlsque J le long de, la séquencé tissus 5 --) tissus A J on observe J au niveau PFJ une augmentationbrutale de i'activité J suivle d'une chute toute aussi rapide à mesure que l'ons'é loigne vers 1a. zone A. Deux hypothèses peuvent être avancées pour e~p1iquercette sltuaÙon: . " ,

- Réaction de l'hôte: dans les tous' premiers instants de l'agression' labiosynthèse des peroxydases est activement stimulée. Au stade ultérleurJ suite àla nécrose tissulaire en voie d'installation ce pool peroxydasique n'est plusrenouve lé et la chute de l'activlté est fonct,ion de la stabi 1ité de l'enzyme.

- Excrétion d'une (ou de plusieurs) peroxydase(s) par le parasite: dans cecas la sécrétion n'est que transitoire contrairement à ce que l'on obse~e pour lesenzymes cellulolytiques ou pectinolytiques. .

Il n'est d'ailleurs pas exclu que les deux phénomèr"!es puissent coexisterJ

P noxius (contrairement à R. /ignosus) excrétant une peroxydase J in vivo.

b) Pivot partiellement colonisé par R. /iqnosus

La.figure 6b montre que le schéma général décrit pour des pivots attaquéspar P noxius est également applicable ici. Les hydrolases (à l'exception de-laphosphatase) des tissus parasités sont d'origine fongique.

L'accroissement de l'activité peroxydasique ne résulte vraisemblablementque d'une réaction de l'hôte J R. / ignosus n'excrétant pas cette enzyme in vitro.<GEIGERJ 1975). . - .

La laccase est vraisemblablement d'origine fonglque J la chute brutale deson activité au niveau des tissus P pourrait être ahribuée à une inhibltion del'enzyme ou à une répression de sa biosynthèse par des produits de dégradatlondes tissus; cette hypothèse reste cependant à vérifier.

Dans le cas particulier de la laccase la réalité de cette répartit~on

spatiale de l'enzyme a pu être démontrée in situ'par révélation de l'activitéenzymatique dans les tissus J après pulvérisation du réactif au gaïacol sur lasurface d'un pivot fraîchement tronçonné et dégauchi. Le résultat de cetteexpérience (Flg. 7) montre que ,1'activlté laccase est maximale au voisinage du

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A

48

B

Figure 7 - Répartition spat1ale de l'act ivité laccase au sein d'un pivotinfecté par R. lignosus Aspect du pivot avant (A) et après (8) révélation del'activité enzymatique ln situ (la révélation est réalisée par pulvérisationdu milieu réactionnel sur la surface du pivot fraîchement tronçonné etdégauchL

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front de progression du champignon Üo'rw d~ Ùssûs ~F) et qu'elle est nulle dansles tissus sains. ' , ';', ',: <',:, ", ( .. ' , ':" '

Des essais simllàires on(été réalisé~ dans ,le but"de mettre en évidencel'activité peroxydaslque:, ,,Ils ont' révélé' que' cette' 'activité' est présente dansl'ensemble du pivot: tissùs sains et parasités. Sa répartition n'est cependant pashomogène; l'activité est importante da'ns- la zone S et, ~urtout, ,la zone PF, elleest, modérée dans la zone p,. Pour, certains pivots on' 'a, noté l'e'xistence d'une,-frange- de tissus éorrespondant à la zone SF où l'activité peroxydasique estanormalement faible. Enfin, au niveau des tissus S la coloration dûe à l'oxydationenzymatique du gaiàc.ol 'est transitoire: après "quelque temps son intensitédiminue. Ceci s4ggère l'existence, dans ces t,'Î'?,sus, d',un système enzymatique ounon enzymatique capabl.e 'de réd,uire les p'roduifs d',oxyd~t.ibn du g~ïaco1.

, 3. VERIFICATION EN ELECTROPHORESE DE,'L',; ORiGINE' 'OÈ,CERTAINES ENZYMES DES TISSUS' PARASITES ' ,

Cette ultime vérificatio,rt a été réalisée pour trdis, types d'enzymes(phosphatase, laccase (R 1ignosus) et pe~oxidase) en raison des incertitudesquant à leur origine. '

. ,

1-) Acitvité phosphatase ..1

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Globalement cinq isoenzymes 'différentes ont, été identiffé~s (Fig. Ba):trois dans les extraits de tissus sains, une dans les tissus parasités par R.lignosus et un~ dans les tissus infec'tés par P. ,nOxiUs. Le~'.isoe.nzymes destissus parasités sont différentes: de celles des tissus sains. L'hypothèse que nousavions proposée pl~s .haut, selon ,laquelle l'activité phosphatase des tissusparasités serait une activité résiduelle du pool ~nzymatique préexistant dans lestissus alors qu'ils se trouvaient au stade S ou SF est donc, à rejeter. Enfin cemême électrophorégramm~, ainsi que le.diagramme de la figure Bdrrévèle que lanature de l'isophosphatase de 'chàque type de'tissu parasité est spécifique de lanature de l'agent pathogène infectant.

Ainsi, tout comme les' autres hydrolases, les phosphatases destissus parasités sont d'origine fongique.'

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2-) Activité laccase

, ,

Les résultats de l'analyse électrophorétique (diagr:-amme Fig.Bb) montrentque les tissus parasités par R Ilgnosuscontiennen't deux isoenzymes identiquesà celles excrétées in vitro par le champignon. " ,

L'hypothèse de l'origine fongique des lac'cases des tissus parasités estdonc confirmée. Ce résultat diffère de celui obtenu par 5HAIN (1971) qui conclutà l'existence de deux types de laccases; l'un présent dans l.es tissus réactionnelsde l'Epicea infectés par Fomes annos(Js, serait synthétisé pal~ l'arbre ; lesecond, présent dans les tissus envahis par le parasite, serait d'origine fongique.

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50

Figure 8 - Electrophorégrammes de dffférentes enzymes présentes, soft dansdes extra1ts de tissus, soft dans des filtrats de culture; (la révélation estbasée sur l'activité catalytique des enzymes).

pPF

SF

CN

CN+L

CL

CL

CN+L

CN.

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P P S P C C + R S R SN N L L N L1 L1 L2 L2 L

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Il

a) phosphat8se oclœ: s= tissus sains; PN et RL= tissus parasités par P. noxius et R. lignosus,CN et Cl = f11trats lE culture œP. noxlus et R. Iignosus. b) loccase: PL 1. PL2 = loccasesL1et L2 purtf1ées à parttr œtissus parasttés par R.llgnosus ; CL 1+L2 =loccase L1et L2 dufiltrat œculture œR.lignosus. c) peroxydase: R: tissus œréoction; S: Tissus sains; PL: tissusparasttés par R. lignosus. d) phosphatase: différenciation entre les enzymes du filtrat œculturede P. noxius(CN) et R. lignosus(CL); CN + L: mélange des deux filtrats. e) ltœ8S8: mêmeexpértence que pour la phosphatase (d). f) peroxydase: ptvot tnfecté par P. noxlus. Stissus satns;SF: tissus sains proche du front de pr<vession du parasite; PF: tissus parasités du front; P: tissusparasités éloignés du front.

51

Notons enfin que les deux laccases excrétées par R. 1igno5u5 sontdifférentes de celle produite par P noxiu5 (diagramme Fig 8e).

3°) Activité oeroxydasique.

Le diagramme électrophorétique (Fig.8c) met en évidence une perturbationcomplexe de la biosynthèse des peroxydases dans les tissus parasités par. R.ligno5u5 dans lesquels apparemment J une seule des isoenzymes J originellementprésentes dans les tissus sainsJ subsiste. Aucune isoenzyme nouvelle dont lasynthèse serait éventuellement attribuable au parasite n'est révélée. Ainsil'augmentation considérable de l'activité peroxydasique dans les tissus de typePF résulteJ pour l'essentiet de la stimulation (biosynthèse ou act1vité) d'uneseule isoenzyme appartenant à l'hôte. Là encore l'hypothèse que nous avionsproposée est vérifiée. Dans le cas des tissus réactionnels l'augmentation del'activité peroxydasique concerne au moins deux isoenzymes.

L'étude de l'infection par P noxiU5 présente une difficultésupplémentaire du fait que le parasite excrète une peroxydase in vitra Lasituation est donc voisine de celle qui prévaut pour d'autîes enzymes ;phosphatase ou glycosidases par exemple.

Les résultats de l'électrophorèse (Fig. 80 montrent qu'au. stade PFl'activité d'une seule des isoenzymes initialement présentes dans les tissussains est stimulée (i 1 s'agit de cette même isoenzyme dont l'activité augmenteaprès une attaque par R. ligno5u5). Par ailleurs deux isoperoxydasessupplémentaires sont détectées dans les extraits de tissus P; eHescorrespondent à des enzymes excrétées par le champignon.

Nous étudierons plus en détail ces enzymes dans le cadre des réactions del'Hévéa à l'agression parasitaire.

En résuméJ l'analyse électrophorétique révèle que les activitésphosphatase et laccase des tissus parasités sont d"origine fongique.En revanche J'activité peroxydasique de ces mêmes tissus corrèspondexclusivement à une réaction de l'hôte en cas d"attaque par R.lignosus et à un mélange d'enzymes de rhôte et du parasite (au moinsdans les premiers stades de l'attaque) en cas d'infection par P. noxius.

III. DISCUSSION ET CONCLUSIONS

Les résultats majeurs qui découlent des analyses enzymatiqueseffectuées in vivo sont les suivants:

L'infection par l'un et l'autre parasite provoque dans lestissus de J'hôte une perturbation considérable de certains sy'stèmesenzymatiques.

Fig~re 9 - Représentation schématique de l'évolution des activitésenzymat.iques da~s un tissu déterminé, en fonction de la progresston desparasites (évolution des tissus du stade S au stade P).

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Les modèles proposés correspondent il l'évolution des EK:tivités enzymatiques suivantes:A) phosphatase ocide. b-glucosldase. a- et b-galoctosidase; B) CM-cellulase. pectlnase et loccase;C) et D) peroxydase respectivement en cas d'infection par n. /ignosils et P. nOX;IIs. ( .-_;enzymes de l'hôte; * -*: enzymes excrétées par les parasites)

53

- A l'exception des peroxydases~ les enzymes détectées dans lestissus parasités sont identiques à celles excrétées par leschampignons in vitro.

- L'analyse des proportions relatives des activités enzymatiquesdétectées dans les tissus parasités et les milieux de culture, l'étude de larépartition spatiale de ces enzymes dans les pivots et enfin la caractérisationélectrophorétique de certaines d'entre elles révèlent que hydrolases(glycosidases et phosphatases) et laccases des tissus parasités sontd"origine fongique. L"activité peroxydasique des tissus parasités estdOe exclusivement à des enzymes synthétisées par l"hôte en casd'infection par R. lignosus et à un mélange d'enzymes de l'hôte et duparasite en cas d"attaque par P. noxius.

- Les proportions relatives entre laccase et hydrolases sontspécifiques à chacun des deux parasites (in vivo et in vitro).

L'ensemble de ces résultats permet de tirer les conclusions suivantes:

* Dynamique d'évolution des activités enzymatiques au sein despivots.

Les données, en particulier celles Qui résultent de J'étude de larépartition spatiale des enzymes dans le pivot, permettent de proposer un schémagénéral du déroulement, dans le temps, de l'agression des tissus lignifiés. Eneffet, au fur et à mesure de la progression d'un parasite dans le -pivot, un tissupasse par les différents "états" suivants : Tissu sain (éloigné du Jront deprogression du parasite) (S) ---) tissu sain proche du front (SF) ---) tissuparasité du front (PF) ---) tissu parasité éloigné du front (P)---) tissualvéolaire (PA) (éventuellement). Pour un tissu sain~ situé dans une zonedéterminée du pivot~ le délai qui le séparera du stade PF dépend de sonéloignement par rapport au front et de la vitesse de progressionintratissulaire du parasite qui, elle même, est sous la dépendance demultiples facteurs liés à l'agressivité du parasite et aux capacitésréactionnelles de l'hôte; le délai nécessaire pour atteindre le stade P (ouPA) dépendra essentiellement de l"aptitude du parasite à dégrader les,po lymères du bois.

D'après l'aspect des histogrammes et compte tenu de l'origine desenzymes, les différentes situations peuvent être schématisées sous la forme deQuatre modèles <Fig. 9): .

- Le modèle A présente l'évolution "moyenne", en fonction du temps (pré­et post-infection), de l'activité des phosphatases et des glycosidases.

- La variante B concerne les enzymes suivantes: CM-cellulase, pectinaseet laccase. Elle se différencie du précédent par le fait Que l'activité de cesenzymes est nulle dans les tissus sains.

-Le modèle C représente l'évolution de l'activité peroxydaslque et tient

54

compte du fait que cette enzyme n'est synthétisée que par J'hôte.La variante D présente J'évolution particulière de J'activité

peroxydasique qui prévaut en cas d'infection par .p. noxius (existence de deuxcatégories d'enzymes) l'une synthétisée par l'hôte} l'autre par P. noxius).

On remarquera que pour les modèl~~ A et D nous ayons admis la présencesimultanée} dans les tissus PF} d'i.soènzymés synthé,tisées 'par l'hÔte et' d'autrespar le parasite. Une telle situation existe en effet' pour la'pe'roxydase dans lestissus attaqués par P. noxius. Il n'est cependant pas exclu qu'i 1 s'agisse d'unartefact} le mode de prélèvement des tissus (au ciseau à bols) étant réellementtrès grossier. Seule une étude en ,immunocytochimie pourrait apporter desinformations plus précises à ce sujet.

Ces courbes ne sont que des modèles; le nivèau d'activité desenzymes ainsi que les valeurs réeJJes de ·t·, c'est-à-dire des délaisséparant le stade (5) des stades (P) ou (A) dépendent notamment,enzyme par enzyme, des capacités de synthèse des tissus sains, desaptitudes d'excrétion du parasite et des capacités réactionneJJes deJ'hôte.

* Excrétion. In vitro et ln vivo de la laccase; significationprobable au plan taxonomiaue.

Si J'on considère l'excrétion de la laccase par des champignonscomme témoignant de leur aptitude à dégrader la lignine (voir discussionà ce sujet chapitre Il), il en découle que P. noxius doit· être classéparmi le groupe des agents de pourriture blanche au même titre que R.lignosus.

* Signification de la "balance" entre activités hydrolasigues et activitélaccase suivant la nature qe l'agent pathogène. '

D'après la nature des enzymes qu'i ls excrètent} les deux champignons sontthéoriquement capables de dégrader à la fois la lignine et les principauxpolyosides. Cependant il existe une différence considérable entre cesdeux agents pathogènes au niveau des proportions entre activitéshydrolasiques et activité laccase. On peut donc penser que si lesactivités enzymatiques qu'ils excrètent interviennent effectivementdans la d~gradation des polymères pariétaux de l'hôte, alors R.lignosus s'attaquerait en priorité à la fraction lignine, tandis queP.noxius dégrad~rait .préférentiellement la fraction polyosidique.Cette. différence .devrait se répercuter sur le comportementparasitaire: le premier coloniserait surtout les tissus l1gnifiés duxylème:' le second' s',attaquèrait de façon privilégiée aux tissus de type·ceJ1ulosique-. . , ",

Ce sont ces hypothèses que nous tenterons de vérifier, .

55

CHAPITRE Il

l'AGRESSION PARASITAIRE; ROlE DES ENZYMESEXCRETEES PAR LES PARASITES

Les enzymes excrétées par les champignons, I/J vivo et I/J vitro. nesont susceptibles d'Intervenir dans le comportement parasitaire que dans lamesure où elles participent effectivement à la dégradation des tissus de l'hôte. Ilétait donc essentiel de vérifier l'action des enzymes recuelllles dans les filtratsde cLllture de R. lig/JOSUS et de P. /Joxius sur différents polymères <lIgnine etpolyosides) ainsi que sur le substrat naturel. Au préalable nous avons effectuéune brève étude de que Iques caractéristiques de l'excrétion des enzymes prisesen compte. Enfin, nous avons clos cette partie des recherches par la purificationpartielle des enzymes excrétées par P. '/Joxlus afin de mettre en évidence ladiversité de l'équIpement enzymatique de ce parasIte.

1. MODALITES DE L"EXCRETION DES ENZYMES

"1. EXCRETION EN fONCTION DU TEMPS.....~.

Cette étude a été réalisée en cultivant les deux champignons sur desbûchettes de bois décoùpées dans des racines d'Hévéa. Cette technique de cultureprésentait l'1ntérêt de confronter les champignons à un substrat quI du poInt devue de la compositIon des polymères de structure est IdentIque à ce lui qU'lIsrencontrent dans la nature (dans ce dernfer cas Il s'agit cependant d·un tissuvivant, capable de réaction, et non d'un substrat Inerte), L'utilisatIon d'unsubstrat non altéré doit condufr~ à une fnductfon des dIfférentes enzymes dansdes condltfons volsfnes de celles qui prévalent dans la nature (ALBERSHEIM etANDERSON-PRONTY, 1972 ; TOUZE, 1972). Dans notre. cas, la mfse en oeuvre debûchettes sfmplement stérflfsées, permettaft en prfncipe de conserver Intactl'équflibre préexfstant entre polymères et olfgomères, ~es derniers jouant un rôlefondamental dans J'I.nductfon des' enzymes extracellulaires (Mac MILLAN etVAUGHN, 1964). Enffn, ce type de substrat autorfsaft le maIntien de culturesactfves durant. des pér10des de plusfeurs mofs .(ce qui n'est guère possible sur unmilieu liqufde), et, par conséquent, J'étude de la variation des activitésenzymatiques dans un substrat en constantè évolution, du faft même des enzymesexcrétées par les champfgnons.

56

figure 10 A - Evolut1on de quelques act1v1tés enzymat1ques au se1n debQchettes tnfectées par R. Iignosuset P. noxlus.

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·57

Les résultats <Fig. 10 A et B) révèlent une évolution en "dents de scie" desactivités enzymatiques; nous pensons que cette évolution n'a pas de significationphysiologique rée Ile) mais qu'en fait elle témoigne plutât d'une hétérogénéité auniveau des cultures) surtout durant les premières semaines de croissance. Dete11es variations sont souvent enregistrées au cours de ce typed'expérimentation. Les résultats majeurs sont les suivants:

a) De manière très générale nous retrouvons les caractèresdistinctifs fondamentaux des deux champignons, en matièred'excrétion enzymatique : prédominance des activités hydrolytlQueschez P. noxius, de l'activité laccase (et catalase) chez R. 1ignosus.

b) De même l'activité a-galactosidase en tant que caractèrediscriminatoire est confirmé, encore que R /ignosus n'en soit pas totalementdépourvu.

c) L'évolution de l'activité laccase sécrétée par R. ./ignosus estremarquable: alors que la production de cette enzyme est très active en début deculture) elle chute brutalement après une période de deux mois po~r se maintenirensuite à un niveau faible. Ce résultat est en accord avec celui enregistré /Iivivo. Nous avions) en effet) observé que l'activi té laccase est maximale auniveau du front de progression du parasite et diminue assez rapidement au fur età mesure que l'on s'éloigne de ce front vers les tissus les plus anciennementcolonisés. Une telle évolution suggère l'intervention d'un système particulier derégulation de la synthèse de cette enzyme ou une inhibition de son activité pardes composés) déchets du métabolisme du champignon ou produits de dégradationdu bois) qui s'accumulent dans ce mil ieu. On ne peut y déceler l'effet d'uneéventuelle réaction de· l'hâte) ces variations étant enregistrés if} vitro. ou ifivivo et dans ce dernier cas dans des tissus nécrosés.

Concernant P noxius, l'activité laccase demeure faible durant toute ladurée de l'expérience. Une étude plus récente révèle cependant qu'e Ile est plusforte après trois qu'après seulement un mois de culture démontrant ainsi unetendance inverse de celle présentée par R /ignosus

d) L'activité catalase

Des essais préliminaires avaient révélé l'excrétion d'une catalase par l'unet l'autre champignon, tant in vitro qu'in vivo. La présente étude montre queces enzymes sont excrétées très activement par R /ignosus, béaucoup plusmodérément par P. noxius Dans les deux cas la catalase s'accumule surtout endébut de culture. Son activité diminue progressivement en fonction de l'âge descultures sans toutefois devenir négl igeable, 2U moins chez R. lignosus.

Nous avons porté un intérêt à cette activité enzymatique parce qu'elle estsusceptib le d'entrer en compétit ion avec ce Ile des peroxydases) notamment de

58

fjgure lOB - Evolut1on de Quelques acttv1tés enzymatIques au seln debûchettes lnrectées par R. ligno~uset P.. noxius.

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59

l'hôte (au niveau du front de progression du parasite ou de l'interface SF-->PF),elle même probablement essentielle dans l'étape finale de la biosynthèse de lalignine. Par ailleurs l'oxygène moléculaire, libéré sous l'action des cata1ases surl'eau oxygénée, constitue l'un des substrats de la laccase, permet à cette enzymed'exercer son activité catalytique. '

Ainsi, au plan théorique, la cata1ase favoriserait plutôt les réactions dedégradation tissulaire au détriment des réactions de défense de l'hôte ; àcondition toutefois qu'il n'existe pas une compartimentation étîoite et différentepour ces trois enzymes.

e) L'activité xy1anase

Les xy1anases font partie du groupe des hémice11u1ases. L'évolution del'activité xy1anase en fonction du temps de culture sur bûchettes est similaire àcelle des autres polyosidases. De même ces enzymes sont excrétées plusactivement par P noxlus que par R. lig,?osu5.

En définaive, si l'on considère les résultats concernant lesdifférentes activités enzymatiques testées dans leur ensemble, ilapparaît qu'il existe une très bonne cohérence: entre ies donnéesenregistrées respective'ment in vivo et in vitro (milieu liquide ou·solide).

2. ESTIMATION DU TAUX D'EXCRETION DE QUELQUES ENZYMES

Les activités enzymatiques, que nous avons quantifiées à différentesreprises et dans diverses conditions, correspondent 'à, celles de protéinessolubles puisque dosées dans des filtrats de culture ou des extraits de tis?usobtenus après broyage dans un milieu tamponné de faible force ionique. Pour lesraisons que nous avons déjà indiquées nous avons considéré ces enzymes solublescomme jouant un rôle privilégié dans le processus de dégradation tissulaire. Ilétait néanmoins intéressant de vérifier quelle fraction de ces enzymes,synthétisées par les champignons, était réellement excrétée.

Quatre classes d'enzymes ont été prises en compte pour cette estimation:

* Enzymes extracell,ulaires) - solubles Uiltrafet "rinçage" du mycélium)

- liées ioniquement (solubilisées par une solution de NaCl 0,75 M)* Enzymes intracellulaires

- solubles (extraites par broyage du mycélium dans un tamponphosphate de sodium 0,0125 M à pH 6)

- liées ioniquement (solubilisées par macération du résidu debroyage dans une solution de NaC1 0,75 r--n.

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60,

Tableau 4

REpartition des aetivit4a enzymatiques

(pourcentage de l'aetivit6 totales)

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s-gluLiq. 62,1 11 ,1 12,3 14,5 73,2 26,8Sei. 28,4 15,5 3Q,'3 . 16,t 43,9 56,1

Cl-galLiq. 17,3 19,1 30,7 32,9 3',4 63,6Sei. 34,3 .19,5 37 9,2 53,8 46,2

.• S-ga'lLiq, 60,1 10,5 13,9 . 15,5 70,6 29,4

, sei'. . 5'5,9 11,6 24,7 7,8 67,5 32,5

Liq. 95,5 2,1 1,0 1,4 . .97,6 2,4• Lac

Sei. 92,2 4,4 2,4 1,0 96,6 3,4

PeroxLiq. 92,6 6,4 0,8 0,2 99,0 1,0

Sei. 89,7 3,9 6,0 0,4 93,6 6,4

Cat.Liq. 65,3 9,5 22,5 2,7 74,8 25,2Sei. 3,4 8,1 82,6 5,9 11,5 88,S

B. R. Zignosus

Liq. 14,9 9,7 26 49,4. 24,6 75,4p5

Sei. 11,8 12,7 57,2 18,3 24,5 75,5

S-gluLiq. 44,6 18,6 7,7 29,1 63,2 36,8

Sei. 33 26,6 22,2. 18,2 59,6 40,'f"

Liq. 12,8 14,2 15,3 57,7 27,0 73Il-gal

Sei. 23,7 21,8 31,0 23,5 45,S 54,5

Liq • 95,6 3,6 0,3 0,5 99,2 0,8• Lac

Sei. ' 94,1 4.7 0,9 0,3 98,8 1,2

Liq. 3,3 6,1 65,2 25,4" 9,4 90,6Cat •.

Sei. 33,7 1,5 '59,8 5 . 35,2 64,8

• L

Liq. milieu bouillon de sciure d'Hévéa

Sei. milieu sciure d'Hévéa

;

." .

"

./

. ,

" Les résultats' (Tableau 4) ,révèlent des situations très variables quidépendent de la nature des enzymes et, pour certaines d'entre elles, de la naturedu milieu de culture. Parmi les enzymes les moins activement excrétées on peutciter les phosphatases (R. / igIJosus et P. IJoxius), a-galactosidases (P.

IJoxius) et b-galactosidases (R" /igIJosus). Toutes les autres sont relarguéesdans'le milieu de culture à près, ou plus, de 50 % par rapport à leur activitétotale. Une remarque particulière concerne la laccase excrétée à 90-95 % parchacun des champignons, et la catalase dont j'excrétion est très fortement liée àla nature du milieu de culture et, pour un milieu déterminé, à la nature duchampignon.

Cet essai a été réalisé sur des cultures (31 à 35 pour chaque motif) âgéesde 13 jours, Il représente donc un instantané d"une situation qui peut être enperpétuelle évolution. Une telle' évolution existe au moins pour' l'a-galactosidasequi, en début de culture est surtout intracellulaire. Le taux d'excrétion augmenteprogressivement avec l'âge de la culture sailS que l'on puisse, a priori; en rendreresponsab1e une éventue 11 e lyse mycé1ienne.

ALI cours de cette expérimentat ion, et pour chaque type' d'enzyme, nousavons classé les activités en quatre groupes, suivant les critères ...définis plushaut. Dès lors on pouvait se demander si pour. chaque groupe et pour:~:chaque typed'enzyme l'activité était imputable aux mèmes protéines enzymatiques ou à desisoenzymes différentes. . . . 1,"

, L'analyse électrophorétique (Fig. Il) réal isée . pour· cidq' activitésenzymatiques différente.s (phosphataseJ b-glucosidase, a- et b-gaJa'Ctosidase etlaccase) révèle que si plusieurs isoenzymes peuvent contribuer à une activitécatalytique donnée, par contre il n'existe aucune différence de compositionisozymique entre les fractions extra- et intracellulaire. Ainsi, pour les activitésétudiées, les' mêmes enzymes ou isoenzymes sont à la fois intra etextrace llulaires, il n'existe 'aucune spécialisation dans l'excrét ion des enzymes itce niveau. seules les proportions des activités totales varient. .

Tous les champignons ne possèdent pas de telles caractéristiques. Ainsi,chez Fomes 3IJIJOSUSJ RhizoctoIJia sO/3IJi ou Trametes par exemple, onobser./e des différences de composition isozymique entre les équipements intra­et extracellulaires et une évolution qualitative (et quantitative) en fonction dutemps de culture (HAARS et aL, 1981.; HUTTERMANN et al., 1979; ZUBER etMANIBHUSHANRAO, 1982 ; SCHANEL et aL, 1971).

3. INDUCTIBILlTE DES ENZYMES EXTRACElLULAIRfS

De très nombreux travaux 0i')t été réalisés paî le passé sur la régulationde la synthèse des enzymes extrac~llulâires. Il est apparu que la majorité d'entreelles se classent dans la catétJorie des enzymes inductibles. Il en est ainsi, à

62

F1gure 11 - Compara1son par électrophorèse en gel d'am1don des 1soenzymesextra- et 1ntra-cellula1res; A) et B): enzymes provenant respect1vement decultures de P nox/us et R. l/gnoSus. (Les enzymes sont révélées par leuract1v1té catalytIque).

1"-'---"':

pas'e

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a-Ga'iLac

3512 4 6

A

1: ftltrat de culture (bout11on de sc1ure d'Hévéa); 2: lavage du mycél1um par du tampon contenantdu NaCl O,75M i 3: extraft mycélfen i 4: lavage du brayat myœlfen par le tampon précédent; 5 et 6:comme 1 et 2 mals sur une culture sur sciure d'Hévéa.

B

Lac b-Glu Pase

6'" 1

63

titre d'exemple, des systèmes pectinolytiques et cellulolytiques del1acroplJomifJa pIJaseolifJ8 (MADKOUR et ALY, 1981), de la cellulase deSporotriclJum tlJermoplJile (CANEVASCINI et aL, 1978) et de CIJrysosporium'ligfJorum (= SporotriclJum pulverulefJtum = PIJafJeroclJaet&cIJrysosporium) (ERIKSSON et RZEDOWSKI, 1969a) ou d'Acetivibrio (SADDLERet KHAN, 1980) ou encore de la laccase de Fomes afJfJOSUS (HAARS et aL, 1981;HAARS et HÜTTERMANN, 1983). '

Concernant les enzymes excrétées par R. ligfJOSUS et P fJoxius, le trientre ces deux classes a été réalisé en cultivant les deux champignons sur lestrois mil ieux suivants: '

- milieu minéral + glucose (20 g/]) (révélation des enzymes'constitutives)

- milieu "sciure d'Hévéa", qui devrait contenir un large spectred' inducteurs

- milieu "papier filtre" (= milieu minéral + 25 g de papier filtre/]) dontle pouvoir inducteur, s'il existe, devrait se limiter au système cellulo1ytique.

Chacun de ces trois milieux permet une bonne: croissance des' deuxchampignons (bien qu'elle ne puisse être quantifiée, dans les deux dernièresconditions de cul ture).

Les résultats sont particulièrement significatifs:' sur les neufactivités enzymatiques extracelllJlakes, testées chez·; P. noxil/s(Fig.A et B), seule la peroxydase est constitutive. Dans le cas de' R. '1ignosl/s (Fig. 12 C>, trois types d"enzymes présentent une fajb!e'activité sur milieu minéral glucosé: phosphatase, b-glucosidase eta-galactosidase; les autres sont adaptatifs.

Le milieu "papier filtre" constitue un bon inducteur du système.cellulolytique: CM-cellulase et b-glucosidase, aussi bien chez P fJoxius quechez R. 1igfJOSUS (induction particul ièrement efficace de la· ce llulasehabituellement très peu active, même sur milieu sciure); il est cependantsurprenant de constater l'induction de la biosynthèse d'autres systèmesenzymatiques par ce milieu (a- et b-galactosidases et xylanase chez P fJoxius,phosphatase, b-galactosidase et laccase chez R. 1igfJosus).

Ces résultats conduisent à deux hypothèses:

- ou la biosynthèse des différentes enzymes se trouve sous la dépendanced'un même système de régulation (ou il existe une induction "en cascade"desdifférentes enzymes), .

- ou bien le papier filtre n'est pas constitué de cellulose pure, maiscontient des inducteurs adéquats des systèmes enzymatiques ne faisant paspartie du complexe cel1ulolytique.

64

Figure 12 A -Induction des enzymes extracellulaires de P. noxius(symboles:vo'ir Fig 12 B)'

P. no xi us

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Temps de culture (jours)

65

Figure 12 B -Induction des enzymes extracellulaires de P. noxius.

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A-A minimum + ce Il ulose

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i i ~0 6 11 14 20Temps de culture (jours)

66

Figure 12 C - Induction des enzymes extrace lluJaires de Il 1ignosus(sym~~les: voir Fig 12 B). '.

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Temps de -cul.ture, (jours)

"

67

D'après les travaux d'autres auteurs] l'une et l'autre de ces hypothèsespeuvent être légitimes. En effet, d'une part ERIKSSON (1981 a) a montré que labiosynthèse de l'endo-glucanase est induite par le ce Ilobiose à une concentrationde 1mg par 1itre; d'autre part ERIKSSON et GOODELL (1974) ont pu déterminer quechez S pulv(i'rulentum la production à la fois d'une endo-xylanase et desendo-glucanases était induite par le xylane purifié comme seule source carbonée.Ces auteurs estiment que la biosynthèse de ces enzymes est sous la dépendanced'un même gène régulateur.

II. LA DE6RADAT1ON DES POLVOS1DES

L'objectif principal de cette partie de l'étude est de répondre àla question suivante : les enzymes excrétées par R. 1ignoslfs et P.noxius sont-elles réellement capables de dégrader les polyosidespariétaux?

Dans un second temps nous avons tenté de oréciser la nature des ....comolexes enzymatiques intervenant resoectivement dans la cellulolyse et la

, oect ino lyse.Enfin dans un troisième temps nous avons réalisé une purification

partielle des hydrolases excrétées par P. noxius afin de comparer son équipementenzymatique à celui d'autres agents de pourriture du bois.

1. ACTION DES FILTTRATS DE CULTURE DE R. L/6NOSlJS ET P.NOX/lJS SUR LA SCIURE DE BOIS D'HEVEA.

Afin de vérifier la capacfté des enzymes] excrétées par les deuxchampignons, à dégrader les polyosides pariétaux nous avons fait agir desfi 1trats de cul ture sur le substrat nature1consti tué par de la sciure débarrasséedes "extractibles". Une partie aliquote du milieu réactionnel est prélevée à diversintervalles de temps et la dégradation est appréciée de deux'manières:

- dosage quantitatif des sucres réducteurs libérés à partir du polymère]- chromatoghraphie sur gel de silice dans des conditions permettant de

séparer les oses simples et certains oligosides.

a) Estimation quantitative'

La figure 13 présente une cinétique de la dégradation des polyosides de lasciure de bois d'Hévéa, par des filtrats de culture de R lignosus et P noxius.Elle démontre que les enzymes excrétées par ces champignons sont effectivementcapables de réaliser une telle dégradation.

Dans les conditions expérimentales utilisées ie filtrat de culture de P

68

Figure 13 - Dégradatlon des polyosides de la sciure par un flltrat de cultureconcentré de R. 1ignosuset Pnoxiu5: (Pour les activités enzymatiques deces mllieux: voir Tab1. 5).

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3 5 7

Incubation (h)

69

Tableau 5

Activités enzymatiques (Ulm]) présentes dans les milieux réactionnels misen oeuvre au cours des essais de dégradation de la sciure de bois par desfiltrats de culture de P noxius (PN) et R. lignosus (RU.

Activitésenzymatiques

Milieux réactionnels comportant un filtrat deP noxius (PN) R. lignosus (RU

RL/PN

Phosphataseb-glucosidasea-ga1actosi daseb-galactosidasePectinaseXylanaseLam inarinaseCM-cellLllase

7,90,82,41, 10,6

65

40,70,68,80,040,30,28

74

510,2580,02

1, 1

Les f'iltrats proviennent de cultures effectuées dans des conditions et sur desmilieux différents. Le rapport RL/PN n'a donc ici aucune sianification, ~

physiologique; il indique simplement les proportions relatives des activitésenzymatiques mises en oeuvre au cours des présents essais.

70

Ffgure 14 - Dégradation enzymatique de la scfure: séparatfon par CCM de gelde silice des sucres contenus dans les milieux réactionnels suivants:A) sciure + ffltrat de culture de P noxi{j5, système de migratfon butanol­acfde acétfque - eau.

Gu

AAG

Te'.\ Î

6

B) sciure + filtrat de culture de R. lignos{j5, système de migratfon:propanol-eau.

B

Xy

Gu

Ga"Ce

Temps d'incubation variable (0 à 6 heures). Composition du milieu réactionnel: sciure à 11 ensuspension dans du tampon citrate 0,01 M, pH 4,6. Composition enzymatique du milieu r~tfonnel:

voir tebleau 5. AG: ~ide gel~turonique; Cf: cellobiose; Bt\: gel~tose; GU: glucose; XV: xylose; Te:témoin ffltrat de culture; Ts: témoin sciure.

71

noxius est environ JO fois plus actif sur la sciure que' celui de R. lignosus.Cette différence ne peut être expliquée par l'activité CM-cellulase présente dansles milieux réactionnels (Tableau 5) (elle est équivalente dans les deux milieux),ni par l'activité b-glucosidase (50 fois plus élevée dans le milieu comportant lesenzymes de R. lignosus que dans celui comportant le filtrat de culture de Pnoxius). Nous pensons qu'une (ou plusieurs) enzyme(s), autre(s) que celles quenous venons de citer, doivent intervenir dans la dégradation de la sciure (nousverrons plus loin que cette activité enzymatique pourrait être de type'"avicelase").

b> Estimation qualitative.

Les deux chromatogrammes de la figure 14 A et B révè lent que l'activitéenzymatique des filtrats de culture a pour effet de libérer divers monomères etoligomères. Deux sucres ont pu être identifiés avec certitude: le glucose et lecellobiose. Les taches situées entre celle du cellobiose et le point de dépot del'échantillon correspondent à des 01 igomères de degré de polymérisationsupérieur à 2. Elles témoignent sans ambiguité de l'intervent ion d'enzymesagissant selon le mode "endo" (provoquant la scission de la macromolécule au"hasard" le long de la chaine d'unités glucose).

Au plan quantitatif on retrouve la différence d'activité entre le filtrat deculture de R. lignosus et celui de P noxius. L'accumulation de glucose,produit ultime de la dégradation de la cellulose peut résulter soit de l'activitéd'une enzyme de type "exo" (scission du polymère à partir de l'extrémité nonréductrice), soit de l'hydrolyse du cellobiose ou des oligosides en glucose parl'intermédiaire d'une b-glucosidase. Il est à noter que l'absence quasi totale decellobiose sur le chromatogramme du milieu réactionnel contenant le filtrat de Rlignosus est sans doute à attribuer à sa très importante activité b-glucosidasehydrolysant immédiatement en glucose le cellobiose (et les cellodextrines àcourte chaine) libéré à partir du polymère.

En cas d'incubation de longue durée et en présence d'un filtrat de culturede P. noxius fortement concentré, de l'acide galacturonique est libéré à partirde la sciure de bois, témoignant de l'intervention d'enzymes pectinolytiques. Dans'des conditions expérimentales similaires, le filtrat de culture de R. lignosuss'avère beaucoup moins efficace: seules des traces d'acide galacturonique sontdécelables après chromatographie sur gel de silice; ce résultat est à mettre enrelation avec la très faible activité pectinolytique excrétée par ce champignon.

Enfin, même après 24 heures d'incubation. nous n'avons pas réussi àmettre du xylose en évidence dans les milieux réactionnels. Ceci tendrait àprouver soit que la xylanase dont l'activité apparaît loin d'être négl igeable, n'estpas efficace sur la sciure de bois, soit que le système xylanasique ne comporte'qu'une (ou des) enzyme(s) de type "endo" à l'exclusion de toute activitéxylosidase. Une telle situation prévaut dans le cas de filtrats de culture deColletotricl7um 1indemutl7ianum (OOUX-GAYAT et al. 19ï8).

"

72

2. LE COMPLEXE CELLULOLYTIOUE DE R. L /6NOSlJS ET P.NOX/US.

Nous venons de voir que la cinétique de libération d'oses réducteurs àpartir de sciure de bois ne pouvait être expliquée entièrem~nt par l'activité desenzymes répertoriées dans les fi 1trats de cul ture. 11 fallai t admettre l'existence,dans ces filtrats, d'une (ou plusieurs) enzyme(s) supplémentaire(s) responsablesde la différence d'activité dépolymérisante constatée.

D'après le schéma de dégradation enzymatique de la cellulose proposé parGHOSE et al. (1981) (Fig. 15), trois enzymes sont nécessaires à l'hydrolyse totaledu polymère en son monom'ère constitutif, le glucose:

- l'exoglucanase ou 1,4 b-glucane ce lIobiose hydro lase (EC 3.2. 1,91), (= )

seule enzyme capable d'attaquer là cellulose cristalline, par hydrolyse des1iaisons b-( 1-->4). Cette hydrolyse s'effectue à partir de l'extrémité nonréductrice et 1ibère du ce1lobiose.

En fait, certains auteurs classent sous la dénomination d'exoglucanaseindifféremment des enzymes libérant, soit du cellobiose (à partir de l'extrémiténon réductrice) (ERIKSSON, 1981 a ; ERIKSSON et PETTERSON, 1975b), soit duglucose, alors que cette dernière enzyme devrajt être désjgnée sous le nom de1.4 b-D-glucane glucosehydrolase (E,c. 3.2.1.74).

- l'endoglucanase ou 1.4 -b-glucane - 4 - glucanohydrolase (Ec. 3.2.1.4) (=

"enzyme CX") plus communément dénommée CM-cellulase en raison de la nature dusubstrat habi tuellement uti 1isé pOLir la tester: la carboxyméthyl-cellulose. Cetteenzyme qui hydrolyse les liaisons b-( 1-->4) "au hasard" le long de la chaînen'exerce son activité que sur de la cellulose de structure amorphe et sur descellodextrines à longue chaîne.

- la cellobiase ou b-glucosidase (E.c. 3.2.1.21) hydrolyse le cellobiose (etles ollgomères, de faible tai Ile) en glucose. Il convient de rappeler que lab-glucosidase est le plus fréquemment testée à l'aide d'un substrat de synthèse,le p-nitrophényl-b-D-glucoside. Les enzymes dont l'activité est mesurée de cettemanière devraient être appelées des aryl-b-glucosidases ; certaines d'entre ellessont incapables d'hydrolyser le cellobiose (BUCHT et ERIKSSON. 19692 et ne fontdonc pas partie du système enzymatique dégradant la cellulose.

L'exoglucanase et l'endoglucanase agissent de manière synergique. D'aprèsREESE et al. (1950), la première a pour rôle de modifier la cellulose hautementpolymérisée pour permettre à la seconde d'twdrolyser le polymère. Actuellementon pense Que les rôles -sont inversés: l'endoglucanase provoque la rupture de lachaîne au niveau des régions amorphes de la microfibrille de cellulosemultipliant ainsi le nombre d'extrémités non réductrices sièges de· l'activité del'exoglucanase <ERIKSSON et PETTERSSON, 1975 ; GHOSE et aL, 1981 ; WOOD etMcCRAE, 1972; 1978 ; HIGHLEY, 1977).

73

f!gure 15 - Schéma de la cellulo1yse (d'après GHOSE et al., 1981 >,

Régions à structurecri sta Iline

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A

Régions amorphes.~

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Endo - 13 - Glucanase (EG)

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8 Cellobiohydrolase (C,f3H)

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13- Glucosidase n. » •Glucose

"..Représentation schématique des différentes

ét~pes de la biodégradation de la cellulose

74 .

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Tableau 6

. .Activités enzyr:natïques (Ulm]) présentes dar)s les filtrats de"culture de P.noxius (PN) et de R. 1ignosfls (RU mis en oeuvre au èours' des ess'ai sd'hydrolyse enzymatique de l'Avicel et du cellobiose.

Activités Milieux réactionnels comportant un filtrat de RL/PNenzymatiques' . R. Iignosus (RU P. noxius (PN)

b-g1ucosidase 2440 1 026 0,42a-galactosidase 34 3276 96b-ga1actosi dase 530 2291 4,3Pectinase 2,2 55 25Xylanase 19,4 232 12Laminarinase 17, 1 132 18"Avicelase:' 1,5 4,6 3CM-cellulase

-,AR (viscQsimétrie) 4444 98 160 22-pouvoir réducteur<PR) 4 26,3 6,6- AR/PR 1 111 3730

CM-ceUAR)/b-glucasi dase 0,45 96

Les deux types de filtrat proviennent de cultures s~r papier filtre âgée? de 13jour.s. Les activités-enzymatiqu~s correspondent à des filtrats concentrés.10 fois. Ici· les rapports PN/RL.ont une r,éelle signification physiologique.

.. , ". " ... .

. '.

75

Enfin, si ce schéma est habituellement respecté par les agents depourriture blanche, en revanche les agents de pourriture brune, qui ne

"synthétisent généralement pas d'enzyme de type "c 1" (HIGHLEY, 1977) doiventdisposer d'un système enzymatique, ou non enzymatique, permettant dedépolymériser au moins partiellement la cellulose, de manière à détru'lre sastructure cristalline orig'inelle et la rendre apte à une dégradation complète parl'endocellulase (CX), D'après KOENIGS 1972, 1974) et HIGHLEY (1980), le systèmeH202/Fe++ pourrait jouer ce rôle, l'eau oxygénée nécessaire au fonctionnement

d'un tel système étant produite extracellulairement par le champignon lui-même,Des travaux plus récents remettent cependant cette théorie en question.

Selon HIGHLEY (1982), seul le radical ,OH agirait sur la cellulose, le système'H202 I.OH serait produit intracellulairement et excrété (ou relargué dans le

m'llieu à la suite de la lyse de filaments mycéliens) sous la forme d'un complexenon affecté par les composés chimiques capables de "capter" l'eau oxygénée et cetype de radicaux.

Concernant la dégradation enzymatique de la cellulose par R. lignosus etp. noxiu~ nous avons démontré que ces champignons synthétisent et excrètentune endoglucanase (CM-cellulase) et, une aryl-b-glucosidase, D'après lesprécisions que nous venons d'apporter sur les systèmes cellulolytiques,ils nedégraderont la cellulose native de manière efficace, que dans la mesure où ilsdisposent d'une exoglucanase . Enfin il reste à démontrer que l'aryl-b-glucosidasetestée est capable d'hydrolyser le cellobiose et donc de participer à ladégradation de la cellulose.

Ces essaIs ont été réalIsées à la fois sur un plan qualitatif et quantitatifen utilisant des filtrats provenant de cultures des champignons sur milieu '."papier flltre". Les cultures étaient âgées de 13 Jours et les fi ltrats ont étéconcentrés (Xl0) avant mise en oeuvre. En dehors de la réalisation des testsd'actIvité classfques nous avons fait agir ces filtrats concentrés sur de l'Avicelet du cellobiose, Le premier substrat est une cellulose microcristallinedégradable uniquement par l'exoglucanase et permet donc de doser cette enzyme<GHOSE et a1., 1981 ; SÀDDLER et KHAN, 1980). Le second substrat permetd'identifier la cellobiase.

a) Ident1f1cat1on d"une exoglucanase

1· Aspect auant itatitat if

Le tableau 6 'Indique l'activité des différentes enzymes présentes dans lesf'lltrats concentrés et pour chacune d'entre elles, le rapport de l'activité dufiltrat de culture de P. noxius sur celle du filtrat de R.lignosus.

Les résultats montrent Que les filtrats de culture des deux champignonscomportent bien une activité exoglucanase hydrolysant l'Avice1.

76

F1gure 16 - Analyse par chromatograph1e sur couche m1nce de gel de s1l1cedes sucres provenant de l'Hydrolyse, par des f1Jtrats de culture de R.!/gnosus et de P nox/us, de: A) l'Avlcel; B): du celloblose; C) de lacellulose. (volr la légende des flgures p. 77 >.

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77

2° Aspect qualitatif:

Comme signalé plus haut deux types d'exoglucanase ont été décrits: l'unelibérant du glucose, l'autre du cellobiose, à partir de la cellulose hautementpolymérisée.

Afin de préciser la nature exacte de l'activité enzymatique, nous avonsséparé les produits de réaction par chromatogr'aphie sur gel de silice.

* Action du filtrat de culture de P. noxius sur l'Avicel

Le chromatogramme de la figure 16A a permis d'identifier deux sucresdans le milieu réactionnel: le glucose et le cellobiose. La présence du cellobiosepermet d'affirmer que le milieu réactionnel contient une activité 1.4-b-glucane .ce llobiose-hydrolase (CBH).

Quant au glucose, il peut avoir deux origines différentes:- hydrolys~ de l'Avicel par une exoglucanase libérant des maillons

glucose- hydrolyse, par une cellobiase, du cellobiose résultant de l'activité de la

CBH sur l'Avice1. .Vu l'activité b-glucosidase relativement élevée du filtrat de cUlture

utilisé au cours de ces essais, nous pensons que le glucose provientvraisemblablement de l'hydrolyse du cellobiose. Seules des expériences réal iséesavec des enzymes purifiées permettraient de trancher entre lés deux hypothèsesproposées.

* Action du filtrat de culture de R. lignosus sur l'Avicel

Le chromatogramme (Fig. 16A) révèle la présence d'un seul sucre, leglucose, dans le mi 1ieu réactionnel. Cependant, étant donné l'activitéb-glucosidase extrêmement élevée, particullèrement en regard de la faibleactivité "avicelase", il n'est pas exclu que l'absence d'accumulation de cellobiosesoit dûe aù fait que ce sucre est hydrolysé en glucose dès sa formation.

Cette hypothèse est indirectement confortée par le fait que du cellobioseest l'ibéré à partir de la sciure de bois. Encore que dans ce cas particulier laproduction de cellobiose puisse provenir de l'action conjuguée de la CM-cellulase

Fig. 16: Analyse par crlromatographie sur couche mince de gel de sllice desproduits d'hydrolyse: A) de l'Avicel (milieu réactionnel: lmldesuspensiond'Avicel à 1:6 dansdu tampon citrate 0,01 M à pH 4,6 + 100 III de filtrat concentré). B) du cellobiose (milieuréactionnel: 100]l1 de cellobiose à O,OlM dans le tampon citrate + 20]l1 de filtrat concentré; pour A) etB) la composition enzymatique ~ filtrats est cell~ indiquée dans le tableau 6. C) de laCM-cellulose (mi1ieu réactionnel: lml de CM-cellulose à 0,5% dans le tampon citrateO,025M à pH4,6 + 1oo]l1 de filtrat de culture; composition enzymatique du milieu réactionnel: voir le tableau 5).Systèmes de migration: propanol-eau pour A) et B); butanol-acide acétique-eau pour C). GU: glucose; CE:cellobiose; Te et TA: témoins filtrats et AviceÎ; Eo ... : temps d'incubation en heure.

78

sur les zones de microf'ibrilles ayant 'perdu leur structure cristalline, et de lab-glucosidase sur le mélange de cellodextrine qui en résulte. Les coupures auha~ard d'une part, le racourcissement régulier des chaînes de cellodextrinesd'autre part, conduisent nécessairement à la production, en principe transitoire,d'une certaine quantité de cellobiose.11 n'en demeure-pas moins que les résultatsde nos essais prouvent que R /ignosus excrèt~bien d~s exoglucanases.

Enfin la différence d'activité exoglucanase existant entre les fi ltrats deculture de R /ignosus et ceux de P noxius permet de rendre compte de ladifférence d'activité de ces mêmes filtrats sur la ,sciure d'Hévéa.

b) Identification d"une activité cellobiase.'

Les hypothèses émises plus haut concernant l'origine du glucoseapparu au cours de l'hydrolyse de l'Avicel ne sont légitimes que dans la mesure oùle filtrat de culture contient effectivement une activité cellobiase.

La recherche d'une telle activité a été réalisée au plan aualitatif enincubant du cellobiose en présence de filtrat de culture de l'un et l'autrechampignon. La composition, en oses) du milieu réactionnel est analysée parchromatographie sur gel de silice, après des temps variables d'incubation.

Le chromatogramme de la figure 166 montre sans ambiguité l'hydrolysedu cellobiose en glucose. Les deux champignons excrètent donc bien desenzymes de type cellobiase.

Au plan Quantitatif on note l'existence d'une corrélation entre la quantitéde glucose qui s'accumule dans les milieux réactionnels (intensité des spots duchromatogramme) et l'activité "aryl-b-glucosidase" des filtrats de culture(Tab1.6). Ceci nous conduit à penser que l'activité "aryl-b-glucosidase" desfiltrats de culture correspond en fait à une activité cellobiase.

,c) Vérification du mode de dégradation du substrat (-endo- ou-exo·) par les CM-cellulases.

Une technique de détermination du type d'action, exo ou endo, exercée parles polyosidases consiste à comparer leur effet d'une part sur le degré depolymérisation du substrat (chute de viscosité par exemple) et d'autre part sur lalibération d'oses dans le milieu réactionnel (augmentation du pouvoir réducteur).

Dans le cas présent on observe une chute rapide de la viscosité du milieuréactionnel alors que l'augmentation 'du pouvoir -réducteur est faible voirenégl igeable. Ainsi, dans les conditions. de· test mis en oeuvre, la différence entreles .deux types d'activité apparaît clairement lorsque l'on, compare les rapportsdes activités enregistrées par les deux techniques (Tabl. 6.): •. ...'

79

CM-ce11 u1ase de P noxius: AR / p.réducteur : 98160/4,55 =3730

CI'1-cellulase de R. /ignosus: AR / p.réducteur: 4444/4 = 1111

(A titre de comparaison, pour l'activité pectinolytique (cf. infra), testéedans des conditions tout à fait comparables, les activités étant exprimées dansles mêmes unités, le rapport (AR/ pouvoir réducteur) est égal à 1,05), Un telrésultat indique que J'activité CM-cellulase conduit à une scission de la celluloseselon le mode "endo", Ce mode d'action a été confIrmé, dans le cas d'un filtrtat deculture de P noxius, par J'analyse des produits de réaction par chromatographiesur gel de sil ice, Le chromatogramme (Fig. 16C) révèle que J'hydrolyse du substratconduit à la formation de produits de réaction de degré de polymérisationvariable et non uniquement au monomètre (ou, éventuellement, au dimère) commele ferait les enzymes de type "exo".

L'ensemble de ces résultats montre que R. lignosus et -P. .noxius disposent d'un équipement très complet en enzymescellu10lytiques (exog1ucanases + endoglucanases + cellobiases) leur,permettant de dégrader efficacement la cellulose du bois d'Hévéa.Concernant cet équipement, la différence entre les deux champignons réside nonpas au niveau qualitatif mais à un niveau Quantitatif, . '~"

3. LE COMPLEXE PECTINOLYTIQUE DE P. NO)(/tJS·ET R. l/GNOStJS

Les matières pectiques sont dégradées par des enzymes dont lanomenclature, les mécanismes réactionnels et le rôle, notamment dans ledéveloppement du processus pathogénique, ont été précisés par BATEI'1AN (1968)et BATEMAN et l'''IILLAR (1966). Deux catégories d'enzymes existent, l'uneresponsable de la déméthylation des pectines (pectine-pectyl-méthyle estérase ==

PME), l'autre, responsable de la dépolymérisation de la macromolécule dont leproduit final est l'acide galacturonique (ou son ester méthylique), Cette dernièrecatégorie regroupe des enzymes agissant soit par voie hydrolytique soit par voietransélim'inasique" les unes et les autres étant de type "endo" ou "exo" etdépolymérisant préférentiellelTlent soit les acides pectiques (faible pourcentagede méthylation des carboxyles en C6), soit les pectines hautement méthylées,

Compte-tenu des résultats précédemment acquis, il convenait de vérifier:

- si R. /ignosus possède ou non la capacité à dégrader les matièrespectiques et par conséquent s'il excrète des enzymes adéquates,

- la nature des enzymes pect'inolytiques excrétées par P noxius et quenous avons désignées globalement et improprement sous le nom de "pectinases",

-.# . .

... :~'''. ~.~

... ~

80

FIgure 17 - Oégradatlon, ln vivo. de la lamelle moyenne par R. Iignosus:observatIon au mIcroscope électronIque: 1) RacIne d'Hévéa sa'in 2) Racined'Hévéa parasité (voIr légende des fIgures p. tlo).

. --.

A

'.

B

Figure 18 - Analyse par CCM de gel de si11ce: A) des produIts d'hydrolyse dupolypectate de sodium par la pectinase purifIée de P noxius,'B) ducellobiose par dIfférentes fractions séparées par chromatographie sur DEAE­cellulose et Sephadex G75. (légende des figures: voir p. ~~).

-.A .'l', ",.

• !8 •• •..... __ .' .

.L, f . (' ,.,. ,. .'. 1 : f, r',

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;l' e . :. '](

81

a) R. lignosus excrète-t-l1 des enzymes pectinolytiques?

Comme nous l'avons indiqué plus haut, les tests d'activité pectinolytiqueeffectués soit sur des filtrats de culture, soit sur des extraits de tissus infectéspar R. lignosus ont régulièrement fourni des résultats négatifs, ou, au mieux,des valeurs proches de la limite,de sens'ibilité de la méthode analytique.

Cependant l'observation de coupes de tissus au microscope électronique(Fig. 17, 1 et 2) révèle une forte altération de la lamelle moyenne dans des tissusnon lignifiés, essentiellement constituée de matières pectiques, t,émoignant del'activité pectinolytique exercée par ce champignon.

Nous avons .tenté de mettre cette activité en évidence,. in vitro, en lecult ivant le champignon sur un mi 1ieu (bouillon de sciure d'Hévéa) supp lémenté enpolypectate de sodium (2 %) ou en Pectine R.B. (1 % ; pectine hautementméthylée). Les variations de viscosité de ce mi 1ieu sont mesurées aprèsrespectivement 5 et 15 jours de culture, par comparaison avec la viscosité demilieux, de même composition et de même âge, non ensemencés. Les résultatsobtenus sont les suivants:

chute de viscosité du mi 1ieu (%)

Temps de culture

Milieu + polypectateMil ieu + pectine

5 j.

2224

15 j.~

75:'68,;::

Ils traduisent une faible, mais néanmoins réelle, activitédépolymérisante du champignon à l'égard des matières pectiques.

Enf'in une telle activité a été mise en évidence récemment, par latechnique classique (mesure de la libération des sucres réducteurs) dans desfiltrats concentrés provenant de cultures sur papier filtre (Tableau 6).

Fig. 17: Dégradation de la lamelle moyenne (in vivo) par R. lignosus:observation au microscope électronique: 1) Racine d'Hévéa sain: Coupe transversale auniveau du phloème (lm =lamelle moyenne; pc = paroi cellulosique); (x 22 500). 2) Racine d'Hévéaparasitée par R. lignosus. Dégradation de la lamelle moyenne (flèches) entre deux tubes criblés (tc) duphlcème. (x 6 000).

Fig. 18: Chromatographie sur ccm de gel de silice des produits d'hydrolyseA) du po1ypectate de sodium par la pectinase purifiée à partir d'un filtrat de culture de P. noxilJs ;Pect: po1ypectate de sodium; AG: acide galacturonique; E: milieu réactionnel. B) du cellobiose différentesfrections isolées au cours de la purification des enzymes de P. noxius (voir schéma de purification).

83

Par ailleurs l'analyse chromatographique confirme l'activitédépolymérisante de ce même filtrat sur le polypectate de sodium: spot d'acidegalacturonique (après 6 heures d'incubation du milieu réactionnel) visible; bienqu'à l'état de traces.

b) Le complexe pectinolytique de P. noxius

P noxius excrète des quantités relativement importantes de"pectinases" laissant supposer une action efficace sur les matières pectiques dela lamelle moyenne des tissus, en particulier des tissus non lignifiés. Une telleaction est en effet observée sur des coupes de tissus.

L'analyse des filtrats de culture a permis d'identifier la présence d'unepectine-methyl estérase (P.M.EJ relativement active. En effet, l'incubation(en milieu non tamponné) d'une pectine hautement méthylée en présence de lasolution enzymatique provoque une acidification rapide du milieu réactionnel(témoin de l'hydrolyse de l'ester méthylique en C6 conduisant à la formationd'alcool méthylique et de la fonction acide carboxylique libre).

L'identification des enzymes de dépolymérisation a été réalisée. enplusieurs étapes:

* Détermination du mécanisme réactionnel (hydrolyse outransé1imination : identification de produits de réaction à l'aide du réactif àl'acide thiobarbiturique).

Cette technique mise au point par SHERWOOD (1966) permet d'identifier,dans le milieu réactionnel, l'acide galacturonique et· l'acideanhydrogalacturonique résultant, respectivement, des activités hydrolytique ettranséliminasique des enzymes. En effet les produits de'· condensation entre cesdeux monomères et le réactif présentent des pics d'absorption à des longueursd'onde distinctes : 515nm pour l'acide galacturonique, 548nm pour l'acideanhydroga1acturonique.

Af'in de distinguer plus nettement les deux activités, des incubations sontréalisées en parallèle à deux pH : 4,6 et 7,5, les enzymes pectiques à caractèrehydrolytique présentant généralement une activité optimale en milieu acide"alors que les transéliminases (ou Iyases) sont plus actives en milieu alcalin.

La Figure 19 révèle que P noxius excrète les deux types d'enzyme.Cependant des essais quantitatifs ont montré que l'activité de l'enzyme àcaractère hydrolytique est toujours très supérieure à celle de la transéliminase.Cette dernière n'est par ailleurs identifiable de manière nette que dans lesextraits de bûchettes infectées. Ainsi, P noxius excrète dans les milieux deculture deux types d'enzymes capables de dépolymériser les matières pectiques:

- "oectine" hvdrolase- "pectine" lyase

Figure 19 - Sp~çtre des produits q~ conqensatl<.mobtenus à J'ald~ dl,! test ~ l'acide thlobablt~r1ql,le,

[!gure 20 - Cln~tlque d'hydrolyse de dlffér~nte~

m~tlères pec~1q4es. par un filtrat de cultur~ ~e

P. noxiu~Oég~nde de 1?t figure; vQlr p. ).

1 .):6 24

heures

! Na PP'. RR .'.

..

...."'.'.'.'.·.·.: .· .· .· .: :· .· .

c' f

..

54

Incubation

32

'" RB::? PC

... .. .:- .:· ..: :

: :· .1;,: !c .. :

/~~j~7 ./

1,~~ .r'

2,5

-E..1

600J\.nm

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500

..... ~. .. .. .. .. .. .. .. .. .· .· .· .. .. .. .. .. .. .. .. .... .. .. .. ...- -..................•.................

....

cici

..

85

* Détermination du substrat préférentiel

Cette détermination a été effectuée, pour l'enzyme à caractèrehydrolytique, en faisant agir un filtrat de culture sur divers substrats: acidepolygalacturonique, pectine faiblement méthylée (pectine Ruban Rouge (RR)Unipectine), pectine hautement méthylée (pectine "Ruban Brun" (RB) Unipectine etpectine de citrus (calbiochem). Les résultats (Fig. 20) indiquent que l'activitépectinolytique s'exerce sur les différents types de substrats, maispréférentiellement sur ceux dont le degré de méthylation est le plus faible.

On peut en déduire que la pectine-méthyl estérase jouevraisemblablement un rôle non négligeable dans la dégradation des matièrespectiques dans la mesure où elle transforme la pectine, généralement hautementméthylée, en un substrat plus facilement dépolymérisable.

* Détermination du mode d'activité: "endo" ou "exo"

Cette détermination a été réalisée sur une "pectinase" purifiée par deschromatographies successives sur DEAE-cellulose et sur gel de Sephadex'GIOO(Fig. 22A). Cette préparation, dépourvue de toute autre polyosidase et glycosidaseprésente les activités spécifiques suivantes:

- mesure viscosimétique: 183 AR/ml- mesure par dosage des sucres réducteurs libérés: 173 U/ml- rapport de ces deux mesures: AR/pouvoir réd.: 1,05

Si l'on compare la valeur de ce rapport à celui obtenu pour la CM-cellulaseon en conclut que la pectinase doit présenter une activité de type exo.

En fait, la vérification du mode d'activité de l'enzyme, par analyse dum'llieu réactionnel (CCM de gel de silice; Fig. 18A) révèle que l'hydrolyse

. enzymatique du polypectate de sodium conduit à des produits de réaction de degré· ,de polymérisation variable et non au seul acide galacturonique. L'enzyme est doncde type endo. .

Cependant une analyse comparable réalisée au cours d'une cinétique dedégradation du polypectate de_ sodium révèle que l'acide galacturoniques'accumule très rapidement, dès l'initiation de la réaction. Il semblerait donc quela pectinase, bien que de type "endo" ne détache du polymère que des fragments depetite taille eux-mêmes hydrolysés en monomères. Ceci expliquerait le faibleeffet sur la viscosité du substrat en solution (chute de viscosité très lente) et,par contre, la libération rapide d'''équivalents réducteurs" à partir du polymère.

. '.

Fig. 20: Cinétique d'hydrolyse de différentes matières pectiques par unfi 1trat de cul ture de P noxius (mil ieux réactionnels: substrat àO,5:fl dans du tampon citrateO,025M à pH 4,6 + filtrat de culture de P. noxills(O,63 unité de pectinase/ml de milieu réactionnel).NaPP: polypectate de sodium; RR et RB: respectivement: pectine Ruban Rouge (faiblement méthylée) etpectine Ruban Brun (hautement méthylée); PC: pectine de Citrus hautement méthylée.

86

Ces résultats sont voisins de ceux obtenus par BARTHE et al., (1981) pourla polygalacturonase.,-II excrétée par. ColletotriclJum lindemutlJianum. Cesauteurs montrent que cette enzyme, qui hydrolyse l'acide po1ygalacturonique parvoie "endo", provoque rapidement l'accumulation d'acide ga1acturonique etd'oligomères de faible taille. Au stade ultime le polymère est hydrolysé enmono-, di- et trimère, ces deux derniers n'étant pas, à leur tour, hydrolysablespar l'enzyme.

En définitive et selon la nomenclature de BATEMAN et MILLAR(1966) la pectinase excrétée par P. noxius est uneendo-polygalacturonase (endo-PG) '" endo-poly-a-1,4- galacturonideglycanohydrolasel

4. LES HEMI CELLULASES

On regroupe sous ce terme des enzymes hydrolysant la 1iaisonintermonomérique de divers polymères osidiques autres que la cellulose et lesmatières pectiques. Parmi les macromolécules les plus représentatives de cegroupe on peut citer des homopolymères (xylanes, arabanes, mannanes) et deshétéropolymères tels que les ga1actomananes, arabinogalactanes...

Deux enzymes ont été identifiées hydrolysant respectivement le xylose etla 1amaminarine (b-( 1->3)-glucane). Leur activité est relativement plus élevéeque celle de la pectinase au moins dans le cas de filtrats de cultures sur papierfiltre (Tableau 6).

5. PURIFICATION PARTIELLE ET DETERMINATION DE QUELQUESCARACTERISTIQUES PHYSICOCHIMIQUES DES ENZYMESEXCRETEES PAR P. HOX/ Us.

Cette étude a été réal isée afin de compléter les informations concernantles enzymes excrétés par P noxius. Seuls des fi 1trats de culture de cechampignon ont été analysés pour des raisons techniques: il est en effet seul àexcréter en abondance la plupart des enzymes.

De nombreux essais d'isolement et de purification ont été réalisées; nousn'en présenterons ici qU'une seule, la plus complète en ce sens qu'elle prend encompte la plupart des enzymes étudiées. Pour complément d'information desdiagrammes d'élution:(sur gel-de Sephadex G75, Gl00 et G150) sont présentésprovenant d'autres purifications partielles. ~.'

Le schéma général de 1a purification· partielle est le suivant (les numérosdes fractions correspondent à ceux des' Figures 21 A-D; l'activité des enzymes

87

des différentes fractions est indiquée dans les Tableaux 7 A-D; seule la positiondu "pic" d'activité de chaque enzyme, est indiquée sur le schéma) : '

F'iltrat de culture

Adsorption sur DEAE-Cellulose+ élution par NaCl 0,75M+ concentration sur ultrafiltre PM10

Chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose

1

FI F2 F3 F4 F5 F6

W 20-40 41-64 68-84 185-96 97-120 121-160b-glu 1 Pase Pect a-gal b-glu2

Lac XàCM-cel 1 CM-cel 2

L··1 1 1 1 1

F5A F5B F5C F5D F5E'

W 89-99 100-111 120-132 133-138 139-155a-gal b-gall b-gal2 CM-cel 1b-glu2 Lac

1 1 1

F6A F6B· . , F6C F6EN° 102-114 115-138 - 139-155 . 156-168

b-glu2 b-gal2 CM-cel 2 CM-cel 2a-gal Xtl

a) Remarques générales:

Le filtrat, provenant de cultures de P noxius en milieu Hévéa, présente "une coloration brune intense et contient une forte concentration en composésp~énoliques ; la 00280 initiale de la solution avoisine en effet 3 unités. L'étape'

... . ;.. ~ .-d'adsorption des e~~Yn:~? sur DEf,E-cellulose! type 'DE52, suiyie d'une élution

Tableau 7. .

Purification partielle de quelques enzymes excrétées par P no.xius:A - Activités enzymatiques contenues dans le f1Jtrat de culture Qrut et dans la

solution "batch-DE52".

Filtrat de culture "Batc..h" DE 52D0280 totales = 14416 D0280 totales = 487,8

Enzymes D0280/D0260 = - D0280/D0260 = 1,02

Activité ActivitéTaux: Taux

Totale Iml ID0280 purifica. Totale Iml ID0280 purifica.

Pase 53000 20 3,8 1 5447 127 11,2 2,9

B-glu 28090 10,6 1,9 1 19322 449 30,6 20,8

a-gal 94340 35,6 6,5 1 91322 2128 187,2 28,8

B-gal 29945 Il ,3 2,1 1 18954 4'11 36,9 18,5

Lacc 148400 56 10,3 1 133300 3107 273,3 26,5

Pect 17755 6,7 1,2 1 7647 1,8 15,7 13,1

Xyl 23320 8,8 1,6 1 13016 303 26,7 16,6

CM-cel. 1365980 515,5 94,8 1 1303000 30300 2671,1 28,2

0000

Tableau 7

Purlfication partielle de quelques enzymes excrétées par P. noxius:B - Activttés enzymatiques présentes dans les dtfférentes fractions séparées

par chromatographte sur DEAE-cellulose (pour la référence des fractton, se'rapporter au schéma de purtftcation p.g-n

n

FI { D0280 totales= 9,93 D0280 to tales _= -1 6,7F3 { D0280 total es = 24 ~ 2

Enzymes D0280/D0260 = 0,89 F2 { D0280/D0260 '= 1,04 . D0280/D0260 = l,Il

Activité Activité ActivitéTaux Taux Taux

Totale /ml /D0280 purifica. Totale /ml /D0280 purifica. Totale /ml /D280 pur ificatio

Pase 0 0 0 - 1591 77 ,5 455 120 770 9,6 31,8 8,4B-glu -1014 13,2 102 54 0 0 0 - 0 0 0 -a-gal 0 0 0 - 0 0 0 - 0 0 0 -13-gal 0 0 0 - 0 0 0 - 3445 43 142,3 68Lacc - - - - 0 0 0 - 2026 25 83,1 8Pect 0 0 0 - 0 0 0 - 2104 33,8 1Il ,1 93Xyl 0 0 0 - 392 4 23,5 15 116 2,2 1,3 4,6CM-cel. - - - - - - - - - - - -

0\00

F6 { D0280 totales", 77D0280/D0260 = 1 0

F5 { D0280 totales= 38,4D0280/D0260 = 1 05

F4 { D0280 totales= 25,2­D0280/D0260 = 0 98, , ,

Pase 410 1,6 16,3 4,3 0 0 0 - 0 0 0 -l3-glu 0 0 0 . - 815 8 23 12 6210 34 81 42

a-gal 16552 306 651 101 58550 542 1525 234 19364 106 251 38

~gal 602 11 24 Il 10123 94 264 125 4100 26 61 29

Lacc 10260 190 401 39 19980 18.? 520 51 2130 15 36 3,4

Pect 723 13 29 24 144 1 19 16 0 0 0 -Xyl 308 5,1 12 8 505 5 13 8 4448 24 56 36

CM-cel. - - - - 198165 1835 5160 54 581096 3226 - 1625 80

Tableau 7

Purification partielle de quelques enzymes excrétées par P. noxius:C - Activités enzymatiques contenues dans différentes fractions séparées par

filtration sur gel de Sephadex 675 de la fraction NF5-DE52" (préalablementisolée par chromatographie sur DEAE-celtulose; voir le schéma depurification p.~1-).

EnzymesD028D totales = 1.6 .

F A { D0280/00260 = 1,14{ D0280" totales = 3.2

F5 B D0280/D0260 ...F5 C { D0280 totales - 1.8

D0280/D0260 ... 1,28

Activitê Activité Activitê

ImlTotale\-----.,r-----.,r-----t Taux \-------.----_---04" Taux \----,------,------4 Taûx

ID0280 purifica. Totale Iml ID0280 Purif ica • Totale Iml ID0280 purifica.

I3-g1u

a-gal

6-gal

Lacc

CM-cel.

332

18643

125

o

30,1

169,5

11.4

o

207

11650

78

o

109

1792

37

116

7987

1816

2072

o

10.3

713

162

î85

o

36

2496

567

647

o

19

384

270

63

13

o1637

213

19392

1

o128

16,7

1515

1

o909

118

10773

433 .

Il ,5

114

F5 D { D0280 totales ... 0.61D0280/260 = 1,22

D0280 totales· 1.7F5 E {D0280/D0260·' = 1,08

6-glu

a-gal

6-gal

Lace

CM-ceL

11

o259

o46

o

17,7

o418

o

9

199

54

ooo

3.3

ooo

32

ooo

17

41865 7476- vis.

- Red. - 11.5 2,05

67520

18,5

712 115830

22,8

7020

1,38

68135

13.4

718

91

Tableau 7

Purification partielle de quelques enzymes excrétées par P noxius:D - Activités enzymatiques contenues dans différentes fractions séparées par

filtration sur gel de Sephadex G75 de la fraction "F6-DE52" (préalablementisolée par chromatographie sur DEAE-cellulose; voir le schéma depurification p$7·).

Enzymes a- g lu

Frac tians

œ-gal f'-gal X'yl CM. cell

F6 A

F6 B

F6 C

F6 D

40

12

o

o

110

23

o

o

25

36,5

10

o

12,7

21,4

13,8

o

o

4 000

6 600

3 640

Activité spécifique en unités/ml.

92

Figure 21A,B - Chromatographie sur DEAE-cellulose: profil d'élution dedifférentes enzymes contenues dans Ur) flltrat de culture de P noxius.. .

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DE 52

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20 10 20 2

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10

20

20 100

Numéro des.' Fracllons

180

93

L1gure 21 - Séparation de différentes fractions enzymatiques par filtrationsur gel de Sephadex 675. C) Rechromatographie de la fractiuon "F5-DE52";D) Rechromatograph1e de la fraction "F6-DE52" (pour la référence desfractions: voir le Scéma de la procédure de purification),

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Numêro des Fractions

· ~4

totale par une solution de force ionique élevée et d'une concentration surultrafiltre AMICON PM 10 conduit à éliminer plus de 96% des composésabsorbant dans cette longueur d'onde et à concentrer les solutions enzymatiques.Le rendement de la première étape varie suivant la nature des enzymes ;il estparticulièrement élevé pour les activités a-galactosidase, laccase etCM-cellulase; il est en revanche médiocre pour celle des pectinases et desphosphatase.

L'élimination de la majeure partie des composés phénoliques conduit à untaux de purification (apparent) particulièrement élevé.

Les résultats (Fig. 21 A-D) montrent que certaines activités des f'iltratsbruts résultent de l'action conjuguée de plusieurs isoenzymes. C'est le cas pourles activités b-glucosidase, la b-galactosidase et la CM-cellulase (deuxisoezymes pour chacune d'entre elles). Concernant cette dernière, les tests ontété réalisés selon les deux méthodes classiques: par viscosimétrie et par dosagedes sucres réducteurs ; ils révèlent que les deux isoenzymes hydrolysent laCM-cellulose selon le mode "endo".

Cette expérience de fractionnement a été mise à profit pour vérifier uncertain nombre d'autres caractéristiques de l'équipement enzymatique de Pnoxius:

b) Les aryl-b-glucosidases sont-elles des cellobiases?

Cette vérification a été' réalisée en incubant, en présence de cellobiose,les différentes fractions isolées au cours de la purification des enzymes dufiltrat de culture de P noxius (fractions F1-->F4 (isolées par chromatographiesur DE52); F5A -->F5E et F6A --> F6D (chromatographie sur DE52 suivie d'unefiltration sur Sephadex G75). Les produits de réactions ont été analysés parchromatographi e sur couche mince de ge1de si lice.

Le diagramme de la figure 188 montre que la b-glucosidase 2 (fractionF5A) hydrolyse le cellobiose: cette enzyme appartient donc au groupe descellobiases. L'enzyme 1 est également une cellobiase (son activité dans lafraction FI étant très faible, seules des traces de glucose ont été libérées durantl'incubation, le spot correspondant n'est pas visible sur le documentphotographique). Les deux isoenzymes de la b-glucosidase sont donc capablesd'hydrolyser le dimère naturel: elles sont par conséquent susceptibles departiciper à la cellulolyse. P noxlus n'excrète pas deux types d'enzyme, l'unspécialisé dans l'hydrolyse d'hétérosides du type p-nitrophényl-glucoside, l'autredans la rupture des liaisons osidiques, comme c'est le cas par exemple chez5tereum sangull70leum (BUCHT et ERIKSSON, 1969).

95

flgure 22 A- Profil d'élution sur Sephadex 6100 de la pectinase de P. noxius.

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60 SO 100 120 140 160

N° des Fractions

Figure 22 B- Profil d'élution sur Sephadex 6100, des CM-cellulase et Xylanasede P. noxius.

96

v./voG 100

2

1,5

Figure 23 - Détermination graphique du PM dedifférentes enzymes isolées à partir du filtratde cultùre de P. noxi{j5.

''------,.......""'''T''--r--r-.-'''I'"'T----i.....1 2 5 8

P.M. x 1040

ve/va

2

1,5

G 150

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5 10 15P.M. x 104 0

l '-- -.-_--.-.......- .......--2102

'P.M.

V~Vo

G 75 G 75

22

1,5/Xylanase

1,538 000

• p Ga12~43000

.'

Laccase~BSA

70000 ~J3 Gal174 000

1 • 1

1 2 1 2 5' 9P. M. P.M. x10 4 0

97

c) Les activités CM-cellulase et xylanase sont-elles dues àdeux protéines enzymatiques distinctes?

Chez Poria placentea ces deux enzymes font partie d'un "complexe" nonséparable en ses éléments (HIGHLEY et 211., 1981). Certains auteurs pensent que lacellLllase possède également une activité xylanasique .; ERI KSSON (1981 a), pour sapart, estime que ces résultats sont dûs à une séparation imparfaite des deuxenzymes et qu'en fait les deux activités sont à mettre au compte de deuxprotéines enzymatiques distinctes.

Dans le cas des enzymes excrétées par P. noxius et bien que leurpurification ne soit pas parfaite, le décalage du pic "xylanase" par rapport àcelui de la CM-ce llulase (chromatographie sur G100 Fig. 22B) démontrel'existence de deux protéines distinctes spécialisées l'une dans la dégradationdes xylanes, l'autre dans celle de la CM-cellulose.

d) Poids moléculaires et pH optimal d'activité desdlfférentes enzymes.

Le poids moléculaire de la plupart de ces enzymes a été déterminé parfiltration sur gel de Sephadex G75, G100 ou G150 étalonné à l'aide de protéinesde PM connu. Ces déterminations ont été réalisées par co-chromatographie de laprotéine dont le PM est à déterminer (repérée sur l'élutogramme par son activitécatalytique) et des protéines marqueurs. La figure 23 présente la déterminationgraphique des PM des différentes enzymes excrétées par P. noxius (voir plusloin pour la détermination du PM des laccases et peroxydases). Parallèle,ment aété vérifié le pH optimum d'activité de ces enzymes. L'ensemble de cescaractéristiques est consigné dans le tableau 8.

6. REMARQUES SUR L'EQUIPEMENT ENZYMATIQUE DES DEUXCHAMP1GNONS

R lignosus et P. noxius possèdent tous les deux un équipement trèscomplet en matière d'enzymes intervenant dans la dégradation des polyosidespariétaux (Tableau 9). Ils sont donc, l'un et l'autre potentiellement aptes àeffectuer des altérations similaires au niveau des parois cellulaires. Seul leniveau d'activité des enzymes diffère, P. noxius possédant des potentialitésnettement supériel:lres à celles de R. lignosus ~ Comme nous l'avons signalé

98 .

Tableau 8

P'oids moléculaire (PM) et pH optimal d'a~tivité de quelques enzymes

extracellulaires de.P noxius partiellement purifiées.

ENZYMES PM pH optimal

a-galactosidase 112-115 000 5,0

b-galactosidase 1 74000 4,3

b-galactosidase 2 43000 4,3

.b-glucosidase 1 69000 5,0

b-glucosidase 2 88000 5,0

CM-cellulase 1 33000 4,8

CM-ce1Julase 2 31 000 4,8

Pectinase 39000 4,5

Xylanase 38000 3,8

Laccase 70000 4,5

Peroxydase 47000 4,0

99

précédemment, cette différence de potentialité est particulièrement évidente auniveau des polyosidases.

Concernant le complexe cellulolytique, les deux champignons excrètentles trois enzymes (exo-glu<;anase, endo-glucanase et cellobiase) nécessaires à ladégradation totale de la cellulose en son monomère, le glucose. D'après HIGHLEY( 1977) un te1équipement est caractéristique d'un agent de pourri ture blanche; 'ilconstituerait donc un indice supplémentaire de l'appartenance de P noxius à cegroupe de champignons et non à celui des agents de pourriture brune.

Les essais de purification des enzymes excrétées par P noxius ontpermis de recenser des isoenzymes (deux dans chaque cas) pour la b-glucosidase,la b-galactosidase et la CM-celJulase. Les deux b-glucosidases dégradent lecellobiose et sont donc susceptibles de participer à la phase ultime de ladégradation de la cellulose. Les deux CM-cellulases sont toutes les deux de typeendo d'après les caractéristiques de l'hydrolyse de la CM-cellulose.

Comparé à celui d'autres champignons, l'équipement de P noxius enenzymes cellulotytiques, notamment en endo-glucanase (CM-cellulase), paraîtrelativement simple. En effet S. pu/veru/entum excrète cinq endo-glucanases,une exoglucanase et deux b-glucosidases (cellolbiase) (ERIKSSON, 1981 a et b ;ERIKSSON et RZEDOWSKI, 1969 a et b ; ERIKSSON et PETTERSON, 1975 a et; ALMINet aL, 1975; BUCHT et ERIKSSON, 1969).

Pour leur part BELDMAN et al. (1985) ont isolé, à partir d'une préparationde cellulase commerciale de TricIJoderma viride, six endoglucanases, troisexoglucanases et une b-glucosidase (cette dernière présente des caractéristiquestout à fait exceptionnelles puisqu'elle n'hydrolyse pas le cellobiose maishydrolyse par contre, modérément, la CM-cellulose, l'Avicel et le xylane et trèsactivement le p-nitrophényl-b-D-glucose et le p-nitrophenyl-b-D-xylose).D'autres systèmes enzymatiques ont été décrits, notamment celui deTricIJoderma resei qui lui aussi est caractérisé par l'existence de plusieursisoenzymes.

Cette multip1icité d'enzymes produites par un même organisme paraissaitsurprenante et l'on pouvait se demander s'il ne s'agissait pas d'artefacts.

De fait si les conditions de culture sont modifiées, r reesei ne produitplus qu'une seule endoglucanase. D'après des essais complémentaires il ressortque la multiplicité des enzymes du filtrat de culture proviendrait de l'actiond'enzymes protéolytiques sur une protéine enzymatique originelle unique.ERI KSSON (1981 a) estime qU'un mécanisme de ce type pourrait égalementexpliquer la présence des 5 endoglucanases (dont les PM sont peu différents lesuns des autres) dans le filtrat de culture de S. pu/veru/entum, dans lequel desenzymes protéo lyt iques ont été caractéri sées.

100

Tableau 9

Activités enzymatiques mises en évidence dans les filtrats de

culture de 'R Iignosus et de P. n.oxlus.

Acitvités enzymatiques R. lignosus P. noxius

Phosphatase acide ++ ++

b-g1ucosidase (ce110biase) +++ +++

a-ga1actosidase +/- ++++

b-ga1actosidase ++ ++

Enzymes pectiques:

- PME ? ++

- Po1yga1acturonase + +++

- PGTE ? +

Enzymes ce 11u10 lytiQues:

- CM-cellu1ase (endo-

glucanase) + ++++

- Exo-g1ucanase + ++++

Xy1anase + ++++

b-(I-->3)-glucanase + ++

Estérases + ++

Protéase (leucyl-

aminopept idase) +

Laccase ++++ +

Peroxydase ++

Catalase +++ +

101

Chez P noxius le nombre de CM-Cellulases peut également varier: lorsde certaines expériences de purification une seule de ces enzymes a été détectée;enfin le PM de la CM-Cellulase 1 (33000 D) est très voisin de celui de l'enzyme 2(31 000 D); en revanche nous n'avons jamais pu détecter d'enzyme protéolytiquedans le filtrat de culture.

Enfin, concernant l'activité des exoglucanases, deux situations peuvent seprésenter quant à la nature du produit d'hydrolyse de l'Avicel : cellobiose seul(cas des enzymes excrétées par T.reesei et des enzymes Exo Il et Exo III de T.viride ), cellobiose + glucose (cas de l'exoglucanase excrétée par 5

. pu/veru/entum ). L'exoglucanase 1 de T. virideJ pour sa part, catalyse lalibération du cellobiose à partlr de l'Avlcel puis hydrolyse le cellobiose englucose ; cette enzyme présente donc ~ la fois la caractéristique d'uneexoglucanase et d'une cellobiase.

Dans le cas de P no,,'dus et R. /ignosus, ces deux sucres sont identifiésdans le m"ilieu réactlonnel. Cependant ces essais ayant été réalisés à l'aide d'unfiltrat brut, l'hydrolyse du cellobiose en glucose résulte à notre avis de l'activitéde la cellobiase (b-glucosidase) présente dans ce milieu réactionnel. Seule lamise en oeuvre d'exoglucanase purifiée permettrait de vérifier si ces enzymesprésentent également une activité cellobiase comparable à celle del'exoglucanase 1de T. viride.

103

III. LA DEGRADATION DE LA LIGNINE. ROLE DE LA LACCASE.

Les hypothèses que nous avons émises plus haut relatives à l'influence dela balance entre activités laccase et hydrolase sur le comportement parasitaire'des deux agents pathogènes reposent sur l'hypothèse selon laquelle la laccaseconstitue un témoin fiable de l'aptitude des champignons à dégrader la lignine. Ilétait donc essentiel, dans l'optique de notre étude, de vérifier si la laccaseintervient effectivement dans la dégradation de ce polymère.

D'entrée une prèmière question peut être posée: pourquoi le choix s'est-ilporté sur la laccase en tant que marqueur de la dégradation de la lignine plutôtque sur une autre enzyme?

Le rôle privilégié des "phénoloxydases" dans la biodégradation de lalignine a été suggéré il y a plus de cinquante ans par BAVENDA/"IM (1928). Lestravaux de cet auteur révélaient que les champignons agents de pourritureblanche du bois, dégradant la lignine, synthétisent et excrétent unephénoloxydase, tandis que les agents de pourriture brune (non lignivores) neproduisent pas cette enzyme. Depuis cette époque, de nombreuses recherches(HARKIN et OBST, 1973; HARKIN et al., 1974; KIRK et KELMAN,1965; SUNDMAN etNÂSE, 1971; inter alii ) ont été conduites, apportant une précisionfondamentale, à savoir que la phénoloxydase spécifique des agents de pourritureblanche est une laccase (p-diphéno1oxydase, E.C. 1.10.3.2).

Cette corrélation étroite entre capacité à excréter une laccase etaptitude à dégrader la lignine, soulevait la question de l'intervention effective del'enzyme dans la dépo1ymérisation de la lignine. Cette question était d'autant pluspertinente que la dégradation du polymère, de structure po1yphéno1ique complexe,fait appel à des réactions oxydatives. L'hypothèse d'une intervention de la laccaseétait donc parfaitement plausible, la très faible spécificité de substrat de cetteenzyme la rendant, de plus, apte à oxyder les composés phéno1iques les plusdivers. Cependant, les très nombreuses investigations opérées dans ce domaine(voir notamment les revues de ANDER et ERIKSSON, 1978; ERIKSSON, 1981aetb;HALL, 1980; HIGHLEYet KIRK, 1979; KIRK, 1971; KIRK et al.,1977; LEVINE, 1966;MAYER et HAREL, 1979) ont conduit à des résultats contradictoires.

En effet, si, de façon générale, les différents auteurs admettentl'intervention de la laccase dans la biodégraâation de la 1ignine comme uneréalité, en revanche, leurs opinions divergent quant aux mécanismes impliqués.Pour certains, l'enzyme effectue (ou, du moins, est théoriquement capabled'effectuer) la rupture oxydative de la macromolécule (15HIHARA, 1980;ISHIHARA et MIYAZAKI, 1972; lWAHARA et HIR05E, 1983; KIRK et a1., 1968 a et b;UI"IEZAWA et al., 1982; Van VLlET, 1954). D'autres estiment qu'elle polymérise lalignine (HAARS et HÜTTERMANN, 1980 a et b; HÜTTERMANN et a1., 1977; 1983); la

104

réallté de cette action étant mise en doute par KERN (1983),. Pour leur part,ISHIHARA et MIYAZAKI (1972) montrent que l'enzyme effeetue à la fois lacondensation et·1a dépo1ymérisation de la macromolécule. Par contre ANDER etERIKSSON (1976) estiment que la laccase joue un rôle majeur dans la régulationde la synthèse d'autres enzymes directement impllquées dans la dégradation dusquelette 1ignocellu1osique. D'autres auteurs pensent que la laccase intervientessentiellement pour détoxifier les m'ilieux de culture (ou les tissus de l'hôte)par oxydation des composés phéno1iques toxiques pour le champignon (GADD,1957; GRASSE et a1., 1968, GIERER et OPARA, 1973). Enfin, l'activitédépo1ymérisante de la laccase n'a pas été confirmée par KAPLAN (1979), qui, parailleurs, n'a pas réussi à mettre en .évidence une stricte corrélation entreprésence de l'enzyme et aptitude des microorganismes à dégrader la lignine(KAPLAN et HARTENSTE1N, 1980).

Ce rapide survol de la littérature montre que le problème posé par lafonction. de la laccase excrétée par les champignons 1ignivores est loin d'êtreclairement résolu.

Schématiquement on peut dire qu'il existe plusieurs écoles: l'uneconsidère l'intervention directe de la laccase dans la biodégradation de la ligninecomme une réal ité, l'autre estime que cette enzyme effectue en fait lapolymérisation de la 1ignine à partir des unités phény1propanes ou de fragmentsde lignine de petite taille. De manière très générale la lecture des différentespublications traitant de ce sujet nous amène à formuler les remarques suivantes:

, - De nombreux travaux sont effectués en ajoutant de la 1ignine, dont onsuit le devenir, directement dans le milieu de culture du champignon. Comme lesignalent LEONOWICZ et al. (1985), les résultats issus de telles expérimentationssont ambigües, la laccase n'étant pas nécessairement la seule enzyme àintervenir dans la transformation de la lignine ni surtout la seule à être excrétéepar le champignon. Dans ces conditions 'il est toujours possible d'imaginer que leséventuels produits de dégradation subissent des transformations successives,rendant de ce fait même l'interprétation des résultats délicate.

- De nombreux travaux sont, également, réal isés en faisant agir lalaccase purifiée sur des substrats-modèles en particulier des dimères. Cesessais sont extrêmement précieux car ils permettent de préciser les mécanismesenzymatiques impliqués. Cependant la capacité à effectuer la rupture d'un dimèrene signifie pas nécessairement que l'enzyme en question soit capable de dégraderle polymère.

C'est pourquoi, dans le cadre de la présente étude il nous paraissaitessentiel de vérifier l'action d'une enzyme purifiée sur une lignine polymérisée.

40 ......

Se posait dès lors le problème du·choix du substrat: la lignine est eneffet insoluble et de surcroît intimement 1iée, dans les parois végétales, à lacellulose, aux hémicellu10ses et aux matières pectiques. Les seules équipes

105

ayant, à notre connaissance, adopté la même démarche ont utilisé, l'une(1 SHI HARA et MIYAZAKI, 1972, 1980), la 1ign'ine de bois moulu extraite audioxane, l'autre (KAPLAN, 1979) différentes lignines du commerce (lignine deKraft, Induline, 1igninosu1fonate.. .> (une troisième équipe (LEONOWICZ et aL,1985) vient récemment de publier un travail similaire en utilisant également du1igninosu1fonate (Peritan-Na) comme substrat); Le problème majeur est d'utiliserun polymère qui, après extraction à partir du bois, conserve les typesd'enchaînement et la composition monomérique de la 1ignine nature Ile. Vu ladiversité des lignines dans le bois et leur hétérogénéité préexistante (MONTIES,1980; MONTIES et LAPIERRE, 1982) on ne peut espérer obtenir, par quelqùeméthode d'extraction que ce soit, ni un produit homogène, ni vraisemblablementun produit représentatif des lignines natives, au moins au plan des proportionsrelatives.

La lignine de bois moulu est considérée par de nombreux spécialistescomme la plus proche de la lignine naturelle, encore que sa composition:monomérique puisse différer du produit originel. Les ligninosulfonates et surtoutdiverses lignines du commerce, sous-produits de l'industrie papetière sontsouvent des dérivés résultant d'une action chimique vigoureuse provoquant desmodifications structurales importantes.

Pour notre part nous avons choisi comme substrat, une'~lignine extraitepar l'acide thioglycollque, traitement considéré comme le plus doux parmi les

,méthodes d'extraction chimique, et respectant le mieux les liaisonsintermonomériques (LAI et SARKANEN, 1971) ; le spectre UV (Fig. 31 A) de cettelignine thiog1ycolique (LTG) est en accord avec les données de la littérature(BRAUNS et BRAUNS, 1960 ; GOLDSCHI'11 D, 197 n La LTG présente par a'illeursl' intérêt d'être hydroso1ub1e en mil i eu tamponné à pH 6.

L'enzyme utilisée pour cette expérimentation est la laccase L1 de R/ignosus. Il s'agit de l'enzyme majeure abondamment excrétée par cechampignon.

Au cours d'une première étape nous' avons purifié cette enzyme tout enétudiant, parallèlement, les caractéristiques de la laccase L2 de R /ignosusainsi que de celle excrétée par P "noxius. Ce faisant nous avions un doubleobjectif :

* d'une part, vérifier si les différentes enzymes citées sont bien deslaccases, déterm'iner leurs pr'incipa1es propriétés et caractéristiquesphysicochimiques et les comparer à celles d'autres enzymes' du même typesynthétisées soit par des arbres, soit par des champignons (voir notamment lesrevues publiées par LEVINE, 1966; MAYER et HAREL, 1978)

* d'autre part, purifier à homogénéité l'enzyme L1 dans le but d'étudier,. au cours d'une seconde étape, son action sur la LTG.

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~ '~. J

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107

Figure 24 - Séparation des laccases L1et L2 par chromatographie surDEAE-celluiose type DE52.

4~ rooNuméro des Fractions

0,1

R. lignosus

*J L1*

DE 52

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figure 25- Contrôle des laccases de R. lignosus et P nox/us à différentesétapes de leur purification. (a et b: électrophorèse en gel d'amidon suivie dela révé latlon des laccases par leur activité catalytique; cet d: électrophorèseen gel de polyacrylamide).

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v· t1,ut

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j --'

1 2 3 4 5 6 /- L . ,l ... .... .,~ -

8) Car~térisationœs1~ LI etL2 (Il. lignosus(L» et de l'enzyme de P. noxius (N);L+N= mélanoe œs œux filtrats. bl Contrôle œs différentes étapes œ purification œs loccases L1etL2: 1,2 et 3: différentes fr~tions de l'éffiuent de la colonne d'hydraxyapatite(1~ L1); 4: élu6tde la colonne hydroxyapatite (locœse L2); 5 et 6: éluet OE52: respectivement: fr~tion L2 (encorecontamInée par l'enzyme LI) et L1. c) F=f1ltrat œculture; LI et L2 HA =llnaSEl LI et L2 aprèspurification sur hydroxyopotite; LI DE • l~ L1oprès l'étope DE52; Bel G· respectivementrévélation au bleu de coomassie (protéine) et au gaïOCDI (~tivilé locœse). d) Electrophorèse en (J31SOS à 1'1ssue œla purIfication.

109

1. PURIFICATION DES LACCASES DE R. l/6NOSUS ET DEP. NOK/US.

a) Identification des enzymes dans les filtrats de culture(rappel)

Par électrophorèse en gel d'amidon, suivi d'une incubation dans le milieuréactionnel des laccases, il est possible de révéler deux enzymes (L 1 et L2) dansle filtrat de culture de R /ignosuset une (LN) dans celui de P. noxius(Fig.25a).Dans ce dernier cas, une incubation de longue durée permet de révéler deux bandessupplémentaires de faible intensité. L'étude qui suit ne prend en compte que lesenzymes majeures LI, L2 et LN.

b) Purification des laccases excrétées par R. lignosus.

La purification de ces enzymes est réalisée en trois étapes résuméesdans le tableau la

Le filtrat brut ayant une pigmentation brune re1ativerTlent intense, lesmesures de DO n'ont pas été mentionnées à ce stade. Elles n'ont en effet aucunesignification quant au contenu réel en protéines de cette solution. Il en est demême au stade "batch DE 52", bien que cette étape permette d'éliminer une partieimportante de la pigmentation dûe, vraisemblablement à la présence de composésphéno1iques oxydés, de taille' inférieure à la 000 D puisqu'ils traversent lamembrane du fi Itre Amicon PM la. Ainsi le degré de purification apparent desfractions LI et L2, séparées par chromatographie sur DEAE-cellulose (Fig. 24 )est grandement amélioré par simple concentration et lavage des solutions surl'ultrafiltre (Tabl. la). '

Le passage sur colonne d'hydroxyapatite. a pour but principal dedébarrasser la fraction L2 de la laccase LI qui la contamine. L'examen desplaques d'électrophorèse (Fig. 25 b) révèle en effet l'importance de cettecontamination. En première approximation, elle représente plus de la moitié del'activité enzymatique totale de la solution "L2 - DE52". Après é1ution, l'enzymeL2 est pure. ,

Cette même procédure permet d'achever la purification de la laccase LIqui, dans les conditions opératoires utilisées, n'est pas adsorbée surl'hydroxyapatite. Les fractions recueillies ne contiennent plus le contam'inantprotéique présent au stade DE 52'(Fig. 25 c; gel "llpE" et "L 1HA").

110

TABLEAU 10

Purification des laccases de R. lignosl./s

Etapes Volumes(ml)

D,Q,28Q0,0.260

Proteines Activité Activité Rendementtotales totale spécifique

(mg) (U) (U/mg)

Filtrat 7050 6850000 100Batch OE52 66 3575000 52

DE 52a) fractions non concentrées

L 1 225 1,04 229,5 1 968600 8750)) 34

L2 175 0,97 296 361 300 1 220)

b) fractions concentrées (Amicon PM 10)L 1 17,2 1,27 60,5 1 892200 31 270)

) 33,4L2 12 1,05 42,9 . 394800 9200)

Hydroxy-apatite (fractions concentrées)L 1 10 l ,4 35,2

L2 7 1, 12 5,0

. 1 472500 41 830)) 22

37500 9000)

La figure 25 c présente les résultats de certa'ines de ces étapes depurification en mettant en parallèle des électrophorégrammes révélés soit par leBleu de Coomassie (coloration des protéines), soit par le galacol (activitélaccase). Enfin, la figure 25 d rend compte de l'homogénéité des proté'ines aprèsélectrophorèse en conditions dé~aturantes (SOS),

c) Purjfjcatjon de la laccase.de P. noxius

La purification de cette enzyme a été moins poussée que celle des deuxlaccases de R. 11~qnosl./s, Notre objectif se limitait, en effet, à l'obtention d'une

111

E!gure 26 - Pur1f1cat1on parttelle de la laccase de P. nox(us: A) Proftld'élut1on de dtrrérentes enzymes par Chromatograph1e sur DEAE-cellulose.B) Rechromatograph1e sur Sephadex G75, de la fract10n enrtch1e en laccaseau cours de l'étape Al

•GO41 «1GO

~ P. noxlusal"0 III •0 •• III - «1., 0 U

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Gl «1 *.. e" e" ..J •0 u

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CD QI~ ~ - D. E. 52... a. 'c

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... , .. "o 20 110

Numéro des Fractions

P. noxius

. 1 0

CI

8..III

CI "t:l., >- 0,5III ..... e...III QI

..J a.• *1 1• ";c *

E

E6000 20000

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ID 000

2000 0,1

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G 100

••CCI

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•

·i\;w•

llîoNuméro. des

*\, '

~ractions

112

f.!gure 27 - Caractér1stlQues spectrales de la laccase LI de R. Ilgnosus(A)et de la laccase de P. nox/us(B). .

2

L1

®LN

500 800 700 ).nm

flgure 28- Oétermlnat1on graph1Que du PM des dlrJérentes laccases: A) LI etL2 de R. I/gnosus' détermlnat10n effectuée par. flltrat10n sur gel de Sephadexen condlt1ons non dénaturantes; B) Laccase '(et peroxydase) de'P' noxlus ,,'(mêmes condItIons Qu'en A); C) Laccases LI et L2 de R. IlgnoSus,détermInatIon effectuée en condItIons dénaturantes (gel de polyacrylamlde +

SOS).

ve/vo

2

G 100

A Bve/vo

G 100

2 Cyl. C

'.5

100

50

csos

3 PGK

L1 --54000 .,#'/'

L 2 55000

1 L...--.....--.---.....-r"'T""'T'"'..---_1 2 5 8

P.M. X 1040

2 5 8P.M. x104

0

113

.1accase suffisamment concentrée et débarrassée de la pigmentation brune dufiltrat de culture de manière à convenir à la détermination, de certainescaractéristiques physicochimiques (notamment spectrales). >

Les premières étapes de purification (adsorption sur DEAE-cellu10sesuivie d'une é1ution par une solution de force ionique élevée et d'uneconcentration sur ultrafiltre Amicon PM10), sont identiques à celles décritesplus haut. Cette solution concentrée est très riche en glycosidases etpo1yosidases. Afin de les séparer de la laccase, la solution est chromatographiéesur colonne de DE 52 (Fig. 26 A). Les fractions enrichies en laccase sont récoltéeset concentrées. Elles contiennent encore une quantité appréciable d'

,a-ga1actosidase et, surtout, de peroxydase. Ces contaminants sont éliminés parfiltration sur colonne de gel de Sephadex 6100 (Fig. 26 B). Les fractions les plusactives sont rassemblées et concentrées; la solution obtenue présente lacoloration bleue caractéristique des laccases. Elle conserve néanmoins une faibleactivité peroxydasique (légère absorption à 402 nm. cf Fig. 27 B). .

d) Propriétés physicochimiques

10 Caractéristiques spectrales

Les spectres des laccases L1 (Fig. 27 A) et LN (Fig. 27 B) purifiées ontété enregistrés pour des longueurs d'onde comprises entre 750 et 240 nm. Ilsprésentent, outre le pic d'absorption des protéines à 280 nm,. un deuxième picvers 605 nm. Ce dernier est caractéristique des enzymes à>~;~cuivre (Cu2+) etresponsab1e de 1a col oration bleue des solutions concentrées de 1accase.L'enzyme L2 possède les mêmes caractéristiques spectrales.

. 2 0 Spécificité de substrat

Les résultats des tests de spécificité de substrats (Tableau 11)confirment l'appartenance des trois enzymes au groupe des laccases. Ellesoxydent en effet l'hydroquinone et la syringa1dazine (HARKIM et OBST, 1973),substrats spécifiques des p-diphéno10xydases , mais non la tyros'ine,substrat-type des po1yphéno1oxydases (o-diphéno1oxydases).

Outre ces trois substrats, divers composés phéno1iques choisis, pour laplupart, pour leur relation avec le métabolisme de la 1ign'ine ont été testés. Dansles conditions indiquées et bien qu'elles ne soient pas nécessairement optimalespour tous les substrats, un certain nombre de tendances significatives sedégagent, des résultats enregistrés.

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114

,. TABLEAU 11

Spécificité de substrat des laccases purifiées

Outre ces trois substrats," divers composés phénoliques choisis, ,pour laplupart, pour leur relation avec le métabolisme de la lignine ont été testés. Dansles conditions indiquées et bien qu'elles ne soient pas nécessairement optimalespour tous les substrats, un certain nombre de tendances significatives sedégagent des résul tats'enregi strés. .

, De manière générale les composés de la série cinnamique sont oxydés plusrapidement que les composés correspondants de la série benzoïque (acidep-coumarique > acide p-hydroxybenzoïque = p-hydroxybenzaldéhyde), Concernantla série cinnamique', cette vitesse 'd'~xydabon c~oît selon la séquence acidep-coumarique ---) acide férulique --) acide sinapique, La méthylation del'hydroxyle en 'C3 'ét 'l'a réduction de la fonction' acide carbôxyl ique' en fonctionalcool (en C.. de la chaîne latérale) n'a 'que'peu d'effet sur l'activité enzymatique

115

(efficacité comparable des acide' caféique et férulique et de l'alcoolconiférylique). Par contre la position de l'hydroxyle phénolique l'ibre paraîtfondamentale: la position en "para" étant la plus favorable. Enfin la ligninethioglycolique, est également un substrat des laccases étudiées.

En définitive, les trois enzymes présentent des caractéristiques despécificité de substrat très voisines.

La 1iste des substrats présentée ici est loin d'être exhaustive. Des testsqualitatifs effectués précédemment à l'aide d'un filtrat de culture de R /ignosusavaient permis d'identifier une trentaine de substrats phénoliques. Il est à noterque l'oxydation enzymatique du p-crésol conduit à la formation d'un précipitéblanc,tout comme celle de l'alcool coniférylique.

Enfin, comme déjà signalé (BOCKS, 1967), l'utilisation d'un substrat. légèrement oxydé, augmente considérablement la vitesse de la réactionenzymatique et supprime la phase d'''accélération'' observée durant les premièressecondes de la réaction. C'est pourquoi les activités spécifiques sont toujoursmesurées à l'aide d'un milieu réactionnel préparé extemporanément.

3" Poids moléculaire

La détermination du poids moléculaire des enzymes natives, réal isée parfiltration sur colonne de gel de Sephadex en présence des marqueurs protéiquescités conduit aux valeurs suivantes: 52 000 et 55 000 D respectivement pourles laccases L1 et L2 de R./ignosus (Fig. 28 A) et 70 000 D pour celle (LN) deP noxius (Fig. 28 S).

La différence de PM entre L1 et L2 est faible mais paraît néanmoinssignificative puisque les valeurs fournies résultent d'une expérience decochromatographie. Il convient de souligner qu'il s'agit de données relatives à desPM apparents.

En conditions dénaturantes (SDS) les valeurs de PM suivantes ont étédéterminées: 54 000 (L 1) et 55 000 (L2) (expériences individuelles; Fig. 28 C),alors qu'une coélectrophorèse effectuée dans les mêmes conditions ne permet derévéler qU'une seule bande protéique. Il faut en conclure que les laccases L1 et L2sont constituées d'une seule chaîne peptidique de PM très voisin.

4° pH optimal d'activité et pH isoélectrique

utilisant le galacol comme substrat, l'activité catalytique es~ optimaleaux pH ~,6; 6,0 et 4,0 respectivement pour les laccases L1, L2 et LN. Il est ànoter que le pH optimal d'activité peut varier suivant la nature' du substrat(KUI'1ARI et SIRSI, 1972).

La détermination du pH isoélectrique n'a été effectuée que. pour les1accases excrétées par R. / ignosus. l,es valeurs enregi strées sont:" 3,83 pour 1aL1 et 3,32 pàur la L2. Les différences de .migration électrophorétique et decomportement en ch~omatographie sur-DEAE-cellulosedes deux protéines natives'résultent vraisemblement de cette différen'ce de pHi.' '" ·

"

116

e) DISCUSSION

. L'objet, de la première partie de cette étude était de purifier leslaccases excrétées par R. .Iignosus et.P noxius et d'en déterminer quelquescaractéristiques physicochimiques (Tableau 12). Les techniques utilisées sontcelles communément mises en oeuvre pour la purification des proteines. SurDEAE-Cellulose, les laccases LI et L2 adoptent un comportement similairerespectivement aux laccases B et A purifiées par MOSBACH (1963), puis parFAHRAEUS et REINHAMAR (1967) à partir de filtrats de culture de Polyporusversicolor .

TABLEAU 12

Principales caractéristiques physicochimiques des laccases

L 1 L 2 LN

PM protéines* natives 52000 55000 70000* dénaturées 53000 54000

pH optimum (gaïacol) 5,6 ·60 4,6,

pHi 3,82 3,32

Inhibition KCN 10-4 M (ro) 66 73 87

D,a 280 24,6 290.0.605

Activité spécifique 41 800 9000 5300(gaïacol pH 6)

A l'issue de la:dernière étape de.purific~tion, no'us ~btenons généralementdes laccases LI et, L2 pures, les deux protéines apparaissant homogènes en

. électrophorèse. 'Cependant, dans certains cas, on pèl~t distInguer, aprèsélectrophorèse en gel de polyacrylamide, en conditions non dénàturantes, deux

117

bandes satellites de faible intensité, très voisines de la bande L 1, donnant uneréaction positive avec le gaïacol. Par é1ectrofoca1isation en veine liquidemettant en oeuvre un gradient de pH de très faible pente (pH 2,5 - 4,0), l'une deces protéines satellite (pHi 3,80) a pu être séparée de l'enzyme majeure (pHi3,83). Ces formes mineures n'apparaissent pas après électrophorèse en conditionsdénaturantes ce qui implique qu'elles ont le même PM que la forme majeure. Lesbandes mineures résultent-elles d'une dégradation ménagée de la protéine L 1originelle? La présence dans le filtrat de culture de R /Ignosus d'uneprotéase relativement active pourrait conforter une telle hypothèse.

L'existence de formes mUltiples de la laccase a déjà été évoquée. AinsiEVANS et PALMER (1983) ont séparé la laccase B de Corlo/us verslc%r en 5fractions dont le pHi varie entre 4,5 et 6,5 tandis que la laccase A était séparéeen 2 fractions seulement (il s'agit des laccases A et B antérieurementconsidérées comme homogènes).

, Il est à noter que lors de contrôles de pureté des enzymes LI et L2 paré1ectrofocalisation en gel de po1yacry1amide (et seulement dans ces conditions)nous avons observé la formation de multiples bandes protéiques, conservant leuractivité laccase, et caractérisées par des pHi variés (entre 3 et 6) trèsdifférents les uns des autres. Un tel résultat obtenu à partir d'enzymes purifiées,homogènes à l'électrophorèse classique ou en SOS paraissait extrèmementsurprenant. En effet ces différences notables de pHi pour des protéines demême PM auraient dû c'onduire à des' différences nettes de migration enélectrophorèse et d'é1ution sur DEAE-Cellu1ose, différences qüi sont d'ailleursobservées entre laccases L1 et L2. Des essais complémentaires ont montré quecette séparation en multiples fractions n'apparaissait plus enélectrofoca1isation lorsque les gels avaient préalablement été soumis à l'actiond'un champ électrique ,( 150 V, 30 minutes). Ceci tend à prouver que la structuremoléculaire des laccases LI et L2 est relativement fragile, en tout cas sensibleà l'un des composés chimiques contenus dans le gel (peut-être le perSUlfate?).Suite à cette expérience toute électrophorèse en gel de polyacrylamide a toujoursété précédée d'une pré-électrophorèse "à vi de" (pre-run).

Comme déjà signalé, la différence entre L1 et L2 repose apparemmentsurtout sur leur pHi respectif. On peut donc estimer que les protéines diffèrentpar leur structure primaire. Cependant, la constance, dans les filtrats de culture,des proportions relatives entre L1 et L2 conduit à penser qu'il existe un "lien"entre ces deux enzymes: leur synthèse est-elle sous le contrôle d'un même gènerégulateur ou bien dérivent-elles l'une de l'autre par modification de la structurede la protéine, ou bien à la suite de l'action ménagée d'une protéase ou d'uneglycosidase, enzymes présentes dans le filtrat de culture? L'analyse de la. .compositïon en amino-acides des deux protéines enzymatiques pourrait fournirune première réponse à ces quèstions. . .,

118

. ~

~. . ""':.~ , _:' ,'" ~'''' . ~ ...... ~.. " . .Les enzymes LI, L2 et LN sont bien des laccases ai~si qU'en témoignent

leurs caractéristiques spectrales (pic d'absorption à 605-610 nm et couleurbleue des solutions purifiées) et leur spécificité de substrat. Comme signalé pard'autres auteurs (LEVINE ~ 1966, Dl)BERNET et al.,l97.7,·SCHANEL et al., J971)cette, dernièr..e. est .exceptionel.lemenL.·large (ortho-, ,meta-, para-d'iphénols,monophénols, ..composés phénoliques," çHversement sUQstituésl ligninethioglyco1ique... ),..

Le PM des enzymes: environ 540000 pour la.L 1 etla L2 et 70 000 0 pourla LN se situe dans une zone de valeurs correspondant fréquemment à celle deslaccases d'autres champignons (MAYER et al.,· 1979 ). Seule l'enzyme 1 dePodospora anser/na avec un PM de 390000 0 semble faire exception, encoreserait-elle formée de 4 sous-unités d'environ 97 500 0 chacune (MOLITORIS etESSER, 1970, MINUTH et al., 1978). Les laccases LI et L2 de R. lignosus ne sontpas constituées de plusieurs sous-unités protéiques.

Les données enregistrées quant au pH optimum d'activité des enzymes et àleur pHi sont elles aussi tout à fait classiques pour des laccases d'originefongique. Celles-ci diffèrent sensiblement des valeurs déterminées pour desenzymes extraites de végétaux tels que Rhus vernicifera (REINHAMAR, 1970).

Enfin, dans un cadre plus général, rappelons que les laccases ont faitl'objet d'investigations nombreuses et diversifiées (LEVI NE, 1966; MAYER et al. "1979). Outre les mises au po'int de tecl"lniques de purification et la déterminationde propriétés physico-chimiques dont nous venons de parler, ces études ont traità la stimulation de l'excrétion enzymatique par différents phénols (LEONOWICZ etTROJANOWSKI, 1975 a et b;·FAHRAEUS et L1NDEBERG, 1953; HAARS et al., 1981HAARS et HÜTTERI'1ANN, 1983), aux différentes formes de cuivre 1ié à la protéineet.à. leur' rôle dans la catalyse enzymatique- (l'1ALKIN et al., 1979 a et b;ANDREASSON et al., 1976 a et: b), enfin à l'intérêt des laccases' comme caractèrechimiotaxQnomique (ROSCH et al:, 1971 Î JOEL et al., 1978).,

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119

2. EFFET DE lA lACCASE II DE R. 1.16NOSlJ5 SUR lA LIGNINETH1OGLVCOl 1QUE.

L'objectif de cette étude est de vérifier si la laccase est capable dedégrader la lignine ou au moins de participer à la dégradation de ce polymère.Nous n'aborderons donc ici aucun des problèmes -liés à l'étude des mécanismeschimiques mis en jeu ni même à l'identification formelle des produits' deréaction. Le seul résultat Qui nous intéresse ici est le suivant: Quel est l'effet del'action de la laccase sur la LTG utilisée comme substrat

a) Matériel et méthodes

1° Enzyme. substrat. milieu réactionnel.

L'enzyme mise en oeuvre est la laccase LI purifiée selon les indicationsfournies plus haut. Le substrat est une LTG préparée selon les techniques décritesprécédemment. La densité optique à 280 nm d'une solution de TGL à 1% dans letampon phosphate 0,05 M à pH 6 est égale à 76,2 unités. Cependant, pour plus decommodité, nous exprimons les Quantités de TGL en éQUival~ents 00280 calculés

de la manière suivante:

Nb total de 00280 = 00280 de la solution x Vol. (ml) ~~ cette solution

La réaction enzymatique est menée· à température ambiante (26°C) surune solution de LTG en tampon phosphate O,05M à pH 6,0 ( voisin du pH optimum(6,2) de J'activité catalytique) , en présence de laccase.: Les Quantités de LTG etd'enzyme variant d'une expérimentation à l'autre,. elles seront indiquées dans lalégende des figures concernées. Le temps d'incubation varie de Quelques heures àplusieurs jours. POLIr éviter le développement éventuel de microorganismes dansle milieu réactionnel, celui-ci est stérilisé par passage au travers d'un filtremillipore 0,42 micron. Le témoin est réalisé dans les mêmes conditions enmettant en oeuvre une laccase préalablement thermoinactivée.

2· Aoalyse des produjts de réactjoo

* Estjmatjon de la masse moléculajre

Les modifications de Poids Moléculaire (PM) sont évaluées par filtrationsur colonne de gel de Sephadex G100, G50 ou G25 (d: 1,8 cm; h: 100 cm) équilibrédans le tampon phosphate de sodium O,05M à pH 6,0. La LTG et les produits deréaction sont élués à l'aide de ce même tampon (débit vari2ble suivant la naturedu gel);l'éluat est recueilli par fraction de 1,2 ml; ia 00280 de l'éluat est

. ( .

.' 'P. '.

120

Figure 29 - Diagramme d'élut10n, sur gel de Sephadex G100, d'une solutionbrute de LTG. (Les valeurs du rapport VelVo sont indiquées ou-dessus des flèches. Pourcentage dematériel recueilli danschtx:lüe fra3tion: F1: 8,2~; F2: 22,7~; F3: 22,3~; F4: 31 ,4~; F5:14,9:g. PM œs protéines marqueurs: voir Nmatériel et méthooes. Toutes les chromatl)Jraphies œLTG sur ~l de SephOOex sont réalisées en tampon phosphate de sodium O,05H àpH 6).

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11

F1 F2 F3 F4 F5

50 100 N" Fractions

Figure 30 - Chromatographie sur colonne de Sephadex G100, de deux fractionA (PM> 10 0000) et B (PM< 10 0000) obtenues par fractionnement d'unesolution de LTG brute sur ultrafiltre AMICON PM10.

Ec

oQ)

N

oc

50

l ,l ,1 .,

100 150 N"

121

enregistrée en continu (appare"il .Uvicord Il, LKB). Le. PM apparent de la LTGcontenue dans les différents pics est évalué par. référence à celui de protéines dePM connu servant à étalonner les colonnes. La position relative des différentspics sur l'élutogramme suffirait à elle seule à classer les molécules d'après leurtaille. Cependant, pour plus de précision certaines fractions sont caractériséespar le rapport VelVo (Ve: volume d'élution de la fraction; Vo: volume mort de lacolonne). Nous examinerons plus loin la validité et la reproductibilité de cettetechnique.

Les molécules de LTG peuvent également être séparées en deux classessuivant la méthode de SUNDMAN (SUNDMAN et SELlN, 1970; SELIN et SUNDMAN,1971), par filtration des solutions sur un ultrafiltre. Au cours de nos essais nousavons utilisé une membrane AMICON PM10 permettant d'isoler deux classes demolécules: une fraction A, retenue sur le filtre regroupe les polymères 'de PI'1supérieur à 10 000 D, et une fraction B, recueillie dans le filtrat, composée demol~cules de masse inférieure à 10 000 D. Au plan pratique les filtrations sontréal isées dans les conditions suivantes: la solution à fractionner est versée dansla cellule de concentration et fi Itrée sous une pression d'azote d'environ 2kg/cm2

(30 psi) jusqu'à réduction du volume à 1à 2 ml. On rajoute alors g~ns la cellule 50~- .. , ..

ml de tampo~ phosphate O,OSM, pH6 et on procède à une nouvelle concentration. Ceprocessus est renouvelé (6 à 8 fois) tant que le fi Itrat contient plus de o,sro de laLTG initialement déposée dans la cellule.

.. ......, ,~

* Analyse spectrale

L'analyse spectrale est effectuée sur les substrats et les produits deréaction par enregistrement du spectre entre 240 et 450 Dm. Ces mesures sontfaites d'une part sur des solutions à pH6 et d'autre part sur des solutions, demême concentration en LTG, portées à pH 12 par addition de soude concentrée. Les·informations les plus significatives sont cependant fournies par l'enregistrementdu spectre différentiel d'ionisation, la solution basique étant "lue" contre lasolution à pH6.

L'analyse spectrale a été systématiquement mise en oeuvre afind'appréhender les modifications provoquées par l'oxydation enzymatique dusubstrat.

b} RESULTATS

1· Validité de la technique de fractionnement sur gel de Sephadex

* Distrjbution des molécules de LIG dans l'éluat

ta filtration, sur gel de Sephadex ,Gl00, d'une ~olution de LTG, révèle latrès grande hétérogénéité de ce substrat au plan .du eH des_molécules qui le

.......:.•It.

.'

122

Figure 31 - Reproductlbllité de la technique de fl1tration sur gel de Sephadex:A) Diagramme d'élut10n, sur Sephadex G50, d'une LTG brute: zone de récoltedes' fractions Frl :-Fr2 et Fr3. B) Diagrammes d'élution (regroupés 'sur lam'ême figure)'résultant'de la rechromatographie successivement des'fractions Fr!, 'Fr2 et Fr3 sur la'mêmë;colonne et dans des conditionsidentiques', '

Jo,200

1

1

, 1N" Fractions

Fr3

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Fr2

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123

composent (Fig. 29). En effet, une première classe de molécules est é1uée avec levolume-mort de la colonne, tandis qU'une seconde s'étend de manière continueentre des valeurs de PM apparents allant de 50 000 à 3 000 D, avec un pic centrévers 10 000 D. Ces valeurs de PM ne sont qu'indicatives, le comportementchromatographique des macromolécules de nature aromatique n'étant pasnécessairement comparable à celui des protéines ayant servi à étalonner lacolonne. L'allure générale du diagramme d'élution correspond à celle décrite parHÜTTERI'1ANN (1977) pour la répartition des molécules de lignosulfonate.Cependant, alors que dans ce dernier cas le pic "haut PM" représente plus de 50%du matériel chromatographié, dans le cas présent cette fraction en contient àpeine 8%.

Afin de vérifier si cette répartition repose effectivement sur desdifférences de masse molaire et n'est pas perturbée par des phénomènesd'adsorption secondaire des molécules sur le gel (ADLER et 211., 1966), nous avonsprocédé au contrôle suivant: la solution brute de LTG est, dans un premier tempsfractionnée sur ultrafiltre PM 10, les fractions qui en résultent (A: PM > 10 000 Det B: PM < 10 000 D) sont ensuite chromatographiées séparément, mais dans desconditions identiques, sur gel de Sephadex G100.

La figure 30 regroupe les deux diagrammes d'élution; elle montre que lesdeux fractions sont éluées de manière "classique", la fraction A dans la zone desPM élevés, la fraction B dans celle des PM plus faibles. A noter que le pic B esté1ué au niveau VelVo = 2,53 alors que le cytochrome c (PM = 12 500) est éluépour une valeur VelVo =2,18. Il existe donc une très bonne concordance entre lesrésultats de la technique de séparation sur membrane PM 10 et ceux de lafiltration sur Sephadex G100.

* Reproductjbilité de la technjQue

Cette vérification a été entreprise suite aux difficultés rencontrées parcertains auteurs (HÜTTERMANN, 1977) lors de la rechromatographie, sur G100, dela fraction lignosulfonate de PM élevé isolée au cours d'un premier tamisagemoléculaire sur gel de Sephadex G100. Une telle rechromatographie conduisait audédoublement de la fraction avec formation de deux pics, l'un situé dans la régiondes PM élevés, l'autre dans la zone des PM plus réduits.

Le contrôle est effectué en deux étapes. La première consisté en unechromatographie, sur gel de Sephadex G50, d'une solution brute de~LTG. L'éluat estrecueilli en trois fractions (Frl, Fr2 et Fr3) selon' les indications de la figure31 A. La seconde étape consiste à rechromatographier chaque fraction sur lamême colon,ne et dans les mêmes conditions. Les résultats, rassemblés sur lafigure 31 B, montrent l'excellente reproductibil ité de la méthode. En part icul iernon seulement aucun dédoublement' de pic n'est observé, mais encore ré lution dechacun d'entre eux se situe dans la zone correspondant à celle de son prélèvementinitial.

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Figure 32 - Spectres UV-visible de solutions de LTG: A) et B): spectres à pH 6et 12, et spectre différentiel d'ionisation, respectivement avant (A) et après(B) action de la laccase. Cl: spectres différentiels d'Ionisation: a et b: avantet après oxydation enzymatique de la LTG;. c: produit de dépolymérisation (pic

Il de la Figure 34).

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Figure 33 - Flltratlon sur Sephadex G100 d'une solution de LTG brute:a) témoin (charge de la colonne: 7000280 ; b) après 21 heures d'incubation

en présence de la laccase (milieu réactionnel: LTG 800 00280 + 3050 U~e

laccase; volume 4ml; dépot sur la colonne: 500°280; c) après 5 jours

d'incubation (milieu réactionnel: LTG: 800 00280 + 6.100 U de laccase; "dépot

sur la colonne: 60 00280);d) profil d'élution de l'activité laccase (U~ités

relat1ves; 11 s'agit de l'act1v1té présente dans les ml1leux réact1onnels),

127

Il ressort de ces deux contrôles préliminaires que la technique defiltration sur gel de Sephadex, dans les conditions expérimentales décrites etavec le substrat choisi, est fiable et permet réellement de différencier, par leurtaille, des classes de molécules de LTG.

2° Effet de la laccase sur la 1jgnjoe thjoglycol jque

* Modjfjcatjons spectrales

Dès l'initiation de la réaction, se manifestent un brunissement rapide dela solution et un accroissement de la DO à 280 nm pouvant atteindre 50% de lavaleur initiale. Au niveau du spectre différentiel (Fig. 32 A, B et C) on notel'atténuation sensible du pic à 255nm, la très forte diminution du pic à 298 nmet, enfin, l'accentuation du pic à 365 nm. D'après les données de la littérature(GOLDSCHMI D, 1971), ces modifications traduisent d'une part la diminutionimportante du nombre d'hydroxyles phénoliques ionisables et d'autre part, uneaugmentation de la proportion de groupes a-carbonyles du polymère.

* l'1odjfjcatjon du degré de polymérjsation

Une première approche du phénomène a été réalisée en incubant, enprésence de la laccase, une solution brute de LTG très hétérogène au plan de lataille des molécules qui la composent. Après respectivement 21 heures et 5 joursd'incubation, une partie aliquote du milieu réactionnel a été chromatographié surSephadex G100. L'analyse des diagrammes d'élution (Fig. 33) fournit deuxrensei gnements fondamentaux:

- La laccase provoque un "déplacement" du pic originellement centré dansla zone des molécules de PM voisins de 10 000 D, vers une zone où sont éluées desmolécules de masse molaire plus élevée. Elle traduit une condensation de cesmolécules, d'autant plus importante que le temps d'incubation est plus long.

- Dans le cas d'une incubation de longue durée on observe, de plus,l'apparition d'un pic correspondant à des molécules de faible taille. Dans lesconditions opératoires util isées, l'origine de ce pic est cependant incertaine; ilpourrait en effet s'agir non pas de la dépolymérisation d'une fractionmacromoléculaire, mais du "démasquage" d'une fraction préexistante non encorepolymérisée par la laccase. Ces molécules sont néanmoins oxydées par l'enzyme,leur spectre différentiel accusant les modifications caractéristiques déjàsignalées (Fig. 32 8).

Notons enfin qu'après 5 jours d'incubation il température ambiante, lalaccase est toujours active; dans la pratique la position du pic laccase sur lesdiagrammes d'élution des colonnes permet de vérifier la reproductibilité deschromatographies; elle constitue de plus un marqueur utile à l'estimation du PI"1des 'Fractions de LTG.

128

F1gure 34 - Dépo1ymér1sation de la LTG par la laccase (légende: voir p.n,>.

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Figure 35 - Condensation de la LTG par la laccase (légende: voir P.'-'~).

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129

Afin de mieux mettre en évidence les deux actions de la laccase, nousavons réal isé une seconde série d'essais mettant en oeuvre, cette fois-ci, dessubstrats "selectionnés" d'après la taille des molécules. Ce tri préalable a étéréalisé par fractionnement d'une solution brute de LTG sur gel de Sephadex. Pourla classe de PM élevé, nous avons choisi une fraction de type Etl isolée surSephadex .G5Q (Fig. 31 A ); la classe de LTG de faille taille correspond à unefraction F4 isolée après chromatographie sur Sephadex 6100 (Fig, 29).

* Actjyjté de dépo1ymérjsation

La Figure 34 révèle sans ambiguité la dégradation d'une partie de la LTGen plusieurs composés de faible masse moléculaire. En effet, au moins trois pics(notés l, Il et III) sont identifiables, dont les valeurs. Ve/Vo sont,respectivement égales à 2,5; 2,7 et 2,9 alors que la partie descendante du piccorrespondant à la fraction hautement polymérisé~ se situe au niveau 1,25 et queles molécules-étalon sont é1uées pour les valeurs suivantes: cytc (PM: 12 500):1,5; vitamine B12 (PM=1735): 2,43 ; o-nitrophénol (PM=139): 2,95. Les fractionsl, Il et 1.11 sont donc constituées de molécules de très faible taille.Quantitativement elles représentent environ 6,3% dû matériel total élué de lacolonne (estimation d'après les DO à 280 nm). ....c'

Toutes ces fractions présentent les caractéristiques spectrales de la LTGoxydée (Fig. 32 B et C), à l'exception de la fraction Il dont le spectre différentielse caractérise par un pic à 335 nm et la disparition des pics à 365 et 298 nm(Fig.32 C, courbe c).

Notons enfin qu'avant oxydation par la laccase, la partie descendante dupic des haut-PM (courbe témoin (a) Fig. 34) se produit pour une valeur de Ve/Voégale à 1,45. La différence entre cette valeur et celle (1,25) enregistrée aprèsaction de l'enzyme témoigne de l'augmentation de PM d'une fraction du substrat.

* Actiyité de polymérisation

L'essai, réalisé en faisant agir la laccase sur une solution de LTG defa'ib1e PM (F4 de la Figure 29), met en évidence la réaction de condensation<F.ig.35). Il en résulte le dédoublement du pic initial (graphe (a): Ve/Vo = 2,3)

Fig. 34: Dépo1ymérisation de la LTG par la laccase. Filtration sur 050 d'unefraction type Frl ( Fig 31 A) de PM élevé. e) témoin (dépot sur la colonne: 1020°280' b) après 9

jours d'incubation (milieu réactionnel: LTG: 545 00280 + 3050 U L1; vol. total: 5ml; charge colonne:1010°280); total du matériel degradé (Pics 1 + 1\ + III) = 6,4~.

F1g. 35: Condensat1on de la LTG par la laccase. Flltrat10n sur Gl 00, d'une UGde fal111e PM (type F.4 Flg 29). a) Témoln: charge colonne: 110°280; b) après 20 jours d'lncubatlon enprésence d'une leccase act1~e (mllieu réactionnel: 51 00280 + 12 200 U laccase; volume total: 4m 1;charge colonne 11,6 00280).produits de condensation (graphe (b): Ve/Vo = 1,7) et d'une seconde(graph~ (b): Ve/Vo = 2,6).

130

conduisant à la formation d'une première classe de molécules correspondant à desdont on ne peut affirmer avec certitude s'il s'agit de produits de dégradation ous'imp1ement de résidus-de la fraction·originelle non encore condensés. Le spectredifférentiel de ces deux classes de·mo1écu1es présentent les caractéristiques decelui d'une LTG oxydée (Fig. 32 B et C).

* Essais de dégradation récurrente.. . .

Le fait que la laccase catalyse à la fois une réaction de condensation etet une réaction,de dépo1ymérisation suggère qu'il existe un équilibre entre cesdeux réactions, à moins que chacune ne concerne spécifiquement qu'une classeparticulière de molécules. Nous avons tenté de vérifier la première hypothèse enréal isant deux incubations successives dans les conditions ci-dessous:

PM 10 1)Laccase 1)LaccaseLTG --------------) A --------------) Al -------------) A2

brute 1 (25%) 2) PM 10 ~ (95,4%) 2) PM 10 ]<95%)

B BI 82(74%) (4

J6%) (S%)

L'intérêt de ce procédé est d'élim'iner, entre les deux incubations, lesproduits de dégradation formés à la suite de la première incubation. Lefractionnement des milieux réactionnels est effectué par ultrafiltration surmembrane Amicon, PM 10. Les fractions· A, A 1 et A2 correspondent à deshaut-polymères (PM ) 10 000 D), les fractions B, 81 et 82 contiennent desproduits de dépolymérisation (PM < 10 000 D). Enfin les nombres figurant entreparenthèses indiquent, en. % du matériel total recueilli à chaque étape, laproportion de ce matériel récupéré dans chaque fraction.

Les résultats enregistrés sont en faveur de l'hypothèse selon laquelle 'ilexiste un équ'il'ibre entre réaction. de condensation et réaction dedépo1ymérisation. Cette dernière peut se poursuivre en cas de déplacementartificiel de l'équilibre notamment en soustrayant du milieu réactionnel lesproduits de dégradation.. -

L'analyse spectrale des différentes fractions conduit à un autre résultatparticulièrement significatif:

. . .- FracNons A et B: spectre différentiel d'une LTG non oxydée {Fig. 32C (a»

• 4 - Fractions A l, A2<et B2: spectre d'une LTG oxydée {Fig. 32C (b»- Fraction Bi: spectre présentant un -pic à 335 ,nm. {8ig:32C (c»

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Le fait que seule la fraction B1 -contienne le composé présentant cette

131

caractéristique spectrale spéciflque signifie que la macromolécule de LTGcomporte dans sa structure des 1iaisons chimiques part icul ières fac'ilementrompues par la laccase (ou bien que·la solution de LTG comporte plusieurs entitésmoléculaires structura1ement différentes les unes de autres, l'une d'entre ellesconstituant un substrat privilégié pour l'enzyme). Des essais ultérieurs depurification de la fraction BI par filtration sur ge de Sephadex G25 ont permis deséparer deux pics. L'un, largement dominant, présente le spectre différentielcaractérisé par un maximum à 335 nm, dépourvu de tout épaulement à 365 et255nm, montrant que le composé a été isolé vraisemblablement avec un bon degréde pureté (il pourrait s'agir d'un composé comportant une structure de typephény1coumarone);. le second pic présente les caractéristiques spectrales

.classiques de la LTG oxydée.

c) DISCUSSION

Les résultats que nous avons acquis au cours des essais que nous venonsde décrire, montrent que la laccase LI de R. /ignosus est capable d'effectuer àla fois la scission et la condensation de la 1ignine.

Ces résultats sont en accord avec ceux enregistrés notamment parISHIHARA et MIYAZAKI (1972) pour l'action de la laccase At:::de" Corto/usvers/c%r sur une lignine de bois moulu. Ils sont également en accord avec leshypothèses de KIRK (KIRK et al., ·1968b) qui prévoyait ce double effet de lalaccase, les formes radicalaires induites conduisant soit à des produits decondensation, soit à une rupture de la liaison a1kyl-aryle de certaines unitésphény1propanes de la lignine. D'après cet auteur une proportion importante des1iaisons intermonomériques (41 %pour la 1ignine d'épicéa) seraient théoriquementsusceptibles de subir une rupture oxydative par la laccase. La scission des autresliaisons intermonomériques nécéssite l'intervention d'autres enzymes, à moinsque certaines de ces liaisons ne puissent être rompues par couplage avec desradicaux libres formés par l'action de la laccase sùr des unités-substrat pourcette enzyme. Ainsi le vératrylglycérol-b-galacyl éther, qui n'est pas un substratde la laccase en raison de l'absence d'hydroxyle phénolique l'ibre, est oxydée.chimiquement en présence de radicaux l'ibres générés par la laccase. dans lalignine de sciure de bois (KIRK et al., 1968 a).

Enfin 'il convient de faire une mention parti cul ière pour les travaux deLEONOWICZ et collaborateurs (1985) qui, faisant agir une laccase purifiée deTrame!es vers/c%r sur du lignosulfonate et utilisant des techniquesd'estimation des PM identiques.aux nôtres (filtration sur gel de Sephadex G50),ont enregistré des résultats comparables: la laccase effectue la dégradation de lalignine lorsqu'elle est incubée en présence" de matériel de PM élev~, et une

132

réaction de condensation lorsque le substrat est un matériel de faible PM. De plusl'étude cinétique de ces réactions montre que les produits de dégradation peuventêtre repolymérisés. L'accumulation de ces produits de dégradation tend vers unéquilibre, après être passée par un maximum; comme dans notre cas, cet équilibreest largement en faveur des produits de polymérisation. L'installation d'un teléquilibre laisse supposer que, dans ce cas également, la réaction dedépolymérisation peut se poursuivre à condition que cet équilibre soit rompu.

La laccase, cependant n'est pas la seule "phénoloxydase" pouvant entraînerla dépolymérisation oxydative de la lignine. Ainsi, récemment, TIEN et KIRK(1983, 1984) ont identifié et purifié, à partir d'un f'iltrat de culture dePIJaneroclJaete cIJr)"sosporiu!Tl, une "oxygénase nécessitant, pour sonfonctionnement, la présence d'eau oxygénée" capable de rompre la liaison Ca-Cbde la' chaîne latérale ô'unités phénylpropanes mêmes dépourvues d'hydroxylephénolique libre. Cette "ligninase", de type peroxydase, catalyse également lecouplage oxydatif de phénols pouvant abàutir à des produfts de c·ondensation.L'existence de ce même type d'enzyme a par ai lieurs été confirmée par d'autresauteurs (GLENN et al., 1983 ; GOLD et al., 1984). Enfin SCHOEMAKER et al. (1985 etHARVEY et al. (1985) ont montré que cette "1 igninase" agit exclusivement commeune peroxydase. L'enzyme exerce-t-elle son action de concert (ou en synergie)avec la laccase également dont ANDER et ERIKSSON (1976) ont démontrél'importance dans la ligninolyse ?

Par ailleurs LOBARZEWSKI (1984 ; LOBARZEWSKI et al., 1982) ontdémontré que la peroxydase de Trametes versicolor (à la fois l'enzymesoluble et celle liée à la paroi du champignon) est, elle aussi, capable d'effectuerà la fois la dépolymérisation et la condensation du lignosulfonate ; ce résultatest, au moins en apparence, en contradiction avec celui obtenu par KAPLAN(1979). .

Enfin des mécanismes, non enzymatiques, conduisant à la 1igninolyse ontété décrits, mettant en oeuvre le radical hydroxyle (SES et al., 1983 ; FAISON etKIRK, 1983).

, En résumé: la laccase L1 de R lignosus est effectivement capable deréaliser la rupture oxydative de la lignine. La similitude entre les enzymes LI, L2et LN au plan de la spécificité de substrat, notamment leur commu'ne aptitude àoxyder la LTG, nous conduit à penser que L2 et' LN jouissent des mêmespotentialités que'L 1 en matière de 'dégradation de la lignine. Enfin laconcordance entre' nos résultats et ceux obtenus par d"autres équ'ipessur d~s laccases d"autres champignons, suggère que ces enzymesconstituent ·a~s marqueurs valables de I"aptitude à la lig'ninolyse desorganismes qui les excrètént.

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133

IV. DEGRADATION D'AUTRES MACROMOLECULES..

A l'occaslon de certalnes expérimentations nous avons pu identifier desenzymes susceptibles d'être· impliquées dans la dégradation de polymèresdifférents de ceux que nous venons d'étudier. Ces enzymes n'ayant pas fait l'objetd'essais particuliers, nous ne ferons qu'évoquer ici leur existence et leur rôlepossib le.

1. Les estérases.

Dans les filtrats de culture de R. / ignosus. nous avons pu mettre enévidence une activité enzymatiql!e catalysant l'hydrolyse des esters formés entrele p-nitrophéno1 et les acides gras suivants: butyrate, myristate, palmitate etstéarate. Les résultats indiquent que les. dérivés du myristate et du palmitateconstituent les substrats privilégiés.

Le rôle de ces estérases n'a pas été déterminé ; néanmoins on peutenvisager l'intervention de ce type d'enzyme, conjointement avec des phénoloxydases, dans la dégradation de la subérine. Ce copo1ymère d'acides grashydroxylés ou dicarboxy1iques et de phénols apparentés aux composés de typephény1propane, dont la structure a été proposée par KOLATTUKUDY (1980; 1981)imprègne les parois des cellules du liège. D'après les observations au r:nicroscopeR. /ignosus dégrade très activement ces parois (NICOLE, 1984). Il est· possibleque cette caractéristique soit à mettre au compte de l'action conJo,tnte .de lalaccase et des estérases excrétées par ce champignon. La première agirait sur lamatri ce po1yphéno1ique, alors que 1es secondes 1ibèrera ient 1es acides grasrattachés à cette matrice par l'intermédiaire de liaisons ester. Ces estérasesfragmenteraient également les chaînes d'acides gras polymérisés par formationde liaisons ester entre la fonction carboxyle d'Lin maillon et l'hydroxylealcoolique d'un autre maillon (acide gras hydroxylé).

2. Les protéases..

Une activité protéolytique non négligeable a été détectée dans les filtratsde culture de R. /ignosus mais non dans ceux de P noxius. Une telle activité aégalement été identifiée in vivo' dans les seuls tissus parasités par R./ignosus . Enfin une séparation électrophorétique réalisée à la fois sur desextraits de tissus parasités par R. /ignosus et un filtrat de culture de cechampignon montre, après révélation de l'activité leucy1-am(nopeptidase, laprésence, dans les deux cas, d'une seule et même. isoenzyme. La migrationé1ectrophorétique de cette isoezyme est différente de celle présente dans lestissus sains. La protéase des tissus infectés par R. /ignosus est donc d'originefongique.

Le rôle de cette enzyme peut être multiple: dégradation des matièresprotéiques de la .membrane cytoplasmique ou des nombreuses protéines du

134

..Figure 36 - R~latfon entre la.cellulolyse et la l1gninoly~e.

glucose'

cellobiose·oxydase

•0-2

ionsuperoxYde

H2 0 2r1 péroxydase

1. t catalase

e ndo ~.1,4· 9 lucana se

cellobiose. hydrolase

Cellulose

Cellobiose

Ac. cellobiono·cS .Iactone

cellobiose· quinone~oxyd~>réductase

glucono·5·lactone

;/acideglucon.ique

dépolymérisation+

phénol. oxydases

. Phénols oxydés

.Qui nones·Radicaux phénoxy

Relation entre les voies de biodégradation

de la Lignine et de la Cellulose

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135

cytoplasme. Rappelons également Que dans certains cas on a observé un effetsynergique important entre po1yga1acturonase et protéase dans le phénomène demacération tissulaire (BATEMAN et MILLAR, 1966).

3., Enzymes recherchées mais non ldentifiées dans lesmllleux de culture et les extraits tissulaires.

Nous avons tenté de détecter trois activités enzymatiques Qui nousparaissaient importantes en raison de leur participation potentielle dans lecatabolisme de la lignine et/ou de la cellulose (Fig. 36)..

a) La ce llobiose -Quinone oxydoréductase

Identifiée par WEsTERMARK et ERIKSSON (\ 974 a et b; 19ï5), cetteenzyme réalise l'interconnexion entre la voie de dégradation de la cellulose etcelle de la lignine. Cette activité conduit d'une part à l'oxydation du cellobiose enacide cellobioniQue (interdisant par le fait même toute possibilité derepo1ymérisation à partir du diho1oside ou toute action inhibitrice sur lesendo-et exo-g1ucanases) et d'autre part à la réduction des quinones en diphéno1scorrespondant, ces derniers étant seuls susceptibles de constitùer un substratpour les oxygénases.

....

\-

b) La cellobiose oxydase,

. ,

Identifiée par AVERS et al. (1978) dans les filtrats de culture de 5.pulverulentufl7, cette enzyme uttlise l'oxygène moléculaire pour oxyder lecellobiose et les cellodextrines. Les produits de réaction' sont, respectivementles acides oniQues et l'anion superoxyde 0'-2'

c) La superoxyde dismutase (500)

L'anion superoxyde, fortement réactif et éventuellement toxique pour lechampignon est dismuté en H 202 et 02 par cette enzyme identifiée dans les

filtrats de culture de ~ pulverulentum (ERI KssON, 1981 b). Elle existe dans lestissus laticifères de l'Hévéa (CHREsTIN, 1984) où elle joue un rôle de protectionde l'intégrité de la membrane 1utoïdique comportant des lipides à acides grasdésaturés dont la double liaison est susceptible de subir une rupture oxydativepar l'anion superoxyde.

Il est à noter que les extraits de tIssus aInsI que les flltrats de culture(sur sciure ou extrait de sciure) présentent une activité "sOD-like" d'origine nonenzymatique (thermostable). La nature du principe actif n'est pas connue, ni sonmode d'action: inhIbition du système générateur de l'ion superoxyde (Xanthine -

136

Xanthineoxydase) ou destruction chimique de l'ion produjt par le système?

. D'après ERIKSSON (communication, personnelle). tous le~ agents depourriture'blanche qu'il lui a été donné d"étudier, :possèdent ces trois enzymes.Leur absence chez R. lignosus et P. noxius parait donc a priori surprenante.D'après ce même auteur, ces enzymes-sont produites plus Çlctivement par lorsqueles champignons sont cultivés sur m'il ieu à base de cellulose. Des essais réal isésen ce sens n'ont pas davantage été couronnés de succès. R. lignosus et P.noxius seraient-ils des champignons atypiques en la matière?

v. DISCUSSION

Les résultats que nous venons de présenter révèlent que R. lignosus etP. noxius excrètent un ensemble d'enzymes dont l'action, combinée ouséquentielle, doit théoriquement conduire à la dégradation de la plupart despolymères de structure des tissus du bois, en particulier la cellulose, lesmatières pectiques, les xy1anes et la lignine. Les résultats que nous avonsenregistrés font apparaître un faisceau de corrélations qui m"ilite en faveur del'intervention effective des enzymes dans la dégradation tissulaire. cescorrélations sont les suivantes:

- des activités enzymatiques sont décelées dans les tissus parasités del'hôte; à l'exception de l'actvité peroxydasique, elles sont dues à des enzymesdifférentes de celles des tissus sains;

- ces enzymes sont identiques à celles produites soécifiauement parl'agent pathogène infectant. lorsqu'il est cultivé en culture pure. Les enzymes destissus parasités sont donc d'origine fongique.

- ces enzymes provoquent in vitro (et en milieu acellu1aire) ladégradation de la sciure de bois, donc du complexe naturel. Ce pool enzymatiqueest par ailleurs composé d'enzymes responsables de la dégradation des principauxpolymères constitutifs de la cellule végétale, 1ignifiée ou non.

- ln vivo, l'observation au microscope photonique et électroniqueconfirme l'existence de la dégradation des principales "substructurescellu1a'ires"; lamelle moyenne, paroi primaire et paroi secondaire, impliquant ladestruction effective des p1ymères constitutifs, notamment celle des matièrespectiques de la cellulose et de la lignine.

- Ces altérations ont lieu au niveau des tissus infectés mais, le plussouvent à quelque distance des hyphes mycéliennes.

- C'est dans ces mêmes tissus que sont excrétées les enzymes duchampignon. enzymes agissant à distance des hyphes mycéliennes.

La conclusion logique de cet ensemble de données est Que lesenzymes excrétées par les parasites dans les tissus qu'ils envahissent

1 137

sont effectivement responsables~ en fonction de leur spécificitérespective~ de la dégradation des polymères constitutifs desstructures cellulaires et~ par conséquent~ responsables de l'altérationdes tissus. Elles sont donc susceptibles de moduler le comportementparasitaire des champignons.ll est à noter, comme le souligne TOUZE (1977)que cette implication des enzymes dans la pathogénie des deux parasites nepermet pas pour autant de conclure si ces enzymes sont, ou non, les déterminantsprimaires du pouvoir infectieux.

; .

139

CHAP1TRE III

REACTION DE L'HEVEA A L'AGRESSION PARASITAIRE:LA STIMULATION DE L'ACTIVITE PEROXYDASIQUE

Nous avons vu que l'attaque parasitaire opérée par R. lignosus et Pnoxius provoque, au niveau des tissus de l'Hévéa, une perturbation complexe dediverses activités enzymatiques présentes dans ces tissus. Parmi lesmodifications mises en évidence, seule la peroxydase dont l'activité augmentedans des proportions considérables au niveau des tissus proches du front deprogression du parasite, est synthétisée par l'Hévéa lUi-même et correspond àune réact ion de l'arbre.

Nous avons porté une attention particulière à ce type d'enzyme en raisonde son implication dans la biosynthèse des lignines, notâmment cellessynthétisées par les plantes en réaction aux agressions parasitaires qu'ellessubissent (voir les revues: TOUZE et E5QUERRE-TUGAYE, 1982 ; VANCE et al.,1980). L'efficacité de la lignification en tant que mécanisme de résistance a étéproposé et, dans certains cas démontrée, par de nombreux auteurs (HIJWEGEN,1963 ; A5ADA et MAT5UMOTO, 1969, 1972 ; RIDE, 1975, 1978 ; VANCE et5HERWOOD, 1976, 1977, KIMt"'IIN5 et WUDDAH, 1977).

L'intervention de la lignification dans les phénomènes de prémunition aégalement été démontrée (TOUZE et ROSSIGNOL, 1977 ; HAMMER5CHMIDT et KUC,1982). Enf'in une lignification de la paroi mycélienne en présence d'alcoolconiférylique, d'eau oxygénée et de peroxydase a été observée et proposée commeun mécanisme indirect contribuant au phénomène de résistance, puisqueprovoquant la diminution de la vitesse de croissance du champignon(HAMMER5CHMIDT et KUC, 1982).

Si la recherche d'une corrélation entre lignification et augmentation desenzymes de la chaîne de biosynthèse de phénylpropane: phényalanine- outyrrosine- ammoniac lyase (PAL ou TAU, o-méthyl transférase (GMT) etc'innamate CoA Ligase, a été l'objet de nombreuses études (GREEN et al., 1975;MAULE et RIDE,1976; VANCE et al., 1976; VANCE et 5HERWOOD, \976 a etb);HENDER50N et FRIEND, 1979; FRIEND et al., 1973; FRITIG et al., 1973 inter all/),par contre l'intervention de la peroxydase en tant que responsable de l'étape depolymérisation semble avoir soulevé moins d'intérêt. Néanmoins le rôlefondamental de cette enzyme dans la 1ignif1cat1on a été précisé par diversauteurs (GHGUCHI et al., 1974 ; OHGUCHI et ASADA, 1974; A5ADA, 1978; VANCEet al. 1976).

140

Tableau 13

Activité peroxydasique (U/g 'poïds frais) conténue dans des extraits bruts de "différents types de' tissus. (Les résultats sont présentés pivot par' pivot afinde mettre en évidence "la variabilité des activités 'enzymatiques),

". 4<.. ""

Nature des tissus

Wdu pivot S P (R. lignoslIs) P (P. noxills) R

1 23000 210002

. 12 "160 67483 5700 159504 13275 236705 14175 102406 488707 98708 273009 18675 156500 1860010 10835 9120011 17200 11460012(SetP) 6400 1795012 (SF) 1090013 7500 11 000 1537514 15000 3275015 6125016 (S et P) 1 672 233216 (SF et pF) 1360 1010017 (S et P) 4800 +

17(PF) 3418 (pF) 24518 (P) 019 14280 271420 6 16021 (S. r.) . ' 3080022 (s. r.) 3124023(S. r.) -. 21 12024(S, r.) 2376025 70\026 (S. r.) 3006627 (S. r.) 4695728 (s. r.) 2689729 ( s. r.) 20960

MOYENNE' 11 484 48571 2 145 26577

.(Sr.) .indique que les tissus R sont prélevés sur un pivqt infecté par S r&p&fJ5.

S,.SF; P~ et P:.sJésjgnent la nature des tissus selon le coqe,habltuel.

..

141

Il est à noter que toutes les recherches que nous venons de citer ont été'réalisées sur des plantes succulentes ou herbacées, des organes foliaires ou destranches de tubercules; à notre connaissance aucune approche du même type n'aété effectuée sur un organe lignifié. Notre étude sur le couple Hévéa":' R.Iignosus et Hévéa - P noxius présente donc une double original ité : puisqueeffectuée sur un tissu lignifié, de surcroît attaqué par des parasites1ignolytiques.

EFFET DE L'INFECTION SUR L'ACTI VITE PEROXYDASIQUE DESTISSUS.

1. VARIATION DE L'ACTIVITE PEROXYDASIQUE TOTALE.

Dès l'initiation de cette étude deux observations ont pu être faites:

- l'activité peroxydasique des tissus parasités est généralementsupérieure à celle des tissus sains. ,

- il existe une forte variabilité "inter-arbres" au niveau des activitésperoxydasiques.

C'est pourquoi, afin de preclser les évènements qui surviennent aumoment de l'infection, nous avons analysé, dans des conditions standardisées" unnombre élevé de pivots.

Le tableau 13 présente l'ensemble des résultats que nous avonsenregistrés, pivot par pivot:

a) En moyenne l'infection par R. lignosus provoque dans les tissusparasités, un accroissement de l'activité peroxydasique (multiplication par unfacteur 4). L'infection par P noxius, entraîne, en moyenne, une diminution decette activité. Enfin les tissus de réaction possèdent, en moyenne, une activitéenviron deux fois supérieure à celle des tissus sains. .

b) Ces moyennes recouvrent en fait des situations variées. En effet sil'on examine les résultats, individu par 'individu, on s'aperçoit que le facteur destimulation de l'activité peroxydasique peut atteindre une valeur proche de 10.Dans quatre cas cette valeur est, par contre, inférieure à 1 (pivots 1 et 5partiellement infectés' par R. 1ignosus; pivots 17 et 19, colonisés par PnoxiusJ

La très 'importante variabilité inter-individus apparaît clairement, tantau niveau des activités peroxydases des tissus sains qu'à celui ~es tissu.sparasités. Son origine est cependant mal définie; plusieurs sources de variabilitépeuvent être envisagées:

143

- âge des arbres; celui-ci est le plus souvent compris entre 4 et 8'ans- origine des prélèvements (trois plantations différentes)- di fférences génét iques.

Cette dernière source de variabilité est sans doute la plus importante. Eneffet comme nous l'avons déjà signalé, les pivots appartiennent à des famillesillégitimes dont les individus sont, par définition, génétiquement moins prochesque ne le sont des individus issus d'un clône. De plus, en plantation les pivotsproviennent de plusieurs familles illégitimes et sont répartis au hasard. Ainsinous ne pouvons connaître l'origine génétique des pivots que nous analysons. (11est à noter qu'une importante variabi 1ité existe même au niveau des clonescomme en témoigne la variabilité des activités enzymatiques du latex (CHRESïIN,1984).

Ces résultats bruts indiquent bien l'existence d'une perturbation dusystème peroxydasique induite par l'infect ion, sans que l'on puisse pour autant, àce stade de l'étude, la qualifier d'exceptionnelle par comparaison avec celleenregistrée pour d'autres couples hôte-parasite.

2. SPECIFICITE DE LA REACTION DE L'ARBRE'AU NIVEAU DE LAPRODUCT JON 0'1 SOPEROXYDASES

Cette spécificité est apparue lors d'essais d'isolement des peroxydasesdes tissus sains et des tissus parasités, par chromatographie sur DEAE-Cellu1ose.Cette technique permet de séparer les enzymes en deux classes:

- celles qui, dans les conditions expérimentales définies, ne sont pasadsorbées sur l'échangeur d'ions et sont donc recueillies, à la sortie de lacolonne, avec l'effluent (:li fraction "EF") ;

- celles qui, dans les mêmes conditions restent adsorbées sur l'échangeuret peuvent être éluées par un tampon de force ionique élévée (= fraction "EL").

Au plan technique nous procédons de la manière suivante:

une quantité déterminée d'extrait brut (dont on a mesuré l'activitéperoxydasique totale peroxydase) est déposée au sommet d'une colonne deDEAE-cellulose (DE52) (d .. 2 cm; h::l 12 cm) équilibrée dans un tampon phosphatede sodium 0,0125 M à pH 6. Après adsorption, la colonne est lavée par le tampond'équilibration, jusqu'à ce que l'activité peroxydasique de "effluante" deviennenulle. L'effluent total est recueilli (=fraction "EF"). On procède ensuite à l'élutiontotale des peroxydases adsorbées sur la DE52 par un tampon de force ioniqueélevée (phosphate 0,0125 M, pH 6; NaCI 0,25 M). Cette é1ution est poursuivie tantque l'éluat présente une activité peroxydasique. La totalité de l'é1uat est

Tableau 14 - Proportion de J'activité peroxydasfque contenue dans les deux fractions,effluent (EF) et éluat (EL) séparées par chromatographie sur colonne deDEAE-cellulose, Effet de la concèntrat1on en tons calcium sur l'act1vitéperoxydasique de la fraction EL.

Extraits de tissus sains Extraits de tissus parasités Extraits de tissus réactionne

Pivots ,Effluent Elluat DE 52 Effluent Eluat DE 52 Effluent Eluat DE 52,

(1)%( 1) % % act. % (1) % (1) % act. % (1) % (1 ) % act., .

(- Ca++) (- Ca++) (- Ca++),"

1

1 (R.I.) 89 11 19 1 99 11,0 - - -2 (R.l.)· 67 33 18 0 100 - - - -3 (R.l.) 65,6 34,4 :,5 0,2 99,8 96 - - -

(R.I.)' 75 25 24.

7 - - - , - - -8 (TS)" 97,3 2,7 9 - - - - - -.9 (R.l.) 52 48 49 1,2 98,8 104 18 82 70

10 (R.l.) 72 28 19,4 0,1 99,9 104 - - -13 ('R.l. ) 78 22 38 0 100 104 8,2 91,8 93

19 (P. n. ) 70,7 29,3 - 2,3 97,7 - - - -20 (TS) 65 35 35 - - - - - -21 (S.r.) - - - - - - 5 95 1.11,22 (S.r.) - - - - - - '11 89 88

23 (S.r.) - - - - - - 10 90 '94

24' (S.r.) 21,

- - - - - - 79 90

25; (TS) 88,5 11,5 - - - - - - -26-29(S.r.) - - - - - - 13,7 86,3 91

( 1): ~ calculé par rapport à l'activité de l'extrait brut. (2): valeurs exprimées en pourcentage de l'activitérésiduelle en l'absence d'fans calcium. par rapport il l'~tfvité en présence d'ions calcfum (0 .005M). lespivots: t. 2. 3. 7. 9, 10, et t3 sont partiellement envahis pflr R. 1ignosus; les pivots 8, 20 et 25proviennent d'arbres sains; le pivot t9 est partiellement colonisé par P. noxius; Les pivots 21 à24 et 26à 29 sont envah 15 par S. repens.

Is

145

recueillie (- fractjon "EL").L'activité peroxydasique est déterminée sur l'une et l'autre fraction, ce

qui permet de calculer sa répartition entre les fractions EF et EL (exprimée enpourcentage par rapport à l'activité totale EF + EU. Le rendement de ces colonnesavoisine généralement 85 - 90%.

Le tableau 14 présente deux types de résultats concernant:

- La distribution de l'activité peroxydasique suivant les fractions quenous venons de définir: EF et EL;

- L'effet des ions calcium sur l'activité des peroxydases recueillies dansla fraction EL (tests enzymatiques réalisés en milieu Tris-maléate 0,05 MàpH 6,8, add!tionné ou non de caC1 2 à une concentration égale à 0,0051'1

(changement de tampon pour éviter la précipitation du calcium sous la forme dephosphate de calcium).

a) Répartition des peroxydases entre les Fractions EF et EL

Le résultat le plus remarquable concerne la variation des orooortionsrelatives de l'activité peroxydasique des fractions EF et EL en fonction de lanature des tissus

De manière très globale on peut condenser les résultats du tableau. 14sous la forme suivante:

T5

TP

TR

EF

65 - 95 %

0-3 %

5 - 20 %

EL

35 - 5 %

100 - 97 %

95 - 80 %

Il en ressort clairement que l'agression parasitaire provoque uneperturbation de l'activité peroxydasique des tissus, non seulement au planquantitatif mais également qualitatif. En effet la proportion des activitéscontenues respectivement dans EF et EL est systématiquement modifiée.

Nous insistons sur l'aspect systématique de cette perturbation car elleest enregistrée même pour des pivots "atypique" (W 1 et 19) où l'activitéperoxydasique totale (extrait brut) des tissus parasités est inférieure à celle destissus sains. (A noter que cette observation tendrait à prouver que le pivot n'estatypique que par l'aspect quantitatif de. la réaction peroxydasique et r)on par sonaspect qua1i tatif.·

146

Figure 37 - Séparation des peroxydases de la fraction "EL DE52" en deuxsous-fractions, P2a et P2b, par ffltration sur colonne de gel de SephadexG200 en milieu Tris-HCl O,025M à pH 8,4 contenant du KCl 0, lM. TS, TR et TPdésignent la provenance tissulairê des éxtraits (tissus sains, réactionnels ouparasités pa'r R. lignosus); TJ 1 et GT 1 désignent l'origine clonale (famflle. .

illégitime) des pivots (W 9 et 10).

T J1 GT1

~BO . ~AOH cyl. c ~ BD ADH cyt. c-,- ~ ~ ~P2 a 1\

2

./\4

TS TS ;-.. P2b- \3 1 --

\ _.~2b . \1

2 1 ·• .'. k 4\ ,. '.P2a i \.' ..l \

c:1 \E • ,...... \

.... \ 1 •- , .'. • ,E • 1 .,

1 .... ."....E ~BD ~AOH cyt. c ~

c: -0 1\~ 5

0

1\ci4 TA

.: . \ G 200u~ 3

1 i2

~ l~IIIIV'tJ>- . \)( 1 •0 .-..

~BO +AOHBD ADH cyt.c

-Q)~ ~ ~Q. r4 4 ii

. \ --1\3

1 \

TP 3 . \ TP

2 2 1 ·. \.1 i- .\ 1 -

- \ - \1 •1 .- \. ,

0 .,~ 0' -66 74 82 90 96 106 114 122 66 74 !l2 90 98 106 114 122

N° des f ract ions

147

Enfin, les extraits de tissus de réaction présentent, en ce qui concerne larépartition des peroxydases, des caractéristiques plus proches de celles d'untissus parasité que de celles d'un tissu sain. Rappelons que les tissus de réactionsont dépourvus de toute contamination par les parasites ayant provoqué. lanéogénèse tissu1aire.

b) Effet des ions calcium sur l'activité peroxydasique de la fractionEL

Les résultats (Tabl. 14) montrent que l'activité peroxydasique de lafraction EL provenant des tissus parasités est indépendante des ions calcium(elle serait plutôt légèrement inhibée par ces ions), alors que celle extraite destissus sains y est particulièrement sensible. L'activité peroxydasique de lafraction EL des tissus de réaction présente des caractéristiques serapprochant de celles de la fraction homologue des tissus parasités.

Si l'on étudie plus en détail cet effet calcium, pivot par pivot, on estfrappé par sa variabilité: l'activité spécifique résiduelle, en l'absence de calciumvarie de 5 à 49% (calculée par rapport à l'activité enregistrée en présence deCa++ à la concentration de 0,005 M). Une telle variabilité impliquenécessairement l'existence d'une hétérogénéité au niveau de la fraction EL TS.Cette fraction doit comporter au moins deux peroxydases différant entre ellespar leur degré de sensibilité au calcium

c) Fractionnement des peroxydases "EL DE52" par filtration sur colonne dege1de Séphadex G200

Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons effectué un fractionnementdes peroxydases "EL DE52" sur G200 (colonne d=l,8 cm; h= 100 cm; équilibrationet élution en tampon Tris-HCl 0,051'1 à pH 8,4; KCI 0, '1 M

. La figure 37 présente les diagrammes d'élution de 5 fractions ELprovenant de deux pivots différents (9 et 10), l'une de ces fractions étantextraite de tissus de réaction. .

Ces diagrammes confirment la présence~ dans la fraction EL destissus sains~ de deux enzymes (ou classes d'enzymes) respectivementappelées P2a et P2b, différant entre elles par:

- leur Poids Moléculaire- leur sensibilité aux ions calcium (Fig. 38)

148

Effet Ca2+

100

Q)

Q);:,'0II)

.~ 50

>

P2a Tp--.-e-e--.____ -* .-+•."pt-e- e.,.,., / -..........

----.---- *P2a TS /

*~bTS* .

/,....10

o '-I,r'-"""--~--or----r---.....,.----;~~

10- 3 10-2 10-1

[Ca2+]M/1

Figure 38 - Effet de la concentration en ions calcium sur les activitésperoxydasiques des fractions P2a TP (tissus parasités) P2a et P2b TS (tissussains) séparées par filtration sur gel de Sephadex 6200 (voir Figure 37).

149

Tableau 15

Estimation de la contribution de la peroxydase P2a à l'activité totale desextraits de tissus: comparaison entre les valeurs enregistréesexpérimentalement (fractlonnement sur Sephadex G200) et les valeurs calculées.

Tissus Èl % activité résiduelle % P2a % P2a(-Ca++) calculé expérimental

(sép. sur G200)

Pivot 9

S 58 51 62

P 104 99 100

R 69 62 79

Pivot 10

S 24 14,7 16

P 104 99 100

Bases du calcul

'P2a pure': % activité résiduelle en l'absence de calcium = 105.

P2b pure : %........................................................................................ = 10

D'où: {105x + 10 y = Zx + y = 1

+ X =.Z - 10

95++

où Z = activité résiduelle en l'absence de Ca (valeur expérimentale en %)

x = fraction de l'activité attribuable à P2a

y = fraction de l'activité attribuable à P.9.b

(avec x et y tels que: O<x<1 ; O<y<l)

151

La fraction EL des tissus parasités ne contient que l'enzyme P2a, tandisque la fraction EL des tissus de réaction ne contient qu'un faible pourcentagede P2b et se rapproche donc également, par ce caractère, descaractéristiques des extraits de tissus parasités.

Notons enfin que la composition de la fraction EL issue des tissus sainspeut varier sans que l'on puisse savoir s'il s'agit d'une caractéristique desfamilles illégitimes ou d'une perturbation de l'équipement enzymatiqueattribuable à la proximité du front de progression du champignon.

En résumé, il ressort de tous ces résultats que l'attaque parasitaIreprovoque une augmentation de l'activité oeroxydasique au niveau des tissusinfestés d'une part. des tissus réactionnels d'autre part: cet accroissementest principalement à mettre au compte d"une seule fraction: P2a::.

d) Essai de quantification de la réaction peroxydasique.

L'estimation de l'augmentation de J'activité P2a peut s'effectuerexpérimentalement par comparaison de l'activité récoltée dans les diversesfractions isolées au cours des étapes de purification successives parchromatographie sur DEAE-Cellulose et gel de Sephadex G200.

Cependant, théoriquement, le pourcentage de J'activité P2a par rapport àl'activité globale doit pouvoir être calculé à partir des trois données suivantes:

* Activité globale* Activité EL DE52* Activité spécifique résiduelle de la fraction EL en J'absence de ca++

Compte-tenu des valeurs expérimentales enregistrées pour J'effetcalcium sur P2a et P2b l'application de J'équation (A) (Tableau 15) nous fournit lepourcentage de P2a dans la fraction EL.

Le tableau 15 présente des résultats comparatifs obtenus par la méthodeexpérimentale et la méthode mixte. La concordance entre ces deux méthodes estbonne pour des valeurs extrêmes des pourcentages d'activité résiduelle enl'absence de Ca++ ; pour des valeurs médianes la technique de calcul conduitapparemment à des résultats par défaut, mais autorise tout de même uneestImatIon approchée de la proportlon de P2a par rapport à J'activitéperoxydasique globale.

Cette méthode de calcul a été mIse à prof1t pour évaluer l'incidence del'infection, la stimulation de l'activité P2a dans différents types de tissus. Letab leau 16 fournit les résultats d'une telle évaluation à propos desquels nousferons les remarques suivantes:

Tableau 16

Répartition de l'activité peroxydasique P2a au sein de quelques pivots d'Hévéa

Nature. Activité dans éluat DE52 Peroxydase P2a (va'leurs calculées)

des tissus et % de l'extrait % act. résidu % de l'act. % de l'act. Act. spéc. Taux de .'

act spéc;' ext. brut (-Ca++) El DE52 totale ' . (U/g PF) ,stimulalionbrut 'U/g PF) •

Pivot 9 .-S 18 675 48 58 51 24 '4 527 1

P 156 500 98,8 104 99 97,8 153 076 34.R 18 600 82 69 62 50,8 9 :456 2

f.ivot 10 ."

S 10 835 33 24 14,7 4,8 525 1.P 91 200 99,9 104 99 99 90 198 171

Pivot 13,

S 7 500 22 39 29 6,4 478 1

SF 3 875 75 57 49 36',7 '1 424 3:

PF 67 500 98,5 108 100 98,5 . 66 487 '140

P 11 000 100 104 99 99 10 890 23

R 15 375 91,8 93 87 80 12 280 26

....VI1\)

153

- La stlmulatlon de l'activité P2a peut atteindre des proportionsconsidérables puisque dans le cas du pivot n° 10 elle atteint un facteur égal à170. Un tel facteur n'a rien de commun avec ceux habituellement· enregistrés(+50 à +300 %) pour des couples hôte-parasite différents.

- Très généralement dans le cas d'autres couples hôte-parasite lastimulation de l'activité concerne' l'ensemble ou au minimum un grouoed'isoperoxydases. Dans le cas de l'Hévéa (pivot d'arbre adulte) une seuleisoperoxydase semble en priorité être impllquée dans la réaction del'arbre.

- La réaction à l'agression se manifeste déjà au niveau des tissus sainsproches du front de progression du parasite (pivot 13 : TSF); en effet, alors quel'activité de l'extrait brut diminue de près de 50% (5: 7500 U/g --) SF: 3875U/g),la proportion de la fraction EL augmente considérablement (22 --) 75%)tandis que la sensibil ité au calcium diminue (activité résidue1le en l'absence deCa++: 39 --) 57%). .

- Variations de l'activité peroxydasique de fractions autres gue P2a:La mesure des activités peroxydasiques "réelles" (et non plus relative)

révèle que celle·des fractions EF et P2b di.minue dans les tissus SF, R et, surtout,PF et P, par rapport à l'activité initialement présente dans les tissus sains. Pources deux fractions l'évolution de l'activité peroxydasique est donc l'inverse decelle mise en évidence pour P2a. Le cas du pivot 13 illustre parfaitement cettesituation (les activités sont exprimées en unités/g de tissu)

Extrait brutEFP 221P 2b

TS

75005850

4781172

TSF

3875970

14241482

TPF

675001000

66500o

P

11000o

11000·o

R

153751265

122751835

L'effet de l'infection sur la biosynthèse des peroxydases est donccomplexe: stimulation de l'enzyme P2a d'une part, répression des enzymes desfractions EF et P2b d'autre part. Concernant ces dernières, la diminutiond'activité n'est cependant pas enregistrée de manière systématique. Enparticulier il n'est pas rare que, dans les tissus réaction~els, l'activitéperoxydasique de fractions autres que P2a soit également stimulées (voir FiG. ).

Figure 39 - Oernlère ét?lpe d~ la purlfiçatl<)n des peroxydases: séparation p~r

chromatographle sur DEAE.,.,ceHulose à pH 5. Seules le~ fr~Gtfons pr~sentant

le rapport 0°280/0°400 le plus fa1ble ont été rassemblées. A) P2C;\ de tlSSU.S

parasltés par R. lignosus. B) P2a de tlssus de réactfon.

A B

\ .

......VI~

0,2

60402010

~ DE 52

/

'... Peroxydase

\ P~TR

· r l. \

...

i\ \1* • t ...n \

... 1\ *

f. ~ _r;. li~ ~~ '.' lQ\ X ••••••.••• zt /~~""'" 01.~.\ 1.... ,

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100 0,\ 0,2 2

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155

Il PURIFICATION ET CARACTERISTIQUES PHYSICOCHIMIQUES DESENZYMES P2a EXTRAITES, RESPECTIVEMENT, DE TISSUS

PARASITES ET DE TISSUS DE REACTION

Nous avons vu précédemment que l'isoenzyme P2a dont l'activitéaugmente par suite de l'attaque parasitaire correspond à une isoenzymehomologue des tissus sains et dans les tissus de réaction. Cependant lecomportement de l'isoenzyme extraite des tissus prarasités présente quelquesdifférences par rapport à ses homologues: PM apparent plus élevé (125000 aulieu de 108-110000), léger décalage au cours des migrations électrophorétiqueset bande plus large. Afin de lever les incertitudes concernant l'identité desisoenzymes P2a respectivement extraites des tissus parasités et des tissusréactionnels, nous avons purifié l'isoenzyme P2a des deux provenances et avonscomparé leurs caractéristiques physicochimiques.

1. PURIFICATION DES ENZYMES

Les deux purifications ont été réalisées en trois étapes les deuxpremières étant identiques à celles décrites pour la purification des laccases.

- "Satch" DEAE-cellulose:

Cette étape consiste en une adsorption des peroxydases sur laDEAE-cellulose (DE52) par addition de l'échangeur d'ions dans l'extrait lUi-même;la DE52 est récupérée par filtration de la suspension sur verre fritté. Le cycleest renouvelé 3 à 4 fois; seules les enzymes correspondant à la fraction EF nes,ont pas adsorbées.

Après le dernier cycle d'adsorption, les lots de DE52 sont co llectés, lavéspar un tampon phosphate de sodium 0,0125 M à pH 6 et les peroxydases sontéluées par un tampon phosphate contenant du NaCl à 0,25 M. Cette élution estrenouvelée à 3 ou 4 reprises de manière à récupérer le maximum de l'activitéperoxydasique préalablement fixée sur la DE52. Les solutions, appelées "SatchDE52", sont filtrées et concentrées sur ultrafi ltre AJ'1ICON PM 1O. Cette étapeintermédiaire permet à la fois de diminuer la force ionique, d'él iminer unefraction importante de la pigmentation brune de la solution originelle et

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157

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Figure 40 - Vérification, après la dernière étape de purification, del'homogénéité des préparations de peroxydase, par électrophorèse en gel depolyacrylamide. 1: étape "batch DE52", 2: P2a purifiée à partir de tissusparasités; 3 et 4: P2a isolée à partir de tissus réactionnels. (t J 2 et 3:révélation des protéines par coloration au bleu de Coomassie; 4: révélation dela peroxydase par son activité catalytique).

158

Figure 41 - Détermination de quelques caractéristiques physicochimiques desperoxydases P2a Oégen?e voir Je texte p. ).

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159

d'effectuer un changement de tampon. En fin de cycle la peroxydase est recueilliedans un tampon Trfs-HCl 0,025 M pH 8,4.

- Chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose à pH 8.4

La solution "Batch-DE52" concentrée est déposée sur une colonne (d = 2cm, h = 15 cm). L'enzyme est éluée par un gradient en NaCl (0 --) 0,35 M ) dans untampon Tris-HCl 0,025M à pH 8,4. Les fractions les plus actives sontrassemblées. Après concentration sur filtre AMICON, avec changement de tampon(acétate 0,025M' à pH 5), cette solution est rechromatographiée sur une colonnede DE52 équil ibrée dans ce même tampon acétate.

Cette étape permet d'écarter la majorité des protéines contenues dans lasolutfon "Batch-DE52", Seules les fractions centrales du pfc sont rassemblées. Letest d'actfvfté révèle que dans ces condftions l'activfté peroxydasfque e~t

fndépendante des fons calcfum. La solution enzymatfque ne contf~nt donc pas lafraction P2b.

- Chromatographfe sur colonne de DEAE-cellulose à pH 5

Les ffgures 39 A et B présentent les dfagrammes d'élutfon (P2a TP et P2aTR). On remarque que pour les deux purificatfons il y a superpositfon des picstracés ~ partir de':'

- l'actfvfté enzymatfque- la DO à 280 nm (protéine)- la DO à 402 nm (hème de la peroxydase).

A l'issue de cette procédure de purffication la peroxydase P2a des tfssusparasités et celle des tissus réactfonnels paraft homogène à l'électrophorèse(Ffg.40)

2. DETERMINATION DES PRINCIPALES CARACTERISTIQUESPHYSICOCHIMIQUES

Les caractérfstfques suivantes ont été déterminées:

- PM des enzymes natfves ou dénaturées par le SDS (Fig. 41 E et F)- pH isoélectrique (vofr pfcs majeurs Fig. 43 graphes TP et TR)- pH optfmal d'actfvfté (Fig. 41 B)- activfté en fonctfon de la température (Ffg. 41 C)- stab'i lfté thermfque (10 mn à la température donnée puis test à

30") (Fig. 41 D)- spectre UV-vfsfble (Fig. 41 A)

'"

FI igure 42 - Finger print tryps1que des peroxydases P2a extraitesrespectivement des tissus parasités (TP) et des tissus de réaction (TR).

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161

TABLEAU f <!

COMPOSITION EN ACIDES AMINES DE LA PEROXYDASE P2aISOLEE A PARTIR DE TISSUS PARASITES PAR R. LIGNOSVS (TP)

ET DE TISSUS DE REACTION (TR)

ACIDES AMINES TP TR

ASP 70 72

THR 47 43

SER 40 39

GLU 51 53

PRO 21 20

GLY 31 31

ALA 40 37

CYS 13 13

VAL 23 22

MET 7 6

ILEU 25 27

LEU 45 48

TYR 9 8

PHE 33 31

HIS 6 6

LYS 12 12

ARG 21 23

TRP

Total 495 492

162

- activité spécifique (unité par DO à 402 nm)(Tabl. 17)- composition en aminoacides (Tabl. 18) ,- finger print trypsique (Fig. 42)

TABLEAU: 17

. Caractéristiques physicochimiques

Origine de l'iso- 00280- 00280 Act. 5péc. (U/00402)enzyme P2a 00402 00260

Galaco1(*) AI. Conif.(**)

T5 2,5 0,9 453

TP 0,52 1,07 510 400

TR 0,34 0,94 650 335

(*) (**) respectivement à une concentration égale à 2.10-2 M et2.10-3 M

Toutes ces caractérlstlQues~ atnsl que celle relatlve aucomportement sur DEAE-celluJose~ sont communes aux deuxprêparatlons enzymat1Ques. Les seules variantes constatées sont une largeurde bande anormale dans le cas de J'enzyme P2a des tissus parasités, une valeurpour 1e rapport 00280/00402 un peu plus élevée que ce 11 e enreg istrée pourl'enzyme homologue des tissus de réaction; ces différences pourraient êtreattr'ibuées, comme J'ont suggéré certains auteurs, à J'adsorption sur la protéineisolée des tissus paras1tés, de composés phénol1ques plus ou m01ns oxydés qu1 setrouvent en quant1tés appréciables dans ces tissus.teci pourrait aussi expliquerla légère différence d'activité spécifique que nous avons notée.

Enfin les variations de compos1tion en aminoacides ne sont passignificatives, un test de comparaison statistique (Test de Pearson) fournit uncoefficient dé similarité supérieur à 0,99 (1 = identité).

Les caractéristiques physicochimiques étudiées sont suffisammentvoisines pOLIr que les deux enzymes puissent être consldérées comme1dent1Ques. L'enzyme native est un· dimère constitué de deux sous-unitésidentiques de PM estimé à 54000 O.

163

Une conséquence en découle: l'isoenzyme P2a est donc bien uneenzyme synthétisée par l'Hévéa et l'accroissement de son activitécorrespond bien à une réaction de l'Hévéa en réponse à l'agressionparas i ta ire.

d) Rôle physiologique potentiel

L'accroissement de l'activité de la peroxydases P2a étant une réaction del'Hévéa, 'il convenait de~ déterminer'sa signification: réaction de défense ou non?L'implication de la peroxydase dans un mécanisme de défense n'est envisageableque dans la mesure où cette enzyme est capable de polymériser les monomères dela 1ignine.

Le tableau 17' révèle que la peroxydase P2a (TP et TR) esteffectivement capable de polymériser l'alcool coniférylique (la réactionsemble également positive, avec l'alcool p-coumarylique ; cependant ce substratque nous avons préparé au laboratoire à partir de l'acide coumarique n'était paspurifié à homogénéité.

Il convient d'ajouter que toutes les fractions EF et EL, qU'elles soientextraites de tlssus sa'insJ parasités ou réactionnels, polymérisent l'alcoolconiférylique.11 en ressort néanmoins que toutes les fractions sont susceptibles,sans doute à des degrés divers, de participer à la lignification des tissus. Parailleurs ne disposant pas des trois alcools de la série cinnamiqueJ il ne nous apas été possible de vérifier si les différentes peroxydases possèdent unespécificité particulière à ce niveau comme cela a été démontré par le grouped'OHGUCHI et A5ADA (1975) dans le cas des isoperoxydases du radis attaqué parPeronospora parasitica.

III ELEMENTS DE REGULATI ON.

1. MECANISME PRESIDANT A L'AUGMENTATION DE L'ACTIVITE DEL'ISOPEROXYDASE P2a.

Nous avons présenté plus haut une estimation de l'importance del'accroissement de l'activité de l'isoperoxydase P2a. Cette augmentation estconsidérable puisque nous avons mesuré des facteurs de stimulation de 20 à 170selon les expériences et selon la nature', des tissus (Tableau 16), Cetaccroissement peut avoir deux origines différerentes : '

164

- activation de la protéine enzymatique elle-même selon un mécanismeimpliquant par exemple une, hydrolyse ménagée par une, protéase (exp.trypsinogène :---) trypsine) .'

- stimulation de la biosynthèse de novo de l'enzyme.. .

Les résultats relatifs à l'activité spécifique de l'isoperoxydase P2a selonles trois origines tissulaires (TS, TP et TR) (Tabl. 17) permettent d'emblée detrancher entre ces deux possibilités. En effet les activités spécifiquesexprimées par rapport à une caractéristique fondamentale des peroxydases, la DOà 402 nm, sont voisines (la référence à la 00402 nous paraissait plus

judicieuse qu'une référence à une 00280 ou une quantité de protéine (méthode de

Fo1in ou de Lowry) car plus sensible et surtout plus fiable puisqu'elle ne tientpas compte de la présence éventuelle de contaminants protéiques (cas del'enzyr:ne P2a TS non purifiée de manière eXhaustive). Il en résulte que lesfa1bles d1fférences d'activ1té spéc1f1ques ne' saura1ent en aucun casrendre compte de raccroisement considérable de ractivité de1"1soperoxydase P2a dans les tissus parasités et les tissusréactionnels.

Il faut en conclure que cet accroissement résulte d'unestimulation de la biosynthèse de novo de la protéine enzymatique.

Il s'agit là d'une information importante pour deux raisons:

- on n'a que rarement pu démontrer de manière indiscutable l'implicationd'une stimulation de la synthèse protéique dans l'augmentation de l'activité decertaines enzymes dans des tissus subissant une agression parasitaire. Dans cescas similaires l'application des techniques sophistiquées (incorporation d'eaulourde dans les molécules (density labeling) et séparation par centrifugation engradient de densité) a été nécessaire (DUCHESNE et aL, 1977; COLLENOAVELOOL etal., 1982; 1983).

- Les résultats orouvent que les tissus du bois sont oarfaitementcapables de réagir. y compris lorSque la réaction implIque une synthèse protéiquede nova.

2. ASPECIFICITE AU NIVEAU DE L'AGENT PATHOGENERESPONSABLE DE LA REACTION DE L'HEVEA.

Nous avons vu qu'au niveau du pool peroxydasique J la réaction présente unespécificité certaine puisque dans le cas de pivots adultes une seule desisoperoxydases est stimulée en priorité.

Dans la nature les racines d'Hévéa sont attaquées par de nombreuxparasites. Ceux-ci provoquent-ils tous la même réaction de la part de l'hôte au

165

Figure 43 - Electtofocalisatfon en veine liquide d'extraits bruts de tfssussains (TS), parasités par R. /ignosus et P. noxius et de tissus de réaction(TR); (le pic principal (TP et TR) correspond à la peroxydase P2a),

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Numéro des Fractions

166

~

niveau du système peroxydasique? Nous avons tenté de répondre à cette questionen comparant, au moyen d'une analyse par é1ectrofoca1isation en veine liquide, lacomposition en isoperoxydases des quatre extraits de tissus suivants: sa'ins,réactionnels (après attaque par S. repens) et infectés par R. /ignosus ou Pnoxius.

Les diagrammes (Fig. 43) sont particulièrement démonstratifs. En effetles trois parasites provoquent la même modification du spectre isoperoxydasiquecaractérisée par une très nette prédominance de l'isoenzyme P2a.

. La stimulation de la réaction de ]."Hévéa est donc aspécifique(au niveau de la cause) puisque provoquée par plusieurs parasites. Ce type deréaction présente un intérêt majeur puisque, au cas où il s'avérerait efficace, ifconstituerait une protection contre un ensemble de parasites.

IV. DISCUSSION

Nous avons vu, plus haut, que de nombreux auteurs ont réussi à établir unecorrélation positive entre l'augmentation de l'activité peroxydasique des tissuset la lignification anormalement élevée de ces mêmes tissus. De même, unecorrélation positive existe entre lignification et résistance à l'agressionparasitaire. Enfin certains auteurs associent directement stimulation desperoxydases et résistance à l'infection (HISLOP et STAHI'1ANN 1971 ; JOHNSON etCUNNI NG,HAM, 1972 ; RETIG, 1974 ; VEGETTI et aL, 1975); en revanche d'autresn'ont pas réussi à établir une telle corrélation (GREZELINSKA, 1970; JOHANSSONet THEANDER, 1974) ou considèrent l'accroissement de l'activité peroxydasiquesoit comme un marqueur de sénescence (MAZEAU et ESQUERRE-TUGAYE, 1976) soitcomme un marqueur de rajeunissement (BIRECKA et al., 1975).

Pour être efficace en tant que mécanisme de défense, la lignification doitintervenir dès la pénétration du parasite dans les tissus. Ceci suppose, quel'ensemble des enzymes de la voie de biosynthèse de la lignine soient stimuléessuffisamment tôt, y compris la peroxydase qui réal ise l'étape finale de cettebiosynthèse. En fait, concernant la stimulation de l'activité peroxydasique onnote, suivant les couples hôte-parasite, soit un accroissement relativementtardif de cette activité dans les tissus (au moins par rapport au délai destimulation de la PAL ou de l'OMT ; LEGRAND et al. (1976) ; peut-être est-ce lerésultat d'une induction séquentielle?), soit une induction précoce (HISLOP etSTAHI'1ANN, 1971).

Par ailleurs J'augmentation de l'activité peroxydasique estquantitativement variable (généralement 50 à 300 %) ; qualitativement, lastimulation concerne, suivant le cas, toutes ou une majorité des isoperoxydases

167

préexistantes dans les tissus sains (HI5LOP et 5TAHMANN, 1971 ; 5EEVER5 et a1.,1971; BIRECKA et 211., 1975 a et b ; OHGUCHI et al., 1974; A5ADA, 1978; OGHUCHIet A5ADA, 1975 ; RETIG, 1974).

Par rapport à la réaction peroxydasique développée par d'autres plantes,celle de l'Hévéa présente deux caractéristiques exceptionnelles:

- son intensité: globalement l'augmentation de l'activité peut atteindreun facteur 10 par rapport à l'activité présente dans les tissus sains;

- sa spécificité (au niveau de l"effet) puisque dans les pivotsadultes la stimulation ne concerne pratiquement qu'une seule dès isoperoxydasesinitialement présentes dans ces mêmes tissus sains, le facteur de stimulationatteignant dans le meilleur des cas étudiés un facteur::l 170.

A noter, de plus, que:

- l"lnduction est aspécjflque, au niveau de la cause, puisque lestrois parasites étudiés provoquent la même réaction;

- l"accrolssement de l"activité de l"isoperoxydase P2a résultenon d"une activation de la protéine enzymatique, mais de 'lastimulation de la biosynthèse de noyo, par la plante, ~'de la protéineelle-même;':

- ri~upero~yda:n: e~t capable de réa1i~er l"ételp~ finale de IIIbIosynthèse de la l1gntne; e.lle est donc susceptible de ,~;bârticipeÎ â ünprocessus de 1ignif icat ion réact ionne 1. '''~+

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169

CHAPITRE IV

MODALITES DE LA DEGRADATION DES TISSUS, IN VITROET IN VIVi], PAR R. llGNOSUS ET P. NOKIUS

L'objectif, en abordant cet aspect des recherches, était de vér1f1er laval idité des hypothèses antérieurement proposées concernant:

- la nature ligninolytique de P. noxius en raison de sa capacité àexcréter une laccase;

- la dégradation préférentielle de la lignine par R. lignosus ~

celle de la fraction polyosidique par P. noxius. Ceci en raison desdifférences d'équipement enzymatique qu'ils présentent, au plan quantitatif;

- rattaque préférentielle~ in vivo~ des tissus cellulosiques duphloème par P. noxius~ des tissus lignifiés du xylème par R.lignosusen raison de ces mêmes différences.

En d'autres termes, il s'agissait de vérifier si les différencesd"équipement enzymatique des deux agents pathogènes influaienteffectivement sur leur comportement à la fois saprophytique etparasitaire.

Pour effectuer ces contrôles nous avons examiné l'effet, in vitro et ifivivo, des deux champignons sur les tissus du bois. Enfin nous avons comparé lesrésultats de l'analyse chimique à ceux de l'observation cytologique exécutéeparallèlement sur des plantules d'Hévéa inoculées artificiellement (NICOLE,1984).

1. DEGRADATION~ IN VITROI DE BUCHETTES DE BOIS D'HEVEA;NATURE LlGNOLYTIQUE DE P. NOXIU5

1. Effet comparé de R. lignosus, P. noxius et Antrodiasp. sur la ·perte en poids" des bûchettes et sur ladégradation de la lignine. -.

L'évaluation de la perte en poids, témoin de l'aptitude des champignons àuti liser ce matériau comme substrat nutritif, a été réal isée non seulement pourles deux agents pathogènes de l'Hévéa, mais également pour Antrodia sp.,responsable d'une pourriture brune du bois de sciage. Ce dernier a été intégré dansces essais à titre d~ témoin des aptitudes dégradatives d'un agent de pourriture

170

Figure 44 - Dégradation de bûchettes d'Hévéa (cultures en tube de Roux) parAntrodia sp. (Ant.>, R. lignosus(souches Lst et L68) et P noxius(Nst).a) Perte en poids (exprimée en ro de perte de mat1ère sèche par rapport à desbûchettes non inoculées), b) Contenu en 1Jgn'ine (LTG) des résidus de bûchettesaprès des temps de"culture variables.

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P. noxius

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2 10 20semaines

171

brune; il constituera un élément de comparaison devant faciliter l'interprétationdes résultats. '

La figure (44 a) permet de comparer l'aptitude des différentschampignons à utiliser le bois d'Hévéa. Il apparaît que l'Antrodia est beaucoupplus actif que la souche de P. noxius (N st.) qui, elle-même, possède un pouvoirdégradatif nettement supérieur à celui des deux souches de R. lignosus (L st etL 68). Notons que ces deux souches diffèrent entre elles par leur agressivitémesurée sur des plantules d'Hévéa inoculées artificiellement, dans des conditionsdécrites par ailleurs (NANDRIS et al, 1983; NICOLE et aL, 1983).

Cette première approche des capacités à dégrader le bois 'a été complétéepar l'estimation du taux de lignine présent dans les résidus de bûchettes aprèsdes temps variables de colonisation par les champignons (Fig. 44 b). .A ce niveau,les résultats deviennent extrêmement démonstratifs quant è la nature del'attaque. En effet alors que, en pr,emière approximation, le taux de lignine desbûchettes envahies par R. lignosus et P. noxius varie peu, dans le cas del'Antrodia, en revanche, on note une augmentation considérable de la proportionde lignine des résidus. On peut en conclure que les deux premiers dégradent defaçon relativement "équ'ilibrée" à la fois la fraction lignine et la fractionpolysaccharidique du bois, alors Que Antrodia ne dégrade que cette dernièrefraction provoquant, de ce fait même, un enrichissement en lignine du résidu debûchette.

Afin de mieux mettre ce résultat en évidence, nous avons calculé, à partirdes données précédentes, le taux de lignine effectivement consornmé au cours dela colonisation des bûchettes et en avons déduit le taux de con'sommation de lafraction "non lignine" (cette fraction contient en majôHté,. mais nonexclusivement, des polysaccharides). La figure 45 confirme les points suivants: -

* R. lignosus et P. noxius dégradent effectivement la lignine. P.noxius doit donc être classé parmi les agents de pourriture blanche au mêmetitre que R. 1ignosus. Ils ne sont pas des agents 1ignolytiques exclusifspuisqu'ils dégradent également la fraction po1yosidique. .

* Antrodia sp., par contre, apparaît bien être un agent de pourriturebrune, ne dépolymérisant que la fraction po1ysaccharidique.

* P. noxius montre une tendance à dégrader de façon privilégiée lespolysaccharides, alors que R. lignosus dégrade de manière relativementéquillbrée lignine et polyosides avec néanmoins une légère préférence pour la1ignine. Ces données sont en accord avec les capacités respectives, au planquantitatif, des deux châmPignons à excréter des polyosidases et -la laccase.Comme nous l'avons vu la proportion entre hydrolases et laccases estcaractéristique de chacun de ces deux parasites: prédominance de l'activitélaccase chez R. lignosus, de l'activité des hydrolases chez p'. noxius.

E.igure 4S - Dégradation (calculée 'à partir des Fig 43 a et b) des fractions"lignine" et "non lignine" par les différents champignons. Les résultats sontexprimés en pourcentage de chacune de ces fractions effectivement dégradé,.par référence à la' quantité de matériel Initialement présent dans lesbûchettes (témoin).

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Temps de Culture (semaines)

173

2. Effet d'une source nutritive exogène sur l'aptitude deR. lignosus et P. noxiusà dégrader le bois

Cette expérimentation a été entreprise en raison des résultats acquispour des champignons tels que PIJaneroclJaete cIJrysosporium et Corio/usversic%r révélant que la lignine ne peut être dégradée en l'absence d'unsubstrat nutritif tel que le glucose ou même la cellulose (KIRK et a1., 1976). Ceschampignons sont incapables de se développer en présence de lignine commeseule source carbonée. ANDER et ERIKSSON (1977) ont également montré quecertains agents de pourriture blanche dégradaient plus rapidement la fraction·lignine de bûchettes de bois en présence de substrats nutritifs exogènes (tel quel'extrait de malt), qu'en l'absence d'un tel substrat.

Les essais que nous avons réalisés (pour les conditions de cultureparticulières, voir matériel et méthodes) révèlent que l'adjonction d'extrait demalt n'a que peu d'influence sur la vitesse de dégradation du bois par R. iignosu5(Fig. 46). En revanche l'efficacité de P. noxius à dégrader les bûchettesaugmente considérablement; il n'est cependant pas possible de déterminer si cetaccroissement est à mettre au compte d'une augmentation de la massemycélienne totale envahissant le bois de la bûchette ou de celle des systèmesenzymatiques impliqués dans la dégradation des différents polymères du bois.

Quoi qu'il en soit, l'augmentation de l'aptitude à dégrader le bois s'exercesans distinction quant à la nature des polymères. Le tableau 19 révèle en effetqu'après quatre mois de culture, en présence de milieu malté, P. noxius adégradé 62 % de la bûchette (exprimé en poids de matière sèche) et 62,1 % de lafraction non lignine. Après 6 mois de culture sur bûchettes seules (en présenced'eau) la dégradation globale du bois et celle des différentes fractions estbeaucoup plus limitée. Ces résultats confirment, pour R. /ignosu::J~ la tendance àune dégradation privilégiée de la fraction lignine; dans les conditionsexpérimentales utilisées ici, P; /7oxius manifeste cette même tendance. Ladifférence de réponse de ce dernier par rapport à celle enregistrée au cours del'essai précédent est-elle dûe à la différence de condition'de culture?

3. Evolution de la composition monomérique de la ligninedes bûchettes

Cette analyse a été entreprise dans le but de vérifier la nature de lalignine résiduelle. L'attaque fongique peut en effet se traduire soit par unedépolymérisation de la lignine sans modification de la composition monomériquedu polymère résiduel, soit par une altération progressive de ce polymère tant auplan du degré de polymérisation qu'à celui de la composition monomérique. .

Les résultats (Tabl. 19) montrent que la modification de la 1ignine estréellement progressive; après deux semaines de culture, la chute du rapport S/V

,1 ~ •

Tableau 19 - Effet d1une source nutritive exogène sur la biodégradation des buchettes de bois

Conditions de cul ture T'emps de 6PS % Lignine % S/Vculture

(mois) (1) dans résidus de ,dégradée Fraction "non li- . (1)gnine" dégradéebûchettes (2 ) (2)

Témoin : bûchettes stérilisées 0 23,2 0 0' 1,72

R. lignosus/ 0,5- 8,3 23,2 8,3 8,3 1,69

bûchett,es + eau 6, 19,0 21 ,° 26,6 17,7 1,60

R. lignosus/ 0,5 12, 1 22,7 14, 1 11,4

bûchettes + extrait de malt 6 23,8 22,9 24,8 23,05 1,57

P. noxius/ 0,5 14, 1 22,8 16,3 ,13,6 1,61bûchettes + eau 6 14,7 22,3 18, 1 13,7 1,31

P. noxius/ 0,5 18, 1 22,7 20,1 17,6bûchettes + extraits de malt 4 62,1 23,3 61,9 62,1 1,32

(1) Valeurs expérimentales

(2) Valeurs calculées

175

est à peine sensible dans le cas de R. 1ignosus (1,72 -;--) 1,69); après six moiselle est nettement plus appréciable (1,60). L'action de P noxius est plus rapidepuisque, le rapport S/V passe de 1,72 à 1,61 dès la deuxième semaine de culturepour atteindre 1,31 après 4 mois de culture. Il est à noter que nous n'avonsjamais enregistré de variation du motif p-coumarylique, lep-hydroxybenzaldéhyde (8) qui résulte de l'oxydation de ce composé par lenitrobenzène, n'est détecté qu'à l'état de traces (0,6 à 1ro de la somme V+S+B),.

Par aill eurs:

- l'apport nutritif exogène n'a qU'un effet négligeable sur l'évolution deS/V par rapport à celle enregistrée pour des bûchettes en l'absence de cesubstrat (1,57 au lieu de 1,60 (R. lignosus) et 1,32 au lieu de 1,31 en casd'infection par P noxius) et ceci après respectivement 6 et 4 mois de culture;

- l'évolution du rapport S/V est particulièrement importante(1,61 --) 1,31) entre 2 semaines et 6 mois de culture (P noxiuSJ

al'ors que durant cette pério.de l'évolution de la consommation en lignine apparaîtcomme relativement limitée (16,3 ro --) 18, 1 ~n L'évolution inverse est notée encas de cultures de R. lignosus(S/V 1,69 --) 1,60 ; 1ignine : 8,3 %--) 26,6).

Ce résultat pourrait signifier que la modification de la ligninen'est pas nécessairement liée à la dépolymérisation ; elle peut eneffet précéder cette dernière (cas de P. noxius ). Il suggèreégalement lïntervention d-au moins deux mécanismes dans ladégradation de la lignine: l'un responsable de la modification durapport S/V, l'autre de la dépolymérisation proprement dHe dupolymère.

La chute du rapport S/V implique soit une élimination préférentie1Je dumotif sinapylique de la macromolécule originelle soit une transformationchimique de cette molécule en un composé différent. A ce propos, on peut noterque la laccase de Coriolus versicolor est capable d'effectuer la déméthylationde l'acide et de l'alcool vanilique ainsi que de la lignine de bois d'érable moulu(ISHIHARA et MIYAZAKI, 1974 ; ISHIHARA, 1980). Cette observation peutégalement être correlée au fait que les laccases de R. lignosus et P fJoxiusoxydent plus rapidement l'acide sinapiniqüe que les composés de la sériecinnamique (Chapitre Il). Cependant si cette action déméthylante de la laccaseétait prédominante on comprendrait mal que la variation S/V soit plusimportante dans le cas de la dégradation des tissus par P fJoxius que dans cellede R. 1igfJosus. .

Une autre interprétation peut être proposée selon laquelle leschampignons dégraderaient en priorité des structures pariétales riches en ligninede type sinapylique ce qui aurait pour effet de diminuer le taux de cette unité debase dans le bois infecté par rapport au taux origi~el du bois non inoculé.

176

Flgure 47 - Taux de l1gnine dans dlfférents types de tissus de pivots infectéspar R. lignos(Js (a et c) et·~ noxk/s (b et dJ. Chaque coUl"'be joint lesrésultats enregistrés pour un pivot déterminé.

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Natûre' d.es· Tissus

177

Cependant les résultats de" l'observation cytologique ne sont pas en faveurd'une telle hypothèse, dans la mesure où, au niveau cellulaire, l'action des hyphesest à la fois centripète et centrifuge (NI COLE, 1984).

II. EFFET DE L'INFECTION DE PIVOTS D'HEVEA PAR R.ll6NOSUS ET P. NOXIUS SUR LE TAUX ET LA COMPOSITION.MONOMERIOUE DE LA LIGNINE DES TISSUS.

1. Variations du taux de lignine dans les différentstypes de tissu. .

. L'analyse a été réalisée sur cinq pivots infectés par R. /ignosus et sixpivots attaqués par P noxius. Dans chaque cas, il s'agit de pivots d'arbresadUltes (4 à 8 ans), partiellement envahis, sur lesquels sont prélevés les quatretypes de tissus S, SF, PF et P. Les résultats sont exprimés de deux manières, soit ". -:.en taux de 1ignine par rapport à la sciure (séChée à 1OS OC) et débarassée descomposés extractibles (Fig. 47 a et b), soit en pourcentages relatifs de ligninecalculés, pour chaque pivot, par rapport au taux de 1ignine présent dans le tissu S(base 100) (Fig. 47 c et d).

Cette dernière représentation permet de mieux exprimer les variations dela teneur en lignine suivant la nature du tissu analysé.

La première remarque concerne la variab'ilité du taux de lignine des tissusS d'un pivot à l'autre (Fig. 47 a et b). Celle-ci peut être mise au compte soit de lavariabilité génétique inter-arbres (les pivots prélevés en plantation sont issusde graines d'origines diverses), soit d'une variation dans l'exécution de latechnique de dosage, d'une série d'analyses à une autre. Une telle variationintroduirait des erreurs dans l'apréciation de l'évolution du taux de lignine detissus prélevés .sur un même pivot, dans les zones caractéristiques déjàprécisées. Or dans le cadre de cette étude seules les variations du taux de 1ignineselon la nature des tissus présentent un réel intérêt.

Afin d'éliminer la source 'de variation éventuellement imputable à latechnique de dosage) les quatre types de tissus d'un même pivo~ sont toujourstraités au cours de la même série de dosages (épuisement en composésextractibles, dosage de la lignine, composition monomérique). L'expérienceeffectuée dans ces conàitions sur un échantillon de sciure divisé en quatre lotssubissant les traitements dans les conditions standardisées, révèle une grandehomogénéité des résultats des dosages de lignine (écarts des valeurs extrêmesinférieurs à 3 % par rapport à la moyenne). Dans ces conditions) les variationsenregistrées pour les différents tissus d'un même pivot sont réellementsi gnHicat ives.

178

Pour des pivots infectés par R. lignosus, on note en particulier et defaçon systématique une augmentation parfois importante, du taux de lignine auniveau des tissus SF, suivie d'une chute de ce taux dans les zones plusanciennement colonisées par le parasite.

Si l'on considère l'ensemble des données enregistrées par ailleurs,notamment en ce qui concerne le très fort accroissement de l'activitéperoxydasique au niveau PF, on est tenté d'attribuer cette augmentation du tauxde lignine, à une lignification réactionnelle des tissus en réponse à l'agressionparasitaire. Une telle réaction peut d'ailleurs être observée au niveauhistologique sur jeune plantule infectée (NICOLE et aL, 1982). A terme elle nes'avère cependant pas efficace puisque dans la plupart des cas la progressionintratissLllaire du champignon se poursuit et la 1ignine qui s'était accumulée dansles tissus au stade SF, est peu à peu dégradée; d'où la chute du taux de ligninedans les tissus de type P (Fig. 47 a et c)

L'interprétation des résultats enregistrés pour des pivots infectés par P.noxius est plus délicate en raison de l'hétérogénéité des réponses à l'attaqueparasitaire. Toute tentative d'interprétation devra tenir compte du fait qu'auniveau anatomique les réactions de l'Hévéa ne sont qu'exceptionnelles en casd'attaque par P. noxius. De même la stimulation de l'activité peroxydasique auniveau des tissus de type SF est bien moindre qU'en cas d'agression par R.1ignosus; dans de nombreux cas l'activité dans ces tissus est même inférieureà celle des tissus sains. Ces observations conduisent à penser que P. noxius tuetrès rapidement les tissus qu'il attaque (résultat également observé enplantation (NANDRIS, 1985). Néanmoins des réactions histologiques, hyperplasie,cellules surnuméraires, et même réactions de lignification sont fréquemmentobservées dans les assises cellulaires situées sous les points de pénétration duchampignon (infections artificielles de jeunes plantules (NICOLE et aL, 1984).Ces faits sont-ils extrapolables aux pivots adultes? Expliqueraient-ils le faibleaccroissement du taux de 1ignine au niveau SF pour certains pivots? Dans ce cascomment expliquer la baisse du taux de lignine à ce même niveau pour deux despivots analysés?

Si nous considérons les stades SF et P, les mêmes difficultésd"interprétation surgissent. Pour trois des pivots on enregistre un accroissementde la teneur en lignine qui pourrait être mis au compte de dégradation privilégiéede la fraction polysaccharidique des tissus (considérés comme morts). Pourd'autres pivots, on note au contraire une diminution de la teneur en ce polymère,ce qui laisse supposer-une action lignolytique privilégiée. Enfin, pour le dernierpivot on assiste en principe à un équ'llibre dans la dégradation des différentesfractions tissulaires.

Pour rendre compte de cette hétérogénéité et considérant que les tissusde type PF et P sont morts et donc que le seul paramètre qui puisse varier est leparamètre "agent pathogène", nous proposons l'hypothèse suivante: les pivotssont attaqués par des souches de P. n()xius se différenciant par leur aptitudephysiologique à dégrader les différents polymères du bois. Cette hypothèse n'est

179

Figure 48 - Composition monomérique de la lignine; exemple de séparationdes aldéhydes de la série benzoïque après oxydation au nitrobenzène desciures provenant de différents types de tissus (TS, TSF, TPF et TP) d'unpivot colonisé par R. lignosus.

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Figure 49 - Variations du rapport S/V dans différents types de tissus depivots infectés par R. lignosus (a) et P. noxius (b) (chaque courbe jointles valeuîS enregistrées pour les tissus provenant d'un même pivot). .

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2. Effet de rinfection sur 1~ composition monomérique ~,de la lignine' résiduelle . .. '.

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Sur le~ échantillons de sciure' provenant des différentes types de tissusde pivots infectés et,don't unê 'partie aliquôte a'servi 'à l'estimation de la teneuren lignine, nous avons effe,ctué l;analyse mono~é~,ique du polymère résiduel. Lesdiagrammes de l~ figure A8 iilustrent'les'résultat~ d'üne tell,e 'analyseen HpLCeffectuée sur les quatre types de tissus d'un pivotinfecté par R. Iignosus. :

De façon très générale; et quelle que soit ia nature ~e l'agent" pathogèneinfestant, nous constatons une chute du rapport S/V, importante essentiellementau niveau des tissus de type P, c'est-à-dire les plus anciennement colonisés (Fig.49). Cette constatation recoupe celle faite ln vitro, dans le cas de bûchettesd'Hévéa infectées. Il semblerait que les processus conduisant à la modification dela lignine, préalable à (ou accompagnant) la dégradation du po'lymère, soientcomparab les, que -l'attaque par les champignons se fasse aü détriment debûchettes stéril isées ou de pivots d'Hévéa infestés naturellement. Ceci provienttrès vraisemblablement du fait que, dans les deux cas, les champignons agissenten saprophytes, les tissus de type P des pivots étant morts" tout comme ceux desbûchettes. ·Une dernière remarque concerne l'absenc'e ,quasi-totale du .motifp-coumaryliquè dans la lignine analysée, quel que soit le 'type de tissu dont elle,provient. ' .' . '.

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III. CONTROLES HISTOLOGIQUE ET CYTOLOGIQUE DESMODALITES DE L'INFECTION PAR R. LI6NOSUS ET P. NOXIUS

1. IN VITRO (bûchettes infectées)

Les observations cytologiques ont été réal isées (NI COLE, 1984) sur descoupes de bûchettes de bois 'infectées, donc uniquement sur des tissus'ligneux.

L'attaque par les deux champignons se fait de manière anarchique et, progresse à la fois dans un sens centripète: lamelle moyenne --) paroi primaire--) paroi secondaire, et centrifuge, après perforation des parois ou pénétrationdans la lumière cellulaire par des ponctuations: paroi secondaire (53 --) 52---) 51) --) paroi primaire --) lamelle moyenne. Ainsi, ln vitro, dans lexylème. le comportement des deux champignons ne peut être différencié.

182

F1gure 50 - Exemp1es de dégradat1on de structures pariéta1es effectuée invivo par les deux parasites.

'.

1) REK:ine d'Hévéa sain: Coupe transversale eu niveau du phloème (lm::: lamelle m(Jy'8nne; pc :a

paroi cellulosique); (x 22 500). 2) Racine d'Hévéa parasitée par R. lignosl/s. Dégradation lE lalemelle moyenne (flèches) entre deux tubes criblés (te) du phloème. (x 6 000). 3) R~ined'Hévœparasitée par R.lignosvs' perforation d'une paroi cellulosique (pc) d'une cellule du parenchymecortical primaire par une hyphe (hl en croissance. Noter l'action "corrosive" conjointe au niveaude la lamelle moyenne (flèche) (x 15 000)...) Racine d'Hévéa sain: coupe transversale au niveaudu xylème (lm: lamelle moyenne; Pl: paroi primaire; sI. s2 et s3: sous-couches lE la paroisecondaire) (x 10 000). 5) Racine d'Hévéa parasité par P. noxil/.s: Altération lE la lamellem(Jy'8nne et œla paroi primaire d'un vaisseau du xylème (flèches) (x 40 000). (ObservationsM. NICOLE. 1984>'

183 '

2. IN VI va (tissu racinaire de plantules inoculéesartificiellement)

Les observations histologiques et ~yto1ogiques effectuées sur desplantules inoculées artificiellement apportent 'des informations extrêmementintéressantes, à plusieurs niveaux, sur le' comport'ement parasitaire des deuxagents pathogènes (La figure 50 illustre la capacité des deux parasites àdégrader certaines structures pariétales)..

a) Agression parasitaire

"10 Cinétique de la colonisation des tissus

Dans une plantule la proportion de tissus non 1ignifié~f du ph loème estbeaucoup plus importante que dans un pivot d'arbre adulte. Ceci permet d'observerle comportement différentiel adopté par les parasites sur ces deux types detissus. ,~~'

L'observation, en fonction du temps, de l'invasion des différents tissusrévè1e que: -(.,

* R 1ignosus traverse le ph1oème, sans s'y ':attarder" et sans ledégrader entièrement, puis s'installe et colonise le xylème. '

, * P. noxius, au contraire dégrade en priorité les tissus du ph10ème puisattaque les tissus lignifiés du xylème. _,

2° Colonisation du xylème~ . r"

Là encore les deux parasites présentent des comportements différents:

* R lignosus adopte un chemin.ement essentiellementcentripète ; ladégradation débute par la lamelle moyenne et se poursuit'v~rs l"intérieur de lacellule dégradant successivement la paroi primaire puis les sous-couches, 5 1, 52et 53 de la paroi secondaire.

* P. noxius adopte, préférentiellement, un cheminement inverse etpénètre, soit par perforation des parois, soit pa~ les ponçtuations, à l'intérieur dela cellule puis dégrade les sous-couches1.de la pàroi .seëondaire (53 7-) 52 --)51) et enfin les' autrés structures,pariéta1es.-A 'noter que"d'après .les tests de. , ,

coloration des lignines (ph1,orog1ucine et KMn04(coloration de Maule) ce polymère

paraît moins complètement dégradé'qu'en cas'd'àtt~que 'p~r R. ~!ignoS.ÙS.. ' , '• ''', , o ••• ; r'J.... " • ': • • ~,- ...

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184

Flgure 51 - Lfgnlf1catlon réactlonnelle (flèches) au nlveau de parols decellules du phloème d'une raclne parasltée.

185

Ces différentes observations montrent que, in' vivoJ P. noxiuss'attaque d'abord aux tissus non HgnUiés. Les tissus du xylème, trèslignifiés, sont également dégradés par ce champignon, la dégradation débutant,préférentiellement par les sous-couches les moins riches en lignine. Lecomportement inverse est observé en cas d'agression par R. lignosus.

Ces résultats confirment les deux points essentiels:

* R. lignosus et P. noxius sont des agents lignolytiQuescapables de dégrader l'ensemble des polymères pariétaux et doncl'ensemble des structures tissulaires et ce llulaires.

* Cependant 11s présentent une spéciallsation certaine, l'un, R.lignosus, pour les tissus ou les structures pariétales à dominanteligneuse, l'autre, P. noxius, pour les structures polyosidiques ou àdominante polyosidique.

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b) Réaction de l'hôte

Parmi les nombreuses réactions décrites, assises cellulairessurnuméraires, hyperplasie... (NICOLE et aL, 1983; 1985 ), nous,jnsisterons plusparticulièrement sur le phénomène de lignification réactionhelle. Une telle1ignification, de novo, a été observée au niveau des cellules parenchymateusesdu phloème, donc dans un tissu normalement non lignifié.· "

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La figure 51 montre clairement l'épaississement anormal de certainesparois cellulaires situées face au point de pénétration du parasit~ (ce qui suggèrel'existence de phénomènes de reconnaissance et un effet topochimique pour leau ."dépôt" de la lignine (activation de sites d'incrustation?). Cet épaississement estbien dû à de la lignine et non à de la subérine puisque le test de coloration à laphloroglucine est positif (coloration de la lignine et de la subérine) alors que lacoloration au Soudan III B ( colorant de la subérine; PURVIS et al, 1963) estnégative.

IV. DISCUSSION - CONCLUSION

Au cours de cette partie des recherches il s'agissait, d'une part, dedéterminer les modal ités de dégradation du bois, in vitro (bûchettesstérilisées) et in vivo (pivots infectés en plantation), par R. lignosus et Pnoxius et, d'autre part, de vérifier l'existence d'une corrélation entre cesdonnées et les résultats de l'analyse enzymatigue et ceux de l'oservationcytologique.

Concernant le premier aspect, les résultats révèlent sans ambiguitél'aptitude des deux champignons à dégrader la lignine. La comparaison avec le

186

/

comportement de l'Antrodia sp, agent de pourriture brune, ne laisse aucundoute à ce sujet. R. 1ignosus et P. noxius font donc bien partie du groupe, desagents responsables de pourritures blanches du bois.

Il existe néanmoins, entre ces deux champignons, des aptitudesdifférentes en ce qui concerne la vitesse relative avec laquelle ils dégradent lesfractions majeures du bois: la lignine et les polysaccharides. R. lignosusmanifeste une tendance à dépolymériser plus rapidement la lignine que lespolysaccharides, alors que P noxius marque une préférence pour cette dernièrefraction; encore un tel effet n'est-"i] pas obtenu systématiquement. Enfin Pnoxius "répond" mieux que R. lignosus à un apport nutritif exogène. Un telapport entraîne une augmentation considérable de la vitesse. de dégradation dubois, sans distinction de la nature des polymères.

Concernant l'aspect in vivo, des difficultés d'interprétation subsistentnotamment pour rendre compte des variations du taux de lignine, suivant lanature des tissus, pour les pivots infectés par P noxius. Les résultats diffèrentd'un pivot à un autre. Comme nous l'avons vu, cette variabil ité pourrait êtreattribuée à l'existence de souches de P noxius se différenciant par leurspotentialités en matière de dégradation des polymères pariétaux.

L'attaque par R. lignosus se traduit par une réponse beaucoup plushomogène; en moyenne, et par rapport aux tissus sains, on note un accroissementd'env'iron 25 à 30 ro du taux de 1ignine dans les tissus de type PF. Nous pensonsqu'il pourrait s'ag'ir d'une lignification réactionnelle des tissus en réponse àl'attaque parasitaire. Cet accroissement peu paraître faible comparé à celuienregistré pour les couples radis- Peronospora parasitica (ASADA andMATSUMOTO, 1969) et haricot-Virus de la nécrose du tabac (TNV) (KIMI"IINS andWUDDAH, 1977) ou tabac-VMT (MASSALA, 1981). Cependant il convient deconsidérer que, chez le couple hôte-parasite qui nous intéresseJ les tissus quivont être le siège de l'infection et de la lignification réactionel1e, sont déjàfortement 1ignifiés ce qui n'est le cas, ni pour le radis, ni pour le haricot, ni pourle tabac.

Enfin, les variations de composition monomérique de la lign'inepourraient, d'après RIDE (1978)J constituer une composante importante de larésistance des plantes à l'infection. Dans le cas du radis une telle modificationintervient effectivement à la suite d'une attaque par P parasitica (ASADA etl'1ATSUMOTO, 1972). En revanche chez le haricot infecté par le TNV cettemodification est mineure (KIMMI NS et WUDDAH, 1977).

Dans le cas de l'Hévéa, l'attaque parasitaire provoque effectivement unemodification du rapport S/V; elle n'est cependant particulièrement sensible qu'auniveau des tissus parasités où elle est comparable à celle intervenant in vitropour des bûchettes inoculées par les champignons. Il serait donc hasardeuxd'attribuer ce type de modification à une réaction de l'hôte.

187

Enfin les résultats de l'observation en microscopie confortent leshypothèses que nous avons proposées au cours des précédents chapitres, à savoir:

-la nature lignolytique des deux champignons;- leur capacité à dégrader l'ensemble des structures pariétales;-leur spécialisation relative respectivement pour les tissus à dominante

ligneuse (R. lignosus) ou à dominante polyosidique (P noxius);

les deux premières caractéristiques découlent de potentialitésqualitativement voisines~ la troisième découle d'une différencequantitative au niveau de leur équipement respectif en enzymesextracellulaires.

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189

CONCLUSION GENERALE

R. lignosus et P noxius sont deux polyporacées polyphages, parasitesfacultatifs d'espèces 1igneuses. L'un et l'autre attaquent l'Hévéa, l'un et l'autredégradent le bois. Cependant ces attaques se traduisent au niveau tissulaire pardes symptômes particuliers à chaque champignon, impliquant, en principe,l'intervention de mécanismes physiologiques et biochimiques spécifiques.

En abordant cette étude, limitée, pour l'essentiel, aux activitésenzymatiques susceptibles de participer à la dégradation des polymères destissus du bois, notre objectif était double:

- vérifier si les deux champignons induisent effectivement dans lestissus de l'hôte une modification de ces activités enzymatiques

- vérifier l'origine de ces activités et déterminer s'il existe unecorrélation entre elles et le type de dégradation effectué par les champignonsin vitro et in vivo.

Enfin, les résultats acquis au cours de ces investigations nous ont amenéà approfondir,les études, d'une part sur l'implication des activités enzymatiquesdans la dégradation de ,certains polymères végétaux et, d'autre part, surl'activité peroxydasique en relation avec les capacités de réaction de l'hôte.

La première partie de ces recherches conduit à plusieurs résultats:* Il existe bien, au niveau des tissus parasités, une perturbation

importante de plusieurs types d'activités enzymatiques: glycosidases,polyosidases, laccase et peroxydase.

* La nature de ces perturbations, mais surtout leur ampl itude estspécifique de chaque parasite. Ainsi, l'attaque par P noxius induit une trèsforte augmentation des activités hydrolytiques (glycosidases et polyosidases),alors que celle de R. lignosus se traduit essentiellement par l'apparition d'~ne

activité laccase très 'intense. On note également, surtout lors de l'infection parR. lignosus, une forte stimulation de l'activité peroxydasique.

* Les études sur: l'excrétion des enzymes par les deux champignons, larépartition spatiale de ces activités au se'in des pivots d'Hévéa, et, finalement,la séparation des isoenzymes par électroohorèse, montrent que, à l'exceptiondes peroxydases, toutes les activités enzymatiques testées ont le parasite pourorigine. En revanche l'accroissement de l'activité peroxydasique correspond àune réaction de l'hôte.

* Concernant les activités enzymatiques attribuées aux parasites, on notesystématiquement, aussi bien in vitro qu'in vivo, la prédominance deshydrolases chez P noxius, des laccases chez R. lignosus

Cet ensemble de résultats nous conduit à conclure que,. théoriquemnt, R.lignosus doit dégrader de manière privilégiée la fraction lignine des parois,alors que P noxius dégraderait plus rapidement la fraction polyosidique. Anoter que, de par sa capacité à excréter des laccases, P noxius doit être

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classé parmi les agents lignivores, tout comme R. lignosus. Enfin, et ceci nousparaît plus fondamental, au plan des processus pathogéniques, le premierdevrait infester plutôt les tissus de type cellulosique, tandis que le seconds'attaquera(t en priorité aux tissus 1ignifiés du xylème.

Ces conclusions reposent sur l'hypothèse selon laquelle les enzymes quenous avons testées sont 'effeètivement capables de ,dégrader les différentspolymères ç1es tissus: en particulier les polyosides et la lignine. Dans l'optiquede notre démarche il était donc essentiel de conforter ces hypothèses.

Les essais réal isés in vitro en ce sens révèlent que les enzymescontenues dans les filtrats de culture de l'un et l'autre champignon détachentdes mono- et oligosaccharides du complexe lignocellulosique naturel préparé àpartir des tissus racinaires de l'Hévéa. Des expérimentations plus àpprofondieseffectuées à l'aide de substrats spécifiques ont mis en évidence la diversité etla richesse des filtrats de culture notamment en polyosidases. Dans ce domaine,et au plan qualitatif. les deux champignons manifestent des aptitudescomparab les.

Enfin des essais ont montré que la laccase L1 purifiée à partir d'un filtratde culture de R. lignosus, est capable à la fois de dépolymériser la lignine etde condenser des fragments de petite taille. Nous en déduisons que pour un agentpathogène, cette enzyme constitue un témoin de son aptitude à dégrader lalignine.'

De façon plus générale, les résultats de tous ces essais démontrent queles enzymes que 'nous avons étudiées sont réellement susceptibles de participerà l'altération des tissus 'de l'hôte et donc de moduler le processus pathogéniquedes champignons.

Les tissus de l'Hévéa ne' constituent pas un substrat inerte pour R.Ii'gnos,us et P noxi'!sJ' la stimulation de l'activité peroxydasique dans lestissus de la zone P~ témoigne au contraire de leurs capacités de réaction. Cettestimulation est tout à fait exceptionnelle au moins à deux titres:

- son 'importance quantitative (l'activité totale peu décupler).- sa relative spécificité: une seule - isoenzyme est, principalement.

concernée par la stimulation. Pour cette isoperoxydase le facteur,de stimulationest considérable (170, 9ans le "meilleur" des cas étudiés) et résulte de labiosynthèse de novo de, la protéine enzymatique. Enfin cette isoenzyme réalisela dernière étape de la biosynthèse de la lignine, elle es.t en effet capable depolymériser l'alccol coniférylique.

Notons également que, comme dans le cas d'àutres couples hôte-parasite,l'augmentation de l'activité peroxydasique est une modification caractéristiquede l'h~te et non du p·arasite. . .' , .' " .

,A .ce stàdè' denos rech'erches il çonvenait,de confronter les hypothèses detravài1 (ba'séés' notârnment sur 'la' ",balance" ènfre àctivités, hydrolytiques etactivité làëcase), àvec la réalité: la nature des a'lférations tissulaires

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effectivement provoquées par les deux agents pathogènes. Cette confrontation aété opérée en deux temps:

- Une première étape a consisté à déterminer, in vitro, la capacité deschampignons à dégrader le bois, notamment la fraction lignine. Les résultatsacquis à ce niveau:

* confirment l'activité ligninolytique des deux champignons ,* mettent en évidence une tendance à la spécialisation de~ parasites: R.

/ignosus pour la fraction lignine des parois, P noxius pour la fractionpolyosidique. Au plan quantitatif les différences entre, les deux champignonssont cependant beaucoup plus limitées que ne le laissaient prévoir les ~onnées

enzymat iques.Enfin ces mêmes essais révèlent une très forte action sur la composition

monomérique de la lignine qui se traduit par une diminution sensible du rapport5/V.

- la seconde étape concerne des essais, réalisés in vivo, sur ladétermination du taux de lignine dans différents types de tissus de pivotsprélevés en plantation.

Les résultats obtenus sur les pivots infectés par R. /ignosus sonthomogènes: dans tous 1es cas on note une alJgmentat ion du taux de 1ignine dansles tissus PF (par rapport à celui des tissus sains) suivie d'une diminution de cetaux dans les tissus anciennement infestés. Une telle;' ~yolution suggèrel'existence, au niveau du front de progression du parasite, d'une zone delignification intense (cette observation est à mettre en relation avecl'accroissement considérable de l'activité peroxydasique à cemême nivea~); elleconfirme également l'activité ligninolytique, in vivo, de R.; I/gnosus.

Les données acquises sur les pivots parasités par P. noxius sont, enrevanche extrèmement variables et ne permettent pas, d'emblée, d'en tirer uneconclusion cohérente; une interprétation possible consiste à admettrel'existence, au sein des populations de P noxius, de souches se distinguant parleur aptitude à dégrader les différents types de polymère. Il en résulterait unedégradation privilégiée de la lignine dans certains cas, de la fractionpolyosidique dans d'autres.

L'existence d'une variabilité au sein des populations des parasitesn'est pas une hypothèse; elle a été démontrée en ce qui concerne le pouvoirpathogène. Par ajlleurs les premiers résultats d'une étude ~es ac~ivités

enzymatiques contenues dans des extraits de bûchettes inoculées avecdifférents isolats 'des champignons ont également mis en évidence une fortevariabilité à ce niveau. Cette expér'imentation n'étant pas achevée, il seraitcependant prématuré d'en tirer une conclusion définitive..

D'autres données ont été acquises in vivo, qui résultent d'observations aumicroscope optique et électronique de coupes de tissus prélevés sur desplantules 'infectées artificiellement. Ces observations révèlent que P noxiusattaque préférentiellement les tissus. du phloème. Ces tissus une fois dégradés,le champignon poursuit son attaque au niveau du. xylème. R. ligno5us, en

. ~.."

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revanche, s'installe très rapidement dans ce dernier. Ces résultats sont donc enaccord avec les hypothèses sur l'influence de la balance entre hydrolases etlaccase sur le processus parasitaire développé respectivement par les deuxchampignons.

Ainsi, alors que la détermination du taux de lignine fournit des donnéesdifficilement interprétables, au contraire, l'étude cytologique conduit à desconc1usisons dénuées d'ambiguité. Cette différence est peut-être liée au.faitque l'analyse chimique (lignines) est réalisée sur des pivots d'arbres adultes, etseulement sur la partie lignifiée de ces pivots (dans de tels pivots le ph10èmene représente qU'une proportion infime des tissus) alors que l'étude cytologiqueest effectuée sur des pivots de jeunes plantules comportant une fractionimportante de tissus de type cellulosique permettant de mettre mieux enévidence le comportement "différentiel" des deux parasites.

En résumé, il apoarait donc bien que le déroulement de la pathogénèse, etplus spécifiquement la phase de colonisation des tissus qui seule a été prise encompte au cours de cette étude, est modulée par l'activité des enzymesexcrétées par 1es paras i tes.

L'observation cytologique a conduit à un autre résultat: la mise enévidence d'une lignification anormale des parois cellulaires au niveau de la zonePF. Au moins en cas d'infection par R. /ignosus, 'il y a ici également accordentre cette observation et les résultats de l'analyse enzymatique (très fortestimulation de l'activité peroxydasique) et ceux de l'analyse du taux de lignine(augmentat ion au niveau des tissus PF).

Nous avons mentionné dans l'avant-propos que l'initiation du programmede recherche répondait, entre autres, à deux préoccupations: l'dentification d'unmarqueur de l'infection et celle d'un marqueur de réaction. On pouvait donc sedemander dans quelle mesure les résultats acquis contr'ibuaient à apporter unesolution à ces préoccupations. .

Concernant le marqueur d'infection. les études ont assez rapidementconduit à la mise au point d'un "test laccase" qui permet de déterminer si untissu est infecté ou sain; seul les tissus infectés (par R. /ignosus, P noxiusou éventue 11 ement un autre agent de pourri ture blanche) f ourn i t LIn test 1accasepositif. Ce test est mis en oeuvre pour vérifier la réussite des inoculationsartificielles, en. particulier aux premiers stades de l'infection alors que lapénétration dans les tissus est encore indécelable. D'autres activitésenzymatiques pourraient jouer un rôle équivalent, elles sont cependant moinsspécifiques, et moins simples à mettre en oeuvre. A noter qu'un "testa-galactosidase" permettrait de plus de distinguer entre P noxius et R./ignosus.

En pratique cet outil ne présente cependant un réel intérêt qu'au niveaudu "laboratoire"; ·en effet les résultats des recherches sur la répartitionspatiale des enzymes dans les pivots montrent que les activités enzymatiquesspécifiques des parasites restent strictement cantonnées dans la zone PF et P.S'agissant d'enzymes solubles, on aurait pu penser, que ces enzymes

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diffuseraient en avant du front de progression des parasites et seraientdétectables, au moins à l'état de traces, dans les tissus sains, en particulierdans ceux du tronc, plus faci 1ement accessibles que ceux des racines. Ceci n'estpas le cas; ces activités ne sont pas même détectables dont le latex dans le fluxdraine une zone importante du tronc (ou des racines, lorsque la saignée estpratiquée au niveau du collet de l'arbre).

Concernant le marqueur de réaction, la stimulation de l'activitéperoxydasique, en particulier celle de l'isoenzyme P2a, démontre clairementl'aptitude de l'Hévéa à réag'ir à l'agression parasitaire; L'accumulation de ligninedans la zone PF en est un autre indice. Ces réactions peuvent-elles êtreassimi 1ées à des réactions de défenses à l'encontre de parasites 1ignivores? Sioui, force est de constater que la 1ignification réactionnelle est inefficace àterme, puisque dans la très grande majorité des cas les parasites poursuiventleur progression intratissu1aire et finissent par tuer l'arbre, Un tel mécanismepourrait néanmoins contribuer à conférer une certaine "tolérance" à l'arbre àcondition qu'il soit induit de 'manière suffisamment précoce pour permettre ..l'édification d'une barrière capable de ralentir la progression des parasite.

Au niveau anatomique, la réaction de l'Hévéa se traduit souvent par'l'hypertrophie des racines latérales, mais également par la néogénèse de tissusde réaction. Ce dernier évènement est fréquent lorsque l'attaque parasitaire estopérée par 5. repens (qui ne détruit que les tissus cortiCaux), rare en casd'infection par R lignosus et inexistant en cas d'atteinte 'parP noxius. Cestissus de réaction, contiennent une activité peroxydasiqueanorma1ementélevée, activité dûe principalement à l'isoenzyme P2a, la même que celle qui setrouve très fortement stimulée dans les tissus PF. ,,,,;.~.~_ .. ,

Une enquête effectuée sur le terrain, a montré qU'enviror)' '1 0% des arbres,dont le pivot était réduit à l'état de moignon, comportaient de tè1s tissu,s. Parailleurs des recencements ont montré qU'au sein d'une population d'Hévéas, uncertain nombre d'individus survivaient à l'attaque parasitaire durant denombreuses années. Un constatation analogue a été faite pour des lots deplantules infectées artificiellement. Il semblerait donc que, statistiquement, 'dans une population, quelques individus soient capables de "mieux" réagir qued'autres. Cette supériol"ité est-elle liée à une aptitude à réagir plus fortementet/ou plus précocément. La "réaction peroxydasique" peut-elle servir d'indiced'une telle aptitude? Est-il envisageable, sur ces bases, soit de selectionner desarbres pour leur tolérance, soit de stimuler les réactions ,des arbres "toutvenant"? Une telle stimulation permettrait-elle de modifier le "rapport desforces" en présence (agression et réaction) dont dépend, en définitive, le devenirde l'arbre: survie ou mort?' Sans doute conviendrait-il de poursuivre lesrecherches dans cette voie afin de répondre à ces questions et ainsi contribuer,parallèlement aux méthodes chimiques de prévention explorées avec succès parl'IRCA, à une toujours meilleure protection de l'Hévéa contre les 'agents depourridiés: R lignosus et P noxius. .

" ..

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Les résultats présentés dans ce mémoire ont fait l'objet des publicationset communications suivantes:

A - Publications:

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GEIGER, J.P.; GOWON, M.; 1977 - Etude de deux peroxydases différentes extraitesdes tissus racinaires d'Hévéa sains et parasités par Leptoporus lignosus(KU Heim. C. R. Aead. Sei. Paris~ Série D~ 284: 1053-1056.

NICOLE, M.; GEIGER, J.P.; NANDRIS, D.; 1982 - Aspects ultrastructuraux de ladégradation du phloème d' Hevea brasiliensis par Rigidoporus lignosus.C. R. Aead. Sei. Paris~ Série III: 471-476.

NICOLE, M.; GEIGER, J.P.; NANDRIS, D.; 1982 - Interactions hôte-parasite entreHevea brasiliensis et les agents de la pourriture racinaire Rigidoporuslignosus et P/7ellinus noxius : étude Physiopathologique comparée.Phytopath. Z.~ 105: 311-326.

GEIGER, J.P.; HUGUENIN, B.; NANDRIS, D.; NICOLE, M.; 1984 - Effect of anextracellular laccase of Rigidoporus lignosus on Hevea brasiliensislignin. Appl. Bfoehem. Bioteehnology (parue).

GEIGER, J.P.; NICOLE, M.; NANDRIS, D. RIO, B.; 1985 - The aggression of Heveabrasiliensis by Rigidoporus lignosus and P/7ellinus noxius : sornebiochemical events. Eur~ J. for. Path. (sous presse).

NICOLE, 1'1.; GEIGER, J.P.; NANDRIS, D.; 1985 - Defense reactions of Heveabrasiliensisto root diseases. Eur. J. for. Path. (sous presse).

GEIGER, J.P.; RIO,B.; NICOLE, M.;- NANDRIS, D.; - Biodegradation of Heveabrasiliensis wood by Rigidoporus lignosus and P/7ellinus noxius. Eur.J. for. Path. (accepté pour pub1ication).

GEIGER, J.P.; NICOLE, 1'1.; NANDRIS, D.; RIO, B.; - Root rot diseases of Heveabrasiliensis. 1- Physiological and biochemical aspects of root aggression.Eur. J. for. Path. (accepté pour publication).

NICOLE, M.; GEIGER, J.P.; NANDRIS D.; - Root rot diseases of Heveabrasiliensis. Il - Some host reactions. Eur. J. for. Path. (accepté pourpub! icat ion).

GEIGER, J.P.; HUGUENIN, B.; RIO, B.; NICOLE, M.; NANDRIS, D. - The laccases ofRigidoporus lignosus and Pel/inus noxius. 1 - Purification and somephysico-chemical properties. Appl. Bioehem. Bioteehnology (accepté pourpub1icat ion).

GEIGER, J.P.; HUGUENIN, B.; NANDRIS, 0:; NICOLE, M.; - The laccases ofRigidoporus lignosusand Pellinus no/dus. Il - Effects on Ci thioglycoliclignin. Appl. Bioehem. Bioteehnology. (accepté pour publication).

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B - Communications et posters présentés à des congrès ou à des colloques:

GEIGER, J.P.; GOWON, M.; 1977 - Effet de l'infection par le pourridié blanc sur lacomposition enzymatique des tissus de l'Hévéa. 13ème Coll. Soc. Fr.Phytopathologie~ (Comm.; résumé: Ann. Phytopathologie, 1978). Paris.

•GEIGER, J.P.; NANDRIS, D.; HUGUENIN, 5.; 1978 - Metabo1 ic changes in Hevea roottissues following infection by Leptoporus 1ignosus. 3rd Int. Congo of PlantPathology, (poster; résumé: proceedings du congrès). Munich.

GEIGER, J.P.; NANDRIS, D.; NICOLE, M.; HUGUENIN, 5.; 1981 - Les pourridiés del'Hévéa. Il - Etude de l'agression du système racinaire de l'Hévéa parRigidoporus lignosus et PIJellinus noxius. Coll. Int. ProtectionCultures Tropicales. (Comm.; résumé: proceedings du colloque). Lyon. '.

NICOLE, M.; GEIGER, J.P.; NANDRIS, D.; HUGUENIN, 5.; 1981 - Les pourridiés del'Hévéa. III Réactions de l'Hévéa à l'infection par Rigidoporus lignosus etPIJellinus noxius. Coll. Int. Protection Cultures Tropicales. (Comm.;résumé: proceedings du colloque). Lyon.

GEIGER, J.P.; HUGUENIN, 5.; 1981 - La peroxydase des tissus racinaires d'Hévéasparasités par Rigidoporus lignosus, origine et rôle physiologiquepotentiel. Coll. Int. Protection Cultures.Tropicales. (Poster; résumé:proceedings du co 11 oque). Lyon.

GEIGER, J.P.; HUGUENI N, 5.; 1981 - Action in vitro d'une laccase purifiée deRigidoporus lignosus sur la lignine d'Hevea brasillensis. Coll. Int.

. Protection Cultures Tropicales. (Poster; résumé:· proceedings duco 11 oque). Lyon.

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GEIGER, J.P.; RIO, B.; NICOLE, M.; NANDRIS, D.; 1984 - Dégradation de la lignined'Hevea brasiliensis par Rigidoporus lignosus'et PIJellinus. noxius.27ème Coll. Soc.' Fr. Phytopathologie (Poster; résumé: Agronomie,1985). Paris.

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Résumé

Rigidoporus lignosus et Phellinus noxius sont deux champignonsparasites des racines de l'Hévéa. Lors de l'attaque parasitaire ils provoquentdans les tissus de l'hôte des modifications considérables de plusieurs activitésenzymatiques, en particulier de celles d'hydrolases (osidases et polyosidases)et de laccases. Ces activités enzymatiques, contenues dans les tissus parasités,correspondent à celles excrétées par les champIgnons en culture pure. In vitro,

\ elles sont capables de dégrader différents polymères 'végétaux, en particulier lecÇ>mplexe llgnocellulosique préparé à partir de sciure de bois d'Hévéa. La laccaseexerce une double action sur la lignine conduIsant soit à la scission, soit à lacondensation du polymère. Il existe un équ'il'ibre entre ces deux réactions.

ln vivo et in vitro, la proportion entre glycosidases et laccase est unecaractéristique de chaque champignon; 11 existe une prédomInance des premièrechez P. noxius, des secondes chez R. lignosus. Cette "balance" influe sur leurcomportement tant saprophytique que parasitaire. Ainsi, in vitro, P. noxilJstend à dégrader plus rapidement la fraction polyosidique que la fraction lignine,alors que R. lignosus tend à dépolymériser prioritairement la lignIne. In vivoces différences de comportement sont encore plus marquées puisque, sur dejeunes plantules infectées artificiellement, P. noxius attaque en priorité lestissus de type cellulosique du phloème, tandis que R. lignoslJs s'installe trèsrapidement dans les tissus lignifiés du xylème. Il existe donc une corrélationétroite entre les potentialités des agents pathogènes en matière d'excrétiond'enzymes et leur comportement parasitaire, au moIns en ce qui concerne laphase d'envahissement des tissus.

L'Hévéa réagit à l'agression parasftaire par une stimulation de l'activitéperoxydasique, exceptionnelle de par son amp11tude (facteur de st imulation égalà 4, en moyenne) et sa spécificité: une seule isoperoxydase est, principalementconcernée (facteur de stimulation égal à 170 dans certains cas).L'accroissement de l'activité peroxydasique résulte d'une néosynthèse de laprotéIne enzymatique. Cette enzyme qui polymérise l'alcool coniféry1fque estsusceptible de participer à la lignification réactionnelle mise en évidence danscertains types de tissus.

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