APPROCHE A LA PHYTOPATHOLOGIE ASSOCIEE A LA …

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU

DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN SCIENCES DE LA VIE

Option : BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE

Présenté par : FALIHERINIAINA Mamy Lalaina

Maître ès-Sciences

Soutenu publiquement ce 13 Mars 2015 devant le Jury composé de :

Président : Professeur RALAMBORANTO Laurence

Examinateurs : Docteur RAZAFINDRAZAKA Vonimanitra

Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina

Encadreurs : Docteur RASAMIRAVAKA Tsiry

Docteur RANDRIANIERENANA Ando

APPROCHE A LA PHYTOPATHOLOGIE ASSOCIEE A

LA GERMINATION IN VITRO DU Theobroma cacao

DE LA VARIETE Criollo

Table des matières

« Tout est possible à celui qui croit »

Marc 9 :23

REMERCIEMENTS

Je rends grâce à Dieu tout puissant qui, par son Eternel Amour et sa Bénédiction me guide chaque

jour et me donne la force pour accomplir ce présent travail.

Nous tenons à exprimer nos vifs remerciements à :

Madame Suzanne RAKOTO-RATSIMAMANGA URVERG. Professeur titulaire de la Faculté

de Médecine et Présidente de la fondation RATSIMAMANGA ;

Au Docteur KIBAN-CHEUK. Directeur du Département Biomédical, Co-promoteur du projet

« Biodiversité et Biotechnologie »au sein de l’IMRA ;

Au Docteur Christian RABEMANANTSOA. Maître de Recherche et coordinateur pour l’IMRA

dans l’unité de Biodiversité, de nous avoir accueillis à bras ouvert au sein de l’Institut

Malgache de Recherches Appliquées.

Au Professeur RALAMBORANTO Laurence. Professeur titulaire en Biochimie Médicale au

Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, qui a bien voulu me faire l’honneur de

présider ce mémoire et d’avoir donné ses précieuses suggestions dans l’amélioration de ce

travail.

Au Docteur RAZAFINDRAZAKA Vonimanitra. Maître de Conférences au Département de

Biochimie Fondamentale et Appliquée et au Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina.

Maître de Conférences et responsable des laboratoires au sein de l’Université ASJA, qui ont

accepté de siéger parmi les membres du jury en tant qu’examinateurs. Leurs

recommandations ont été très indispensables pour l’amélioration de ce travail.

Au Docteur RASAMIRAVAKA Tsiry. Docteur en Médecine et en Sciences de la vie

(Biotechnologie-Microbiologie) et responsable au sein du laboratoire LBM (unité

Biotechnologie), qui a bien voulu accepter de m’encadrer dans ce travail, pour sa

disponibilité, ses conseils et instructions malgré ses occupations et au Docteur

RANDRIANIERENANA Ando. Maître de Conférences et Chef de Département de Biochimie

fondamentale et appliquée, pour ses soutiens, ses remarques et ses suggestions et pour son

temps en dépit de ses lourdes responsabilités. Qu’elle trouve ici l’expression de ma haute

considération.

Nous addressons également nos vives reconnaissances :

A tous les enseignants de la Faculté des Sciences

A tous les personnels du laboratoire Biodiversité IMRA

A Monsieur ANDRIANTAHINARINJAKA D.T de m’avoir encouragé tout au long de ce travail

et aussi de m’avoir aidé à finaliser ce mémoire, qu’il trouve ici le témoignage de ma profonde

tendresse.

A mes parents, mes sœurs pour leur soutien aussi moral, physique que financier.

A tous mes amis de la promotion BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE

Table des matières

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENT

GLOSSAIRE i

LISTE DES ABREVIATIONS ii

LISTE DES TABLEAUX iii

LISTE DES FIGURES iv

INTRODUCTION 1

1ère

PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I : CARACTERISQUES DU THEOBROMA CACAO

I.1 Position systématique 3

I.2 Description botanique 3

I.2.1 Appareil vegetative 5

I.2.1.1 Système racinaire 5

I.2.1.2 La feuille 5

I.2.1.3 Les tiges 5

I.2.2 Appareil reproducteur 5

I.2.2.1 Fleurs et inflorescences 5

I.2.2.2 Fruits et graines 6

I.3 Biologie et écologie 6

I.3.1 Biologie 6

I.3.1.1 Cycle de vie 6

I.3.2 Ecologie 7

I.4 Valeurs nutritionnelles 7

Chapitre II: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO

II.1 Généralités 9

II.2 Principes et bases de la culture in vitro 9

II.3 Milieu de culture 10

II.4 L’hormone de la germination 10

II.5 Acclimatation en serre 10

Chapitre III: LA PHYTOPATHOLOGIE ET LES MICROORGANISMES

ENDOPHYTES

III.1 Généralités sur la phytopathologie 11

III.2 Les principales maladies des cacaoyers 12

Table des matières

III.3 Notions et définitions 13

III.3.1 Endophytes 13

III.4 Mode de transmission des endophytes dans la plante 13

III.5 Relation entre endophytes et phytopathogènes 14

2ème

PARTIE: MATERIELS ET METHODES

Chapitre I: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO

I.1 Matériels 15

I.1.1 Matériels et équipements 15

I.1.2 Matériel biologique 15

I.2 Méthodes 15

I.2.1 Mode de désinfection 15

I.2.2 Préparation du milieu de culture 16

I.2.3 Mode et mise en culture 16

I.2.4 Incubation des cultures et paramètres à étudier 17

I.2.5 Acclimatation 17

Chapitre II: ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE

II.1 Matériels 18

II.1.1 Matériels et équipements 18

II.1.2 Matériel biologique 18

II.2 Méthodes

18

II.2.1 Isolement des germes issus des feuilles malades 18

II.2.1.1 Prétraitement des feuilles 18

II.2.1.2 Isolement proprement dite 19

II.2.1.3 Purification 19

II.2.1.4 Conservation 20

II.2.2 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades 20

II.2.2.1 Etude bactériologique 20

II.2.2.2 Etude mycologique 21

Chapitre III : VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES

(Postulat de Koch)

III.1 Matériels 22

III.1.1 Matériels et équipements 22

III.1.2 Matériel biologique 22

Table des matières

III.2 Méthodes 22

III.2.1 Recherche des germes responsables des maladies diagnostiquées 22

III.2.2 Préparation de l’inoculum 22

III.2.3 Désinfection des feuilles 22

III.2.4 Inoculation des feuilles saines 23

3ème

Partie: RESULTATS, INTERPRETATION, DISCUSSION


I.1 Efficacités de la désinfection 24

I.2 Taux de germination 24

I.3 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des pousses 25

I.4 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des racines 25

I.5 Effets des différentes concentrations de GA sur le nombre de bourgeons

axillaires

26

I.6 Evolution de l’acclimatation 27

Chapitre II : ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE

II.1 Diagnostic des maladies 28

II.2 Isolement des germes issus des feuilles malades 29

II.2.1 Etude bactériologique 29

II.2.2 Etude mycologique 30

II.3 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades 31

II.3.1 Etude bactériologique 31

II.3.2 Etude mycologique 33

Chapitre III: VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES

(Postulat de Koch)

III.1 Inoculation avec les souches bactériennes 34

III.2 Inoculation avec les champignons 35

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 38

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES v

ANNEXES vi

i

Glossaire

GLOSSAIRE

Angiosperme : plante à graine dont l’ovule, fécondé par l’intermédiaire d’un tube

pollinique, se transforme en un fruit clos.

Callogenèse : phénomène de formation d’amas de cellules indifférenciées appelés :

cals lors de l’embryogenèse somatique.

Caulogenèse : désigne à la fois l’initiation et le développement des bourgeons

terminaux, axillaires.

Dicotylédone : plante angiosperme dont la graine possède deux cotylédons

généralement égaux.

Drupe : fruit charnu à noyau.

Nécrose : maladie des plantes caractérisée par un noircissement ou dessèchement.

Rhizogenèse : désigne la néoformation et la croissance des racines

Verruqueuse : qui est de la nature de la verrue ou qui en a l’aspect, dont la surface

présente des excroissances arrondies.

Vivace : se dit d’une plante dont la période de végétation s’étend sur plusieurs années.

ii

Liste des abréviations

Liste des abréviations

Densicheck : Densité Checking

CSS: Cacao Swollen Shoot

ICCO : International CoCoa Organization

IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliquées

McF : Mc Farland

MS : Murashige et Skoog

NA: Nutrient Agar

PDA: Potato Dextrose Agar

UFC : Unité Formant Colonie

G.A : Gibberilline Acid

iii

Liste des tableaux

Liste des tableaux

Tableau 1 Efficacités de la désinfection ............................................................................ 24

Tableau 2 Taux de germination ........................................................................................ 24

Tableau 3 Longueurs de pousse en moyenne ................................................................... 25

Tableau 4 Longueurs des racines en fonction des milieux ............................................... 26

Tableau 5 Nombre de bourgeons axillaires ...................................................................... 27

Tableau 6 Caractères macroscopiques de chaque colonie bactérienne ............................ 31

Tableau 7 Récapitulatif des caractéristiques microscopiques des bactéries isolées ......... 31

Tableau 8 Morphologie et coloration de Gram de chaque bactérie .................................. 32

Tableau 9 Récapitulatif des caractères macroscopiques des champignons isolés ............ 33

iv

Liste des figures

Liste des figures

Figure 1 Pied de Theobroma cacao .................................................................................. 3

Figure 2 Les 3 variétés de Theobroma cacao ................................................................... 4

Figure 3 Principe et base de la culture in vitro ................................................................. 9

Figure 4 Formule développée de l’acide gibbérellique .................................................... 10

Figure 5 Coupe transversale d’une cabosse de Criollo montrant les fèves à l’intérieur . 15

Figure 6 Graine sans mucilage ......................................................................................... 15

Figure 7 Coupe de graine de cacao ................................................................................... 15

Figure 8 Plants de cacao après un mois d’acclimatation .................................................. 27

Figure 9 Symptôme 1 ......................................................................................... 28

Figure 10 Symptôme 2 ......................................................................................... 28

Figure 11 Souches isolées des deux symptômes ............................................................... 29

Figure 12 Souches pures des champignons isolés ............................................................ 30

Figure 13 Feuille inoculée par la souche 1C.AIII

............................................................... 34

Figure 14 Feuille inoculée par la souche 2C.B6 ............................................................... 35

Figure 15 Feuille inoculée par la souche 2C.C7 ............................................................... 35

Figure 16 Feuille inoculée par la souche 1C.A2 ............................................................. 36

Figure 17 Feuille inoculée par la souche 1C.A1 .............................................................. 36

Figure 18 Feuille inoculée par la souche 1C. C4

.............................................................. 37

Introduction

INTRODUCTION

1

Introduction

Si aujourd’hui le cacaoyer est mondialement apprécié pour son fruit appelé cabosse,

à base de chocolat, il faut remonter plus de 4000 ans en arrière pour en retrouver ses origines

et son étymologie, quelque part dans les forêts tropicales d’Amérique Centrale et d’Amazonie

[HUBERT, 1984].

Le cacaoyer a gardé dans son nom scientifique son origine Maya : « Theobroma » qui vient

du latin et signifie « nourriture des Dieux ».

A Madagascar, le premier cacaoyer a été introduit vers les années 1900, c’était des

Criollo, puis environ 10 ou 15 ans plus tard furent introduit les cacaoyers Forastero. Enfin, les

Trinitario, qui au Sambirano, dominent dans les plantations, sont des hydrides de Criollo et

Forastero, très vigoureux et très productifs, ils donnent en plus un produit de qualité. C’est la

particularité de Madagascar, quasi unique au monde d'accueillir ces trois variétés de cacaoyer,

dont la variété « Criollo », très recherchée pour son arôme prononcé et sa faible amertume, le

«Forestero », qui dégage une saveur acide et corsée et le «Trinitario » (hybride, issu du

croisement entre « Forestero » et « Criollo »), au goût fin, a une teneur plus élevée en

matières grasses [Tribune Diego, 2014].

La production cacaotière de Madagascar est assurée par le District d’Ambanja qui est

fortement reconnu pour ses fortes potentialités et son microclimat favorable à la culture du

cacao. Les 2/3 de la production locale sont assurés par les petites exploitations familiales. Les

grandes exploitations, gérées par les opérateurs économiques, contribuent pour le reste. La

culture du cacao tient une place prépondérante dans la vie des petits producteurs car il assure

une source financière régulière [Tribune Diego, 2014].

Historiquement, Madagascar est mondialement reconnu pour sa production de cacao

fin et aromatique. En effet, le cacao malagasy est très recherché par les plus grands maîtres

chocolatiers du monde tant pour son arôme que pour sa couleur. Mais actuellement, ces

critères de qualité tendent à se détériorer progressivement et les acheteurs commencent à se

méfier de nos produits. La renommée de la production cacaotière malagasy entre dans une

phase critique. Il est donc impératif que les producteurs mettent l’accent sur l’amélioration de

leurs techniques pour proposer des produits de qualité supérieure, facilement valorisables sur

le marché international [Tribune Diego, 2014].

Ainsi, le présent travail se consacre sur la relance de la variété Criollo qui est une

meilleure variété de cacaoyer et qui est malheureusement en voie de disparition alors que

c’est avec cette variété que Madagascar a obtenu le label « Cacao fine » de l’Organisation

Internationale du Cacao (ICCO).

2

Introduction

Par ailleurs, étant considéré comme le meilleur cacao du monde, sa reproduction, ou du moins

la relance de la meilleure variété à forte tendance Criollo est un enjeu bénéfique pour

l’économie malgache [Tribune Diego, 2014].

Bien que, la variété Criollo est à forte potentialité organoleptique et aromatique, elle

est fragile et peut être facilement atteinte de n’importe quelle maladie, d’où l’importance

d’une étude phytopathologique dont le but est de diagnostiquer sa maladie et d’identifier par

la suite le ou les pathogènes responsables afin de les maîtriser ultérieurement.

Ce travail a pour objectifs spécifiques :

La multiplication végétative in vitro de la variété Criollo par la méthode de germination

in vitro des fèves de cacao de cette dernière avec une gamme de concentration d’acide

gibbérellique et avec des témoins sans l’hormone. C’est la partie culture in vitro.

L’isolement et identification préliminaire des microorganismes pathogènes.

La vérification de la réapparition des symptômes des maladies bactériennes sur des plantes

apparemment saines : c’est le postulat de Koch qui se fera in vitro.

Pour atteindre ces objectifs, le travail sera structuré de trois grandes parties dont la

première sera consacrée sur la culture in vitro composé de la germination in vitro. Quant à la

deuxième, la partie phytopathologie sera mise en valeur par l’isolement et purification des

germes bactériens et des champignons issus des plantes malades. Et enfin la troisième partie

se consacrera à la vérification de la réapparition des symptômes des maladies sur des plantes

apparemment saines.

Synthèse bibliographique

1

1ère

PARTIE :

SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE


3

Chapitre I : CARACTERISQUES DU Théobroma cacao

I.1 Position systématique : [ALVERSON et al, 1999]

La position systématique du cacaoyer est la suivante :

Règne : VEGETAL

Embranchement : SPERMAPHYTE

Sous-embranchement : ANGIOSPERME

Classe : DICOTYLEDONES

Sous-classe : DILLENIIDAE

Ordre : MALVALES

Famille : STERCULIACEAE

Genre : Théobroma

Espèce : cacao

I.2 Description botanique

Le cacaoyer est un arbre vivace cultivé sur toute la ceinture tropicale pour ses

graines, ou ses fèves qui servent à fabriquer le chocolat. C'est un arbre qui mesure 10 à

15 mètres de haut, généralement taillé à 6 ou 8 mètres [ALVERSON et al, 1999].

Figure 1 : Pied de Theobroma cacao


4

Traditionnellement, les cacaoyers sont répartis en 3 variétés : les Criollo, les Trinitario et

les Forastero:

Variété Criollo

La cabosse est petite et très verruqueuse. L’enveloppe ou mésocarpe est mince et

tendre. La couleur est violet rouge, à maturité avec quelques traces jaunes à l’intérieur des

sillons. Cette variété constitue les premières introduites à Madagascar, leurs fèves sont

dodues, de section presque ronde. Elle fournie un cacao à « casse claire » très recherché pour

son arôme prononcé et sa faible amertume. Actuellement, la variété n’est représentée que par

quelques pieds très vieux et correspondent à moins de 5% de la production mondiale

[ZEFOUO M.A.L, 2011].

Variété Trinitario [ZEFOUO M.A.L, 2011]

La variété Trinitario est issue d’un croisement entre le Criollo et le Forastero. Les

Trinitario ont de grosse cabosse, verruqueuse allongée. Les couleurs varient sur le fruit, le

plus souvent la partie supérieure est violet-rouge, puis rouge-jaune et la pointe verte très claire

avec quelques traces violettes. Le croisement combine la rusticité des premières variétés avec

les arômes fins mais moins intenses des seconds. Elles produisent un cacao de qualité

intermédiaire. C’est la forte proportion de ce type Trinitario (70%) qui dicte la réputation fine

et aromatique du cacao malagasy vue la disparition petit à petit de la variété Criollo.

Variété Forastero [ZEFOUO M.A.L, 2011]

Leur cabosse est peu allongée et parfois ronde, elle n’est pas verruqueuse, elle est de

couleur verte ou vert pâle et devient jaune à maturité. Leur mésocarpe est très dur. Ces

cabosses présentent une surface lisse, ces fèves sont plus ou moins aplaties. Elle donne un

cacao de saveur relativement amère et de goût souvent acide. La variété Forastero est très

appréciée par les producteurs du Sambirano du fait de leur rusticité et de leur productivité

élevée par rapport aux deux autres groupes. Cette variété est le plus productif et très résistant.

Figure 2 : Les 3 variétés de Theobroma cacao :

A :Criollo ; B :Trinitario ;C : Forastero

A

B

C


5

I.2.1 Appareil végétatif [RANDRIANANDRASANA Z. 2014]

I.2.1.1. Système racinaire

Le cacaoyer possède des racines pivotantes et traçantes. Ces racines aident le cacaoyer à

se fixer profondément dans le sol ainsi qu’à puiser l’eau nécessaire pour son développement.

I.2.1.2. La feuille

Le cacaoyer porte un feuillage persistant sur les branches situées au sommet de son

tronc. Les jeunes feuilles sont rougeâtres et tendres ; lorsque ces jeunes feuilles atteignent

l’âge adulte, elles sont épaisses, brillantes et coriaces, d'une longueur moyenne de 30 cm et

d’une couleur vert foncé.

Chaque feuille est portée par un pétiole de 3 à 7 cm, leur limbe est entier et nervuré. Ces

feuilles sont alternes : disposées de chaque côté de la tige à des hauteurs différents : chaque

nœuds ne portant qu’une seule feuille.

I.2.1.3. Les tiges

Les graines germent très rapidement après leur extraction des cabosses et arrivent vite à

maturité et lorsqu’elles ont été mises dans des conditions favorables d’humidité. La croissance

de la tige se poursuit ensuite verticalement, avec une émission régulière de feuilles allongées.

La tige principale, dont la croissance est donc définie, différencie 3 à 5 bourgeons axillaires

qui donnent naissance à une couronne formée de branches plagiotropes et dorsiventrales, avec

des feuilles alternes à pétiole court et une phylotaxie 1/2.

I.2.2. Appareil reproducteur [ZEFOUO M.A.L, 2011]

I.2.2.1. Fleurs et inflorescences

Les fleurs sont reparties sur des coussinets floraux et regroupées en inflorescence sur

le tronc. Sur ces coussinets, il peut y avoir à la fois des fleurs et des fruits (le fruit à ce stade

est appelé : « chérelle ». Un coussinet floral chez le cacaoyer porte beaucoup de boutons

floraux (rosâtres au départ et vire au blanc après) dont un bouton floral mesure 3 à 5mm. Une

coupe longitudinale d’un bouton floral montre l’appareil reproducteur femelle (gynécée) et

les staminodes (étamines).

Une fleur de cacaoyer se compose de 5 sépales, 5 pétales, un androcée composée de 5

étamines, 5 staminodes.

La pollinisation doit obligatoirement être réalisée par les insectes (entomophile) non

seulement parce que les anthères qui portent ce pollen sont abritées sous les cuculles mais


6

également parce que ce pollen est gluant et forme des amas difficilement transportables par le

vent.

I.2.2.2. Fruits et graines

Considéré comme une drupe, le fruit du cacaoyer est communément appelé « chérelle

» pendant la durée de sa croissance, puis « cabosse » lorsqu’il atteint la maturité après cinq à

six mois selon ses origines. Le fruit est indéhiscent et sa taille varie de 10 à 30 cm de

longueur. De forme allongée, il possède 5 à 10 sillons longitudinaux plus ou moins marqués et

régulièrement espacés longeant la cabosse d’une extrémité à l’autre. La surface du fruit peut

être parfaitement lisse ou, au contraire, très verruqueuse. Sa couleur varie de vert à rouge pour

jeune fruit [ZEFOUO M.A.L, 2011]. La cabosse contient entre 20 à 60 fèves de forme ovoïde

de 2 à 4 cm de long alignées sur cinq rangées, c’est l’organe principalement attaqué par les

Phytophtora.

La cabosse renferme à maturité une quarantaine de graines à la forme comparable à

celle d’une amande plus ou moins bombée, communément appelées fèves, logées dans une

pulpe mucilagineuse. Si l’on débarrasse la graine de la pulpe blanche sucrée et acidulée qui

l’entoure, elle apparaît revêtue d’une enveloppe mince, de couleur rosée, fortement nervurée,

provenant des téguments de l’ovule. Cette enveloppe constitue la coque de la fève de cacao.

A maturité, les fèves fraîches représentent jusqu'à 25% du poids du fruit.

I.3 Biologie et écologie [RANIAVOSON L.B, 2009]

I.3.1. Biologie

I.3.1.1. Cycle de vie

Phase de germination

Cette phase peut durer en moyenne une à 2 semaines environ. 4 à 6 jours après le

semi, la racine et l'hypocotyle (partie de l'axe de la plantule qui se trouve entre la racine et les

cotylédons) sont déjà bien développés. 6 à 8 jours : l’hypocotyle (lorsqu’il grandit) va pousser

les cotylédons hors du sol et les amener à l’air libre et à la lumière. 8 à 10 jours : la première

paire de feuille apparaisse.

Phase de croissance

Dans les conditions favorables, la croissance se caractérise par l'ouverture des deux

cotylédons d'une jeune plantule de cacaoyer et qui laisse apparaître la tigelle (axe épicotylé)

qui prolonge l'hypocotyle. Cette tigelle se transforme en tige où se développent les premières

feuilles dix à quinze jours après la germination. C'est un bourgeon terminal, situé au sommet

du jeune plant de cacaoyer, qui permet la croissance par poussées successives de l’axe vertical


7

dit axe "orthotrope" (appelé aussi tige).

La croissance de la tige n’est pas continue, elle s’interrompt environ un an et demi

après le semi. On parle de croissance définie. Le bourgeon terminal cesse son activité et est

remplacé par une vague de 5 bourgeons qui vont donner chacun naissance à un rameau plus

ou moins horizontal dit axe plagiotrope, et une couronne va se développer.

Cette jeune plantule sera considérée comme adulte après une quinzaine à une vingtaine

d’année.

Phase de floraison

La phase de floraison se produit dès la 4ème

année de plantation pour les semis.

Phase de production

A compter de la formation de fleur, la maturité de cabosse est entre 150 à 180 jours.

I.3.2. Ecologie

Exigence édaphique

Le sol doit assurer une bonne rétention en eau et doit permettre une aération ainsi

qu’un drainage correct. Un sol à texture argilo-sableuse est idéal et un teneur en matière

organique élevé est essentiel voir obligatoire pour un bon développement de la plante.

Une jeune plantule de cacaoyer a besoin d’un ombrage provisoire : ne laissant passer

que 50 % de lumière totale.

Exigence climatique

La culture des cacaoyers nécessite des températures élevées dont la moyenne

(l’optimale) est de 25°C, la minimale est de 10°C.

Le cacaoyer a une hygrométrie constamment élevée. Les précipitations doivent être

ainsi abondantes dont la moyenne annuelle est de l’ordre de 1500 à 2000 mm, et ces

précipitations doivent être bien réparties tout au long de l’année. Le taux d’humidité optimale

est de 85%.

Les périodes sèches, moins de 100 mm de pluie par mois, ne doivent jamais excéder

de 3 mois.

I.4 Valeurs nutritionnelles [www.consoglobe.com]

Le cacaoyer est cultivé pour ses fèves dont on extrait le cacao et le beurre servant à

fabriquer du chocolat. [HUBERT, 1984].


8

Le chocolat est reconstituant et énergétique :

• 100 g de chocolat noir peuvent apporter 520 kcals.

• 100 g de chocolat au lait apportent 540 kcals.

Le chocolat noir est riche en magnésium et apporte du fer tandis que le chocolat au

lait, il est riche en phosphore et apporte du calcium, du potassium ainsi que du sodium.

Le chocolat contient de la théobromine et de la caféine qui lui confèrent ses propriétés

toniques et stimulantes.

Le chocolat est également un antidépresseur car certains de ses composants ont un

effet euphorisant, crée un état de bien-être et une meilleure résistance à la douleur. Il est un

puissant protecteur des dommages oxydatifs (comme le vieillissement).

Il participe à l’élimination du cholestérol, prévient aussi l’athérosclérose.

Il constitue une source importante de minéraux majeurs, d’oligoéléments, contient des

fibres, participe à l’élimination des calculs biliaires et constitue une source équilibrée de

vitamine.


9

Chapitre II: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO

II.1 Généralités

De nos jours, la culture in vitro est en pleine expansion et constitue une belle

application de la biotechnologie. Elle est basée sur la mise en culture d’un explant dans un

milieu artificiel contrôlé. Elle est spécifique chez toutes les cellules végétales en raison de leur

totipotence [NOVELLO C, 2005].

Les cellules végétales possèdent l’aptitude à la dédifférenciation (lorsqu’elles sont

soumises à des conditions telles : la culture des cellules en milieu artificiel, en additionnant

des activateurs de croissance) et à la régénération d’un individu : c’est la totipotence.

La culture in vitro a pour but de :

- Préserver ou sauvegarder les espèces rares en voie de disparition

- Faire une multiplication à grand nombre

- Améliorer les variétés végétales (par clonage)

II.2 Principes et bases de la culture in vitro

A partir d’une plante donneuse, la partie qui sera mise en culture est extraite et conditionnée

L’organogenèse est la base fondamentale d’une multiplication végétative. Il est dit

direct si en partant d’un explant, il aboutit à la formation d’un individu par l’élaboration de

tige et bourgeon (caulogenèse et phylogenèse) et de racine (rhizogenèse).

Il est dit indirect si la régénération passe par un stade de cal.

Figure 3: Principe et base de la culture in vitro [NOVELLO C, 2005]


10

II.3 Milieu de culture [NOVELLO C, 2005]

En culture in vitro, il y a différents types de milieu :

Le milieu carotte

Le milieu MS (Murashige et Skoog) : milieu de base de la plupart des cultures in vitro.

Le milieu MS-H : milieu MS mais sans hormone.

Le milieu MS/4 : milieu MS contenant 4 fois plus d’hormone.

II.4 .L’hormone de la germination

La gibbérelline (issue de Gibberella fujikuroi) est une famille de phytohormones. Le

composé actif est appelé acide gibbérellique. Les Gibbérillines sont souvent nommées G ou

GA. Elle fut mise en évidence pour la première fois en 1926, chez Gibberella fujikuroi

(Ascomycète parasite du riz qui allonge exagérément les tiges) par le phytopathologiste Eiichi

Kurosawa.

L’acide gibbérellique contribue à la levée de dormance des graines.

II.5 Acclimatation en serre

L’acclimatation est la dernière étape de la micropropagation in vitro et elle détermine

en partie la qualité finale de l’explant.

Les plants qui ont bien développé des appareils racinaires et aériens bien distingués

sont concernés par l’acclimatation. Ces plants sont transplantés dans des poches pour

pépinière contenants des terreaux stériles imbibés d’eau jusqu’à saturation. C’est la partie

racinaire qui est enfoncée dans la terre jusqu’au niveau du collet.

Pour maintenir les conditions de cultures in vitro, une solution nutritive contenant de la

vitamine ainsi que des hormones de croissances sont apportées une fois par semaine.

Figure 4: Formule développée de l'acide gibbérellique


11

Chapitre III: LA PHYTOPATHOLOGIE ET LES MICROORGANISMES

ENDOPHYTES

III.1 Généralités sur la phytopathologie

La phytopathologie est définie comme l’étude des maladies des plantes au cours de

leur croissance mais aussi des altérations des produits végétaux. Les données biologiques de

n’importe quelle plante malade sont très importantes car une maladie peut être causée par une

rupture de l’équilibre physiologique et se manifester par un ensemble de modification

(anatomique, physiologique et métabolique) [MICHEL L, 2000].

D’habitude, les végétaux ont un pH acide et on sait que les champignons vivent en

milieu acide aussi alors que la plupart des bactéries vivent en milieu basique, ceci nous pousse

à croire que les parasites sont généralement des champignons et que la phytopathologie est

l’étude des champignons pathogènes [MICHEL L, 2000].

Parmi les différents types de maladies, on distingue les maladies non parasitaires ou

maladies abiotiques. Parmi celles-ci on a :

Les facteurs environnementaux tels la température, la pluie (en excès ou en

sécheresse), le vent, les polluants, l’humidité relative, etc.…

Les pratiques culturales : choix du site (incluant le non-respect de la rotation de

culture), la fertilisation, l’irrigation, le sol (pH et salinité), le drainage, etc.…

Les maladies physiologiques qui sont des troubles de fonctionnement causés par une

ou plusieurs carences en sels minéraux.

A part les maladies abiotiques, on distingue également les maladies parasitaires ou

maladies biotiques.

Selon l’American Phytopathological Society :

50 à 65% sont des maladies fongiques

10 à 20% virales

5 à 10% bactérienne et

1 à 2% sont dues aux phanérogames [MICHEL L, 2000].

Le cacaoyer est une plante endémique du bassin Amazonien et de l’Amérique centrale

[WHITLOCK B. et al, 2001]. Il est actuellement cultivé sur plus de cinq millions d’hectares à

travers le monde. C’est ce déplacement du cacaoyer de son centre d’origine qui l’a exposé à

de nombreux pathogènes opportunistes des hôtes indigènes.


12

Fulton, en 1989 annonça que l’environnement de croissance du cacaoyer est

généralement confiné, humide, ombragé, qui sont des conditions extrêmement favorables aux

développements des agents pathogènes.

Or ces différentes maladies sont responsables de la perte d’environ 50% de la

production au niveau mondial.

III.2 Les principales maladies du cacaoyer

La pourriture brune des cabosses : est la maladie courante du cacao du niveau dont

l’agent responsable est un Oomycète du genre Phytophthora provoque des dégâts pouvant

s’élever à 90 ou 100% de perte de la production en fonction des zones de culture, du

génotype, de la souche pathogène et des conditions environnementales.

La pourriture brune se manifeste par l’apparition de lésions brunes sur les fruits et un

revêtement sporifère au bout d’une semaine d’infection [FLOOD J et al, 2003].

Le balai de sorcière : est causé par un champignon, Monioliophthora perniciosa , c’est

une maladie répandue dans les Caraïbes et en Amérique du Sud. Le pathogène infecte les

tissus méristématiques, ce qui provoque la prolifération anarchique des rameaux, des

coussinets floraux et des fruits. Les cabosses sont peu développées et pourrissent sur l’arbre

avant maturité [FLOOD J et al,2003].

La moniliose : est causée par un champignon : Monioliophthora roreri, originaire des

pays Andins. Dans les conditions naturelles, la moniliose affecte uniquement les cabosses.

Les fruits infectés présentent des fèves nécrosées et compactes. Elle est responsable de la mort

et la chute des feuilles, la mort des rameaux, puis de l’arbre entier [SCHAAD N.W, 2001].

Le cacao swollen shoot : le CSS est la principale maladie virale connue chez le

cacaoyer. L’agent responsable est le « cacao swollen shoot virus » appelé également virus du

gonflement des tiges de cacaoyer.

Les principaux ravageurs et insectes : le cacaoyer étant une espèce très sensible aux

insectes surtout les piqueurs (les mirides) qui attaquent les jeunes pousses et les cabosses.


13

Heureusement, la plantation de cacao à Madagascar n’est touchée que par la maladie

de pourriture brune de la cabosse [TAYLOR et al, 2008].

III.3 Notions et définitions [RAJAONARIVELO A.J.P, 2006]

III.3.1 Endophytes

Les endophytes doivent s’adapter aux conditions de l’environnement internes

(physiologie, biochimie,…) une fois qu’ils sont à l’intérieur des tissus de plante. Toutefois,

leur développement dépend de deux facteurs : de la plante hôte et de son degré de virulence.

Il existe différentes possibilités d’interaction entre l’endophyte et leur hôte :

Les endophytes pathogènes latents

Les endophytes pathogènes latents sont des parasites, qui après transmission dans

l’hôte ne sont pas virulents dans l’immédiat, donc ne causent pas de symptômes

apparents, on peut dire qu’ils sont encore en phase de latence prolongée.

Au moment où le comportement de la plante hôte change, les endophytes pathogènes

latents deviennent ensuite virulents.

Les endophytes symbiotiques

Les endophytes symbiotiques ne sont pas virulents et ne causent pas de symptômes

apparents. Son interaction avec la plante hôte est bénéfique dans les deux sens : ils

soutirent de la plante hôte tous les éléments nutritifs dont ils ont besoin et par ailleurs ils

offrent à leur hôte une protection contre les parasites.

Les endophytes commensaux

La plante leur sert d’abri (gite) pour s’échapper aux différents prédateurs. Ils passent la

quasi-totalité de son cycle de vie dans leur hôte sans pour autant les endommagés.

III.4 Mode de transmission des endophytes dans la plante [RAJAONARIVELO

A.J.P,2006]

Il existe deux types de transmission pour les endophytes :

La transmission verticale

Les endophytes sont initialement contenus dans la graine et se retrouveront plus tard

dans les différentes parties de la plante après la germination (cas de transmission de

certains Ascomycètes notamment dans le genre Claviceps, endophytes d'herbe).


14

La transmission horizontale

Les spores de champignons emportés par le vent ou la pluie se déposent sur les parties

aériennes (tiges et feuilles) et les racines de la plante, ils vont pénétrer à travers les

stomates et envahissent finalement l’intérieur de la plante (cas des endophytes du

cacaoyer).

III.5 Relations entre endophytes et phytopathogènes [RAJAONARIVELO A.J.P,2006]

Historiquement, les endophytes ont été considérés comme des phytopathogènes peu

virulents.

Les pathogènes latents, les endophytes symbiotiques et les phytopathogènes ont été

confondus et le sont encore quelques fois puisque des points communs existent entre eux tels

le mode de transmission ainsi que le mode de colonisation de la plante.

Or, les vrais pathogènes sont des espèces distinctes des parasites (infectant un mauvais

hôte). Ils sont souvent spécifiques ou apparentés d’une espèce ou d’un genre de plante qu’ils

infectent.

Il existe deux types de pathogènes de plantes :

les pathogènes virulents : causant des maladies sévères pouvant entraîner la mort de

leur hôte et se nourrissent des matières mortes : les champignons nécrotrophes;

les pathogènes non agressifs : causant des symptômes légers, pouvant vivre dans la

plante lorsqu'elle est en vie : les champignons biotrophes.

Matériels et méthodes

2ème

PARTIE :

MATERIELS ET

METHODES


15

Chapitre I : ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO

I.1 Matériels

I.1.1 Matériels et équipements

Les verreries, les équipements et les réactifs utilisés lors du travail sont cités

dans l’annexe I.

I.1.2 Matériel biologique

Deux cabosses de la variété Criollo provenant d’Ambanja ont été utilisées.

Chaque cabosse contenait 25fèves.

I.2 Méthodes

I.2.1 Mode de désinfection

Dans chaque cabosse, 25 fèves ont été retenues. On a alors 50 graines à désinfecter :

1ère

étape de la désinfection

Passage des 50 graines dans de l’eau distillée stérile ajoutée d’une petite quantité de

tween. Cette première étape de désinfection dure 20 minutes et doit être effectuées sous hotte

à flux laminaire autour de la flamme d’un bec Bunsen et dans la zone aseptique de travail.

Coque

Cotylédon

Figure 6: Graine sans mucilage Figure 7 : Coupe de graine de cacao

Cabosse

Fèves entourés

de mucilage

Figure 5 : Coupe transversale d’une cabosse de Criollo montrant les fèves à l’intérieur


16

2ème


Les 50 graines dans l’eau distillée stérile additionné de tween ont été transvasées dans

l’hypochlorite de calcium pendant 10 minutes.

3ème


Après passage dans l’hypochlorite de Calcium, les graines ont été rincées dans de

l’eau distillée stérile 03 fois dont chaque rinçage dure 05 minutes.

L’eau distillée qui sert à la préparation des solutions désinfectantes et de rinçage, les

verreries nécessaires sous hotte et les pinces ont été stérilisées à l’autoclave à une température

de 120 ° C sous une pression de 1bar pendant 20 minutes.

I.2.2 Préparation du milieu de culture

La solution mère des macroéléments est préparée en avance, elle est nommée Stock1.

Le stock2 contient les microéléments, le stock3 regroupe les apports en fer.

Les solutions mères (macro et micro) peuvent être conservées plusieurs semaines dans

un réfrigérateur, c’est pourquoi elles sont préparées à l’avance. De même, les régulateurs de

croissance, le fer chélaté, les vitamines sont aussi conservées à basse température.

Les stocks et la composition du milieu MS et MS/2 sont détaillés en annexe II.

I.2.3 Mode et mise en culture

Les graines désinfectées ont été ensuite mises en culture en raison d’une graine par

tube, dans différents types de milieu de culture dont 10 tubes de verre contenant des milieux

MS/2 comme témoin.

Une gamme de concentration d’acide gibbérellique a été entamé allant de 0,5ml/l

jusqu’à 2ml/L (0,5ml/l ; 1ml/l ; 1,5ml/l et 2ml/l).

Chaque concentration possède 10 répétitions en tubes de verre et chaque tube contient

du milieu MS/2 comme milieu de base.

Toutes les étapes de la germination telle la levée, le développement de l’hypocotyle,

l’apparition du premier feuillage, l’ouverture des cotylédons, l’apparition de la tigelle,

l’apparition des bourgeons et les autres paires de feuille ont été notées tous les 5 jours.

La mise en culture est donc notée J-0.


17

I.2.4 Incubation des cultures et paramètres à étudier

Les cultures ont été incubées dans une chambre de croissance (salle de culture)

maintenue à 25°C sous un éclairement de 2000 Lux pendant 16h.

Les paramètres à étudier sont :

Le taux de germination en MS/2 seul et MS+H

La longueur de pousse, le nombre de bourgeons axillaires et la longueur de la racine.

I.2.5 Acclimatation

But

Le but est de soumettre les explants aux conditions externes pour le postulat de Koch.

Principe

Les plants qui ont développés des appareils racinaires et aériens bien individualisés ont

été transférés dans un pot contenant des substrats naturels.

Mode opératoire

Le terreau en sachet a été stérilisé 2 fois et a été laissé refroidir pendant 24 heures.

Ensuite, le terreau a été distribué dans 22 poches pour pépinière. Les plants ont été retirés du

tube un à un. Chaque racine a été lavée à l’eau pour enlever les débris. La partie racinaire est

enfoncée dans la terre jusqu’à hauteur du collet. Les petits sachets contenant la culture ont été

regroupés dans des bacs contenant de l’eau stérile. Ces bacs ont été recouverts par des caches

en plastique pour maintenir l’humidité.

Les plants ont été arrosés abondamment à l’eau du robinet stérile contenant de la

vitamine et de la kinétine chaque matin.


18

Chapitre II : ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE

II.1 Matériels

II.1.1 Matériels et équipements

Les verreries, les équipements et les réactifs utilisés lors du travail sont

cités dans l’annexe I.

II.1.2 Matériels biologiques

Feuilles de cacaoyer présentant deux symptômes différents.

II.2 Méthodes

II.2.1 Isolement des germes issus des feuilles malades

II.2.1.1 Prétraitement des feuilles

But

La désinfection a pour but d’éliminer tous les microorganismes épiphytes qui ne sont

pas nécessaires.

Principe

Il s’agit d’éliminer les microorganismes présents en surface par deux sortes de

désinfectants les moins sévères tels l’hypochlorite de sodium et de l’alcool éthylique 70°. Ils

vont juste tuer les microorganismes en surface sans pour autant toucher les endophytes.

Mode opératoire

La technique de désinfection utilisée ici est celle que l’on utilise au sein du

laboratoire de phytopathologie de l’IMRA.

Les échantillons présentant différents symptômes sont traités séparément mais le mode

de désinfection est le même.

Chaque feuille a été lavée à l’eau du robinet. Ensuite, sous la hotte à flux laminaire et

dans la zone aseptique chaque feuille a été trempée dans de l’eau de Javel à 2% pendant 10

minutes, puis, rincée dans de l’eau distillée stérile 3 fois pendant 5 minutes chacune.


19

II.2.1.2 Isolement proprement dite

But

L’isolement est une technique qui permet de séparer les microorganismes d’un

échantillon et d’obtenir des colonies différentes espacées les unes des autres.

Principe

On cherche à isoler les différentes cellules de l’échantillon. Chaque souche isolée étant

alors susceptible de conduire à une colonie.

Mode opératoire

Sous la hotte à flux laminaire et autour de la flamme du bec Bunsen, les feuilles

présentant les symptômes et désinfectées précédemment ont été découpées en petit carré à

l’aide d’un ciseau stérile. Une partie (8 morceaux par BP) est déposé sur une gélose nutritive

(NA dont la composition est detaillée en ANNEXE II) additionnée d’antifongique

(cyclohexemide à 50mg/L) et une autre partie est déposée sur un autre milieu : le milieu PDA

(composition en ANNEXE II) additionnée d’antibactérien (chloramphénicol à 200mg/L).

Les boîtes ont été ensuite incubées à 25°C pour les champignons pendant 5 jours et à

37°C pour les bactéries pendant 48 heures.

Une vérification du procédé de désinfection a été faite dans le but de savoir si la

désinfection effectuée était efficace ou pas. Pour s’y faire, 100µl de chaque dernière eau de

rinçage ont été ensemencées en nappe sur milieu de culture NA sans antibiotique.

Les cultures ont été observées tous les jours et les souches bactériennes qui émergent

les explants ont été transférées sur NA stérile sans antifongique. La même procédure a été

effectuée pour les champignons mais sur milieu PDA.

Le nombre de différentes souches isolées et purifiées pour chaque explant malade a été

noté.

II.2.1.3 Purification

But

La purification consiste à séparer les souches microbiennes. Elle nécessite au préalable

la caractérisation précise d’une colonie déjà isolée que l’on veut purifier.

Principe

Chaque colonie isolée est repiquée sur un autre milieu jusqu’à obtention d’une seule

colonie dans la boite identique à celle du départ.


20

Pour la purification, les souches ont été repiquées toutes les 24 heures sur de nouveaux

milieux :

milieu NA stériles sans antifongique pour les bactéries ;

milieux PDA sans antibiotique pour les champignons jusqu’à obtention de souche

pure (un seul type de colonies dans chaque boîte).

II.2.1.4 Conservation

La conservation des souches pures est indispensable car elles peuvent être utiles pour

d’autres études comme l’identification ou pour améliorer une recherche faite auparavant, ou

encore elles seront utilisées pour constituer des souches de référence.

Il existe de nombreuses méthodes de conservation comme la congélation à très basse

température avec l’utilisation de cryoprotecteur, la lyophilisation mais nous avons choisi la

conservation–20°C au congélateur dans des cryotubes contenant du glycérol.

II.2.2 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades

II.2.2.1 Etude bactériologique

Observation macroscopique

La première étape a été la caractérisation macroscopique des différentes colonies pures

isolées.

A partir d’une souche jeune de 24 heures : la couleur, la taille, la consistance, l’allure

du contour, l’aspect de leur surface, le relief et la transparence de chaque colonie ont été

observés puis notés.

Test à l’état frais

But :

Le but est de voir la mobilité ainsi que le mode de groupement des cellules

microbiennes.

Principe :

Les cellules fixées par de l’eau distillée stérile sont observées au microscope optique

avec un grossissement 400x.

Mode opératoire

Une goutte d’eau distillée est déposée sur une lame, une petite quantité de souche pure

est prélevée puis étalée de façon spirale sur la lame et le tout est recouvert d’une lamelle.


21

Enfin, la préparation a été montée sur microscope optique à fort grossissement.

Le mode de groupement ainsi que la mobilité de chaque bactérie ont été observés puis

notés.

Coloration GRAM

But

Le but est l’identification de chaque espèce bactérienne : gram+ ou gram-.

Principe

Les bactéries à Gram+ gardent la coloration violette après décoloration par l’alcool-

acétone. Les bactéries à Gram- décolorées par l’alcool-acétone, teintées par la Fushine

apparaissent rose ou fushia au microscope optique.

Mode opératoire

La troisième étape a été la coloration de Gram. A partir de la même souche jeune de

24 heures de chaque type de bactérie, une colonie isolée a été prélevée et étalée sur une lame

puis fixée par séchage sur une plaque chauffante.

Le frottis a été recouvert avec du violet de Gentiane durant une minute puis avec du

lugol pendant 30secondes. Il a été ensuite décoloré avec de l’alcool/acétone et rincé à l’eau de

robinet puis chaque extrémité est couverte par de la Fuschine pendant une minute.

La lame a été lavée à l’eau de robinet puis séchée sur plaque chauffante et observée au

microscope optique.

La forme et la couleur de la bactérie ont été notées.

II.2.2.2 Etude mycologique


Dans le cas des mycètes, l’observation macroscopique se base sur la texture de chaque

colonie, la topographie, la couleur de la surface ainsi que du revers et la vitesse de croissance.

Ces critères d’observations ont été notés.


22

Chapitre III : VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES

(Postulat de Koch)

III.1 Matériels

III.1.1 Matériels et équipements

Les verreries, les équipements et les réactifs utilisés lors du travail sont

cités dans l’annexe I.

III.1.2 Matériels biologiques

Les feuilles saines provenant de l’acclimatation ont été utilisées pour le

Postulat de Koch

III.2 Méthodes

III.2.1 Recherche des germes responsables des maladies diagnostiquées

But

Le Postulat de Koch a pour but de confirmer les symptômes diagnostiqués

précédemment et de connaitre le ou les germes responsables de ces symptômes diagnostiqués

afin de continuer leur identification.

Principe

Le postulat de Koch consiste à inoculer tous les germes issus de l’isolement effectué

précédemment, un à un que ce soit bactéries ou champignons. L’évolution de l’apparition des

symptômes confirmera le responsable de la maladie et la persistance du symptôme.

III.2.2 Préparation de l’inoculum

A partir d’une culture jeune de 24h de chaque souche bactérienne, une suspension

bactérienne de 108 UFC équivaut à 0,5 Mcf a été préparée par le biais d’un densicheck.

III.2.3 Désinfection des feuilles

Des feuilles isolées de la variété Criollo issue de l’acclimatation d’apparence saine ont

été trempées dans de l’alcool éthylique dénaturé 70% puis elles ont été rincées deux fois avec

de l’eau distillée stérile puis séchées une fois avec du papier filtre stérile.


23

III.2.4 Inoculation des feuilles saines

Ces feuilles isolées ont été inoculées avec une suspension de chaque souche

bactérienne à l’aide d’écouvillons stériles. Ces feuilles ont été déjà écrasées à l’aide de l’oese.

Les feuilles ainsi inoculées ont été placées dans des boîtes de Pétri contenant des

billes de verre baignant dans de l’eau distillée stérile.

Quant aux champignons, des découpes de jeune mycélium sont déposés sur l’extrémité

inférieure et supérieure du limbe.

Un lot de feuille témoin sans inoculation est aussi préparé. Deux répétitions ont été

réalisées. Les boîtes ont été incubées sous lumière blanche continue et à une température de

25°C. Des observations ont été faites tous les 05 jours.

Résultats, Interprétation, Discussion

3ème

PARTIE:

RESULTATS,

INTERPRETATION,

DISCUSSION

24

Résultats, interprétation, discussion


I.1 Efficacité de la désinfection

La désinfection est dite efficace lorsqu’il y a peu de graines contaminées par des

bactéries ou des champignons.

L’efficacité de la désinfection est notée en pourcentage et présentée dans le tableau 1.

Tableau 1: Efficacité de la désinfection

Nombres total de grains Nombres de graines

contaminés

Nombre de graines non

contaminés

50 10 40

La technique de désinfection est efficace jusqu’à 80%. La méthode adoptée a pu

éliminer les microorganismes épiphytes contenus sur les fèves.

La condition d’asepsie a été respectée.

I.2 Le taux de la germination

L’étude des taux de germination permet de déterminer le rôle de l’hormone sur la

germination. Ces différents taux sont présentés dans le tableau 2, selon la concentration en

hormone utilisée.

Tableau 2: Taux de germination

Types de milieu MS/2 seul MS/2+GA[0,5] MS/2+GA[1] MS/2+GA[1,5] MS/2+GA[2]

Taux de germination

en %

100 77,7 85,7 88,8 85,7

Les taux de germination obtenus ont variés entre 77,7 et 100%. Le milieu MS dilué

deux fois a permis d’obtenir 100% de germination.

Avec les milieux additionnés d’hormone, le taux de germination est supérieur à 50%.

L’acide gibbérellique a été actif selon les concentrations utilisées.

La présence d’acide gibbérellique dans les milieux a permis une levée de la

dormance des graines ainsi qu’un bon taux de germination.

25

Résultats, interprétation, discussion

I.3 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des pousses

La croissance en longueur des pousses n’a révélé de différences remarquables qu’à

partir du 15ème jour de la mise en culture pour le milieu MS/2 seul. La hauteur de la pousse

est entre 1,5 cm et 4,9 cm.

Quant au milieu MS/2 additionné de différentes concentrations en acide gibbérellique,

en 8 jours seulement, tous les échantillons ont présentés un bon développement de

l’hypocotyle et une formation de pré-feuille.

Ces résultats ont été pris entre le 5ème

et 15ème

jour et une moyenne a été faite entre les

valeurs prises.

Tableau 3 : Longueurs de pousse en moyenne

Types de

milieu

MS/2 seul MS/2+GA[0,5] MS/2+GA[1] MS/2+GA[1,5] MS/2+GA[2]

Hauteur de la

pousse (cm)

3,42

2,37

2,35

3,06

3,90

Selon [Quennoz, 2001], l’acide gibbérellique favorise la germination des graines, le

bourgeonnement après la dormance et l’élongation de la tige : dans notre cas, cette hypothèse

est fondée.

Cependant on a pu constater que l’effet de l’hormone dépend aussi de sa

concentration relative, c’est-à-dire que plus la concentration est forte, plus on obtient un bon

résultat..

I.4 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des racines

Au bout de 9 jours, avec les milieux additionnés d’acide gibbérellique, on a déjà

un bon développement racinaire en moyenne 3,2cm de longueur.

Quant au milieu MS/2 sans hormone, ce n’est qu’à partir du 18è jours de culture

qu’il s’est révélé optimal avec en moyenne une longueur de 7cm.


26

Tableau 4 : Longueurs des racines en fonction des milieux

La rhizogenèse semble être stimulée par la présence d’acide gibbérellique surtout à

concentration élevée pendant les neuf premiers jours.

En 20 jours, c’est avec le milieu MS/2 qu’on a pu avoir une meilleure croissance

racinaire (7cm de longueur en 20 jours).

[Quennoz, 2001] a affirmé que le milieu MS/2 est un milieu riche contenant tous les

nutriments dont une plante a besoin.

I.5 Effets des différentes concentrations de GA sur le nombre de bourgeons

axillaires

Des différences importantes ont été observées entre les traitements au bout du 9è

jours ainsi qu’au 15è jours de culture.

Au bout de 20 jours, ce sont les milieux sans hormones qui se sont révélés

performants avec 5 bourgeons axillaires biens distincts en moyenne.


Longueur des

racines (en cm)

en 9 jours

2

3

3,5

3,5

4

Longueur des

racines (en cm)

en 18 jours

7

3

3,5

3,5

4


27

Tableau 5 : Nombre de bourgeons axillaires en fonction de la concentration en GA

Ici, on constate que la croissance semble être inhibée en présence d’acide

gibbérellique.

[Quennoz, 2001], l’effet des hormones dépend à la fois de leur concentration, leur

site d’action et le stade de développement de la plante.

Au bout de 30 jours, seuls les explants issus du milieu MS/2 sont prêts pour être

acclimatés tandis que ceux issus des milieux contenant l’hormone sont morts : ce sont

probablement les rejets d’exsudats phénoliques dans le milieu qui ont provoqué cette nécrose.

I.6 Evolution de l’acclimatation

L’évolution de l’acclimatation est montrée dans la figure 8

Figure 8: Plants de cacao après un mois d’acclimatation

Au bout d’un mois d’acclimatation, on a pu avoir de belles et de nombreuses feuilles qui

seront utilisées lors du postulat de Koch.


Nombre moyenne

de bourgeon

5

1

1

1

1


28

Chapitre II: ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE

II.1 Diagnostic des maladies

Deux échantillons ont été prélevés à Ambanja. La tâche brune est nommée symptôme

1 et la tâche jaune est nommée symptôme 2.

Description du symptôme 1 :

Des lésions nécrotiques brunes plus particulièrement localisées en bordure du limbe

déforment les folioles. Lorsqu’une lésion apparait à l’extrémité du limbe, elle s’étend

progressivement de façon centripète.

Le symptôme 1 est présenté dans la figure ci-dessous :

Description symptôme 2

Les tâches jaunes se repartissent tout le long de la feuille infectée. Ces tâches jaunes

sont en pointillées.

Le symptôme 2 est présenté dans la figure ci-dessous :

Figure 10: Symptôme 2

Figure 9: Symptôme 1


29

II.2 Isolement des germes issus des feuilles malades

II.2.1 Etude bactériologique

Après les différentes étapes de l’isolement et purification, 5 bactéries pures et une

levure ont été isolées des 2 échantillons avec des caractères macroscopiques bien distingués.

Parmi ces 5 bactéries, 4 dénommées : 1C.AI, 1C.A

II, 1C.A

II’,1C.A

III, ont été isolées

du symptôme 1 et une seule type de bactérie a été isolée du symptôme 2 (2C.AV).

La levure, notée 1C.AIV

a été isolée du symptôme 1.

Selon [Michel, 2001], des bactéries différentes peuvent donc induire un même

symptôme et deux espèces génétiquement différentes peuvent coloniser un même habitat.

1 : symptôme 1 A : boîte A C : cacao Criollo

2 : symptôme 2 Chiffre : numérotation des souches

Souche symptôme 1

Souche symptôme 2

Souche 1C.AI

Souche 1C.AII

Souche 1C.AII’

Souche 1C.AIV

Souche 2C.AV

Souche 1C.AIII

Figure 11: Souches pures isolées des deux symptômes


30

II.2.2 Etude mycologique

Huit champignons ont été isolés des 2 symptômes : 3 champignons ont été isolés du

symptôme 2 (2C.B6, 2C.C

7, 2C.C

8) alors que 02 types de champignons ont été isolés des 02

symptômes (1C.A2, 2C.B

3) et 03 types de champignon du symptôme 1 (1C.A

1, 1C.C

4, 1C.C

5).

1 : symptôme 1 A : boîte A C : cacao Criollo

2 : symptôme 2 B : boîte B Chiffre : numérotation des souches

Souche 1C.C4

Souche 1C.C5

Souche 2C.C8

Souche 2C.B3

Souche 2C.B6

Souche 2C.C7

Figure 12 : Souches pures des champignons isolés

Souches symptôme 2

Souches symptôme 1

Souche 1C.A1

Souche 1C.A2

Souche 1C.A1

Souche 1C.A2

Souche 1C.C4

Souche 1C.C5


31

II.3 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades

II.3.1 Etude bactériologique

Caractères macroscopiques des colonies

Les caractères macroscopiques des colonies sont présentés dans le tableau 6

Tableau 6 : Caractères macroscopiques de chaque colonie bactérienne

Types de

bactéries

1C.AI 1C.A

II 1C.A

II’ 1C.A

III 2C.A

V

Couleur Blanchâtre Jaunâtre Jaunâtre Blanchâtre Blanchâtre

Taille Grande Petite Petite Petite Moyen

Consistance Sèche Crémeuse Crémeuse Crémeuse Sèche

Allure du

contour

Irrégulier Régulier Régulier Irrégulier Irrégulier

Aspect de la

surface

Rugueuse Lisse Lisse Lisse Rugueuse

Relief Bombé Bombé Bombé Bombé Bombé

Transparence Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque

Caractères microscopiques des colonies

Après observation à l’état frais, 4 bactéries sont mobiles et une seule bactérie est

isolée.

Les récapitulatifs des caractères microscopiques des colonies sont présentés dans les

tableaux 7 et 8 ci-dessous :

Tableau 7 : Récapitulatif des caractéristiques microscopiques des bactéries isolées

Types de bactéries Mobilité Mode de groupement

1C.AI Mobile Groupée 2 par 2

1C.AII Mobile Groupée 2 par 2

1C.AII’

Immobile Groupée 2 par 2

1C.AIII

Mobile En chainette

2C.AV Mobile Isolée


32

Après coloration Gram, 3 bactéries sont des bactéries à Gram (-) et 2 bactéries sont des

bactéries à Gram (+).

Les détails sont notés dans le tableau 8.

Tableau 8 : Morphologie et coloration de Gram de chaque bactérie

Souches Formes Gram

1C.AI Bacille Positif

1C.AII Bacille Négatif

1C.AII’

Coccobacille Négatif

1C.AIII

Cocci Négatif

2C.AV Arrondie Positif


33

II.3.2 Etude mycologique


Les caractéristiques macroscopiques de ces champignons sont récapitulées dans le tableau 9 ci-après :

Tableau 9 : Récapitulatif des caractères macroscopiques des champignons isolés

Souches

Texture

Topographie

Couleur de la

surface

Couleur du revers

Vitesse de croissance

(diamètre en fonction du temps

d’incubation)

24h 48h

1C.A1

Duveteux

plane

blanchâtre

Centre noir verdâtre, blanc qui vire au jaune

poussin

4,8 cm

9,1 cm

1C.A2 Duveteux, plane blanchâtre Noir verdâtre 4,5 cm 9,1 cm

2C.B3 Duveteux plane blanchâtre Blanchâtre 3,8 cm 9,1 cm

1C.C4

Laineux

plane

blanchâtre

Verdâtre au centre, extrémité blanchâtre

4,3 cm

8,8 cm

1C.C5

Duveteux

plane

Blanchâtre

aux

extrémités,

noir au centre

Blanchâtre aux extrémités, noir verdâtre au

centre

4 cm

8,8 cm

2C.B6 Laineux

plane blanchâtre Noir au centre 3,9 cm 9,1 cm

2C.C7 Cotonneux

surélevée blanchâtre Rose grisâtre 1,1 cm 2,9 cm

2C.C8 Cotonneux

surélevée blanchâtre Blanc-rosâtre 0,8 cm 2,6 cm

Pour les champignons, on a pu isoler les mêmes souches venant des deux symptômes (type 2 et type 3). Ceci dit, un champignon peut

causer différents symptômes selon les tissus vasculaires envahis [HARINARIVO,2012].


34

Chapitre III: VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES

(Postulat de Koch)

III.1 Inoculation avec les souches bactériennes

Toutes les souches ont été inoculées chacune sur une feuille saine mais seule la

souche 1C.AIII

a montrée les symptômes qui sera montrée dans la figure ci-dessous :

Avec la souche 1C.AIII

A partir du 4ème

jour, une petite tâche brune commençait à apparaître au niveau du bord

supérieur et bord inférieur du limbe.

La bactérie est moins sévère vu qu’en 8jours d’incubation, la tâche ne s’est pas

répartie tout le long de la feuille.

J-0

J-4

J-8

Figure 13 : Feuille inoculée par la souche 1C.AIII


35

III.2 Inoculation avec les champignons

Souche 2C.B6

La figure 17 montre qu’à partir du 4ème

jour d’incubation seulement, la feuille a été

recouverte par plusieurs tâches jaunâtres.

Souche 2C.C7

Les taches ont commencées sous les blocs d’agar contenant les mycéliums et se sont

réparties tout le long de la feuille au bout de 8 jours d’incubation.

J-0

J-4

J-8

J-0

J-4

J-8

Figure 14 : Feuille inoculée par la souche 2C.B6

Figure 15 : Feuille inoculée par la souche 2C.C7


36

Souche 1C.A2

La tâche brune a commencé au bord inférieur du limbe en 4 jours d’incubation. Au

bout de 8 jours la tâche s’est repartie le long de la feuille de façon centripète

Souche 1C.A1

La tâche brune a commencé au bord inférieur ainsi qu’à l’extrémité du limbe en 4

jours d’incubation. Au bout de 8 jours la tâche s’est repartie le long de la feuille de façon

centripète.

J-0

J-4

J-8

J-0

J-4

J-8

Figure 16 : Feuille inoculée par la souche 1C.A2

Figure 17 : Feuille inoculée par la souche 1C.A1


37

Souche 1C.C4

La figure 20 nous montre qu’en 4 jours d’incubation, la tâche commençait à apparaître

au niveau du bord inférieur du limbe.

En 8 jours le bord supérieur a aussi révélé une tâche qui s’est répartie de façon

centripète le long de la feuille.

Les maladies observées sont des nécroses associées à des bactéries et champignons.

Selon [MICHEL, 2001], un microorganisme phytopathogène responsable d’une

quelconque maladie doit reproduire les mêmes symptômes sur des plantes saines.

J-0

J-4

J-8

Figure 18 : Feuille inoculée par la souche 1C. C4

Conclusion et perspectives

CONCLUSION ET

PERSPECTIVES

Conclusion et perspectives

38

Le présent travail a été effectué au sein du laboratoire de recherche de l’IMRA et ayant

pour objectif la multiplication végétative in vitro de la variété Criollo par la méthode de

germination in vitro des fèves de cacao en présence d’acide gibbérellique et des témoins sans

l’hormone : dans la partie culture in vitro. L’isolement et identification préliminaire des

microorganismes pathogènes à l’origine de la tâche brune sur les jeunes feuilles ainsi que

pour les taches jaunes ainsi que la vérification de la réapparition des symptômes des maladies

bactériennes sur des plantes apparemment saines pour la partie phytopathologie.

La culture in vitro a révélé qu’une hormone agit en fonction de leur concentration et

selon le stade de développement de la plante. Des hormones doivent donc être ajoutées

pendant la période de croissance après la germination. Dans notre étude, le milieu MS/2 est

démontré comme étant un milieu riche d’après les résultats obtenus après 30 jours de culture.

L’étude de la phytopathologie du cacaoyer a permis de déterminer que les nécroses

observées sont associées à des champignons et bactéries. Ceci a été vérifié par la technique du

postulat de Koch qui est une technique simple et facile à appliquer.

Ce travail est une phase préliminaire de recherche concernant la culture in vitro et la

phytopathologie du Théobroma cacao. Cependant, notre stage nous a permis :

De nous initier aux manipulations microbiologiques et à la culture in vitro

De maîtriser les techniques d’isolement et purification surtout concernant les

champignons

A l’avenir, nous envisageons :

De compléter les identifications préliminaires utilisées en déterminant les genres

et espèces des germes responsables des symptômes diagnostiqués surtout pour les

champignons afin d’affirmer s’il s’agit encore du Phytophtora sp. ou bien des

nouveaux genres de champignons pathogènes.

D’optimiser la culture in vitro du Théobroma cacao en fonction des hormones de

croissances

Références bibliographiques

v

REFERENCES

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http://www.CABI-Commodities.org

http://www.fsagx.ac.be/pp/coursenligne.php

http://thesesmalagasy.org

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http://www.memoireonline.com

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http://www.memoireonline.com/

Annexes

vi

ANNEXES

Annexes

ANNEXE I : LISTES DES MATERIELS ET EQUIPEMENTS

Matériels, verreries, réactifs et équipements

Agitateur magnétique chauffant HB 450

Autoclave Sanyo MLS-3780

Acide gibbérellique 1ml/L

Alcool éthylique dénaturé 70%

Bain ultrason SONOCLEAN

Balance

Balance de précision

Bec bunsen

Bocal alimentaire

Boîtes de Pétri 90mm

Ciseau

Centrifugeuse

Densichek

Eau distillée stérile

Eprouvettes graduée

Erlen meyer gradué

Fiole jaugée

Hotte à flux laminaire (flufrance)

Incubateur Napco

Incubateur Sanyo

Micropipettes et cônes

pH-mètre Inolab

Pince

Réfrigérateur Philips

Stock 1, 2,3

Vitamine

Annexes

ANNEXE II : LES MILIEUX DE CULTURE ET LEURS COMPOSITIONS

I. EN MICROBIOLOGIE

Milieu pour le rajeunissement des souches de bactéries

Nutrient Agar (NA)

Peptone--------------------------------- 5g/l

Beef extract----------------------------3g/l

Agar ------------------------------------ 15g/l

Eau distillée ---------------------------- 1l

Milieu pour repiquage des champignons

Potato Dextrose Agar (PDA)

Pomme de terre --------------------------------- 10g/l

Glucose ou dextrose ----------------------------10g/l

Agar ----------------------------------------------15g/l

Eau distillée ------------------------------------- 1l

II. EN CULTURE IN VITRO

STOCK COMPOSITION DE CHAQUE STOCK

Stock 1 : regroupe les macroéléments

Quantité pour 250ml d’eau distillée

CaCl2 : 1,1g

KH2PO4 : 0,425g

KNO3 : 4,75g

MgSO4, 7H2O : 0,925g

NH4NO3 : 4,125g

Stock 2 : regroupe les microéléments


CoCl2, 6H2O : 0,625mg

CuSO4,5H2O : 0,625mg

H3BO3 : 155mg

KI : 20,75mg

MnSO4, H2O : 422,5mg

Na2MOO4, 2H2O : 6,25mg

ZnSO4, 7H2O : 215mg

Stock 3 : apport en fer


FeSO4, 7H2O : 776mg

Na2EDTA : 932mg

Annexes

A ces 3 différents stocks sont ajoutés :

la vitamine : 1ml/L

le saccharose : 20g/L

le gélifiant qui est l’agar : 8g/L

La composition du milieu MS utilisé est le suivant :

MS MS/2

S1 : 100ml/L

S2 : 10ml/L

S3 : 10ml/L

Vitamine: 1ml/L

Saccharose: 20g/L

Agar: 8g/L

S1 : 5O ml/L

S2 : 10ml/L

S3 : 10ml/L

Vitamine: 1ml/L

Saccharose: 20g/L

Agar: 8g/L

Annexes

ANNEXE III : DIFFERENCES ENTRE LA PAROI D’UNE BACTERIE

GRAM – ET GRAM +

Gram négatif Gram positif

Paroi constituée d’une mince couche de

peptidoglycane

Leur paroi représente 5 à 10% de leur poids

Une membrane externe se trouve à l’extérieur du

peptidoglycane

La protéine la plus abondante est la lipoprotéine de

BRAUN (petite lipoprotéine attachée par liaison

covalente au peptidoglycane) : elle relie la membrane

externe et le peptidoglycane

La membrane externe est composée de

lyposaccharides (les LPS)

Il s’agit d’une paroi homogène et

épaisse constituée principalement

de peptidoglycane

Leur paroi représente 30% de leur

poids

Leur paroi est composé d’une

grande quantité d’acides

téïchoïques qui sont des polymères

de glycérol et de ribitol phosphate ;

des acides aminés tels que la D-Ala

ou des sucres comme le glucose

sont attachés au ribitol

Les acides téïchoïques sont

connectés soit au peptidoglycane

soit au lipide de la membrane

plasmique.

Name FALIHERINIAINA

First name Mamy Lalaina

Tittle Approch to the phytopathology associed to the germination in vitro of

Théobroma cacao variety Criollo

ABSTRACT

The present work has been done within the laboratory of research of the IMRA. The

survey dedicated itself on the raise of the Criollo variety that is in way of disappearance

whereas it is a variety to strong potentiality organoleptic and aromatic. The specific objectives

were the in vitro multiplication of the beans by the in vitro germination method in presence of

acid gibbérellique, the isolation and preliminary identification of the germs on observed

leaves patients and harvested to Ambanja as well as the verification of the resurgence of the

symptoms on healthy leaves.

Ranges of concentrations in acid gibberellic have been used for germination and the

technic of Assumption of Koch has been used for the verification of the resurgence of the

symptoms.

The in vitro culture demonstrated the specificity of the MS/2 middle that is a very rich

environment in nutriments whose plants have needed but also the efficiency of the acid

gibberellic in the levee of the dormance at the seeds.

The isolation of the pathogenic stumps from the sick leaves permitted to get 13

different colonies of which 5 are proven pathogenic by the method of Assumption of Koch. A

microorganism phytopathogen responsible for any illness must reproduce the same symptoms

on apparently healthy plants: this hypothesis is founded.

Before these promising results, it would be primordial to continue this survey on the

optimization of the in vitro culture according to the hormones of growth as well as the

determination of the kinds and species of the stumps proven like being pathogenic.

Keywords: Theobroma cocoa, in vitro germination, hormones of growth, phytopathology,

Assumption of Koch.

Advisors: Doctor RASAMIRAVAKA Tsiry

Doctor RANDRIANIERENANA Ando

Nom FALIHERINIAINA

Prénoms Mamy Lalaina

Titre: Approche à la phytopathologie associée à la germination in vitro du

Théobroma cacao de la variété Criollo

RESUME

Le présent travail a été effectué au sein du laboratoire de recherche de l’IMRA.

L’étude s’est consacré sur la relance de la variété Criollo qui est en voie de disparition alors

que c’est une variété à forte potentialité organoleptique et aromatique. Les objectifs

spécifiques étaient la multiplication in vitro des fèves par la méthode de germination in vitro

en présence d’acide gibbérellique, l’isolement et identification préliminaire des germes sur

des feuilles malades observées et récoltées à Ambanja ainsi que la vérification de la

réapparition des symptômes sur des feuilles saines.

Des gammes de concentrations en acide gibbérellique ont été utilisées pour la

germination et la technique de Postulat de Koch a été utilisée pour la vérification de la

réapparition des symptômes.

La culture in vitro a démontré la spécificité du milieu MS/2 qui est un milieu très riche

en nutriments dont les plantes ont besoin mais aussi l’efficacité de l’acide gibbérellique dans

la levée de la dormance chez les graines.

L’isolement des souches pathogènes à partir des feuilles malades a permis d’obtenir 13

colonies différentes dont 5 sont prouvées pathogènes par la méthode de Postulat de Koch. Un

microorganisme phytopathogène responsable d’une quelconque maladie doit reproduire les

mêmes symptômes sur des plantes apparemment saines : cette hypothèse est fondée.

Devant ces résultats prometteurs, il serait primordial de continuer cette étude sur

l’optimisation de la culture in vitro en fonction des hormones de croissance ainsi que la

détermination des genres et espèces des souches prouvées comme étant pathogène.

Mots clés : Théobroma cacao, germination in vitro, hormones de croissance, phytopathologie,

Postulat de Koch.

Encadreurs : Docteur RASAMIRAVAKA Tsiry

Docteur RANDRIANIERENANA Ando

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