Apport des nouvelles techniquesdans la détection des anomalies du génome

des Syndromes Myélodysplasiques

V Eclache DESC -2015

Introduction • Les MDS sont des hémopathies clonales

– Sans anomalie spécifique unique – Clonalité de l’X par HUMARA uniquement chez les

femmes Anomalies CC sont surtout Des pertes de chromosomes (-7, -Y) – Des délétions 5q-; 7q-, 20q-, 17p-, 12p-, 11q-, 13q-… – Des trisomies +8, +11,+21 – Peu de translocations réciproques

▪ Le caryotype est indispensable à la prise en charge des SMD ▪ Diagnostic (selon OMS 2008)

▪ Pronostic (IPSS)

▪ Les études collaboratives portant sur un grand nombre de patients ont

amélioré les connaissances sur la valeur pronostique des anomalies

cytogénétiques ▪ 20 sous groupes d’anomalies cytogénétiques dont l’impact sur la survie globale et la

transformation en LAM ont été établis

▪ Répartis en 5 sous-groupes pronostiques cytogénétiques (très bon,-très mauvais) dans

l’IPSS- R ( Greenberg, 2012)

▪ Pronostic des anomalies chromosomiques isolées et des anomalies doubles

▪ Vérification statistique en analyses uni- et multivariées

Introduction -2

Places et limites respectives de la CC et de la FISH

Limites respectives de la CC et du FISH

FISH EGR1

Caryotype de très mauvais pronostic (> 3anomalies)

Pb des SMD à caryotype normal : environ 60% des cas Pour un caryotype identique : évolutions différentes Mécanismes des délétions interstitielles ? les zones connues de pertes et gains portent des gènes qui contribuent à la pathogénèse des SMD : exemple de la del(5q) - happloinsuffisance de RPS14 sur le 5q, analogie avec anémie constitutionnelle de Blakfand Diamond - miR145 & 146a réguleraient les gènes impliqués dans la mégakaryopoïèse Caséine Kinase11 (sensibilité au LEN) et d’autres gènes dans et au dehors de CDR ! Chromothripsis : del complexes ? !! Intérêt des nouvelles technologies d’exploration du génome mise en évidence de nouveaux mécanismes

Intérêt des nouvelles technologies pour les SMD à K Nx

Nouvelles technologiessans culture cellulaire

• CGH puces BACS puis oligonucléotides • SNP array • Séquençage ciblé • Séquençage Haut débit

A- CGH

B- SNP

Uniquement gain et pertes de régions

-CNV

Visualise les 2 allèles Perte d’hétérozygotie CNV Confirmation de l’anomalie somatique

Maciejewski, J. P. et al. Blood 2008;112:965-974

Confirmation par RQ-PCR ou FISH

Del 21

CD 3+

Gondek LP , Blood 2008

Différents types de lésions touchant le chromosome 7 et impact sur la survie

Délétion Perte d’hétérozygotie

*Non détectées par la CC survie

CC et SNP nal SNP anormal CC anormal

Anomalies chromosomiques et UDP detectées par SNP arrays dans 175 cas de MDS, MDS/MPD, et LAMs.

Augmentation du nombre d’anomalies détectées en particulier dans les LAMs Réduction du nombre de cas non informatifs

Gondek LP .Blood. 2008 1;111:1534-42.

Pronostic s’aggrave avec le nbr d’anomalies

Détection d’une nouvelle anomalie récurrente

Clonage et séquençage

Vérifier le caractère acquis

TET2

Delhomeau F et al,NEJM 2009

Birnbaum Br J Haematol. 2009 145:788-800

Anomalies mises en évidence par la CGH array

Mutation du gène ASXL1dans 11% des MDS et 43% de LMMC rôle d’ASXL1 dans la progression vers la LAM

Prot associée complexe polycomb qui régulent l’expression des gènes Homéotiques. (régulation des histones et de la voie de WNT)

Dunbar, A. J. et al. Cancer Res 2008;68:10349-10357

Identification de mutations nonsens de c-Cbl (11q23.3) dans des MDS/MPD

E3 ubiquitine ligase Impliquée dans la régulation de tyrosine kinase Gène supresseur de tumeur

Apport des techniques CGH et SNP

Augmentation de la résolution du caryotype grâce aux techniques de SNP A et CGH-A qui sont :

- Indépendantes de la division des cellules - Peuvent détecter les déséquilibres génétiques cryptiques et les UPD Ne peuvent détecter les clones minoritaires (< 25% cellules anormales) L’analyse complexe doit suivre des critères strictes d’exclusion de polymorphisme Outil de recherche: reconnaissance de nouvelles microdélétions/ microduplications et de

gènes cibles mutés Ces techniques devraient compléter le caryotype mais sont difficiles à utiliser en routine

diagnostique (plate formes dédiées) Etudes cliniques préliminaires montrant une influence de ces anomalies cryptiques sur le

pronostic des patients SMD

Méthode Résolution

Sensibilité (% cell anormales)

Détection des UPD

Nécessite Cellules en

division

Distinction entre clones individuels

Caryotype sur métaphases

Faible (10 à 15%) Non Oui Oui

FISH Faible (élevée) Non Non Oui

CGH arrays Elevée (20-30%)

Non Non Non

SNP arrays Très Elevée (20-30%)

Oui Non Non

Résolution de la CGH 200pb vs 10-15 Mb pour la CC

Essai QMPSF corrélation avec la CyC et aCGH

• 12 patients avec SMD, caryotypés, étudiés en aCGH Agilent 44K

• 20 gènes cibles sélectionnés dans régions délétées en CC et aCGH

• QMPSF : pcr multiplex, analyse de fragments

• Puis 69 patients supplémentaires

• Identification de del(7q) cryptiques et del(17p) avec CN

Stanopoulos et Bastard

QMPCF résultat

À chaque région : 1 pic en fonction de la taille du fragment amplifié Comparaison à témoin normal, différence des hauteurs des pics

Cellules CD34 médullaires triées n=33 Résultats

!!• Caryotypes AN: 15/33 dont 13 ont des anomalies de nombre dans les régions ciblées par

la QMPSF

• QMPSF anormales : 17/33, dont12 sur 13 anomalies de nombres détectées par CC

• 5 délétions non identifiées par CC impliquent :12p, 20q, and 7q • Des délétions cryptiques du chromosome 7q sont aussi détectées

Stamatoullas A et al , Leuk Res 2012

Séquençage haut débit

Plusieurs techniques encore complexes et couteuses !Fragments génomiques de 200 à 400 pb Whole exome, whole génome !Spectrométrie de masse pour génotypage !Permet de détecter des remaniements équilibrés des mutations géniques !Meilleure compréhension des mécanismes

Séquençage haut débit : Principe du NGS

Matériel biologique : ADN ou ARN !Etapes communes aux différentes technologies : - Fragmentation enzymatique de l’ADN !- Préparation d’une banque d’ADN (library) par ligation d’adaptateurs !- Amplification clonale !- Séquençage générant des signaux (luminescent ou fluorescent !- Détection des signaux émis et conversion en séquence

Les 3 principales variations de protocole de NGS. Le séquençage simple donne les informations sur les variations nucléotidiques, la technique paired-end permet de détecter des remaniements de petites tailles, la technique mate-paired est adaptée à la détection de remaniements de structure du génome (translocation chromosomique).

Établissement des banques de fragments et amplification avant séquençage. L’ADN est tout d’abord fragmenté, les extrémités sont “ réparées” et ligaturées à des adaptateurs (petits rectangles verts). Selon les constructeurs, 2 méthodes d’amplification sont proposées le plus souvent.a. Amplification en émulsion (ePCR).b. Amplification in situ sur la lame de verre.

Avantages et inconvénients du NGS

• Très grande sensibilité de détection (1 copie par cellule) • Lecture de séquences de plus en plus longues en un temps de plus en plus court 20 Mb/run – 100 bp/read en 2006 700 Mb/run – 700 bp/read en 2012 • Coût de – en – élevé avec l’apparition de NGS de paillasse! une application en diagnostic ! Inconvénients • Quantité de données recueillies (traitement et stockage des données, recours à un bio-informaticien) !• Problèmes au niveau insertions/délétions pas toujours détectées !• Ethique !

Mutations somatiques dans les MDS recherche de nouveaux gènes candidats

• Utilisation du NGS et de la spectrométrie de masse pour rechercher des mutations somatiques dans des régions « hotspots » de 111 gènes sur une cohorte de + 900 patients et leur implications cliniques (Bejar 2011)

• Vérification de l’ADN constitutionnel !

• Suivi par des études de tout le génome ou de tout l’éxome !

• Amélioration des connaissances

Bejar, Ebert; NEJM 2011

18 mutations récurrentes analysées

Anomalies 50% pats

CBL, BRAFF, RAS, Jak2

Bejar el al, NEJM 2011; 364(26):2491

Analyse multivariée de l’impact de 5 mutations sur la survie de 428 patientsBejar el al, NEJM 2011; 364(26):2491

!Facteur de risque

!Risque de décès

(95% IC)

!p

Age > 54 ans vs <55 ans

!1.8

!0.004

IPSS !Int-1 vs faible Int-2 vs faible Fort vs faible

!!2.29 3.45 5.85

!!< 0.001 < 0.001 < 0.001

Mutations !TP53 mut vs non EZH2 mut vs non ETV6 mut vs non RUNX1 mut vs non ASXL1 mut vs non

!!2.48 2.13 2.04 1.47 1.38

!!< 0.001 < 0.001 0.03 0.047 0.049

Modifications épigénétiques• 1-Methylation • Méthylation : profils différents entre Cellules normales et Cellules de

SMD • Méthylation en 5’ des cytosines dans régions promotrices riches en

CpGdinucléotides par DNMT3A / B • Statut de méthylation des cytosines influence transcription des gènes • Des gènes régulateurs de méthylation des cytosines sont mutés dans les

MDS : TET2, DNMT3A; IDH1- IDH2

• 2-Modification des histones • Contribuent à la régulation de l’expression des gènes • Chromatine ouverte ou fermée • EZH2 régule la balance auto renouvellement cellulaire/différenciation

Si mutations de DNMT3A, TET2, IDH1: modification méthylation des cytosines

Graubert Blood 2011

Maintient état répressif

isoCitratedehydrogénase

Triméthylation De la lysine 27

Répression de la transcription

Ilots CpG

5Méthyl Cytosine

5-AZA

AG-221

I- HDAC

Implications thérapeutiques importantes : traitement par les agents déméthylants ex: 5 aza -cytidine AMM dans le traitement des MDS de Haut grade

DNMT3A : mutations dans 8% des SMD, évolution vers LAM Souris-/-avantage compétitif, dominance clonale !TET2 : mutations dans 11 à 26% des SMD 37 à 44% des SMD/MPN 11 à 24% des LAM Pas d’influence sur la survie Augmentent l’auto renouvellement des CSH !IDH1/IDH2 : mutations dans 4 à 10% des SMD, plus si sAML Pronostic péjoratif !Les mutations de TET2, IDH1/H2 sont mutuellement exclusives

À la recherche de nouvelles anomalies du métabolisme de la 5-hydroxyméthylcytosine !-Les mutations de TET2 empêchent la formation de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC, intermédiaire de déméthylation)(Ko, Nature 2010 ; Guo, Cell 2011) !-Les mutations d’IDH1/2 bloquent la fonction de TET2 (Figueroa, Cancer Cell 2010) !- Il est vraisemblable que d’autres mutations que TET2 et IDH1/2 affectent le taux de 5-hydroxyméthylcytosine, mais celles-ci restent inconnues !!

CTRL TET2 TET2 MUT WT

Reséquençage ciblé -! Non concluant (métabolisme IDH, réparation ADN) !Mutations IDH ! rares !Exomes !Mutations de splice Défaut d’épissage de TET2 ?

Autre avancées récentes : découvertes du rôle des Mutations touchant les gènes de l’Epissage (spliceosome)

Étape 1 : Le complexe U1 reconnait le site donneur en 5’

Étape 2 : SF1 et U2AF65 reconnaissent le point de branchement intronique !!

Étape 3 : U2AF35 reconnait le site accepteur en 3’et s’associe aux protéines SR

Étape 4 : Le complexe U2 et ses cofacteurs SF3A/B sont recrutés !

Spliceosome : complexe de 5 petits ribonucléoprotéines nucléaires snRNPs + autres protéines U2AF1 rôle dans l’épissage du premRNA : évènement initiateur U2AF1 se lie au dinucléotide accepteur de intron cible SF3B1 reconnaît le site donneur à jonction intron-exon (22 heat domains) donne complexe U2snRNP

Site donneur Site accepteurPoint de branchement

!!U2AF1

Reproduit d’après Abdel-Wahab et al. Cancer Cell 2008

!RARS et RARS-T +++ LMMC +++

Autres SMD

Mutations fréquentes

U2AF1

Mutations rares

Mutations des gènes de l’épissage dans les SMD

SF3A, PRPF40B, U2AF65, SF1, LUC7L2, PRPF8 Mutation de SF3B1 entraine down régulation

du réseau de gènes des voies mitochondriales

Mutations de gènes de l’épissage dans les SMD

• Spliceosome (Yoshida) : mutation de la voie de l’épissage dans SMD par whole exome sequencing

• Mutations des différents intervenants du spliceosome • Mutations exclusives U2AF1, SF3B1 • Lié à sous type de SMD • Tôt dans la progression • Mutation de U2AF1 serine 34 : (Graubert) 8.7% SMD de

novo • Événement précoce car id qqsoit chiffre de blastes • Favoriserait progression vers LAM

Nouvelle mutation SF3B1 localisé en 2q33

- Mutations hétérozygotes, substitution, exon 12 à 15 sans perte d’hétérozygotie. Il existe une mutation principale de SF3B1 : K700E. (Papaemmanuil oct 2011 sur 2087 échantillons)

Un modèle murin SF3B1 +/- reproduit la maladie. down regulation de gènes déterminant les fonctions mitochondriales

!- La mutation paraît largement exclusive par rapport aux autres mutations

déjà décrites.- Jamais de mutation dans les formes congénitales.

- Mutations liées à la présence de sidéroblastes, 75-78 % pour les RARS, 63 % pour les RCMD-RS et de 70 % pour les RARS-T versus 14- 20% des SMD – GB augmentés, plaq aussi, anomalies erythro, peu de blastes

• Le pronostic est le même que celui des ARSI à K nal ou Interm 1 • Patnaik jan2012; Damm nov 2011

Architecture génomique d’une cohorte de 738 MDS et SMP/SMD

Les anomalies sont regroupées par pathologies selon OMS

Associations préférentielles en vert SF3B1 avec les ARS SRSF2 et LMMC Ou exclusives en brun

Papaemmanuil E et al. Blood 2013;122:3616-3627

CNV d’un patient avec del(5q) 85% des anomalies CyC sont dépistées en aSNP

SF3B1 :24% TET2 :22% SRSF2: 14%

Mutations oncogéniques m e e dans les MDS !A :Anomalies détectées par CYC 33% , séquençage 74% ou les 2 combinés 78% B : mutations et An CyC réparties selon les entités OMS

C: Appariement entre les anomalies CyC et moléculaires retrouvées chez plus de 10 patients En bleu : les associations > au hasard En brun : associations quasi exclusives

Les mutations de l’épissage sont exclusives TET2 et IDH2 anomalies de hydroxyméthylation de l’ADN

Predicting leukemia-free survival.

Papaemmanuil E et al. Blood 2013;122:3616-3627

Le risque de transformation en LAM augmente avec le nombre de mutations dans les gènes oncogéniques

TET2 m corrélé au taux d’Hb les plus élevés Del(5)q aux taux d’Hb les plus bas

IDH2,WT1, NRAS, STAG2 et caryo complexe correllent avec les taux de blastes les plus hauts SF3B1 le plus bas

Outcome by whether driver mutations are clonal or subclonal.

Papaemmanuil E et al. Blood 2013;122:3616-3627

La présence d’une mutation oncogénique impacte la transformation en leucémie de la même façon qu’elle soit clonale ou sous clonale

Conclusion• Le caryotype garde une place importante pour le diagnostic

et le pronostic (Révision de IPSS en 2012 Greenberg et al) • Complété par la FISH en cas d’échec !

• Techniques CGH ou QMPCF peu développées !

• Mutations par NGS: de plus en plus d’étude !

• Vers de nouveaux scores pronostiques incluant les mutations les plus fréquentes

Eviter le naufrage !

!• Cytogénétique • Mutations

– Fondatrices – Epi génétiques – Sous clonales – ….